穩定蛋白質的方法

2023-11-09 22:42:22

專利名稱：：穩定蛋白質的方法穩定蛋白質的方法
技術領域：
：本發明涉及穩定水性蛋白溶液對抗外源脅迫的方法和穩定水性蛋白溶液的容器的用途。使水性蛋白溶液對抗外源脅迫(例如機械脅迫，例如振蕩)而穩定仍然是製藥工業的技術難題。已知下述事實水性蛋白溶液在受到機械脅迫時具有聚集的趨向。在水性蛋白溶液(例如在容器中，例如藥瓶中)運輸期間幾乎總會發生此類機械脅迫。本領域中常用的解決方案是使用例如穩定劑如聚山梨酯進行物理-化學穩定，其中廣泛使用聚山梨酯20(也稱為Tween2(FM)或聚山梨酯80(Tween80TM)、泊洛沙姆188或其它表面活性劑。但是，易於理解的是，不用化學產品進行穩定將有很多優點。具體而言，可能涉及到化學穩定劑對人體安全性的影響。因此，行政管理機構通常希望將藥物製劑中包含的化學穩定劑的數量和含量都最小化。與健康問題相比的次要考慮是為了穩定水性蛋白溶液必須加入的化學穩定劑的成本。因此，很清楚的是，需要不使用化學穩定劑來使水性蛋白溶液對抗外源脅迫而穩定的方法。對於該目的，本申請人發現，使用包括將所述水性蛋白溶液填裝入容器中，以使得容器在封閉時基本沒有氣體頂部空間的步驟的方法，令人吃驚地能夠在不使用穩定劑的條件下使水性蛋白溶液對抗外源脅迫(例如機械脅迫)而穩定。考慮到克服了通常存在的技術偏見，該發現甚至更加令人吃驚。事實上，本發明的方法克服了公知的技術偏見，即必須使用化學穩定劑來使水性蛋白溶液對抗外源脅迫而得到穩定。圖1顯示了根據本發明的方法可在水溶液中被穩定的AP抗體的糖基化位點。圖2顯示了10mg/ml抗體(MabA)製劑於5°C在振蕩脅迫下在6ml瓶中隨時間進程的情況，其中使用3種填裝體積(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，並且有不同的PS20的量(畫0%;□0.0025%;▲0.005%;△0.01%)，這是通過可見的顆粒計數、濁度和可溶的聚集產物來分析的。圖3顯示了10mg/ml抗體(MabA)製劑於25°C在振蕩脅迫下在6ml瓶中隨時間進程的情況，其中使用3種填裝體積(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，並且有不同的PS20的量(國0%;□0.0025%;▲0.005%;△0.01%)，這是通過可見的顆粒計數、濁度和可溶的聚集產物來分析的。圖4顯示了10mg/ml抗體(MabA)製劑於5°C在振蕩脅迫下在6ml瓶中隨時間進程的情況，其中使用3種填裝體積(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml,並且有不同的PS20的量(謹0%;□0.0025%;▲0.005o/o;△0.01%)，這是通過對每ml中^2pm、^10jim和^25^mi的鏡檢可見的(sub-visible)顆粒來分析的。圖5顯示了10mg/ml抗體(MabA)製劑於25。C在振蕩脅迫下在6ml瓶中隨時間進程的情況，其中使用3種填裝體積(A)2.5ml(B)5.3ml(C)9.0ml，並且有不同的PS20的量(隱0%;□0.0025%;▲0.005%;厶0.01%)，這是通過對每ml中^2^im、210pm和^25jim的鏡檢可見的顆粒來分析的。圖6顯示了兩種10mg/ml的抗體MabA■和MabB0在(A)非脅迫條件下和25°C振蕩脅迫72小時條件下的聚集物形成，其在6ml瓶中使用3種填裝體積(B)2.5ml(C)5.3ml(D)9.0ml，並且有不同的PS20的量(0%;0.0025%;0.005%)，這是通過可見的顆粒計數、濁度和可溶的聚集產物來分析的。圖7顯示了兩種10mg/ml的抗體MabA■和MabB0在(A)非脅迫條件下和25。C振蕩脅迫72小時條件下的聚集物形成，其在6ml瓶中使用3種填裝體積(B)2.5ml(C)5.3ml(D)9.0ml,並且有不同的PS20的量(0%;0.0025%;0.005%)，這是通過對每ml中^2jim、SlOpm和^25pm的鏡檢可見的顆粒來分析的。圖8和9顯示了外源脅迫(此處是機械脅迫)之後填裝有水性蛋白溶液的容器(此處是可藥用的瓶)的照片。左側顯示了與現有技術類似的在封閉時具有氣體頂部空間的含有蛋白溶液的容器。