體外抑制人TNFα活性的方法

2023-11-10 05:31:17

專利名稱：體外抑制人TNFα活性的方法
本申請是申請日為1997年2月10日，申請號為97193635.8，發明名稱為「結合人TNFα的人抗體」的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
腫瘤壞死因子α(TNFα)是由許多細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞)產生的細胞因子，其原始鑑定是基於其誘導某些小鼠腫瘤壞死的能力(參見例如Old，L.(1985)Science230630-632)。隨後，一個與惡病質相關的名稱為惡病質素的因子表明是與TNFα相同的分子。據信TNFα參與介導休克(參見例如Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev.Biochem.57505-518；Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev.Immunol.7625-655)。另外，據信TNFα參與各種各樣的其它人類疾病和紊亂的病理生理學，包括膿毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(參見例如Moeller，A.等(1990)Cytokine2162-169；Moeller等的美國專利5,231,024號；Moeller，A.等的歐洲專利公開260 610 B1號，Vasilli，P.(1992)Annu.Rev.Immunol.10411-452；Tracey，K.J.和Cerami，A.(1994)Annu.Rev.Med.45491-503)。
由於人TNFα(hTNFα)在各種各樣的人體紊亂中的有害作用，已設計治療策略以抑制或抵消hTNFα的活性。特別是，已尋找與hTNFα結合或中和hTNFα的抗體做為抑制hTNFα活性的手段。一些最早的這種抗體是由用hTNFα免疫的小鼠的淋巴細胞製備的雜交瘤分泌的小鼠單克隆抗體(mAbs)(參見例如Hahn T；等，(1985)Proc Natl Acad SciUSA823814-3818；Liang，C-M.等(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137847-854；Hirai，M.等(1987)J.Immunol.Methods9657-62；Fendly，B.M.等(1987)Hybridoma6359-370；Moeller，A.等(1990)Cytokine2162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024號；Wallach，D.的歐洲專利公開186 833 B1號；Old等的歐洲專利申請公開218 868A1號；Moeller，A.等的歐洲專利公開260 610 B1號)。雖然這些小鼠抗hTNFα抗體經常展示與hTNFα的高親和力(例如Kd≤10-9M)並能夠中和hTNFα活性，但它們的體內使用受與給與人類小鼠抗體相關的問題所限制，所述問題例如為血清半衰期短、不能觸發某些人體效應物的功能和引出不想要的人體內抗該小鼠抗體的免疫應答(「人抗鼠抗體」(HAMA)反應)。
為試圖克服與在人體內使用全鼠抗體相關的問題，已對鼠抗hTNFα抗體進行遺傳工程使其更「人類化」。例如，已製備嵌合抗體，其中抗體鏈的可變區為鼠源，而抗體鏈的恆定區為人源(Knight，D.M等(1993)Mol.Immunol.301443-1453；Daddona，P.E.等的PCT公開WO92/16553號)。另外，也已製備人化抗體，其中所述抗體可變區的超變域為鼠源，但所述可變區的其餘部分和所述抗體恆定區為人源(Adair，J.R.等的PCT公開WO 92/11383號)。然而，因為這些嵌合抗體和人化抗體仍然保留一些鼠序列，因此它們仍然可能引出不想要的免疫反應，即人抗嵌合抗體(HACA)反應，特別是當長期給藥時，例如用於慢性適應症，例如類風溼性關節炎(參見例如Elliott，M.J.等(1994)Lancet3441125-1127；Elliot，M.J.等(1994)Lancet3441105-1110)。
優於鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗體或人化抗體)的hTNFα抑制劑可以是完全人類抗hTNFα抗體，因為這種藥劑甚至在長期給與時也不會引起該HAMA反應。已使用人類雜交瘤技術製備了抗hTNFα人單克隆自身抗體(Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol.152556-568；Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol.152569-581；Boyle等的歐洲專利申請公開614 984 A2號)。然而，據報導這些雜交瘤來源的單克隆自身抗體對hTNFα的親和性太低，以致於不能用常規方法計算，不能結合可溶性hTNFα並且不能中和hTNFα誘導的細胞毒性(參見Boyle等；見上述)。另外，人雜交瘤技術的成功取決於產生hTNFα特異性自身抗體的淋巴細胞在人外周血中的自然存在。某些研究已在人類對象中檢測到抗hTNFα血清自身抗體(Fomsgaard，A.等(1989)Scand.J.Immunol.30219-223；Bendtzen，K.等(1990)Prog.Leukocyte Biol.10B447-452)，而其它的研究未檢測到(Leusch，H-G.等(1991)J.Immunol.Methods139145-147)。
除自然發生的人抗hTNFα抗體之外的另一選擇是重組hTNFα抗體。已描述了以相對低親和性(即Kd～10-7M)和快解離速率(即Koff～10-2秒-1)結合hTNFα的重組人抗體(Griffiths，A.D.等(1993)EMBO J.12725-734)。然而，由於它們的相對快速解離的動力學，這些抗體可能不適於治療用途。另外，已描述了一種重組人抗hTNFα，它不中和hTNFα活性，卻增強hTNFα與細胞表面的結合併增強hTNFα內在化(Lidbury，A.等(1994)Biotechnol.Ther.527-45；Aston，R.等的PCT公開WO 92/03145號)。
因此，仍然需要以高親和性和慢解離動力學地結合可溶性hTNFα並具有中和hTNFα活性包括hTNFα誘導的細胞毒性(體外和體內)和hTNFα誘導的細胞激活的能力的人抗體，諸如重組人抗體。
發明概要本發明提供特異性與人TNFα結合的人抗體，最好是重組人抗體。本發明抗體的特徵為高親和性和慢解離動力學地與hTNFα結合和中和hTNFα的活性，包括hTNFα誘導的細胞毒性(體外和體內)和hTNFα誘導的細胞激活。本發明抗體的其它特徵為與hTNFα而非hTNFβ(淋巴細胞毒素)結合併具有與除人TNFα之外的其它靈長類TNFα和非靈長類TNFα結合的能力。
本發明的抗體可以是全長的(例如IgG1或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結合部分(例如Fab、F(ab』)2或scFv片段)。本發明最優選的重組抗體D2E7稱為D2E7，有一包含SEQ ID NO3的胺基酸序列的輕鏈CDR3域和一包含SEQ ID NO4的胺基酸序列的重鏈CDR3域。該D2E7抗體最好具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)和包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。
在一個實施方案中，本發明提供分離的人抗體或其抗原結合部分，它以不高於1×10-8M的Kd和不高於1×10-3s-1的Koff速率常數(均由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離，並在標準體外L929檢測中以不高於1×10-7M的IC50中和人TNFα細胞毒性。該分離的人抗體或其抗原結合部分更優選地以不高於5×10-4s-1、甚至更優選地以不高於1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。更優選的是，在標準體外L929檢測中以不高於1×10-8M、甚至更優選地以不高於1×10-9M、甚至再更優選地以不高於5×10-10M的IC50中和人TNFα細胞毒性。
在另一實施例中，本發明提供具有以下特徵的人抗體或其抗原結合部分a)以不高於1×10-3s-1的Koff(由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離；b)具有一輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列，或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的1-5個保守胺基酸置換從SEQ ID ID NO3修飾的胺基酸序列；c)具有一重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列，或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1-5個保守胺基酸置換從SEQ ID NO4修飾的胺基酸序列。
更優選的是，該抗體或其抗原結合部分以不高於5×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。再更優選的是，該抗體或其抗原結合部分以不高於1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。
在再一實施方案中，本發明提供人抗體或其抗原結合部分，其LCVR具有的CDR3域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列、或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO3修飾的胺基酸序列，其HCVR具有的CDR3域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列、或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO4修飾的胺基酸序列。更優選地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO5的胺基酸序列的CDR2域，並且該HCVR另外具有包含SEQ ID NO6的胺基酸序列的CDR2域。再更優選地，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO7的胺基酸序列的CDR1域，並且該HCVR具有包含SEQ ID NO8的胺基酸序列的CDR1域。
在再一實施方案中，本發明提供具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的LCVR和包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的HCVR的分離人抗體或其抗原結合部分。在某些實施方案中，該抗體具有一IgG1重鏈恆定區或一IgG4重鏈恆定區。在其它實施方案中，該抗體是一Fab片段、一F(ab』)2片段或一單鏈Fv片段。
在另一些實施方案中，本發明提供抗體或其抗原結合部分，其LCVR具有選自以下胺基酸序列的一個CDR3域SEQ ID NO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26或其HCVR具有選自以下胺基酸序列的一個CDR3域SEQ ID NO4、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
在再一實施方案中，本發明提供中和人TNFα而非人TNFβ(淋巴細胞毒素)活性的分離人抗體或其抗原結合部分。在一最佳實施方案中，該人抗體或其抗原結合部分中和人TNFα、黑猩猩TNFα和選自以下的至少一種其它的靈長類TNFα的活性狒狒TNFα、狨TNFα、獼猴TNFα和恆河猴TNFα。最好是，該抗體亦中和至少一種非靈長類TNFα的活性。例如，在一分實施方案(subembodiment)中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和犬TNFα的活性。在另一分實施方案中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和豬TNFα的活性。在再一分實施方案中，該分離人抗體或其抗原結合部分亦中和小鼠TNFα的活性。
本發明的另一方面涉及編碼本發明抗體或其抗原結合部分的核酸分子。本發明優選的核酸分子編碼D2E7 LCVR，具有圖7和SEQ IDNO36所示的核苷酸序列。本發明的另一優選核酸分子編碼D2E7HCVR，具有圖8和SEQ ID NO37所示的核苷酸序列。本發明亦包含攜帶本發明抗體編碼核酸的重組表達載體、導入這種載體的宿主細胞，也包括通過培養本發明的宿主細胞製備本發明的抗體的方法。
本發明的再一方面涉及使用本發明的抗體或其抗原結合部分抑制人TNFα活性的方法。在一個實施方案中，該方法包括用本發明的抗體或其抗原結合部分接觸人TNFα，使得抑制人TNFα活性。在另一實施方案中，該方法包括將本發明的抗體或其抗原結合部分給與患病(其中TNFα活性是有害的)的人類受治療者，使得抑制該人類受治療者中的人TNFα活性。該疾病可以是例如膿毒症、自身免疫疾病(例如類風溼性關節炎，變態反應，多發性硬化，自身免疫性糖尿病，自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合症)、傳染性疾病、惡性腫瘤、移植物排斥或移植物抗宿主病、肺功能紊亂、骨疾病、腸功能紊亂或心臟功能紊亂。
附圖簡述

圖1A和1B展示了下述的胺基酸序列D2E7的輕鏈可變區(D2E7 VL；亦示於SEQ ID NO1)、D2E7 VL的丙氨酸掃描突變體(LD2E7*.A1、LD2E7*.A3、LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8)、D2E7相關抗體2SD4的輕鏈可變區(2SD4 VL；亦示於SEQ ID NO9)和其它D2E7相關輕鏈可變區(EP B12、VL10E4、VL100A9、VL100D2、VL10F4、LOE5、VLLOF9、VLLOF10、VLLOG7、VLLOG9、VLLOH1、VLLOH10、VL1B7、VL1C1、VL1C7、VL0.1F4、VL0.1H8、LOE7、LOE7.A和LOE7.T)。圖1A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。圖1B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述輕鏈CDR1(「CDR L1」)、CDR2(「CDR L2」)和CDR3(「CDR L3」)域位於框內。
圖2A和2B展示了下述的胺基酸序列D2E7的重鏈可變區(D2E7 VH；亦示於SEQ ID NO2)、D2E7 VH的丙氨酸掃描突變體(HD2E7*.A1、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和DH2E7*.A9)D2E7相關抗體2SD4的重鏈可變區(2SD4 VH；亦示於SEQ ID NO10)和其它D2E7相關重鏈可變區(VH1B11、VH1D8、VH1A11、VH1B12、VH1-D2、VH1E4、VH1F6、VH1G1、3C-H2、VH1-D2.N和VH1-D2.Y)。圖2A展示所述FR1、CDR1、FR2和CDR2域。圖2B展示所述FR3、CDR3和FR4域。所述重鏈CDR1(「CDR H1」)、CDR2(「CDR H2」)和CDR3(「CDR H3」)域位於框內。
圖3是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK 195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對TNFα誘導的L929細胞毒性的抑制。
圖4是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK 195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對rh TNFα與U-937上的hTNFα受體結合的抑制。
圖5是一曲線圖，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK 195相比，由人抗hTNFα抗體D2E7對TNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上表達的抑制。
圖6是一柱狀圖表，描述與鼠抗hTNFα抗體MAK 195(空心柱)相比，通過給與人抗hTNFα抗體D2E7(實心柱)保護D-半乳糖胺致敏小鼠免受TNFα誘導的致死性。
圖7展示D2E7的輕鏈可變區的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預期的胺基酸序列。在所述CDR L1、CDR L2和CDR L3區下劃線。
圖8展示D2E7的重鏈可變區的核苷酸序列，在該核苷酸序列下是預期的胺基酸序列。在所述CDR H1、CDR H2和CDR H3區下劃線。
圖9是一曲線圖，描述D2E7抗體治療對做為多關節炎模型的Tg197轉基因小鼠平均關節尺寸的影響。
發明詳述本發明涉及以高親和性、低解離速率和高中和能力地與人TNFα結合的分離人抗體或其抗原結合部分。本發明的各個方面涉及抗體和抗體片段以及其藥用組合物、以及製備這種抗體和片段的核酸、重組表達載體和宿主細胞。本發明亦包括用本發明的抗體檢測人TNFα或在體外或體內抑制人TNFα活性。
為更易理解本發明，首先定義某些術語。
本文所用的術語「人TNFα」(本文縮寫為hTNFα或簡單地寫為hTNF)是指以17kD分泌形式和26kD膜結合形式存在的人細胞因子，其生物學活性形式由非共價鍵連接的17kD分子的三聚體組成。hTNFα的結構另外描述於例如Pennica，D.等(1984)Nature312724-729；Davis，J.M.等(1987)Biochemistry261322-1326；和Jones，E.Y.等(1989)Nature338225-228。術語人TNFα包括重組人TNFα(rhTNFα)，它可以通過標準重組表達方法製備或購買得到(RD Systems，目錄號210-TA，Mirmeapolis，MN)。