右側顯示了根據本發明方法的在封閉時基本沒有氣體頂部空間的含有蛋白溶液的容器。術語"穩定"是指用下文實施例中描述的相應試驗進行測量時，水性蛋白溶液基本上不含顯著量的聚集物和/或渾濁和/或鏡檢可見的顆粒和/或可見的顆粒。"外源脅迫，，這種表述指通過外源作用誘導的對水性蛋白溶液的脅迫。外源作用指來自包含容器和水性蛋白溶液的系統之外的作用。外源脅迫的一種例子是機械脅迫。機械脅迫的一種例子是振蕩。在製藥工業中的振蕩可偶然發生(例如在運輸期間)或主動發生(例如用於勻化溶液)。術語"容器"指可藥用容器。合適的容器包含與開關裝置相連的容納器(recipieiit)部分。優選地，容器由與開關裝置相連的容納器構成，例如常規的帶有封閉蓋子的可藥用瓶、預裝填的注射器、膠嚢或安瓿。進一步更優選地，容器是帶有封閉蓋子的常規可藥用瓶。容器可裝有密封關閉裝置，例如，對瓶起密封關閉作用的蓋子，防止周圍外界大氣進入水性蛋白溶液。"水性蛋白溶液"這種表述指含有蛋白的水性溶液。蛋白質濃度可以是0.01-280mg/mL。"在封閉時基本沒有氣體頂部空間"這種表述表示用水性蛋白溶液填裝容器的本領域技術人員將容器填裝至該容器的最大體積，所述最大體積是通過例如目測或者通過計算預先確定的。這可通過例如用水性蛋白溶液將容器填裝至容器的最大可能體積來實現，測量的精密度通過對所述溶液在最大體積時形成的凹液面在實驗室目測確定，或通過對容器稱重而從重量上測定，或者使用本領域已知的標準設備通過體積測定，其通常是製藥工業在規^莫生產時的所用方法。填裝體積表示仍舊足以使容器關閉而不會溢出。因此，術語"基本"在與"在封閉時基本沒有氣體頂部空間"這種表述一起使用時表示目測的、採用重量或體積測定的最大體積和/或沒有氣體頂部空間的精確度，其取決於目測時操作填裝者的精確度或者在採用重量或體積測定時所用設備的精確度。術語"通常可藥用的賦形劑"是指施用給人類或動物的市售產品或其它研發產品中已經含有的賦形劑。該術語包含下列類別的賦形劑緩沖劑(包括檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽、組氨酸、甘氨酸、精氨酸緩衝液)、胺基酸(包括精氨酸、甘氨酸、賴氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、糖或糖醇(包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇)、表面活性劑(包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、十二烷基硫酸鈉、TritonX)和其它賦形劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、環糊精、聚乙二醇)，等等。術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"在本文中使用時指單種胺基酸組成的抗體分子的製備物。因此，術語"人單克隆抗體"指顯示出單種結合特異性的抗體，其具有源於人類種系的免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。在一種實施方式中，人單克隆抗體通過雜交瘤產生，所述雜交瘤包括與永生化細胞融合的B細胞，該B細胞來自於轉基因的非人動物(例如轉基因小鼠)，具有包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。抗體分子作為蛋白質藥物類的一部分，非常易於物理和化學降解，例如變性和聚集、脫醯胺、氧化和水解。蛋白質穩定性受蛋白自身特性(例如胺基酸序列)影響和外界影響(例如溫度、溶劑pH、賦形劑、界面、振蕩或剪切率)的影響。因此，確定最佳的製劑條件以保護蛋白質在生產、貯藏和給藥過程中避免降解反應是很重要的。術語"抗IGF-1R人單克隆抗體，，或"huMAbIGF-IR"是指在WO2005/005635中所述的和要求保護的抗體，該文獻的內容、尤其是權利要求引入本文作為參考。"Ap"指能夠特異性結合澱粉樣蛋白-p肽的Ap抗體(或其混合物)。特異性結合Ap的抗體是本領域已知的。能用於本發明的製劑中的A卩抗體的具體例子已在公開的PCT專利申請WO03/070760中、尤其是權利要求中被描述過，該文獻的內容通過引用併入本文。澱粉樣蛋白-P肽也被稱為"p澱粉樣蛋白"、"Ap"、"A卩4"或"p-A4"，特別是在本發明的上下文中被稱為"AjT，是與形成澱粉樣病變的疾病例如阿爾茨海默症有關的細胞外神經斑的主要組分；參見，Sdkoe(1994)，Ann.Rev.CellBiol.10，373-403，Koo(1999)，PNASVol.96，pp.9989-99卯，US4，666，829或Glenner(1984),BBRC12，1131。該卩澱粉樣蛋白源於"阿爾茨海默前體蛋白/p-澱粉樣蛋白前體蛋白"(APP)。APP是整合膜糖蛋白(見Sisodia(1992)，PNASVol.89，pp.6075)，其內的A(5序列,皮一種質膜蛋白酶a-分泌酶進行內源性蛋白酶切除(見Sisodia(1992)，如上述文獻)。而且，其它一些分泌酶活性，特別是p-分泌酶和，分泌酶活性導致了包含39個胺基酸(A卩39)、40個胺基酸(AP40)、42個胺基酸(A^42)或43個胺基酸(A卩43)的p澱粉樣蛋白(AP)的細胞外釋放；見Sinha(1999)，PNAS96，11094-1053;Price(1998)，Science282，1078-1083;WO00/72880或Hardy(1997)，TINS20，154。A卩具有幾種天然存在的形式，其中人的形式被稱為上述的AP39、A卩40、AP41、Ap42和Ap43。最主要的形式AP42具有下述胺基酸序列(從N-末端開始)在A卩41、Ap40、AP39中，分別丟失了C-末端的胺基酸A、IA和VIA。在AP43形式中，在上述序列(SEQIDNO:3)的C-末端包含額外的蘇氨酸殘基。合適的Ap抗體是免疫球蛋白分子，例如IgG分子。IgG特徵在於包含兩條重鏈和兩條輕鏈(如圖1所示)，這些分子包含兩個抗原結合位點。所述抗原結合位點包含由重鏈的部分(VH)和輕鏈的部分(VL)構成的"可變區"。抗原結合位點通過VH和VL結構域並列形成。關於抗體分子或免疫球蛋白分子的一般信息，還可參見常用教科書，例如Abbas"CellularandMolecularImmunology",W.B.SoundersCompany(2003)。在一種實施方式中，本發明的水性蛋白溶液中存在的蛋白是Ap抗體(或此類抗體的混合物)，其中所述抗體的重鏈中至少一個可變區包含N-糖基化。重鏈的可變區(VH)中糖基化的天冬醯胺(Asn)可以處於互補性決定區域2(CDR2區域)中，所述糖基化的天冬醯胺(Asn)可處於SEQIDNO:1所示的重鏈可變區(VH)的第52位上。術語"單糖基化抗體"指在羊個抗體分子的一個(Vh)區域中包含N-糖基化的抗體分子；也見圖1。術語"雙糖基化抗體"定義了在重鏈的兩個可變區都被N-糖基化的抗體分子(圖1)。在兩個重鏈(VH)結構域上都沒有N-糖基化的抗體分子被稱為"非糖基化抗體"(圖1)。單糖基化抗體、雙糖基化抗體和非糖基化抗體可包含相同的胺基酸序列或不同的胺基酸序列。單糖基化抗體和雙糖基化抗體在本文中被稱為"糖基化抗體亞型"。經純化的抗體分子其特徵為至少一個抗原結合位點包含在重鏈可變區(VH)中的糖基化，是指單糖基化抗體，其不含選自雙糖基化抗體和非糖基化抗體的亞型或者僅含有非常低的量，即"經純化的單糖基化抗體"。本發明含有非常低的量，即"經純化的雙糖基化抗體"。根據本發明方法的水性蛋白溶液中的蛋白質可以是單糖基化或雙糖基化或非糖基化的抗體，或其被具體定義的混合物。本文提供的抗體混合物或抗體庫可以包含50%的如本文所述的單糖基化抗體和50%的雙糖基化抗體。但是，30/70至70/30的比例也是本發明所包括的。並且，本領域技術人員知道，本發明的抗體混合物也包括其它比例。例如，10/卯或90/10、20/80或80/20以及40/60或60/40的比例也可用於本發明的範圍。本發明體，其特別有用的比例是40/60至45/55。術語"不含或僅含有非常低的量"是指完全不存在各種其它(糖基化)亞型，或其它(糖基化)亞型以至多10%,例如至多5%，例如至多4%，例如至多3%，例如至多2%，例如至多1%，例如至多0.5%,例如至多0.3%,例如至多0.2%的濃度存在。