本文所用的術語「抗體」是指免疫球蛋白分子，它們由四條多肽鏈組成，即由二硫鍵相互連接的二條重鏈(H)和二條輕鏈(L)。每條重鏈由重鏈可變區(本文簡寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區組成。該重鏈恆定區由CH1、CH2和CH3三個結構域組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文簡寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區組成。該輕鏈恆定區由一個結構域即CL組成。VH和VL區可以進一步劃分為超變區，稱為互補性決定區(CDR)，其間散布著更為保守的稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它從氨基末端至羧基末端的排布順序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本文所用的抗體的「抗原結合部分」(或簡稱為「抗體部分」)指保留與抗原(例如hTNFα)特異性結合能力的抗體的一個或多個片段。已發現可以由全長抗體的片段行使抗體的抗原結合功能。在抗體的「抗原結合部分」術語中包括的結合片段的例子包括(i)一個Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；(ii)一個F(ab』)2片段，包含在鉸鏈區由二硫橋連接的二個Fab片段的二價片段；(iii)一個Fd片段，由VH和CH1域組成；(iv)一個Fv片段，由抗體單臂的VL和VH域組成；(v)一個dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)，由一個VH域組成；和(vi)一個分離的互補性決定區(CDR)。另外，儘管該Fv片段的二個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但可以採用重組方法用能使它們成為單蛋白鏈的合成接頭將它們連接，在該單蛋白鏈中所述VL和VH區配對形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體亦包含於術語抗體的「抗原結合部分」之中。亦包括其它形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL域表達於一個多肽單鏈上，但所用的接頭太短使得同一鏈上的這二個結構域不能配對，因此迫使這些結構域與另一鏈的互補結構域配對而創造出二個抗原結合位點(參見例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poliak，R.J.等(1994)Structure21121-1123)。
另外，抗體或其抗原結合部分可以是一個較大的免疫粘附分子的一部分，該分子由該抗體或抗體部分與一個或多個其它蛋白或肽通過共價或非共價結合而形成。這種免疫粘附分子的例子包括用抗生蛋白鏈菌素核心區製備四聚體scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 693-101)和使用半胱氨酸殘基、標記肽和C末端多組氨酸標記製備二價生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。可以採用常規技術例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體，從完整抗體製備諸如Fab和F(ab』)2片段的抗體部分。另外，可以按照本文描述的標準重組DNA技術獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。
本文使用的術語「人抗體」包括具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體例如在CDR中和在CDR3中可以包括未被人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變導入的突變)。然而，本文使用的術語「人抗體」不包括其中CDR序列得自其它哺乳動物種(例如小鼠)並已被移植至人框架序列的抗體。
本文使用的術語「重組人抗體」包括通過重組方法製備、表達、創造或分離的所有人抗體，例如用轉染至宿主細胞的重組表達載體表達的抗體(在以下第II節進一步描述)、從重組、聯合人抗體文庫中分離的抗體(在以下第III節進一步描述)、從用人免疫球蛋白基因轉基因的動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.206287-6295)或通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法製備、表達、創造或分離的抗體。這種重組人抗體具有得自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某些實施方案中，對這種重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變)，因此所述重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是那些雖然得自人種系VH和VL序列並與之相關、但在體內的人抗體種系的所有組成部分中都不天然存在+的序列。
本文使用的「分離抗體」是指大致不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如特異性結合hTNFα的分離抗體大致不含有與hTNFα之外的抗原特異性結合的抗體)。然而，與hTNFα特異性結合的分離抗體具有對其它抗原(例如來自其它種的hTNFα)的交叉反應性(在以下詳細討論)。另外，分離抗體可以大致不含其它細胞物質和/或化學物質。
本文使用的「中和抗體」(或「中和hTNFα活性的抗體」)是指與hTNFα結合導致hTNFα的生物學活性被抑制的抗體。這種對hTNFα生物學活性的抑制可以通過測定hTNFα生物學活性的一個或多個指標進行評價，所述指標例如hTNFα誘導的細胞毒性(或者體外或者體內)、hTNFα誘導的細胞激活和hTNFα與hTNFα受體的結合。可以通過本領域已知的一種或多種標準體外或體內檢測評價這些hTNFα生物學活性指標(參見實施例4)。最好是，通過抑制hTNFα誘導的L929細胞的細胞毒性評價抗體中和hTNFα活性的能力。做為另一個或者二者擇一的hTNFα活性指標，可以評價抗體抑制hTNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上的表達的能力，做為hTNFα誘導的細胞激活的量度。
本文使用的術語「表面等離子體激元共振」是指一光學現象，它允許通過例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)檢測在生物傳感器基質中蛋白質濃度的改變進行實時生物特異性相互作用分析。有關進一步的描述，參見實施例1和J nsson，U.等(1993)Ann.Biol.Clin.5119-26；Jnsson，U.等(1991)Biotechniques11620-627；Johnsson，B.等(1995)J.Mol.Recognit.8125-131；和Johnnson，B.等(1991)Anal.Biochem.198268-277。
本文使用的術語「Koff」是指抗體從所述抗體/抗原複合物解離的解離速率常數。
本文使用的術語「Kd」是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數。
本文使用的術語「核酸分子」包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好是雙鏈DNA。
本文使用的與編碼結合hTNFα的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸有關的術語「分離核酸分子」是指下述核酸分子，其中編碼該抗體或抗體部分的核苷酸序列不含其它編碼與hTNFα之外的抗原結合的抗體或抗體部分的核苷酸序列，所述其它序列可能在人基因組DNA中天然位於該核酸的側翼。因此，例如編碼抗TNFα抗體的VH區的本發明的分離核酸分子不含任何其它編碼與TNFα之外的抗原結合的其它VH區的序列。
本文使用的術語「載體」是指有能力運送與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是「質粒」，是指其中可以連接其它DNA片段的環狀雙鏈DNA環。載體的另一類型是病毒載體，其中在病毒基因組中可以連接其它DNA片段。某些載體能夠在其導入的宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動物載體)可以在導入該宿主細胞時被整合入該宿主細胞的基因組，由此可以與該宿主基因組一起複製。另外，某些載體能夠指導它們可操作地連接的基因的表達。這種載體在本文中稱為「重組表達載體」(或簡稱為「表達載體」)。一般而言，在重組DNA技術中使用的表達載體的常見形式為質粒。在本說明書中，可以將「質粒」和「載體」互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明包括具有相同的功能的其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
本文使用的術語「重組宿主細胞」是指導入了重組表達載體的細胞。應理解這種術語不僅指特定的對象細胞，而且指這種細胞的後代。因為在後續世代中由於或者突變或者環境影響可能發生某些修飾，事實上這種後代可以與親本細胞不同，但卻仍然包含於本文使用的術語「宿主細胞」的範圍之內。
在下面的小節中更詳細地描述本發明的各種方面。
I.與人TNFα結合的人抗體本發明提供以高親和性、低解離速率和高中和能力與人TNFα結合的分離人抗體或其抗原結合部分。本發明的人抗體優選地是重組的、中和人抗TNFα抗體。最優選的本發明重組中和抗體在本文中稱為D2E7並具有圖1A、1B和圖2A、2B分別展示的VL和VH序列(D2E7 VL區的胺基酸序列亦示於SEQ ID NO1；D2E7 VH區的胺基酸序列亦示於SEQ ID NO2)。以下概述了與表現出高親和性和低解離動力學的鼠抗hTNFαMAK 195mAb和另一個與D2E7、2SD4有關的人抗hTNFα抗體相比的D2E7的結合特性
在用幾種體外和體內檢測評價時，該D2E7抗體及其相關抗體亦表現出強大的中和hTNFα活性的能力(參見實施例4)。例如，這些抗體中和hTNFα誘導的L929細胞的細胞毒性的IC50值的範圍為約10-7M至約10-10M。當D2E7以全長IgG1抗體表達時，中和hTNFα誘導的L929細胞的細胞毒性的IC50值的範圍為約1.25×10-10M。另外，當以Fab、F(ab』)2或scFv片段表達該抗體時，保持D2E7的中和能力。D2E7亦抑制通過hTNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上的表達測定的TNFα誘導的細胞激活(IC50＝約1.85×10-10M)和hTNFα與U-937細胞上的hTNFα受體的結合(IC50＝約1.56×10-10M)。關於後者，D2E7抑制hTNFα與p55和p75 hTNFα受體的結合。另外，該抗體抑制hTNFα在小鼠體內誘導的致死性(ED50＝1-2.5μg/小鼠)。
關於D2E7的結合特異性，該抗體與各種形式的人TNFα結合，包括可溶性hTNFα、跨膜hTNFα和結合至細胞受體的hTNFα。D2E7不特異性地與其它細胞因子結合，例如淋巴細胞毒素(TNFβ)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFNγ和TGFβ。然而，D2E7確實表現出對來自其它物種的腫瘤壞死因子的交叉反應性。例如，該抗體以與中和hTNFα大致相同的IC50值中和至少五種靈長類(黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恆河猴)TNFα的活性(參見實施例4，E小節)。D2E7亦中和小鼠TNFα的活性，儘管其效果比中和人TNFα低1000倍(參見實施例4，E小節)。D2E7亦結合犬和豬TNFα。
在一個方面，本發明涉及D2E7抗體和抗體部分、D2E7相關抗體和抗體部分和其它具有與D2E7相同性質(例如以低解離動力學和高中和能力高親和性地與hTNFα結合)的其它人抗體和抗體部分。
在一個實施方案中，本發明提供分離人抗體或其抗原結合部分，它以不高於1×10-8M的Kd和不高於1×10-3s-1的Koff速率常數(均由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離，並在標準體外L929檢測中以不高於1×10-7M的IC50中和人TNFα細胞毒性。該分離人抗體或其抗原結合部分更優選地以不高於5×10-4s-1、甚至更優選地以不高於1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。該分離人抗體或其抗原結合部分更優選地在標準體外L929檢測中以不高於1×10-8M、甚至更優選地以不高於1×10-9M、再更優選地以不高於5×10-10M的IC50中和人TNFα細胞毒性。在一個最佳實施方案中，該抗體是分離人重組抗體或其抗原結合部分。在另一最佳實施方案中，如用標準體外檢測進行TNFα誘導的ELAM-1在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)上表達所評價的，該抗體亦中和TNFα誘導的細胞激活。
可以按照實施例1所述，進行測定Kd和Koff的表面等離子體激元共振分析。在實施例4的A小節中描述了測定IC50值的標準體外L929檢測。在實施例4的C小節中描述了TNFα誘導的ELAM-1在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)上表達的標準體外檢測。符合或預期符合上述動力學和中和標準的重組人抗體的例子包括具有下述[VH/VL]對的抗體，其序列示於圖1A、1B、2A和2B(有關動力學和中和分析亦可參見實施例2、3和4)[D2E7 VH/D2E7 VL]；[HD2E7*.A1/D2E7 VL]，[HD2E7*.A2/D2E7 VL]，[HD2E7*.A3/D2E7 VL]，[HD2E7*.A4/D2E7VL]，[HD2E7*.A5/D2E7 VL]，[HD2E7*.A6/D2E7 VL]，[HD2E7*.A7/D2E7 VL]，[HD2E7*.A8/D2E7 VL]，[HD2E7*.A9/D2E7VL]，[D2E7 VH/LD2E7*.A1]，[D2E7 VH/D2E7*.A4]，[D2E7VH/LD2E7*.A5]，[D2E7 VH/LD2E7*.A7]，[D2E7 VH/LD2E7*.A8]，[HD2E7*.A9/LD2E7*.A1]，[VH1-D2/LOE7]，[VH1-D2.N/LOE7.T]，[VH1-D2.Y/LOE7.A]，[VH1-D2.N/LOE7.A]，[VH1-D2/EP B12]和[3C-H2/LOE7]。
本領域眾所周知抗體重鏈和輕鏈CDR3域在抗體與抗原結合的特異性/親和性方面起重要作用。因此，在另一方面，本發明涉及具有與hTNFα結合的低解離動力學並具有與D2E7的CDR3域在結構上相同或相關的輕鏈和重鏈CDR3域的人抗體。正如實施例3中證明的，D2E7 VL CDR3的位置9可以被Ala或Thr佔據而基本上不影響Koff。因此，D2E7 VL CDR3的共有基序包含以下胺基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO3)。另外，D2E7 VH CDR3的位置12可以被Tyr或Asn佔據而基本上不影響Koff。D2E7 VH CDR3的共有基序包含以下胺基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ ID NO4)。另外，正如在實施例2中證明的，D2E7重鏈和輕鏈的CDR3域可以經受用一個單丙氨酸殘基置換(在該VL CDR3內的1、4、5、7或8位，或在該VH CDR3內的2、3、4、5、6、8、9、10或11位)而基本上不影響該Koff。另外，技術人員會理解，已知D2E7 VL和VH的CDR3域對丙氨酸置換的經受性，則在仍然保持該抗體的低解離速率常數時在所述CDR3域內的其它胺基酸置換也是可能的，特別是用保守胺基酸置換。本文使用的「保守胺基酸置換」是指其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈的胺基酸取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族已在本領域中定義，它們包括鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、無電荷極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。優選在D2E7 VL和/或VH的CDR3域內製造不超過1至5個保守胺基酸置換。更優選在D2E7 VL和/或VH CDR3域內製造不超過1至3個保守胺基酸置換。另外，不應在對與hTNFα結合的關鍵胺基酸位置進行保守胺基酸置換。如實施例3所示，看來該D2E7 VL CDR3的位置2和5以及該D2E7 VH CDR3的位置1和7對與hTNFα相互作用是關鍵的，因此最好不在這些位置進行保守胺基酸置換(儘管在該D2E7 VL CDR3的位置5的丙氨酸置換是可以接受的，如上所述)。
因此，在另一實施方案中，本發明提供具有以下特徵的分離人抗體或其抗原結合部分a)以不高於1×10-3s-1的Koff速率常數(由表面等離子體激元共振測定)與人TNFα解離；b)具有的輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列，或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個保守胺基酸置換從SEQ ID NO3修飾的胺基酸序列。
c)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列，或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個保守胺基酸置換從SEQ ID NO4修飾的胺基酸序列。
更優選地是，該抗體或其抗原結合部分以不高於5×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。甚至更優選地是，該抗體或其抗原結合部分以不高於1×10-4s-1的Koff與人TNFα解離。
在再一實施方案中，本發明提供分離人抗體或其抗原結合部分，其輕鏈可變區(LCVR)具有的CDR3域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列、或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換從SEQ ID NO3修飾的胺基酸序列，其重鏈可變區(HCVR)具有的CDR3域包含SEQID NO4的胺基酸序列、或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換從SEQ ID NO4修飾的胺基酸序列。優選地是，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO5的胺基酸序列的CDR2域(即D2E7 VL CDR2)，並且該HCVR另外具有包含SEQ ID NO6的胺基酸序列的CDR2域(即D2E7 VH CDR2)。甚至更優選地是，該LCVR另外具有包含SEQ ID NO7的胺基酸序列的CDR1域(即D2E7 VLCDR1)，並且該HCVR具有包含SEQ ID NO8的胺基酸序列的CDR1域(即D2E7 VH CDR1)。VL的框架區優選來自VKI人種系家族，更優選來自A20人種系Vk基因，最優選來自示於圖1A和1B的該D2E7 VL框架序列。VH的框架區優選來自VH3人種系家族，更優選來自DP-31人種系VH基因，最優選來自示於圖2A和2B的該D2E7 VH框架序列。