術語"抗體"在本文中使用時與術語"抗體分子"同義，其在本發明的範疇中包括抗體分子，例如完整的免疫球蛋白分子，例如IgMs、IgDs、IgEs、IgAs或IgGs(例如IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3或IgG4)以及此類免疫球蛋白分子的部分，例如Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、嵌合F(ab)2或嵌合Fab，片段、嵌合Fab片段或經分離的VH區域或CDR區域(所述經分離的VH區域或CDR區域是例如被整合或加工在相應的"框架"中)。因此，術語"抗體，，還包含免疫球蛋白的已知亞型和修飾物，例如單鏈抗體或單鏈Fv片段(scAB/scFv)或雙特異性抗體構建體，所述亞型和修飾物的特徵在於包含至少一個本文所定義的糖基化的VH區域。此類亞型或寸務飾物的一個具體例子可以是VH-VL或VL-VH形式的sc(單鏈)抗體，其中所述VH包含本文所述的糖基化。雙特異性的scFv也包括在本文內，例如VH-VL-VH-VL、VL-VH-VH-VL、VH-VL-VL-VH形式。術語"抗體"還包括雙抗體和包含與至少一個抗原結合部位/肽連接的作為載體的抗體Fc結構域的分子，例如WO00/24782所述的肽抗體。從上文明顯可知，用於本發明方法中的水性蛋白溶液還包括含有抗體/抗體分子的混合物的水性Ap抗體溶液。所述抗體的一種具體"混合物"是上文所述的，即，抗A卩的"單"和"雙，，糖基化抗體的混合物。"抗體片段"還包括本身不能提供效應物功能(ADCC/CDC),但在與合適的抗體恆定結構域組合後能以本發明的方式提供該功能的此類片段。Ap抗體可用作為本發明方法中的水性蛋白溶液中的蛋白質，其包括重組產生的Ap抗體。這些抗體可在哺乳動物細胞培養系統，例如CHO細胞中產生。此類哺乳動物細胞培養系統特別是用於製備AP抗體或糖基化的AP抗體/抗體分子，如本文具體例舉的在可變區包含N-糖基化的Ap抗體。抗體分子還可通過系列的色鐠或過濾步驟來純化，例如按照下文所述純化特異性的糖基化抗體亞型。術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"在本文中使用時指單種胺基酸組成的抗體分子的製備物。因此，術語"人單克隆抗體"指顯示出單種結合特異性的抗體，其具有源於人類種系的免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。在一種實施方式中，人單克隆抗體通過雜交瘤產生，所述雜交瘤包括與永生化細胞融合的B細胞，該B細胞來自於轉基因的非人動物(例如轉基因小鼠)，具有包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。A卩抗體可包含或具有如SEQIDNO:l定義的可變區:NGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKAKGQPREPQVY丁LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:1)該序列也在下文中闡述，其中指出了CDR、CH區域、重區域以及兩個N-糖基化位點(Asn52和Asn306):QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSR皿Q-G股墜.SYM邸AL朋HYT.Q.跳區巡.(SEQIDNO:1)力口框CDRl、2、3下劃線:cm鉸鏈雙下劃線:CH2處煞.下.M終.CH3粗體N:N-連接的糖基化位點本文所述的包含SEQIDNO:1的示例性A卩抗體還可包含輕鏈，所述輕鏈可包含或具有下述胺基酸序列TGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQ簡MPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTENO:2)術語"AP抗體A"在本文中使用時指包含如SEQIDNO:1所定義的重鏈和如SEQIDNO:2所定義的輕鏈的A卩抗體。術語"單糖基化抗體，，在本文中使用時指在單個抗體分子(例如免疫球蛋白，例如IgG，例如IgGl)的一個(VH)區域中包含N-糖基化的抗體分子。例如，所述"單糖基化形式"包含在重鏈的一個可變區上的糖基化，例如在本文所述的"AP抗體A"的天冬醯胺位置"Asn52"上。