在又一實施方案中，本發明提供具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列(即D2E7 VL)的輕鏈可變區(LCVR)和包含SEQ ID NO2的胺基酸序列(即D2E7 VH)的重鏈可變區(HCVR)的分離人抗體或其抗原結合部分。在某些實施方案中，該抗體包含一重鏈恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。優選地是，該重鏈恆定區是IgG1重鏈恆定區或IgG4重鏈恆定區。另外，該抗體可以包含一輕鏈恆定區，或者κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區。最好是，該抗體包含κ輕鏈恆定區。另一方面，該抗體部分可以是例如一Fab片段或一單鏈Fv片段。
在另一些實施方案中，本發明提供具有D2E7相關VL和VH的CDR3域的分離人抗體或其抗原結合部分，例如，其輕鏈可變區(LCVR)具有包含選自以下胺基酸序列的CDR3域的抗體或其抗原結合部分SEQ ID NO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25和SEQ ID NO26或其重鏈可變區(HCVR)具有包含選自以下胺基酸序列的CDR3域SEQ ID NO4、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
在另一實施方案中，本發明提供中和人TNFα而非人TNFB活性的重組人抗體或其抗原結合部分。最好是抗體或其抗原結合部分亦中和黑猩猩TNFα和選自以下的至少一種其它靈長類TNFα的活性狒狒TNFα、狨TNFα、獼猴TNFα和恆河猴TNFα。該抗體或其抗原結合部分在標準體外L929檢測中中和人、黑猩猩和/或另一靈長類TNFα時的IC50優選為不高於1×10-8M，更優選為不高於1×10-9M，甚至更優選為不高於5×10-10M。在一個分實施方案中，該抗體亦中和犬TNFα的活性，它在標準體外L929檢測中的IC50優選為不高於1×10-7M，更優選為不高於1×10-8M，甚至更優選為不高於5×10-9M。在另一分實施方案中，該抗體亦中和豬TNFα的活性，其IC50優選為不高於1×10-5M，更優選為不高於1×10-6M，甚至更優選為不高於5×10-7M。在再一分實施方案中，該抗體亦中和小鼠TNFα的活性，其IC50優選為不高於1×10-4M，更優選為不高於1×10-5M，甚至更優選為不高於5×10-6M。
可以將本發明的抗體或抗體部分衍生為或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白)。因此，本發明的抗體和抗體部分包括本文描述的人抗hTNFα抗體的衍生的和其它修飾的形式，包括免疫粘附分子。例如，本發明的抗體或抗體部分可以功能性地連接(通過化學偶聯、遺傳融合、非共價結合或其它)至一個或多個其它分子實體，例如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、可檢測藥劑、細胞毒藥劑、藥用藥劑和/或可以介導該抗體或抗體部分與另一分子結合的蛋白或肽(例如抗生蛋白鏈菌素核心區或多組氨酸標記)。
一種類型的衍生抗體是通過交聯二個或多個抗體(同一類型或不同類型，例如創造雙特異性抗體)製備。適當的交聯劑包括那些雜雙官能的、具有二個由適當隔離物分隔的獨特反應基團(例如鄰馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)或同雙官能的(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)。可以從Pierce Chemical Company，Rockford，IL得到這些接頭。
可以用於衍生本發明抗體或抗體部分的可檢測劑包括螢光化合物。典型的螢光可檢測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺醯氯、藻紅蛋白等等。亦可以用可檢測酶衍生抗體，所述酶為例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶等等。當用可檢測酶衍生抗體時，通過加入該酶用於產生可檢測反應產物的另外的試劑檢測該抗體。例如，當有可檢測劑辣根過氧化物酶時，加入過氧化氫和二氨基聯苯胺產生可檢測的有色反應產物。亦可以用生物素衍生抗體，並通過間接測定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合檢測。
II.抗體表達可以通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈製備本發明的抗體或抗體部分。為重組表達抗體，用攜帶編碼該抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的一個或多個重組表達載體轉染宿主細胞，使所述輕鏈和重鏈在該宿主細胞中表達並最好分泌至培養所述宿主細胞的培養基中，可以從該培養基回收所述抗體。使用了諸如Sambrook，Fritsch和Maniatis(編輯)，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，(1989)，Ausubel，F.M.等(編輯)分子生物學現行方法，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美國專利4,816,397號描述的標準重組DNA方法，以獲得抗體重鏈和輕鏈基因、將這些基因加入重組表達載體並將所述載體導入宿主細胞。
為表達D2E7或D2E7相關抗體，首先獲得編碼所述輕鏈和重鏈可變區的DNA片段。可以通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和修飾種系輕鏈和重鏈可變序列製備這些DNA。本領域已知道人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列(參見例如「Vbase」人種系序列資料庫；亦可參見Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)「人種系VH序列的所有組成部分揭示約50組具有不同超變環的VH區段」J.Mol.Biol.227776-798；和Cox，J.P.L等(1994)「人種系VK區段的目錄揭示在其使用中的強偏差」Eur.J.Immunol.24827-836；其內容通過引用結合到本文中)。為獲得編碼該D2E7或D2E7相關抗體的重鏈可變區的DNA片段，通過標準PCR擴增人種系VH基因的VH3家族的一員。最優選地是，擴增DP-31VH種系序列。為獲得編碼D2E7或D2E7相關抗體的輕鏈可變區的DNA片段，通過標準PCR擴增人種系VL基因的VKI家族的一員。最優選地，擴增A20 VL種系序列。可以使用標準方法、根據上述引用參考文獻中公開的核苷酸序列，設計用於擴增DP-31種系VH和A20種系VL序列的適當PCR引物。
一旦得到所述種系VH和VL片段後，可以使這些序列突變以編碼本文公開的所述D2E7或D2E7相關胺基酸序列。首先將由種系VH和VL DNA序列編碼的胺基酸序列與所述D2E7或D2E7相關VH和VL胺基酸序列比較，以鑑別在所述D2E7或D2E7相關序列中與種系不同的胺基酸殘基。然後，使用遺傳密碼確定應改變的核苷酸，將所述種系DNA序列的適當核苷酸突變，使得該突變種系序列編碼該D2E7或D2E7相關胺基酸序列。通過標準方法例如PCR介導的誘變(其中將所述突變核苷酸加入所述PCR引物，使得所述PCR產物含有所述突變)或定點誘變進行所述種系序列的誘變。
另外，應注意如果該通過PCR擴增得到的「種系」序列在框架區編碼的胺基酸與真正的種系構型不同(即例如由於體細胞突變，與真正的種系序列相比擴增序列中有差異)，可能最好將這些胺基酸差異變回真正的種系序列(即框架殘基「回復突變」至該種系構型)。
一旦得到編碼D2E7或D2E7相關VH和VL片段的DNA片段(按上述，通過擴增和誘變種系VH和VL基因)，可以通過標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如，將所述可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，將VL或VH編碼DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白(例如抗體恆定區或撓性接頭)的另一DNA片段。本文使用的術語「可操作地連接」是指連接這二個DNA片段使得由這二個DNA片段編碼的胺基酸序列保持在框架中。
通過可操作地將該VH編碼DNA連接至另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)的DNA分子，可以將編碼該VH區的分離DNA轉變為全長重鏈基因。本領域已知道人重鏈恆定區基因序列(參見例如Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNO.91-3242)，並且可以通過標準PCR擴增獲得包含這些區的DNA片段。該重鏈恆定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最好是IgG1或IgG4恆定區。關於Fab片段重鏈基因，可以將該VH編碼DNA可操作地連接至僅編碼該重鏈CH1恆定區的另一DNA分子。
通過可操作地將該VL編碼DNA連接至另一編碼該輕鏈恆定區CL的DNA分子，可以將編碼該VL區的分離DNA轉變為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。本領域已知道人輕鏈恆定區基因序列(參見例如Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNO.91-3242)，並且可以通過標準PCR擴增獲得包含這些區的DNA片段。該輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區，但最好是κ恆定區。
為製備scFv基因，將所述VH和VL編碼DNA片段可操作地連接至編碼撓性接頭(例如編碼胺基酸序列(GlY4-Ser)3)的另一片段，使得該VH和VL序列做為相連單鏈蛋白表達，由該撓性接頭連接所述VL和VH區(參見例如Bird等(1988)Science242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348552-554)。
為表達本發明的抗體或抗體部分，將上述得到的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體，使得所述基因可操作地連接至轉錄和轉譯控制序列。在本文中，術語「可操作地連接」是指抗體基因連接至載體中，使得該載體內的轉錄和轉譯控制序列發揮它們調節該抗體基因轉錄和轉譯的既定功能。選擇該表達載體和表達控制序列使之與所用的表達宿主細胞相容。可以將該抗體輕鏈和該抗體重鏈插入單獨的載體中，或更常用的是將這兩個基因插入同一載體中。通過標準方法(例如連接該抗體基因片段和載體上的互補限制位點、或如果沒有限制位點就進行平端連接)將所述抗體基因插入該表達載體。在插入該D2E7或D2E7相關輕鏈或重鏈序列之前，該表達載體可以已經攜帶抗體恆定區序列。例如，將該D2E7或D2E7相關序列轉變為全長抗體基因的一個方法是，將它們分別插入已經編碼重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表達載體，使得該VH區段可操作地連接至該載體內的CH區段並使該VL區段可操作地連接至該載體內的CL區段。另外或二者擇一地，該重組表達載體可以編碼便於該抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽。可以將該抗體鏈基因克隆入該載體，使得該信號肽在框架內連接至該抗體鏈基因的氨基末端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。
除所述抗體鏈基因之外，本發明的重組表達載體還攜帶控制所述抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調節序列。術語「調節序列」包括啟動子、增強子和控制所述抗體鏈基因轉錄或轉譯的其它表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這種調節序列例如描述於Goeddel；GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。本領域技術人員會理解該表達載體的設計(包括選擇調節序列)可以取決於種種因素，例如選擇欲轉化的宿主細胞、所需蛋白的表達水平等。優選的哺乳動物細胞表達調節序列包括指導在哺乳動物細胞中高水平蛋白表達的病毒元件，例如來自巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)和多形瘤的啟動子和/或增強子。有關病毒調節元件及其序列的進一步描述，參見例如Stinski的美國專利5,168,062號、Bell等的美國專利4,510,245號和Schaffner等的美國專利4,968,615號。
除所述抗體鏈基因和調節序列之外，本發明的重組表達載體還可以攜帶其它序列，例如在宿主細胞中調節該載體複製的序列(例如複製起點)和選擇標記基因。該選擇標記基因便於選擇已導入該載體的宿主細胞(參見例如Axel等的美國專利4,399,216、4,634,665和5,179,017號)。例如，一般該選擇標記基因賦予已導入該載體的宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素或氨甲蝶呤)的抗性。優選的選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞用氨甲蝶呤選擇/擴增)和neo基因(用於G418選擇)。
為表達所述輕鏈和重鏈，將編碼所述重鏈和輕鏈的表達載體通過標準技術轉染入宿主細胞。術語「轉染」的各種形式涵蓋了眾多的各種用於將外源基因導入原核或真核宿主細胞的常用技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE葡聚糖轉染等等。儘管理論上可以在或者原核宿主細胞或者真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但最優選在真核細胞中、最優選在哺乳動物細胞中表達抗體，因為這種真核細胞、特別是哺乳動物細胞比原核細胞更有可能裝配和分泌正確摺疊和具免疫活性的抗體。據報導抗體基因原核表達在活性抗體的高產率生產方面是低效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today612-13)。
優選的表達本發明重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠子宮(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220，與DHFR選擇標記一起使用，例如描述於R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞時，通過培養所述宿主細胞足夠時間以在所述宿主細胞中表達該抗體，或更優選地將該抗體分泌到所述宿主細胞生長的培養基中生產所述抗體。使用標準蛋白純化方法可以從該培養基中回收抗體。
亦可以用宿主細胞生產完整抗體的部分，例如Fab片段或scFv分子。應理解上述方法的變化亦屬於本發明的範圍。例如，可能最好用編碼本發明抗體的或者輕鏈或者重鏈(但不是兩者)的DNA轉染宿主細胞。亦可以用重組DNA技術除去編碼對與hTNFα結合非必需的或者輕鏈或者重鏈或者這二者的一些或全部DNA。本發明的抗體亦包括從這種截短的DNA分子表達的分子。另外，通過用標準化學交聯方法交聯本發明的抗體和第二抗體，可以生產雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈是本發明的抗體，另一條重鏈和另一條輕鏈對非hTNFα的抗原具特異性。
在一重組表達本發明抗體或其抗原結合部分的推薦系統中，通過磷酸鈣介導的轉染將既編碼該抗體重鏈又編碼該抗體輕鏈的重組表達載體導入dhfr-CHO細胞。在該重組表達載體中，所述抗體重鏈和輕鏈基因都可操作地連接至增強子/啟動子調節元件(例如來自SV40、CMV、腺病毒等等的，例如CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調節元件)以驅動所述基因的高水平轉錄。該重組表達載體亦攜帶DHFR基因，它使得可以用氨甲蝶呤選擇/擴增選擇已用該載體轉染的CHO細胞。培養該選出的轉化體宿主細胞以表達所述抗體重鏈和輕鏈，並從該培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學方法製備該重組表達載體、轉染所述宿主細胞、選擇轉化體、培養所述宿主細胞並從該培養基中回收該抗體。
鑑於前述，本發明的另一方面涉及可以用於重組表達本發明抗體和抗體部分的核酸、載體和宿主細胞組合。編碼該D2E7輕鏈可變區的核苷酸序列示於圖7和SEQ ID NO36。該LCVR的CDR1域包括核苷酸70-102，該CDR2域包括核苷酸148-168，而該CDR3域包括核苷酸265-291。編碼該D2E7重鏈可變區的核苷酸序列示於圖8和SEQ ID NO37。該HCVR的CDR1域包括核苷酸91-105，該CDR2域包括核苷酸148-198，而該CDR3域包括核苷酸295-330。技術人員會理解，使用遺傳密碼和標準分子生物學技術可以從編碼該D2E7LCVR和HCVR的核苷酸序列衍生編碼D2E7相關抗體或其部分(例如諸如CDR3域的CDR域)的核苷酸序列。
在一個實施方案中，本發明提供編碼輕鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列(即D2E7 VL CDR3)、或包含通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的一至五個保守胺基酸置換從SEQ ID NO3修飾的胺基酸序列。該核酸可以僅編碼該CDR3區，或更優選編碼整個抗體輕鏈可變區(LCVR)。例如，該核酸可以編碼一個具有包含SEQ ID NO5的胺基酸序列的CDR2域(即D2E7 VL CDR2)和包含SEQ ID NO7的胺基酸序列的CDR1域(即D2E7 VL CDR1)的LCVR。