如本文所述，該"單糖基化的IgGl形式或單糖基化的亞型，，還可包括在Fc部分的高度保守的糖基化位點中的糖基化，例如在本文示例的"A卩抗體A"的非可變Fc部分中的天冬醯胺Asn306。在本發明的含義中，術語"雙糖基化抗體，，包含如本文定義的在重鏈(VH)區域的兩個可變區上的糖基化。該"M基化形式"還包含在兩條重鏈的可變區上的糖基化，例如，在本文所述的"AP抗體A"的天冬醯胺位置"Asn52"上。該"雙糖基化的IgGl形式或雙糖基化的亞型"還可包括如本文所述在非可變/恆定的Fc部分中高度保守的糖基化位點上的糖基化，特別是在示例的"A卩抗體A"的第306位上。所附的圖l說明了相應的抗體分子。在可變區(例如重鏈的兩個可變區(兩個(VH)區域))沒有此類翻譯後修飾的抗體在本發明範疇內被視為"非糖基化形式"，包括在重鏈的可變區沒有糖基化的。但是，該"非糖基化形式"可在抗體的恆定區(C-區域)包含糖基化，例如，最常見是在Fc部分的高度保守的糖基化位點上，特別是本文所定義的非可變/恆定的Fc部分的天冬醯胺(Asn)306上；也參見SEQIDNO:1。本發明方法中的水性蛋白溶液中的蛋白質可以是上文所定義的示例性的"AP抗體A，，。因此，所述蛋白質可以是A卩抗體A，其包含如上文所定義的單糖基化Ap抗體A或雙糖基化Ap抗體A或非糖基化A卩抗體A，或它們的混合物。對重組表達的Ap抗體分子的糖基化亞型的純化包括下述步驟(1)蛋白A柱純化；(2)離子交換柱純化，例如陽離子交換色鐠；以及任選地，(3)尺寸排阻柱純化。純化方案還可包含其它步驟，例如進一步的濃縮步驟(例如滲濾)或分析步驟(例如包括分析柱)。還可釆取重複某些特定步驟(例如，可進行兩次離子交換色譜步驟)或者省略某些步驟(例如尺寸排阻色語法)。蛋白A是與大多數IgGl的同種型的Fc區域結合的基團特異性配體。其由一些金黃色葡萄球菌菌抹合成，並可從中加以分離，將其與色語粒偶聯。也可從商業上獲得一些類型的凝膠製備物。可使用的蛋白A柱的例子是MabSelect(商標)柱。理想地，用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA對柱加以平衡，將細胞培養物上清液上樣到柱上，用lMTris/HClpH7.2洗柱，使用100mM乙酸在pH3.2時洗脫抗體。陽離子交換色譜利用了固定相中帶正電荷的基團和移動相中樣品之間的相互作用。當使用弱陽離子交換劑(例如CMToyopearl650⑧)時，進行下述色譜步驟用100mM乙酸pH4預平衡、將蛋白A洗脫液上樣和用100mM乙酸pH4洗柱後，通過應用250mM乙酸鈉(pH7.8-8.5)和500mM乙酸鈉(口117.8-8.5)的步驟洗脫抗體和分級分離。採用第一個步驟，通常洗脫出雙糖基化亞型流分和單糖基化亞型流分的混合物，使用第二個步驟通常洗脫出非糖基化亞型流分。可通過鹽步驟從強陽離子交換劑(例如SPToyopearl650)洗脫出抗體用50mM乙酸pH5.0對柱加以平衡、將pH4的蛋白A洗脫液上樣後，使用50mM乙酸和210mM氯化鈉進行第一個洗脫步驟。然後，用50mM乙酸和350mM氯化鈉進行第二個洗脫步驟。通過第一個鹽步驟，通常洗脫出雙糖基化亞型流分和單糖基化亞型流分的混合物，第二個鹽步驟通常洗脫出非糖基化亞型。此外，還可通過鹽梯度從強陽離子交換柱(例如SP-Sepharose⑧)洗脫出抗體在pH4.5下對柱預平衡、上樣和洗滌之後，應用從50mMMESpH5.8至50mMMES/1M氯化鈉pH5.8的鹽梯度。此時，通常分別洗脫出雙糖基化亞型、單糖基化亞型和非糖基化亞型的流分。隨後，雙糖基化亞型和單糖基化亞型流分可以合併，以得到產品庫和/或所需的抗體混合物。雙糖基化和單糖基化的抗體分子(例如免疫球蛋白)的混合物可通過尺寸排阻色譜法進行進一步純化。可用的柱的例子是Superdex200⑥柱。操作緩沖液的例子包括組氨^/氯化鈉，例如10mM組氨^/125mM氯化鈉/pH6，和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。以流穿模式進行陰離子交換色譜、隨後進行濃縮/透析是一種備選的純化步驟。QSepharose⑧是陰離子交換步驟的樹脂的一個例子。例如，可用37.5mMTris/HClpH7.9對來自SP色鐠的洗出液進行三倍稀釋，並使其通過預先用25mMTris/83mM乙酸鈉平衡過的Q-Sepharose柱。