在另一實施方案中，本發明提供編碼重鏈CDR3域的分離核酸，該CDR3域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列(即D2E7 VH CDR3)、或包含通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的一至五個保守胺基酸置換從SEQ ID NO4修飾的胺基酸序列。該核酸可以僅編碼該CDR3區，或更優選編碼整個抗體重鏈可變區(HCVR)。例如，該核酸可以編碼一個具有包含SEQ ID NO6的胺基酸序列的CDR2域(即D2E7 VH CDR2)和包含SEQ ID NO8的胺基酸序列的CDR1域(即D2E7 VH CDR1)的HCVR。
在再一實施方案中，本發明提供編碼D2E7相關CDR3域的分離核酸，該CDR3域例如包含選自以下的胺基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34和SEQ ID NO35。
在又一實施方案中，本發明提供編碼包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的抗體輕鏈可變區(即D2E7 LCVR)的分離核酸。該核酸最好包含SEQ ID NO36的核苷酸序列，儘管技術人員會理解由於遺傳密碼的簡併性，其它核苷酸序列可以編碼SEQ ID NO1的胺基酸序列。該核酸可以僅編碼該LCVR或亦可以編碼可操作地連接至該LCVR的抗體輕鏈恆定區。在一個實施方案中，該核酸存在於一個重組表達載體中。
在又一實施方案中，本發明提供編碼包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的抗體重鏈可變區(即D2E7 HCVR)的分離核酸。該核酸最好包含SEQ ID NO37的核苷酸序列，儘管技術人員會理解由於遺傳密碼的簡併性，其它核苷酸序列可以編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列。該核酸可以僅編碼該HCVR或亦編碼可操作地連接至該HCVR的重鏈恆定區。例如，該核酸可以包含IgG1或IgG4恆定區。在一個實施方案中，該核酸存在於一個重組表達載體中。
本發明亦提供既編碼抗體重鏈又編碼抗體輕鏈的重組表達載體。例如，在一個實施方案中，本發明提供編碼以下的重組表達載體
(a)具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的可變區的抗體輕鏈(即D2E7 LCVR)；和(b)具有包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的可變區的抗體重鏈(即D2E7 HCVR)。
本發明亦提供已導入一個或多個本發明重組表達載體的宿主細胞。該宿主細胞優選是哺乳動物宿主細胞，該宿主細胞更優選是CHO細胞、NS0細胞或COS細胞。
另外本發明提供合成本發明重組人抗體的方法，即通過在適當培養基中培養本發明的宿主細胞直至合成本發明的重組人抗體。該方法還包括從該培養基中分離該重組人抗體。
III.選擇重組人抗體可以通過篩選重組聯合抗體文庫、最好是從得自人淋巴細胞的mRNA製備的人VL和VH cDNA製備的scFv噬菌體呈現文庫分離除本文公開的該D2E7或D2E7相關抗體之外的本發明重組人抗體。本領域已知道製備和篩選這種文庫的方法學。除市售製備噬菌體呈現文庫的藥盒(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現藥盒，目錄號240612)之外，可以在以下文獻中找到特別適用於製備和篩選抗體呈現文庫的方法和試劑例如Ladner等的美國專利5,223,409號；Kang等的PCT說明書WO92/18619號；Dower等的PCT說明書WO 91/17271號；Winter等的PCT說明書WO 92/20791號；Markland等的PCT說明書WO 92/15679號；Breitling等的PCT說明書WO 93/01288號；McCafferty等的PCT說明書WO 92/01047號；Garrard等的PCT說明書WO 92/09690號；Fuchs等(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等(1992)Hum AntibodHybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；McCafferty等，Nature(1990)348552-554；Griffiths等(1993)EMBO J12725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226889-896；Clackson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)PNAS893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res194133-4137；和Barbas等(1991)PNAS887978-7982。
在一個最佳實施方案中，為分離對hTNFα具有高親和性和低解離速率常數的人抗體，首先用對hTNFα具有高親和性和低解離速率常數的鼠抗hTNFα抗體(例如MAK 195，保藏號為ECACC 87 050801的雜交瘤)、採用描述於Hoogenboom等的PCT說明書WO 93/06213號的表位印記或導向選擇方法，選擇具有對hTNFα類似的結合活性的人重鏈和輕鏈序列。在該方法中使用的抗體文庫最好是按照McCafferty等的PCT說明書WO 92/01047號，McCafferty等，Nature(1990)348552-554；和Griffiths等，(1993)EMBO J12725-734所述製備和篩選的scFv文庫。最好用重組人TNFα做為抗原篩選所述scFv抗體文庫。
一旦選擇出最初的人VL和VH區段，就進行「混合和配對」實驗，在該實驗中對最初選擇的VL和VH區段的不同配對進行hTNFα結合篩選，以選擇優選的VL/VH對組合。另外，為進一步提高對hTNFα結合的親和性和/或降低hTNFα結合的解離速率常數，可以對優選的VL/VH對的VL和VH區段進行隨機突變，該突變最好在VH和/或VL的CDR3區進行，突變過程與造成在自然免疫應答中抗體親和性成熟的體內體細胞突變過程相似。可以使用與VH CDR3或VL CDR3分別互補的PCR引物，通過擴增VH和VL區完成這種體外親和性成熟，所述引物已用四種核苷酸鹼基的隨機混合物於某些位置「釘入」，使得該得到的PCR產物編碼已在VH和/或VL CDR3區中導入隨機突變的VH和VL區段。可以再次篩選這些隨機突變VH和VL區段的hTNFα結合性，可以選擇出展示對hTNFα結合有高親和性和低解離速率的序列。
可以將選擇的抗體重鏈和輕鏈的胺基酸序列與種系重鏈和輕鏈胺基酸序列比較。在該選擇的VL和/或VH鏈的某些框架殘基不同於種系構型時(例如由於用於製備該噬菌體文庫的免疫球蛋白基因的體細胞突變的結果)，可能需要將所述選定抗體的改變的框架殘基「回復突變」為該種系構型(即改變該選定抗體的框架胺基酸序列，使它們與所述種系框架胺基酸序列相同)。框架殘基的這種「回復突變」(或「種系化」)可以通過用於導入特異性突變的標準分子生物學方法(例如定點誘變；PCR介導的誘變等等)完成。
在從重組免疫球蛋白呈現文庫篩選和分離本發明的抗hTNFα抗體之後，可以從該呈現包裝物(例如從該噬菌體基因組)回收編碼該選擇抗體的核酸並通過標準重組DNA技術將其亞克隆入其它表達載體。如果需要，可以進一步操作該核酸以創造本發明的其它抗體形式(例如連接至編碼另外免疫球蛋白結構域的核酸，例如其它恆定區)。為表達通過聯合文庫篩選分離的重組人抗體，如上述II節詳述，將編碼該抗體的DNA克隆入重組表達載體並導入哺乳動物宿主細胞。
IV.藥用組合物和給藥可以將本發明的抗體和抗體部分加入適於給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發明的抗體或抗體部分和藥學上可接受的載體。本文使用的「藥學上可接受的載體」包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。藥學上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其組合物。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、或氯化鈉。藥學上可接受載體還可以包含少量的輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，它們增強了該抗體或抗體部分的有效期或效力。
本發明的組合物可以有各種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑量形式，例如液體溶液(例如注射液和輸注液)、分散液或懸液、片劑、丸劑、粉劑、脂質體和栓劑。推薦的形式取決於給藥方式和治療用途。典型的推薦組合物是注射液或輸注液的形式，例如與用其它抗體對人進行被動免疫所用的組合物類似的組合物。推薦的給藥方式是非腸道的(例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)。在一個最佳實施方案中，通過靜脈內輸液或注射給與該抗體。在另一最佳實施方案中，通過肌內注射或皮下注射給與該抗體。
治療組合物一般必須無菌且在生產儲存條件下穩定。可以將該組合物配製成溶液、微乳液、分散液、脂質體或其它適於高藥物濃度的有序結構。通過將所需量的該活性化合物(即抗體或抗體部分)與所需上述成分的一種或組合一起加入適當的溶劑中並接著進行除菌過濾製備無菌注射液。一般而言，通過將該活性化合物加入含有基本分散介質和所需的上述其它成分的無菌溶媒中製備分散液。在用於製備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥產生該活性成分與任何其它來自先前除菌過濾溶液的所需成分的粉劑。例如通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當流動性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)可以達到注射組合物的延長吸收。
本發明的抗體和抗體部分可以用本領域已知的各種方法給藥，儘管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是靜脈內注射或輸液。技術人員會理解給藥途徑和/或給藥方式隨所需的結果而變化。在某些實施方案中，該活性化合物可以與保護該化合物免於快速釋放的載體一同製備，例如控釋製劑，包括移植物、透皮貼和微囊傳遞系統。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯和聚乳酸。製備這種製劑的許多方法均已申請專利或一般為本領域技術人員所知。參見例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，紐約，1978。
在某些實施方案中，本發明的抗體或抗體部分可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。該化合物(和其它成分，如果需要)亦可以包於硬或軟殼明膠膠囊、壓製成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關於口服治療給藥，可以將所述化合物與賦形劑一起加入並以可食片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、糯米紙囊劑等等形式使用。為了以非腸道給藥之外給與本發明的化合物，可能需要用防止其失活的材料對該化合物包衣或與該化合物一同給與。
亦可以將補充的活性化合物加入該組合物中。在某些實施方案中，將本發明的抗體或抗體部分與一種或多種可以用於治療hTNFα活性為有害的疾病的其它治療藥物共配製和/或共給與。例如，本發明的抗體或抗體部分可以與一種或多種結合其它靶的抗體(例如結合其它細胞因子的抗體或結合細胞表面分子的抗體)、一種或多種細胞因子、可溶性TNFα受體(參見例如PCT說明書WO 94/06476號)和/或一種或多種抑制hTNFα產生或活性的化學藥劑(例如PCT說明書WO93/19751號中描述的亞環己烷基衍生物)共配製和/或共給與。另外，可以將一種或多種本發明的抗體與二種或多種前述治療藥物聯用。這種聯合治療可以優越地利用較低劑量的該給與的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關的併發症。
可以與本發明的抗體或抗體部分聯用的類風溼性關節炎治療藥物的非限制性例子包括以下非類固醇抗炎藥(NSAID)；細胞因子抑制抗炎藥(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75 kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；55kdTNFR-IgG(5kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(無缺失靈長類化抗CD4抗體；IDEC/SmithKline；參見例如Arthritis Rheumatism(1995)Vol.38，S185)；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；參見例如Arthritis Rheumatism(1993)Vol.36，1223)；抗Tac(人化抗IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(抗炎細胞因子；DNAX/Schering)；IL -10(SCH 52000；重組IL-10，抗炎細胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；Synergen/Amgen)；TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結合蛋白；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S284；Amer.J Physiol.-Heart and Circulator+y Physiology(1995)Vol.268，第37-42頁)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制劑；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)；MK-966(COX-2抑制劑；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S81)；Iloprost(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；酞胺哌啶酮(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)和酞胺哌啶酮相關藥物(例如Celgen)；leflunomide(抗炎和細胞因子抑制劑；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)Vol.45，第103-107頁)；凝血酸(血纖維蛋白溶酶原激活抑制劑；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S284)；T-614(細胞因子抑制劑；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)；前列腺素E1(參見例如Arrhritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S282)；Tenidap(非類固醇抗炎藥；參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S280)；萘普生(非類固醇抗炎藥；參見例如NeuroReport(1996)Vol.7，第1209-1213頁)；Meloxicam(非類固醇抗炎藥)；布洛芬(非類固醇抗炎藥)；吡羅昔康(非類固醇抗炎藥)；雙氯芬酸(非類固醇抗炎藥)；消炎痛(非類固醇抗炎藥)；柳氮磺胺吡啶(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S281)；ICE抑制劑(白介素-1β轉化酶抑制劑)；zap-70和/或lck抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制劑)；VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑(血管內皮細胞生長因子或血管內皮細胞生長因子受體抑制劑；血管發生抑制劑)；皮質類固醇抗炎藥(例如SB203580)；TNF-轉化酶抑制劑；抗IL-12抗體；白介素-11(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S296)；白介素-13(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S308)；白介素-17抑制劑(參見例如Arthritis Rheumatism(1996)Vol.39，第9期(增刊)，S120)；金；青黴胺；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥；環磷醯胺；環孢菌素；全淋巴照射；抗胸腺細胞球蛋白；抗CD4抗體；CD-5毒素；口服肽和膠原蛋白；lobenzarit disodium；細胞因子調節劑(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性補體受體1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；強的松；肝蛋白；葡糖胺聚糖多硫酸鹽；二甲胺四環素；抗IL2R抗體；海洋和植物脂質(魚類和植物種子脂肪酸；參見例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21759-777)；金諾芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；靜注免疫球蛋白；zileuton；黴酚酸(RS-61443)；tacrolimus(FK-506)；sirolimus(雷帕黴素)；amiprilose(therafectin)；cladribine(2-氯脫氧腺苷)；和阿扎立平。
可以與本發明的抗體或抗體部分聯用的炎症性腸病治療藥物的非限制性例子包括以下budenoside；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢菌素；柳氮磺胺吡啶；氨基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制劑；氨水楊酸；奧沙拉秦；balsalazide；抗氧化劑；凝血噁烷抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；55kdTNFR-IgG(55kDTNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；白介素-10(SCH52000；Schering Plough)；IL-4；IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)；白介素-11；強的松龍、地塞米松或budesonide的葡糖苷酸或葡聚糖結合前體藥物；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性補體受體1(TP10；T CellSciences，Inc.)；緩釋氨水楊酸；氨甲蝶呤；血小板激活因子(PAF)拮抗劑；環丙沙星；和利多卡因。