收集流穿液體，將其調節至pH5.5，並用例如Hydrosart30kD⑧膜通過超濾濃縮。隨後，濃縮物可在例如10倍體積的20mM組氨^7HC1pH5.5中透析。如上文所定義的，抗體亞型還可包含處於抗體分子的恆定/非可變部分的其它糖基化，例如在IgG的Fc部分，例如在IgGl的Fc部分中。Fc部分中的所述糖基化涉及高度保守的糖基化，其特徵是位於重鏈的Asn306位置上(例如，4艮據本文定義的SEQIDNO:1的重鏈)。本發明的製劑中所包含的抗體的IgG-Fc區域可以是同源二聚體，其包含鏈間二硫鍵連接的鉸鏈區、糖基化的CH2結構域(其在CH2的天冬醯胺306(Asn-306)處帶有N-連接的寡糖)和非共價配對的CH3結構域。Asn-306上糖基化的寡糖是複合雙觸角(biantennary)型的，可包含核心的庚糖結構，並具有可變添加的外臂糖。寡糖影響或決定了Fc結構和功能(Jefferis(1998)ImmunolRev.163，50-76)。效應物的功能(編號為具體的特異性的IgG-Fc/效應物配體作用)已被討論過(Jefferis(2002)ImmunolLett.82(1-2)，57-65和Krapp(2003)JMolBiol.325(5)，979-89)。該保守的Fc位置Asn306對應於Kabat系統中的"Asn297"(Kabat(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD.)。"穩定劑"這種表述是指能使水性蛋白溶液對抗機械脅迫而化學穩定的可藥用穩定劑。此類穩定劑的例子是表面活性劑，例如Tween20、Tween80、Tween40、Tween60、泊洛沙姆、SDS或TritonX或任何其它兩親的分子，或它們的混合物。表面活性劑在水性溶液中的作用已被廣泛描述過，它是本領域技術人員公知的。"注射裝置"這種表述指可藥用的注射裝置。此類裝置的一個例子是注射器。如上文所述，申請人已發現了使水性蛋白溶液對抗機械脅迫而穩定的方法，所述方法包括下述步驟將所述水性蛋白溶液填裝進容器，從而使得所述容器在封閉時基本沒有氣體頂部空間。在才艮據本發明的方法的任何實施方式中，可通過例如目測、採用重量或體積方法對沒有氣體頂部空間加以預先測定。在根據本發明的方法的任何實施方式中，容器可被填裝至超過容器總體積的約97%。在才艮據本發明的方法的任何實施方式中，氣體頂部空間可佔容器總體積的少於約3%，優選少於2%，更優選少於1%。在根據本發明的方法的任何實施方式中，蛋白質可以是抗體，特別是單克隆抗體，例如選自IgGl或IgG2和IgG4，優選地選自針對至少一種下述耙點的有效的單克隆抗體IGF-1R、CD20、CD19、CCR5、澱粉樣蛋白、0X40、EGF受體、VEGF、HER、IL1R、IL13、IL6、IL17或P-選擇素。抗體還可選自本々頁域已知的和以Actemra、Avastin或Herceptin的名稱公開的那些抗體。衝艮據本發明的方法還可通過下述事實來表徵水性蛋白溶液中沒有用於對抗外源脅迫(特別是機械脅迫)的穩定劑。在根據本發明的方法的任何實施方式中，機械脅迫可以是振蕩。機械脅迫通常在約0。C至約40。C之間的溫度下發生。在根據本發明的方法中穩定的水性蛋白溶液包含水、蛋白質和其它常規的可藥用賦形劑。根據本發明的方法可通過下述事實來表徵一旦被穩定，在振蕩時水性蛋白溶液基本沒有顯著的混濁和/或聚集物和/或可見的顆粒。在根據本發明的一種特定實施方式中，容器不是注射裝置，例如不是注射器。容器可包含與開關裝置相連的容納器部分。在一種實施方式中，容器由與開關裝置相連的容納器組成，優選與打開和密封關閉裝置相連的容納器。本發明還涉及包含與開關裝置相連的容納器部分的容器用於使水性蛋白溶液對抗4幾械脅迫而穩定的用途。該用途可才艮據上文所述的本發明方法來實現。下述實施例用來闡述本發明，但並非將其限制為本文公開的單獨的實施方式。實施例在下述實施例中，在振蕩脅迫下，在兩種不同溫度、不同填裝體積和不同量的聚山梨酯條件下，研究了兩種單克隆抗體(IgGl)的聚集行為。使用多種分析技術目測、濁度、光遮蔽、尺寸排阻色譜法和動態光散射來在尺寸和數量方面對聚集物形成進行檢測和監測。用尺寸為6ml020mm的玻璃瓶來測定容器體積和表面積，它們進而被用於計算每種填裝體積的氣-液界面程度(通過表面積與體積的比例和頂部空間與體積的比例)。