可以與本發明的抗體或抗體部分聯用的多發性硬化治療藥物的非限制性例子包括以下皮質類固醇；強的松龍；甲基強的松龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；tizanidine；幹擾素-β1a(AvonexTM；Biogen)；幹擾素-β1b(BetaseronTM；Chiron/Berlex)；Copolymer 1(Cop-1；CopaxoneTM；Teva PharmaceuticalIndustries，Inc.)；高壓氧；靜注免疫球蛋白；clabribine；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffnann-LaRoche)；IL-10；IL-4；和IL-10和/或IL-4激動劑(例如激動劑抗體)。
可以與本發明的抗體或抗體部分聯用的膿毒症治療藥物的非限制性例子包括以下高滲鹽溶液；抗生素；靜注γ球蛋白；連續性濾血；carbapenems(例如meropenem)；諸如TNFα、IL-1β、IL-6和/或IL-8的細胞因子的拮抗劑；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；細胞因子調節劑(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；SK F 107647(低分子肽；SmithKlineBeechem)；四價脒基腙CNI-1493(Picower Instirtute)；組織因子通道抑制劑(TFPI；Chiron)；PHP(化學修飾血紅蛋白；APEX Bioscience)；鐵螯合劑和螯合物，包括五乙酸二乙三胺-鐵(III)絡合物(DPTA鐵(III)；Molichem Medicines)；lisofylline(合成小分子甲基黃嘌呤；CellTherapeutics，Inc.)；PGG-葡聚糖(水溶性β1，3葡聚糖；Alpha-BetaTechnology)；用脂類重建的載脂蛋白A-1；手性異羥肟酸(抑制脂A生物合成的合成抗菌劑)；抗內毒素抗體；E5531(合成脂A拮抗劑；EisaiAmerica，Inc.)；rBPI21(人殺菌劑/透過性增強蛋白的重組N末端片段)；和合成抗內毒素肽(SAEP；BiosYnth Research Laboratories)；可以與本發明的抗體或抗體部分聯用的成人呼吸窘迫綜合症(ARDS)治療藥物的非限制性例子包括以下抗IL-8抗體；表面活性劑置換療法；CDP-571/BAY-10-3356(人化抗TNFα抗體；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗TNFα抗體；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex；參見例如Arthritis Rheumatism(1994)Vol.37，S295；J.Invest.Med.(1996)Vol.44，235A)；和55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)。
在IV小節中進一步討論將本發明的抗體或抗體部分與其它治療藥物聯用的用途。
本發明的藥用組合物可以包括「治療有效量」或「預防有效量」的本發明抗體或抗體部分。「治療有效量」是指在必要的劑量和時間下有效達到所需治療效果的量。抗體或抗體部分的治療有效量可以根據諸如個體的病況、年齡、性別和體重以及該抗體和抗體部分在該個體引起所需反應的能力等因素而變化。治療有效量亦指該抗體或抗體部分的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量。「預防有效量」是指在必要劑量和時間下有效達到所需預防效果的量。因為預防劑量用於患病前或疾病早期的受治療者，預防有效量通常小於治療有效量。
可以調整劑量制度以提供最佳所需反映(例如治療或預防應答)。例如，可以單次大團給藥，可以在一段時間內給與幾個均分量或根據治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配製易於給藥和劑量統一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式指適於欲治療的哺乳動物受治療者的單元劑量的物理分離單位；每個單位含有預定量的計算用於與所需藥用載體一同產生所需治療效果的活性化合物。本發明的劑量單位形式的規格由以下確定並直接取決於以下(a)該活性化合物的獨特特徵和欲達到的特定治療或預防效果，和(b)在混合這種用於治療個體敏感性活性化合物的技術中的內在限制。
本發明的抗體或抗體部分的治療或預防有效量的典型的非限制性範圍是0.1-20mg/kg，更優選為1-10mg/kg。應注意劑量值將根據欲減輕的疾病類型和嚴重性變化。另外應理解對於任何特定受治療者，應隨著時間根據個體需要和給與或監督給與所述組合物的人的專業判斷調整特定劑量制度，並且本文設定的劑量範圍僅為例證性的，並不會限制要求保護的組合物的範圍或實踐。
IV.本發明抗體的用途已知本發明的抗hTNFα抗體或其部分結合hTNFα的能力，可以將其用於在諸如酶聯免疫吸附檢測(ELISA)、放射免疫檢測(RIA)或組織免疫組織化學的常規免疫檢測中檢測hTNFα(例如在諸如血清或血漿的生物樣品中)。本發明提供在生物樣品中檢測hTNFα的方法，該方法包括用本發明的抗體或抗體部分接觸生物樣品並檢測或者結合至hTNFα的抗體(或抗體部分)或者未結合抗體(或抗體部分)，由此檢測該生物樣品中的hTNFα。用便於檢測結合或未結合抗體，用可檢測物質直接或間接標記該抗體。合適的可檢測物質包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合體例子包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的螢光物質的例子包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質的例子包括魯米諾；而合適的放射性物質的例子包括125I、131I、35S或3H。
與標記該抗體二者擇一地，利用用可檢測物質標記的rhTNFα標準和未標記抗hTNFα抗體，通過競爭免疫檢測可以在生物流體中檢測hTNFα。在該檢測中，將該生物樣品、該標記rhTNFα標準和該抗hTNFα抗體混合併測定與該未標記抗體結合的標記rhTNFα標準的量。該生物樣品中的hTNFα量與結合至該抗hTNFα抗體的標記rhTNFα標準的量成反比。
亦可以用本發明的D2E7抗體檢測來自除人類之外的其它物種的TNFα，特別是來自靈長類(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恆河猴)、豬和小鼠的TNFα，因為D2E7可以與這些TNFα的每一種結合(在實施方案4的E小節中進一步討論)。
本發明的抗體和抗體部分能夠在體外和體內中和hTNFα活性(參見實施方案4)。另外，至少一些本發明抗體(例如D2E7)可以中和來自其它物種的TNFα。因此，本發明的抗體和抗體部分可以用於例如在含有hTNFα的細胞培養物、在人類受治療者或在其它具有本發明的抗體可以交叉反應的TNFα的哺乳動物受治療者(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恆河猴、豬或小鼠)中抑制TNFα活性。在一個實施方案中，本發明提供抑制TNFα活性的方法，該方法包括用本發明的抗體或抗體部分接觸TNFα使得TNFα活性被抑制。該TNFα最好是人TNFα。例如，可以在含有或懷疑含有hTNFα的細胞培養物的培養基中加入本發明的抗體或抗體部分，以抑制該培養物中的hTNFα活性。
在另一實施方案中，本發明提供在患病的受治療者中抑制TNFα的方法，在該病中TNFα活性是有害的。已提出TNFα參與許多的各種紊亂的病理生理學(參見例如Moeller，A.等(1990)Cytokine2162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024；Moeller，A.等的歐洲專利公開260 610 B1號)。本發明提供在患這種紊亂的受治療者中有關TNFα活性的方法，該方法包括給與該受治療者本發明的抗體或抗體部分，使得該受治療者中的TNFα活性被抑制。最好是，該TNFα是人TNFα並且該受治療者是人。二者擇一地，該受治療者可以是表達本發明抗體交叉反應的TNFα的哺乳動物。另外的該受治療者可以是已經導入hTNFα的哺乳動物(例如通過給與hTNFα或通過表達hTNFα轉基因)。可以將本發明的抗體以治療目的給與人受治療者(以下進一步討論)。另外，可以將本發明的抗體給與表達該抗體交叉反應的TNFα的非人類哺乳動物(例如靈長類、豬或小鼠)，以達到獸醫目的或做為人類疾病的動物模型。有關後者，這種動物模型可以用於評價本發明抗體的治療效力(例如測試給藥的劑量和時間過程)。
本文使用的術語「其中TNFα活性是有害的紊亂」包括疾病和其它紊亂，其中在患該紊亂的受治療者中TNFα的存在已顯示出或被懷疑或者對該病的病理生理學負責或是造成該病加重的因子。因此，其中TNFα是有害的紊亂是這樣一種紊亂，其中TNFα活性的抑制預期將減輕該紊亂的症狀和/或進程。這種紊亂可以通過例如患該病的受治療者的生物流體中TNFα濃度的增加(例如在該受治療者的血清、血漿、滑液等中TNFα濃度增加)而證實，這可以用上述抗TNFα抗體檢測。有許多其中TNFα是有害的紊亂的例子。以下進一步討論本發明的抗體和抗體部分在治療具體紊亂中的用途A.膿毒症腫瘤壞死因子在膿毒症病理生理學中已有確定地位，其生物學效應包括低血壓、心肌抑制、血管漏出綜合症、器官壞死、刺激釋放毒性次級介質和激活凝血級聯(參見例如Moeller，A.等(1990)Cytokine2162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024號；Moeller，A.等的歐洲專利公告260 610 B1號；Tracery，K.J.和Cerami，A.(1994)Annu.Rev.Med.45491-503；Russell，D和Thompson，R.C.(1993)Curr.Opin.Biotech.4714-721)。因此，本發明的人抗體和抗體部分可以用於治療任何臨床背景中的膿毒症，包括膿毒症性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒症和毒性休克綜合症。
另外，為治療膿毒症，可以將本發明的抗hTNFα抗體或抗體部分與一種或多種可以另外減輕膿毒症的其它治療藥物共給藥，所述其他治療藥物為例如白介素-1抑制劑(諸如在PCT說明書WO 92/16221和WO 92/17583號中描述的)、細胞因子白介素-6(參見例如PCT說明書WO 93/11793號)或血小板激活因子的拮抗劑(參見例如歐洲專利申請公告EP 374 510號)。在小節III中進一步討論治療膿毒症的其它組合療法。
另外，在一個最佳實施方案中，將本發明的抗hTNFα抗體或抗體部分給與一膿毒症病人小組的人受治療者，這些病人的治療時的血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml，更優選地超過1000pg/ml(參見Daum L.等的PCT說明書WO 95/20978號)。
B.自身免疫疾病已發現腫瘤壞死因子在各種自身免疫疾病的病理生理學中起作用。例如，已發現TNFα參與激活組織炎症並引起類風溼性關節炎中的關節破壞(參見例如Moeller，A.等(1990)Cytokine2162-169；授予Moeller等的美國專利5,231,024號；Moeller，A.等的歐洲專利公開260610 B1號；Tracery，K.J.和Cerami，見上述；Arend，W.P.和Dayer，J-M.(1995)Arth.Rheum.38151-160；Fava，R.A.等(1993)Clin.Exp.Immunol.94261-266)。亦發現TNFα在糖尿病中參與促進胰島細胞死亡和介導胰島素抗性(參見例如Tracery，K.J.和Cerami，見上述；PCT說明書WO94/08609號)。亦發現TNFα在多發性硬化中參與介導對少突神經膠質細胞的細胞毒和誘導炎症斑(參見例如Tracey和Cerami，見上述)。已經進行了嵌合和人化鼠抗hTNFα抗體治療類風溼性關節炎的臨床試驗(參見例如Elliott，M.J.等(1994)Lancet3441125-1127；Elliot，M.J.等(1994)Lancet3441105-1110；Rankin，E.C.等(1995)Br.J.Rheumatol.34334-342)。
本發明的人抗體和抗體部分可以用於治療自身免疫疾病，特別是那些與炎症有關的自身免疫疾病，包括類風溼性關節炎、類風溼性脊椎炎、骨關節炎和痛風性關節炎、變態反應、多發性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎和腎病綜合症。典型地，系統性給與該抗體或抗體部分，儘管對某些紊亂而言在炎症位點局部給與該抗體或抗體部分是有益的(例如單獨或與PCT說明書WO 93/19751號描述的環己烷-ylidene衍生物聯用，在類風溼性關節炎的關節處局部給與或在糖尿病性潰瘍表面塗藥)。本發明的抗體或抗體部分亦可以與在III小節中進一步討論的用於治療自身免疫疾病的一或多種治療藥物一同給與。
C.傳染病已發現腫瘤壞死因子參與介導在各種傳染病中觀察到的生物學效應。例如，已發現TNFα介導瘧疾中的大腦炎症和毛細管血栓形成和梗塞。亦發現TNFα參與介導大腦炎症，誘導腦膜炎中的血腦屏障崩潰、觸發膿毒症性休克綜合症和激活靜脈梗塞。亦發現TNFα在獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)中參與誘導惡病質、刺激病毒增殖和介導中樞神經系統損傷。因此，可以用本發明的抗體和抗體部分治療傳染病，包括細菌性腦膜炎(參見例如歐洲專利申請公告EP 585 705號)、腦型瘧、AIDS和AIDS相關綜合症(ARC)(參見例如歐洲專利申請公告EP 230574號)、以及移植繼發的巨細胞病毒感染(參見例如Fietze，E.等(1994)Transplantation 58675-680)。本發明的抗體和抗體部分亦可以用於減輕與傳染病有關的症狀，包括因感染(例如流感)引起的發燒和肌痛和感染繼發的惡病質(例如AIDS或ARC繼發的)。
D.移植已發現腫瘤壞死因子可能是同種移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的關鍵介質並參與介導在用導向T細胞受體CD3複合物的大鼠抗體OKT3抑制腎移植排斥時觀察到的負反應(參見例如Eason，J.D.等(1995)Transplantation59300-305；Suthanthiran，M.和Strom，T.B.(1994)New Engl.J.Med.331365-375)。因此，可以用本發明的抗體和抗體部分抑制移植排斥，包括同種移植和異種移植排斥和抑制GVHD。儘管可以單獨使用該抗體或抗體部分，但更優選地將其與一種或多種抑制抗同種移植的免疫應答或抑制GVHD的其它藥劑聯用。例如，在一個實施方案中，將本發明的抗體或抗體部分與OKT3聯用，以抑制OKT3誘導的反應。在另一實施方案中，將本發明的抗體或抗體部分與一或多種導向參與調節免疫應答的其它靶的抗體聯用，這些靶例如為細胞表面分子CD25(白介素-2受體-α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在再一實施方案中，將本發明的抗體或抗體部分與諸如環孢菌素A或FK506的一或多種一般性免疫抑制劑聯用。
E.惡性腫瘤已發現腫瘤壞死因子在惡性腫瘤中參與誘導惡病質、刺激腫瘤生長、增強轉移潛力和介導細胞毒性。因此，可以使用本發明的抗體和抗體部分治療惡性腫瘤，抑制腫瘤生長或轉移和/或減輕惡性腫瘤繼發的惡病質。可以將該抗體或抗體部分系統性給藥或局部給與該腫瘤部位。
F.肺功能紊亂已知腫瘤壞死因子參與成人呼吸窘迫綜合症(ARDS)的病理生理學，包括刺激白細胞-內皮細胞激活、細胞毒性導向肺細胞和誘導血管漏出綜合症。因此，可以用本發明的抗體和抗體部分治療肺功能紊亂，包括成人呼吸窘迫綜合症(參見例如PCT說明書WO 91/04054號)、休克肺、慢性肺炎、肺結節病、肺纖維化和矽肺。可以將該抗體或抗體部分系統性給藥或局部地給與肺表面，例如做為氣溶膠。亦可以將本發明的抗體或抗體部分與一種或多種用於治療肺功能紊亂的其它治療藥物(在III小節中進一步討論)一同給與。
G.腸功能紊亂已發現腫瘤壞死因子參與炎症性腸功能紊亂的病理生理學(參見例如Tracy，K.J.等(1986)Science234470-474；Sun，X-M.等(1988)J.Clin.Invest.811328-1331；MacDonald，T.T.等(1990)Clin.Exp.Immunol.81301-305)。已進行嵌合鼠抗hTNFα抗體治療局限性迴腸炎的臨床試驗(van Dullemen，H.M.等(1995)Gastroenterology109129-135)。亦可以使用本發明的人抗體和抗體部分治療腸功能紊亂，例如特發性炎症性腸病，該病包括二種綜合症，即局限性迴腸炎和潰瘍性結腸炎。亦可以將本發明的抗體或抗體部分與一或多種用於治療腸功能紊亂的治療藥物(在III小節中進一步討論)一同使用。
H.心臟功能紊亂亦可以用本發明的抗體和抗體部分治療各種心臟功能紊亂，包括心臟局部缺血(參見例如歐洲專利申請公告EP 453 898號)和心臟功能不全(心肌虛弱)(參見例如PCT說明書WO 94/20139號)。
I.其它亦可以用本發明的抗體和抗體部分治療各種其中TNFα活性是有害的其它紊亂。已發現TNFα活性參與其病理生理學並因此可以用本發明抗體或抗體部分治療的其它疾病和紊亂的例子包括炎症性骨病和骨吸收(參見例如Bertolini，D.R.等(1986)Nature319516-518；Konig，A.等(1988)J.Bone Miner.Res.3621-627；Lerner，U.H.和Ohlin，A.(1993)J.Bone Miner.Res.8147-155；和Shankar，G.和Stern，P.H.(1993)Bone14871-876)、肝炎，包括酒精性肝炎(參見例如McClain，C.J.和Cohen，D.A.(1989)Hepatology9349-351；Felver，M.E.等(1990)Alcohol.Clin.Exp.Res.14255-259；和Hansen，J.等(1994)Hepatology20461-474)、病毒性肝炎(Sheron，N.等(1991)J.Hepatol.12241-245；和Hussain，M.J.等(1994)J.Clin.Pathol.471112-1115)和爆發性肝炎；凝結紊亂(參見例如van der Poll，T.等(1990)N.Engl.J.Med.3221622-1627；和van der Poll，T.等(1991)Prog.Clin.Biol.Res.36755-60)，燒傷(參見例如Giror，B.P.等(1994)Am.J.Physiol.267H118-124；和Liu，X.S.等(1994)Burns2040-44)，再灌注損傷(參見例如Scales，W.E.等(1994)Am.J.Physiol.267G1122-1127；Serrick，C.等(1994)Transplantation581158-1162；和Yao，Y.M.，等(1995)Resuscitation29157-168)，瘢痕疙瘩形成(參見例如McCauley，R.L.等(1992)J.Clin.Immunol.12300-308)，瘢痕組織形成；發熱；牙周病；肥胖和放射毒性。
通過以下實施例進一步描述本發明，這些實施例並不限制本發明。本申請引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請通過引用結合到本文中。
實施例1人抗體與hTNFα結合的動力學分析使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)通過表面等離子體激元共振(SPR)檢測配體(生物素化的重組人TNFα(rhTNFα)，固定於生物傳感器基質上)與分析物(溶液中的抗體)之間的實時結合反應。該系統利用SPR的光學特性檢測葡聚糖生物傳感器基質中蛋白濃度的改變。以已知濃度將蛋白共價結合至該葡聚糖基質。將抗體注射通過該葡聚糖基質，注射抗體和固定化配體之間的特異性結合導致基質蛋白濃度增加並導致SPR信號變化。SPR信號的變化以共振單位(RU)記錄並沿著傳感圖的y軸隨時間顯示。
為便於將生物素化rhTNFα固定於生物傳感器基質上，通過首先用100mM N-羥基檸檬醯亞胺(NHS)和400mM鹽酸N-乙基-N』-(3-二乙基氨丙基)碳二亞胺(EDC)激活基質上的羧基，將抗生蛋白鏈菌素通過游離氨基共價連接至該葡聚糖基質。下一步，將抗生蛋白鏈菌素通過該活化基質注射。將稀釋於乙酸鈉pH4.5的35微升抗生蛋白鏈菌素(25μg/ml)注射通過該活化的生物傳感器，該蛋白上的游離胺直接結合至該活化的羧基。通過注射1M的乙醇胺失活未反應的基質EDC-酯。抗生蛋白鏈菌素偶聯的生物傳感器晶片亦有市售(Pharmacia BR-1000-16，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。
通過首先溶解5.0mg生物素(D-生物素-ε-氨基己酸N-羥基檸檬醯亞胺酯；Boehringer Mannheim目錄號1008 960)於500μl二甲基亞碸以製備10mg/ml溶液，製備生物素化rhTNFα。每毫升rhTNFα(2.65mg/ml)加入10微升生物素以使生物素與rhTNFα摩爾比為2∶1。溫和攪拌反應物並於黑暗處於室溫保溫2小時。用25ml冷PBS平衡裝有Sephadex G-25M(Pharmacia目錄號17-0851-01)的PD-10柱，並以每根柱2ml thTNFα-生物素上柱。用10×1ml冷PBS洗脫該柱。收集分部收集液並於OD280讀數(1.0OD＝1.25mg/mh)。合併適當的分部並儲存於-80℃直至使用。生物素化rhTNFα亦有市售(R D Systems目錄號FTA00，Minneapolis，MN)。
將欲通過抗生蛋白鏈菌素固定化於該基質上的生物素化rhTNFα稀釋於PBS流動緩衝液(Gibco目錄號14190-144，Gibco BRL，GrandIsland，NY)，該緩衝液添加了0.05％(BIAcore)表面活性劑P20(Pharmacia BR-1000-54，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。為測定rhTNFα特異性抗體結合固定化rhTNFα的能力，按下述進行結合檢測。以5μl/min的流速將數等份的生物素化rhTNFα(25nM；10μl等份)注射通過該偶聯了抗生蛋白鏈菌素的葡聚糖基質。在注射該蛋白之前和剛注射完時，僅使BS緩衝液流過每個流動池。基線和生物素化rhTNFα注射完成後約30秒鐘的信號的淨差值做為結合值(約500RU)。測定了rhTNFα特異性抗體與固定化生物素化rhTNFα的直接結合。在PBS流動緩衝液中稀釋抗體(20μg/ml)，並將25μl的等份以5μl/min的流速注射通過所述固定化蛋白基質。在注射抗體之前和剛注射完時，僅使PBS緩衝液流過每個流動池。基線信號和抗體注射完成後的信號的淨差值做為該特定樣品的結合值。在注射下一個樣品之前用100mM HCl再生生物傳感器基質。為確定解離速率(Koff)、結合速率(Kon)、結合速率(Ka)和解離速率(Kd)常數，使用了BIAcore動力學評價軟體(2.1版)。
D2E7(IgG4全長抗體)與生物素化rhTNFα結合的代表性結果以及與之比較的鼠mAb MAK 195(F(ab』)2片段)，均示於以下表1中。表1D2E7 IgG4或MAK 195與生物素化rhTNFα的結合
在第二系列試驗中，按照上述用BIAcore技術定量分析了D2E7的IgG1全長形式與生物素化rhlTNF之間的分子動力學相互作用，並得出了動力學速率常數，概括於以下表2、3和4中。
表2D2E7和生物素化rhTNF相互作用的表觀解離速率常數
表3D2E7和生物素化rhTNF之間相互作用的表觀結合速率常數
表4D2E7和生物素化rhTNF的表觀動力學速率常數和素和性常數
用BIA分析軟體通過分析該傳感圖的解離區和結合區計算解離和結合速率常數。以常規化學反應動力學假設D2E7與生物素化rhTNF分子之間的相互作用零階解離和一階結合動力學。為了分析的原因，在選擇分析該動力學數據的分子模型時僅考慮該二價D2E7抗體的一個臂與該三聚體生物素化rhTNF的一個單位之間的相互作用。進行了三次獨立的實驗並分別分析其結果。D2E7與生物素化rhTNF之間相互作用的平均表觀解離速率常數(Kd)是8.81±1.06×10-5s-1，平均表觀結合速率常數Ka是1.91±1.26×105M-1s-1。然後用公式Kd＝Kd/Ka計算表觀內在解離常數(Kd)。因此，得自動力學參數的D2E7抗體對rhTNF的平均Kd是6.09±3.42×10-10M。未將D2E7的IgG1形式的動力學值(示於表2、3和4中)和D2E7的IgG4形式的動力學值(示於表1和實施例2和3中)的較小的差別認為是由或者IgG1恆定區或IgG4恆定區的存在產生的真正差別，而認為是由於將更精確的抗體濃度測定用於IgG1動力學分析而造成。因此，認為本文提出的D2E7的IgG1形式的動力學值是該D2E7抗體最精確的動力學參數。
實施例2D2E7 CDR3域的丙氨酸掃描誘變通過標準方法沿著D2E7 VL區和D2E7 VH區的CDR3域導入一系列單丙氨酸突變。所述輕鏈突變示於圖1B(LD2E7*.A1、LD2E7*.A3，LD2E7*.A4、LD2E7*.A5、LD2E7*.A7和LD2E7*.A8，分別於該D2E7 VLCDR3的位置1、3、4、5、7或8具有一個丙氨酸突變)。所述重鏈突變示於圖2B(HD2E7*.A1、HD2E7*.A2、HD2E7*.A3、HD2E7*.A4、HD2E7*.A5、HD2E7*.A6、HD2E7*.A7、HD2E7*.A8和HD2E7*.A9，分別於該D2E7 VH CDR3域的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11具有一個丙氨酸突變)。將rhTNFα與由野生型D2E7 VL和D2E7 VH組成的抗體相互作用的動力學與下述組成的抗體的動力學比較1)野生型D2E7VL與丙氨酸置換的D2E7 VH配對；2)野生型D2E7 VH與丙氨酸置換的D2E7 VL配對；或3)丙氨酸置換的D2E7 VL與丙氨酸置換的D2E7 VH配對。所有的抗體都做為全長IgG4分子進行試驗。
按照實施例1所述通過表面等離子體激元共振測定抗體與rhTNFα相互作用的動力學。不同VH/VL配對的Koff速率概括於以下表5中
表5D2E7丙氨酸掃描突變體與生物素化rhTNFα的結合
這些結果證明該D2E7 VL區和VH區的CDR3域的大多數位置可以經受用單丙氨酸殘基置換。與野生型親本D2E7抗體相比，於該D2E7VL CDR3域的1、4、5或7位或於該D2E7 VHCDR3域的2、5、6、8、9或10位的單丙氨酸置換未顯著影響hTNFα結合的解離速率。於該D2E7VL CDR3的位置8或於該D2E7 VH CDR3的位置3的丙氨酸置換給出了快四倍的Koff，於D2E7 VH CDR3的4或11位的丙氨酸置換給出了快八倍的Koff，表明這些位點對與hTNFα結合更為關鍵。然而，於該D2E7 VLCDR3域的1、4、5、7或8位或於該D2E7 VH CDR3域的2、3、4、5、6、8、9、10或11位的單丙氨酸置換仍然產生一個具有不高於1×10-3的Koff的抗hTNFα抗體。
實施例3D2E7相關抗體的結合分析按照實施例1所述通過表面等離子體激元共振，分析與D2E7相比的其序列與D2E7相關的一系列抗體。測試的VL區的胺基酸系列示於圖1A和1B中。測試的VH區的胺基酸序列示於圖2A和2B中。各種VH/VL配對(在所示的形式中，或者做為全長IgG1或IgG4抗體或做為scFv)的Koff速率概括於以下表6中表6D2E7相關抗體與生物素化rhTNFα的結合
具有選自D2E7、LOE7、LOE7.T和LOE7.A的VL(它們在位置9或者有一個蘇氨酸或有丙氨酸)的全長抗體(即IgG形式)的慢解離速率(即Koff≤1×10-4sec-1)，表明該D2E7 VL CDR3的位置9可以由這二種殘基之一佔據而大致不影響Koff。因此，該D2E7 VL CDR3的共有基序包含胺基酸序列Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO3)。另外，具有選自D2E7、VH1-D2.N和VH1-D2.Y的VH(它們在位置12或者有酪氨酸或有天冬醯胺)的抗體的慢解離速率(即Koff≤1×10-4sec-1)，表明該D2E7VH CDR3的位置12可以由這二種殘基之一佔據而大致不影響Koff。因此，該D2E7 VH CDR3的共有基序包含胺基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D(Y/N)(SEQ ID NO4)。
示於表6中的結果證明，在scFv形式下，與含有該D2E7 VL或VHCDR3區的抗體相比，含有2SD4 VL或VH CDR3區的抗體表現出更快的Koff(即Koff≥1×10-3sec-1)。在該VL CDR3內，2SD4在2、5和9位與D2E7不同。然而，如上述討論，9位可以由Ala(如在2SD4中)或Thr(如在D2E7中)佔據而基本不影響Koff。因此，通過比較2SD4和D2E7，可以鑑定出該D2E7 VL CDR3的2和5位(都是精氨酸)對該抗體與hTNFα結合是關鍵的。這些殘基可以做為該抗體結合位點的接觸殘基直接參與或可以對保持在該區抗體分子的支架結構起關鍵作用。關於位置2的重要性，用Lys(在EP B12中)取代Arg(在LOE7中，它與D2E7具有相同的VL CDR3)以2倍係數加速解離速率。關於位置5的重要性，如實施例2所述，用Ala(在LD2E7*.A5)取代Arg(在D2E7中)亦加速解離速率2倍。另外，在2和5位均無Arg時(在2SD4中)，解離速率快5倍。然而，應注意儘管位置5對增強與hTNFα結合是重要的，但此位置的變化可以由其它位置的變化抵消，如在VLLOE4、VLLOH1或VL0.1H8中觀察到的。
在該VH CDR3中，2SD4在1、7和12位與D2E7不同。然而，如上述討論，12位可以由Asn(如在2SD4中)或Tyr(如在D2E7中)佔據而基本不影響Koff。因此，通過比較2SD4和D2E7，可以鑑定出該D2E7 VHCDR3的1和7位對與hTNFα結合是關鍵的。如上述討論，這些殘基可以做為該抗體結合位點的接觸殘基直接參與或可以對保持在該區抗體分子的支架結構起關鍵作用。這二個位置對與hTNFα結合都是重要的，因為使用3C-H2 VH CDR3(它相對於D2E7 VH CDR3而言，在位置1有一個纈氨酸變為丙氨酸的變化)時，該scFv的解離速率比用D2E7 VHCDR3時快3倍，但該解離速率仍然比使用2SD4 VH CDR3時慢4倍(它相對於D2E7 VH CDR3而言在位置1和7都有變化)。
實施例4D2E7的功能活性為檢查D2E7的功能活性，將該抗體用於幾個或者體外或者體內測定該抗體抑制hTNFα活性的能力的檢測之中。
A.在L929細胞中中和TNFα誘導的細胞毒性在培育18-24小時後，人重組TNFα(rhTNFα)引起對鼠L929細胞的細胞毒性。如下述通過共溫育抗體與rhTNFα和所述細胞，在L929檢測中評價人抗hTNFα抗體。將含有100μl抗hTNFαAbs的96孔微滴定板用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培養基沿著該板雙份進行1/3連續稀釋。加入50μl rhTNFα使每個樣品孔的最終濃度為500pg/ml。然後將所述板於室溫溫育30分鐘。接著，加入含有1μg/ml放線菌素D的50μlTNFα敏感型L929小鼠成纖維細胞，使最終濃度為每孔5×104細胞。對照包括培養基加細胞和rhTNFα加細胞。這些對照和範圍為2ng/ml至8.2pg/ml的一個TNFα標準曲線用於測定該檢測的質量並提供一個中和窗口。然後將這些板於37℃在5％CO2中培育過夜(18-24小時)。
從每個孔中取出100μl培養基，並加入50μlPBS中的5mg/ml溴化3，(4，4-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基-四唑鎓(MTT；可從Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO購得)。然後將這些板於37℃培育4小時。然後加入50μl的20％十二烷基硫酸鈉(SDS)至每個孔中，並將這些板於37℃培育過夜。測定570/630nm的光密度，為每個樣品繪製曲線並通過標準方法確定IC50。
與鼠MAK 195mAb的相比，具有各種VL和VH配對的人抗體的代表性的結果示於圖3和下表7中。
表7中和TNFα誘導的L929細胞毒性
圖3和表7中的結果證明，該D2E7人抗hTNFα抗體和各種D2E7相關抗體以與鼠抗hTNFαmAb MAK 195基本相等的能力中和TNFα誘導的L929細胞毒性。
在另一系列實驗中，按照上述檢查了D2E7的IgG1形式中和TNFα誘導的L929細胞毒性的能力。在以下表8中概括了三個獨立實驗的結果及其平均值表8D2E7 IgG1中和TNFα誘導的L929細胞毒性
該系列實驗證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.25±0.01×10-10中和TNFα誘導的L929細胞毒性。
B.抑制TNFα與U-937細胞上的TNFα受體結合使用表達hTNFα受體的人組織細胞系U-937細胞系(ATCC No.CRL 1593)檢測人抗hTNFα抗體抑制hTNFα與細胞表面hTNFα受體結合的能力。將U-937生長於RPMI 1640培養基中，該培養基添加了10％胎牛血清(Hyclone A-1111，Hyclone Laboratories，Logan，UT)、L-穀氨醯胺(4nM)、HEPES緩衝液(10mM)、青黴素(100μg/ml)和鏈黴素(100μl/ml)。為檢測全長IgG抗體的活性，用添加了1mg/ml人IgG(Sigma I-4506，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的PBS在冰上預培養U-937細胞45分鐘，然後用結合緩衝液清洗細胞三次。為進行受體結合檢測，將U-937細胞(5×106細胞/孔)在96孔微滴定板(Costar 3799，Costar Corp.，Cambridge，MA)中的結合緩衝液(PBS，添加了0.2％牛血清白蛋白)與125I標記的rhTNFα(3×10-10M；25μCi/ml；得自NEN Research Products，Wilmington，DE)、加或不加抗hTNFα抗體、總體積為0.2ml中溫育。將該板在冰上培養1.5小時。然後，將各75μl的樣品轉移至含有鄰苯二甲酸二丁酯(Sigma D-2270，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和鄰苯二甲酸二癸酯(ICN 210733，ICN，Irvine，CA)的1.0ml試管(Sarstedt 72.700，Sarstedt Corp.，Princeton，NJ)。所述試管分別含有體積比為2∶1的鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二癸酯的300μl混合物。通過微量離心5分鐘除去游離的(即未結合的)125I標記的rhTNFα。然後，藉助微試管剪刀(Bel-Art 210180001，Bel-Art Products，Pequannock，NJ)剪下每個含有細胞沉澱的試管末端。該細胞沉澱含有與p60或p80 TNFα受體結合的125I標記的rhTNFα，而油混合物上的水相則含有多餘的游離125I標記的rhTNFα。將所有的細胞沉澱收集於計數管(Falcon 2052，BectonDickinson Labware，Lincoln Park，NJ)並於閃爍計數器中計數。
代表性的結果示於圖4。在這些實驗中，D2E7對hTNFα與U-937細胞上的hTNFα受體結合的抑制的IC50值為約3×10-10M。這些結果證明該D2E7人抗hTNFα抗體以與鼠抗hTNFαmAb MAK 195基本相同的濃度抑制rhTNFα與U-937細胞上的hTNFα受體結合。
在另一系列實驗中，按照上述檢測了D2E7的IgG1形式抑制rhTNFα與U-937細胞上的hTNFα受體結合的能力。在以下表9中概括了三個獨立實驗的結果及其平均值表9D2E7 IgG1抑制U-937
該系列實驗證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.56±0.12×10-10抑制U-937細胞上TNF受體結合。
為研究D2E7對125I-rhTNF與單個p55和p75受體結合抑制的能力，進行固相放射免疫檢測。為測定D2E7對獨立TNF受體的IC50值，將各種濃度的該抗體與3×10-10濃度的125I-hTNF一同培育。然後以劑量依賴性方式在含有或者p55 TMF受體或者p75 TNF受體的獨立平板上檢測該混合物。結果概括於下表10表10D2E7 IgG1對TNF受體與p55和p75 TNFR結合的抑制
由D2E7對125I-rhTNF與U937細胞上的p55和p75TNF受體的結合抑制遵循簡單的S形曲線，表明每個受體的IC50值相似。在用重組TNF受體的固相放射免疫檢測(RIA)實驗中，D2E7對125I-rhTNF與所述p55和p75受體結合抑制的IC50值分別計算為1.47×10-9和1.26×10-9M。在固相中IC50值的降低可能是因為在該RIA形式中受體密度較高，而未標記rhTNFα亦以類似IC50值進行抑制。未標記rhTNF對125I-rhTNF與p55和p75受體結合抑制的IC50值分別為2.31×10-9和2.70×10-9。