實施例中的所有實驗都在這樣的瓶中進行。從下表1和表2可以看出，填裝體積越小，頂部空體積就越大，這是針對與液體樣品相互作用的氣體體積量的振蕩實驗過程中的重要方面。填裝至最大體積的樣品沒有頂部空間，振蕩期間液體在瓶中的物理運動受到限制。表面積與填裝體積的比例隨著填裝體積的降低而增加，這使振蕩過程中玻璃、表面的接觸更多(表2)。表l:計算出的6ml02Omm瓶的表面積和容器體積tableseeoriginaldocumentpage17表2:計算出的表面積與填裝體積和頂部空間與填裝體積的比例tableseeoriginaldocumentpage17通過在5°C和25°C，在168小時的時期內選定的時間點，對含有0%、0.0025%、0,005%和0.01。/0(w/v)的PS20的蛋白製劑隨時間進程的情況加以觀察，在用橡皮塞和密封鋁箔封閉的額定6ml體積的瓶中進行不同填裝體積(2.5ml、5.3ml和9ml)的振蕩研究。進行該研究是為了評估振蕩期間頂部空間對蛋白質穩定性的影響，這是由於蛋白質所暴露的氣-液或液-玻璃界面是基於樣品瓶中存在的氣-液的體積。PS20對蛋白質對抗這些界面以及由此抵抗振蕩期間的變性和聚集而加以保護的程度也被評估。圖2-9中概括了由于振蕩脅迫所致的渾濁、可見的顆粒計數、鏡檢可見的顆粒和可溶的聚集產物的結果。從上述結果(圖2-9)可以看出，瓶中存在頂部空間對在5°C和25°C下受到振蕩脅迫的抗體製劑穩定性都有很大影響。處於"最大"填裝體積的所有製劑(圖2-5的C欄和圖6-7的D欄)以及作為對照的安慰劑(數據未顯示)保持穩定，受脅迫的樣品表現出與未受脅迫的樣品相當的結果。填裝至最大體積的樣品沒有顯著的頂部空間(少於3%的頂部空間體積)，因此液體在瓶內的運動被限制，沒有觀察到對蛋白的損害。與市面上的常規藥物產品中所用的一樣，具有"標準"的頂部空間時，液體樣品在振蕩過程中具有在瓶內旋轉和潑濺的能力，這導致氣-液相互作用，從而使得蛋白不穩定。所有樣品的液體以同樣的方式移動，每種製劑都具有1.1158±0.002mPa.s的動力學粘度。在有和無頂部空間時，振蕩時蛋白穩定性之間的差別明顯，而在具有體積為2.51111或5.31111的頂部空間的樣品之間，振蕩時沒有觀察到顯著差別。在兩個溫度下針對可見的顆粒計數、濁度和鏡檢可見的顆粒計數進行分析時，即使少到只存在0.0025%的PS20對空瓶和額定填裝量(圖2-5,A和B欄；圖6-7，B和C欄)中的蛋白質也提供了與不含PS並且填裝至最大量的樣品(圖2-5，C欄；圖6-7，D欄)相似的保護。但是，通過SEC分析，發現對於聚集產物的抑制，儘管0.0025%的PS20在5。C下足以防止MabA的可溶聚集物形成(圖2，最下面一行)，但在25。C振蕩條件下還需要顯著更高的量(0.01。/。PS20)(圖3,最下面一行)。因此，振蕩脅迫對形成可溶聚集物的負面影響在25°C時要比在5°C時明顯得多，尤其是對於有頂部空間(2.5ml和5.3ml)的樣品來說。但是，在整個研究中，在5。C、0。/。PS20下，具有2.5ml填裝體積的樣品的渾濁導致比25°C下高得多的FTU值。這種渾濁結果與對MabA同一樣品的鏡檢可見的顆粒計數和可溶聚集物分析所得的數據並不對應。渾濁被描述為由於各種大小的鏡檢可見的顆粒散射和吸收了決定液體光學性質的光，導致溶液混濁或模糊。具有5.3ml額定填裝體積MabA和B樣品(圖3B，6C和7C)顯示出隨著PS20含量的增加，可溶聚集物和鏡檢可見的顆粒預期的減少趨勢。在2.5ml的MabA填裝體積下也觀察到了可溶聚集物形成對PS20濃度的強烈依賴性(圖3A，最下面一行)，但是有趣的是，與5.3加1填裝體積的樣品相反，0.0025%PS20的製劑導致了比0%PS20更大量的聚集物。總之，數據顯示，在配製期間填裝至"最大量"的振蕩樣品(即，頂部空間最小化)表現為不需要PS來抑制顆粒或聚集物形成(圖2-5,C欄；圖6-7,D欄)，然而，具有常規頂部空間的樣品如果受到脅迫，則需要PS作為穩定劑。所有在玻璃瓶中的市售液體蛋白製劑都有頂部空間(預裝填的注射器除外)。目前對於含有蛋白溶液的瓶子所必需的頂部空間體積還沒有任何指導或說明。對於商業產品而言，沒有頂部空間或僅有最小頂部空間的填裝(被定義為封閉的填裝體積的97%)對生物醫藥產品的穩定性有很大價值，使得蛋白溶液中所需的穩定劑最小化。缺少PS20會導致鏡檢可見的顆粒數量很多，而這一點卻通過在同樣製劑中不含頂部空間而被完全抑制。另一點是在分析聚集物時正交方法的重要性。如本文中，僅僅基於濁度分析的製劑穩定性表明，0.0025%的PS20足以在25。C振蕩期間保護蛋白質，但是與之相反，考慮到SEC數據時必須採用高於0.005%的PS20。數據顯示，當受到振蕩脅迫時，瓶中頂部空間的存在對蛋白製劑的穩定性有很大影響。填裝至最大體積的樣品沒有顯著的頂部空間，因此，在振蕩期間液體在瓶中的運動受到限制，沒有觀察到對蛋白的損害。在不含PS20的製劑中除去頂部空間所產生的在振蕩時的保護性能，與存在0.70cm3/cm3和2.61cm3/cm3的頂部空間與體積比例的含有0.0025%PS20的製劑相似，而在0.70cm3/cm3和2.61cm3/cm3這兩種體積比例之間沒有觀察到顯著差別。權利要求1.使水性蛋白溶液對抗外源脅迫而穩定的方法，所述方法包括下述步驟將所述水性蛋白溶液填裝進容器，以使所述容器在封閉時基本沒有氣體頂部空間。2.權利要求l所述的方法，其中通過目測、重量或體積方法對沒有氣體頂部空間加以預先確定。3.權利要求1或2中任意一項所述的方法，其中所述容器被填裝至超過所述容器總體積的約97%。4.權利要求1至3中任意一項所述的方法，其中所述氣體頂部空間佔所述容器總體積的少於約3%。5.權利要求1至4中任意一項所述的方法，其中所述氣體頂部空間佔所述容器總體積的少於約2%。6.權利要求1至5中任意一項所述的方法，其中所述氣體頂部空間佔所述容器總體積的少於約1%。7.權利要求1至6中任意一項所述的方法，其中所述蛋白是抗體。8.權利要求1至7中任意一項所述的方法，其中所述蛋白是單克隆抗體。9.權利要求8所述的方法，其中所述單克隆抗體是IgGl或IgG2或IgG4。10.權利要求9所述的方法，其中所述單克隆抗體針對至少一種下述把點GF-1R、CD20、CD19、CCR5、澱粉樣蛋白、0X40、EGF受體、VEGF、HER、IL1R、IL13、IL6、IL17或P-選擇素。11.權利要求10所述的方法，其中所述單克隆抗體選自Actemra、Avastin或Herceptin。12.權利要求l至ll中任意一項所述的方法，其中所述水性蛋白溶液不含對抗外源脅迫的穩定劑。13.權利要求12所述的方法，其中所述外源脅迫是機械脅迫。14.權利要求13所述的方法，其中所述機械脅迫是振蕩。15.權利要求1至14中任意一項所述的方法，其中所述外源脅迫發生在0-40。C的溫度下。16.權利要求1至15中任意一項所述的方法，其中所述水性蛋白溶液包含水和蛋白。17.權利要求1至15中任意一項所述的方法，其中所述水性蛋白溶液還包含可藥用的賦形劑。18.權利要求1至17中任意一項所述的方法，其中所述水性蛋白溶液在振蕩時基本沒有顯著的渾濁和/或聚集物和/或可見的顆粒。19.權利要求1至18中任意一項所述的方法，其中所述容器不是注射裝置。20.權利要求1至19中任意一項所述的方法，其中所述容器不是注射器。21.權利要求1至20中任意一項所述的方法，其中所述容器包含與開關裝置相連的容納器部分。22.權利要求1至21中任意一項所述的方法，其中所述容器由與開關裝置相連的容納器構成。23.權利要求1至22中任意一項所述的方法，其中所述容器由與打開和密封關閉裝置相連的容納器構成。24.包含與開關裝置相連的容納器部分的容器用於使水性蛋白溶液對抗外源脅迫而穩定的用途。25.權利要求24所述的用途，其中所述外源脅迫是機械脅迫。26.權利要求25所述的用途，其中所述機械脅迫是振蕩。27.權利要求24至26中任意一項所迷的用途，其用於權利要求1至25中^壬意一項所述的方法中。28.如上所述的本發明。全文摘要本發明涉及使水性蛋白溶液對抗外源脅迫而穩定的方法，該方法包括將所述溶液填裝進容器以使所述容器在封閉時基本沒有氣體頂部空間的步驟。還提供了容器用於穩定水性蛋白溶液的用途。文檔編號A61K39/395GK101674847SQ200880014420公開日2010年3月17日申請日期2008年4月22日優先權日2007年5月2日發明者A·帕彭博格,H-C·馬勒,S·基澤,W·弗裡斯申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司