C.抑制ELAM-1在HUVEC上表達通過用rhTNFα處理，可以誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在其表面表達內皮細胞白細胞粘附分子(ELAM-1)，通過用鼠抗人ELAM-1抗體與rhTNFα處理的HUVEC反應可以檢測到該分子。如下述檢測人抗hTNFα抗體抑制該TNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上表達的能力將HUVEC(ATCC No.CRL 1730)平板接種於96孔平板(5×104細胞/孔)並於37℃培養過夜。第二天，以20-100μg/ml抗體為起點，在微滴定板中進行人抗hTNFα抗體的連續稀釋(1∶10)。製備4.5ng/ml的rhTNFα貯液，將等份的rhTNFα加入每個含有抗體的孔中，並徹底混合內容物。對照包括培養基自身、培養基加抗hTNFα抗體和培養基加rhTNFα。將HUVEC平板從其37℃過夜培養中移出，並溫和地從每個孔中吸出培養基。向所述HUVEC平板的每個孔中轉移200μl的該抗體-rhTNFα混合物。然後將所述HUVEC平板在37℃再培育4小時。接著，將鼠抗ELAM-1抗體貯液在RPMI中稀釋1∶1000。從該HUVEC平板的每個孔中溫和地吸出培養基，加入50μl/孔的該抗ELAM-1抗體溶液並於室溫將所述HUVEC平板培育60分鐘。在RPMI中製備125I標記的抗鼠Ig抗體溶液(約50,000cpm/50μl)。將所述HUVEC平板的每個孔中的培養基溫和地吸出，用RPMI清洗這些孔二次，然後向每個孔中加入50μl的125I標記的抗鼠Ig溶液。將所述平板於室溫培育1小時，然後用RPMI清洗每個孔三次。向每個孔中加入180μl的5％SDS以裂解所述細胞。將每個孔中的溶胞物轉移至試管中並於閃爍計數器中計數。
代表性結果示於圖5中。在這些實驗中，D2E7對hTNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上表達的抑制的IC50值為約6×10-11M。這些結果證明該D2E7人抗hTNFα抗體以與鼠抗hTNFαmAb MAK 195基本相同的濃度抑制hTNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上的表達。
在另一系列實驗中，按照上述檢測了D2E7的IgG1形式抑制hTNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上的表達的能力。在以下表11中概括了三個獨立實驗的結果及其平均值表11D2E7 IgG1受體抑制TNFα誘導的ELAM-1表達
該系列實驗證明，全長IgG1形式的D2E7以平均IC50[M]為1.85±0.14×10-10抑制TNFα誘導的ELAM-1在HUVEC上的表達。
亦檢測了D2E7 IgG1對rhTNF誘導的其它二種粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達的中和能力。因為於16小時的ICAM-1表達的rhTNF效價曲線與ELAM-1表達的曲線非常相似，因此在該抗體中和實驗中使用了同樣濃度的rhTNF。在各種濃度的D2E7存在下，將HUVEC與rhTNF於37℃ CO2培養箱中培養16小時，通過鼠抗ICAM-1抗體後加125I標記的羊抗鼠抗體測定ICAM-1的表達。進行二次獨立的實驗並計算IC50值。一種不相關人IgG1抗體沒有抑制該ICAM-1表達。
測試VCAM-1表達抑制的實驗程序與用於ELAM-1表達的程序相同，但是使用了抗VCAM-1 MAb代替抗ELAM-1 MAb。進行了三次獨立的實驗並計算IC50值。一種不相關人IgG1抗體沒有抑制該VCAM-1表達。
結果概括於下表12中表12D2E7 IgG1抑制ICAM-1和VCAM-1表達
這些實驗證明用rhTNF處理原代人臍靜脈內皮細胞導致粘附分子的最佳表達ELAM-1H和VCAM-1在第4小時，ICAM-1的最大向上調節表達在第16小時。D2E7能夠以劑量依賴性方式抑制這三種粘附分子的表達。抑制ELAM-1、ICAM-1和VCAM-1的IC50值分別是1.85×10-10、2.17×10-10和1.01×10-10M。這些值非常相似，表明誘導ELAM-1、ICAM-1和VCAM-1表達對rhTNF激活信號劑量的要求相似。有意義的是，D2E7在該ICAM-1表達的較長久的抑制檢測中有相似效力。該ICAM-1抑制檢測需要將rhTNF和D2E7與HUVEC共培育16小時，與之相反，ELAM-1和VCAM-1抑制檢測需要4小時。因為D2E7對rhTNF有慢解離速率，可以相信在該16小時共培育期間在HUVEC上的TNF受體沒有顯著競爭。
D.體內中和hTNFα使用了三種不同的體內系統以證明D2E7有效地在體內抑制hTNFα活性。
I.在D-半乳糖胺致敏的小鼠中抑制TNF誘導的致死性給D-半乳糖胺致敏的小鼠注射重組人TNFα(rhTNFα)導致在24小時內的致死性。已表明TNFα中和劑可以在此模型中防止致死性。為檢測人抗hTNFα抗體在此模型中體內中和hTNFα的能力，用PBS中的各種濃度的D2E7-IgG1或對照蛋白腹膜內注射C57B1/6小鼠。30分鐘後，用PBS中的1μg rhTNFα和20mg D-半乳糖胺腹膜內注射攻擊小鼠，並於24小時後觀察。已預先確定這些量的rhTNFα和D-半乳糖胺在這些小鼠中達到80-90％的致死性。
代表性結果以存活百分比對抗體濃度做成柱狀圖表示於圖6中。實心柱代表D2E7，而空心柱代表MAK 195。每隻小鼠注射2.5-25μgD2E7抗體保護這些動物不受TNFα誘導的致死性影響。ED50值約為1-2.5μg/小鼠。陽性對照抗體MAK 195在保護能力方面相似。在沒有rhTNFα的情況下注射D2E7對小鼠沒有任何有害影響。注射非特異性人IgG1抗體沒有提供任何免於TNFα誘導的致死性的保護。
在第二個實驗中，將49隻小鼠分成7個相等的組。每組在接受LD80劑量的rhTNF/D-半乳糖胺混合物(1.0μg rhTNF和20mg D-半乳糖胺/小鼠)的30分鐘之前接受了各種劑量的D2E7。對照組7接受了25μg/小鼠劑量的正常人IgG1κ抗體。24小時後檢查小鼠。各組的存活率概括於下表13中。
表13用D2E7處理24小時後的存活率
II.抑制TNF誘導的兔發熱檢測了D2E7抑制rhTNF誘導的兔發熱反應的效力。用D2E7、rhTNF和D2E7與rhTNF的免疫複合物靜脈注射三隻一組重約2.5kg的每一隻NZW雌兔。用Kaye熱記錄儀的熱敏電阻探頭測定每分鐘的直腸溫度約4小時。在注射後約45分鐘，鹽水中的以5μg/kg注射的重組人TNF導致溫度上升超過0.4℃。直至注射後140分鐘，溶於鹽水並以138μg/kg劑量單獨的抗體製劑沒有導致兔子溫度上升。在所有的進一步實驗中，將D2E7或對照試劑(人IgG1或鹽水載體)靜脈注射給兔子。並於15分鐘後靜脈注射鹽水中5μg/kg的rhTNF。幾個實驗的代表性結果概括於下表14
表14用D2E7在兔子中抑制rh-TNF誘導的發熱
*＝峰值溫度**＝抑制百分比＝(1-{使用rhTNF和D2E7時的溫度上升/僅使用rhTNF時的溫度上升})×100與僅用鹽水預治療的兔子相比，用14μg/kg的劑量的D2E7靜脈預治療部分地抑制該熱原反應。以137μg/kg給與的D2E7在同一實驗中完全抑制了rhTNF的熱原反應。在第二個實驗中，與僅用鹽水預治療的兔子相比，以24μg/kg給與的D2E7亦部分地抑制該熱原反應。在這個實驗中，D2E7與rhTNF的摩爾比是1/6∶1。在第三個實驗中，與鹽水中的30μg/kg的對照人IgG1預治療的兔子相比，以48μg/kg(摩爾比D2E7∶rhTNF＝3.3∶1)靜脈注射的D2E7完全抑制了該熱原反應。在最後一個實驗中，用很高D2E7∶rhTNF(55∶1)摩爾比的D2E7(792μg/kg)預治療的兔子在直至觀察的4個小時內的任何時刻體溫都升高。用將D2E7和rhTNF的混合物(摩爾比55∶1)於37℃培育1小時製備的免疫複合物治療兔子亦未引起在同一實驗中的任何溫度上升。
III.在Tg197轉基因小鼠中預防多關節炎在轉基因鼠關節炎模型中研究D2E7對疾病發展的影響。已製備表達人野生型TNF(在所述編碼序列的3』區內修飾)的轉基因小鼠(Tg197)，並且這些小鼠在4-7周齡時100％發生慢性多關節炎(參見EMBO J.(1991)104025-4031有關多關節炎Tg197模型的進一步描述)。
通過PCR在年齡為三天時識別轉基因動物。將一窩轉基因小鼠分成六組。在年齡為15天時通過槽印跡雜交分析確認轉基因小鼠。按下述程序治療這六個組1組＝未治療；2組＝鹽水(載體)；3組＝1.5μg/g的D2E7；4組＝15μg/g的D2E7；5組＝30μg/g的D2E7；和6組＝30μg/g的IgG1同種型對照。將一窩非轉基因小鼠亦包括於本研究中做為對照(7組-非轉基因；未治療)。每組每周接受指明的治療的三次腹膜內注射。注射持續10周。每周，記錄每個動物的關節形態的宏觀變化。第10周時，處死所有的小鼠並將小鼠組織收集於福馬林中。對該組織進行顯微鏡檢查。
在每周開始時記錄每隻小鼠的動物重量克數。同時記錄測定的關節尺寸(mm)以做為疾病嚴重性的尺度。用測微儀三次測定後右踝的平均值做為關節尺寸。每周按照下述記錄關節分數0＝無關節炎，(正常外觀和彎曲)；+＝輕微關節炎(關節變形)；++＝中等關節炎(腫脹，關節變形)和+++＝嚴重關節炎(在屈曲檢測到關節強硬和嚴重運動受損)。根據關節切片的蘇木精/曙紅染色的組織病理學計分按下述進行0＝未檢測到疾病；1＝滑膜增生；2＝嚴重滑液加厚；3＝軟骨破壞和骨侵蝕。
D2E7治療對該Tg197轉基因關節炎小鼠的平均關節尺寸的影響示於圖9的曲線圖中。11周齡時該Tg197轉基因小鼠的組織病理學和關節炎計分概括於下表15中
表15D2E7對Tg197小鼠組織病理學和關節炎計分的影響
該實驗證明D2E7抗體對表達野生型人TNF的轉基因小鼠(Tg197)具有明確有益效果，在本研究時期後沒有可證實的關節炎。
E.D2E7中和來自其它物種的TNFα利用L929細胞毒性檢測(如上述實施例4A小節所述)，通過檢測D2E7中和來自各種靈長類物種和來自小鼠的腫瘤壞死因子檢測其結合特異性。結果概括於下表16中
表16D2E7在L929檢測中中和來自不同物種TNF的能力
表16中的結果證明，D2E7可以以約等於人TNFα的情況中和五種靈長類TNFα的活性，而且可以中和犬TNFα(約比人TNFα差10倍)、豬和鼠TNFα(約比人TNFα差～1000倍)。另外，D2E7與溶液相rhTMFα的結合未受其它細胞因子(例如淋巴細胞毒素(TNFβ)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFNγ和TGFβ)抑制，表明D2E7對其配體TNFα具有非常的特異性。
F.用D2E7培育的人全血缺乏細胞因子釋放在該實施例中，檢測了D2E7本身誘導正常人血液細胞分泌細胞因子或排出細胞表面分子的能力。將D2E7與來自三個不同正常獻血者的稀釋全血於不同濃度培育24小時。同時進行LPS陽性對照，其濃度已預先確定可以刺激免疫活性血細胞分泌細胞因子。收集上清液並在有10種可溶性細胞因子、受體和粘附分子(IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗劑、IL-6、IL-8、TNFα、可溶性TNFα受體I、可溶性TNFα受體II、可溶性ICAM-1和可溶性E-selectin)的ELISA藥盒嵌板中檢測。直至濃度為343μg/ml，由於D2E7抗體共培育的結果，沒有檢測到顯著數量的細胞因子或排出細胞表面分子。未加入該抗體的對照培養物亦未產生可檢測量的細胞因子，而LPS共培養對照產生了pg至ng範圍的較高的值。這些結果表明D2E7沒有誘導全血細胞離體培養中分泌高出正常水平的細胞因子或排出細胞表面蛋白。
所附的順序表構成了本說明書的一部分，該表的內容概括於下表中
等價物僅僅使用常規實驗，本領域技術人員將會識別或能夠確定許多與本文描述的本發明的具體實施方案的等價物。這種等價物包括於下列權利要求之內。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)收信人BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl-Bosch Str.38(C)城市67056 Ludwigshafen(D)州 Rheinland-Pfalz(E)國家 德意志聯邦共和國(ii)發明名稱結合人TNFα的人抗體(iii)序列數37(iv)通信地址(A)收信人LAHIVE COCKFIELD(B)街道60 State Street，suite 510(C)城市波士頓(D)州麻省(E)國家美國(F)郵政編碼02109-1875(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)當前申請數據(A)申請號(B)提交日期(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號US 08/599,226
(B)提交日期1996年2月9日(vii)在先申請數據(A)申請號US 60/031,476(B)提交日期1996年11月25日(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名DeConti，Giulio A.，Jr.
(B)註冊號31,503(C)參考/檔案號BBI-043CPPC(ix)電訊資料(A)電話(617)227-7400(B)傳真(617)227-5941(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特徵(A)長度107個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO2的信息(i)順序特徵(A)長度121個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120
(2)SEQ ID NO3的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ii)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置9(D)其它信息/注釋＝「Xaa為Thr或Ala」(xi)順序描述SEQ ID NO3Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置12(D)其它信息/注釋＝「Xaa為Tyr或Asn」
(xi)順序描述SEQ ID NO4Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO5的信息(i)順序特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ii)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO5Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5(2)SEQ ID NO6的信息(i)順序特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO6Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu1 5 10 15Gly
(2)SEQ ID NO7的信息(i)順序特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO7Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala1 5 10(2)SEQ ID NO8的信息(i)順序特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO8Asp Tyr Ala Met His1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)順序特徵(A)長度107個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO9Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr85 90 95Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO10的信息(i)順序特徵(A)長度121個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO11的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO11Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO12的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO12Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5(2)SEQ ID NO13的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO13Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部
(xi)順序描述SEQ ID NO14Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO15的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO15Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO16的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO16Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO17的信息(i)順序特徵
(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO17Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr1 5(2)SEQ ID NO18的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO18Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn1 5(2)SEQ ID NO19的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽
(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO19Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO20的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO20Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn1 5(2)SEQ ID NO21的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO21Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser1 5(2)SEQ ID NO22的信息
(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO22Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr1 5(2)SEQ ID NO23的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO23Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO24的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性
(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO24Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO25的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO25Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO26的信息(i)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO26Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5
(2)SEQ ID NO27的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO27Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10(2)SEQ ID NO28的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO28Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO29的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO29Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO30的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO30Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp1 5 10(2)SEQ ID NO31的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部
(xi)順序描述SEQ ID NO31Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO32的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO32Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO33的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO33Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO34的信息(i)順序特徵
(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO34Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO35的信息(i)順序特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)順序描述SEQ ID NO35Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10(2)SEQ ID NO36的信息(i)順序特徵(A)長度321個核苷酸(B)類型核酸(C)類型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA
(xi)順序描述SEQ ID NO31GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGGGA CAGAGTCACC 60ATCACTTGTC GGGCAAGTCA GGGCATCAGA AATTACTTAG CCTGGTATCA GCAAAAACCA120GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCACTT TGCAATCAGG GGTCCCATCT180CGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTACAGCCT240GAAGATGTTG CAACTTATTA CTGTCAAAGG TATAACCGTG CACCGTATAC TTTTGGCCAG300GGGACCAAGG TGGAAATCAA A 321(2)SEQ ID NO37的信息(i)順序特徵(A)長度363個核苷酸(B)類型核酸(C)類型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)順序描述SEQ ID NO31GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CCGGCAGGTC CCTGAGACTC 60TCCTGTGCGG CCTCTGGATT CACCTTTGAT GATTATGCCA TGCACTGGGT CCGGCAAGCT120CCAGGGAAGG GCCTGGAATG GGTCTCAGCT ATCACTTGGA ATAGTGGTCA CATAGACTAT180GCGGACTCTG TGGAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAT240CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCTGAGGAT ACGGCCGTAT ATTACTGTGC GAAAGTCTCG300TACCTTAGCA CCGCGTCCTC CCTTGACTAT TGGGGCCAAG GTACCCTGGT CACCGTCTCG360AGT 36權利要求
1.一種體外抑制人TNFα活性的方法，該方法包括將人TNFα與抗體接觸使得人TNFα活性被抑制，其中所述抗體是分離的人抗體或其抗原結合部分，由表面等離子體激元共振測定，以不高於1×10-8M的Kd和不高於1×10-3s-1的Koff速率常數與人TNFα解離，並在一標準體外L929檢測中以不高於1×10-7M的IC50中和人TNFα細胞毒性。
2.權利要求1的方法，其中抗體是分離的人抗體或其抗原結合部分，其還具有下列特徵a)具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列，或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO3修飾得到的胺基酸序列；b)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列，或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO4修飾得到的胺基酸序列。
3.權利要求1的方法，其中抗體是分離的人抗體或其抗原結合部分，其具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)，和包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)。
4.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分，由表面等離子體激元共振測定，以不高於1×10-8M的Kd和不高於1×10-3s-1的Koff速率常數與人TNFα解離，並在一標準體外L929檢測中以不高於1×10-7M的IC50中和人TNFα細胞毒性，並且抗體被施用給人受治療者使得人受治療者中人TNFα活性被抑制。
5.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分具有下列特徵a)由表面等離子體激元共振測定，以不高於1×10-3s-1的Koff速率常數與人TNFα解離；b)具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列，或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO3修飾得到的胺基酸序列；c)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列，或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO4修飾得到的胺基酸序列；其中抗體被施用給人受治療者使得人受治療者中人TNFα活性被抑制。
6.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)，和包含SEQID NO2的胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)，其中抗體被施用給人受治療者使得人受治療者中人TNFα活性被抑制。
7.抗體D2E7在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中抗體被施用給人受治療者使得人受治療者中人TNFα活性被抑制。
8.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫疾病。
9.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是傳染病。
10.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是移植排斥或移植物抗宿主病。
11.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是惡性腫瘤。
12.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是肺功能紊亂。
13.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是腸功能紊亂。
14.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是心臟功能紊亂。
15.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是膿毒症。
16.權利要求1 5的用途，其中抗體與細胞因子白介素-6(IL-6)一同向該人類受治療者給藥，或者將該抗體給與血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml的人受治療者。
17.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是類風溼性關節炎。
18.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是類風溼性脊椎炎。
19.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是骨關節炎。
20.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是痛風性關節炎。
21.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是變態反應。
22.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是多發性硬化症。
23.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫性糖尿病。
24.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫性眼色素層炎。
25.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是腎病綜合症。
26.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是炎症性骨病。
27.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是骨吸收疾病。
28.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是酒精性肝炎。
29.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是病毒性肝炎。
30.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是凝結紊亂。
31.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是燒傷。
32.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是再灌注損傷。
33.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是瘢痕疙瘩形成。
34.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是瘢痕組織形成。
35.權利要求4、5、6、7中任一權項的用途，其中紊亂是發熱。
36.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分，由表面等離子體激元共振測定，以不高於1×10-8M的Kd和不高於1×10-3s-1的Koff速率常數與人TNFα解離，並在一標準體外L929檢測中以不高於1×10-7M的IC50中和人TNFα細胞毒性，並且抗體被施用給受治療者使得紊亂被治療。
37.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分具有下列特徵a)由表面等離子體激元共振測定，以不高於1×10-3s-1的Koff速率常數與人TNFα解離；b)具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO3的胺基酸序列，或通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO3修飾得到的胺基酸序列；c)具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO4的胺基酸序列，或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的1至5個保守胺基酸置換由SEQ ID NO4修飾得到的胺基酸序列；其中抗體被施用給受治療者使得紊亂被治療。
38.分離的人抗體或其抗原結合部分在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中分離的人抗體或其抗原結合部分具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)，和包含SEQID NO2的胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)，其中抗體被施用給受治療者使得紊亂被治療。
39.抗體D2E7在製備用於治療其中TNFα活性是有害的紊亂的藥物中的用途，其中抗體被施用給受治療者使得紊亂被治療。
40.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫疾病。
41.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是傳染病。
42.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是移植排斥或移植物抗宿主病。
43.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是惡性腫瘤。
44.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是肺功能紊亂。
45.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是腸功能紊亂。
46.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是心臟功能紊亂。
47.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是膿毒症。
48.權利要求46的用途，其中抗體與細胞因子白介素-6(IL-6)一同向該人類受治療者給藥，或者將該抗體給與血清或血漿IL-6濃度超過500pg/ml的人受治療者。
49.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是類風溼性關節炎。
50.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是類風溼性脊椎炎。
51.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是骨關節炎。
52.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是痛風性關節炎。
53.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是變態反應。
54.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是多發性硬化症。
55.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫性糖尿病。
56.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是自身免疫性眼色素層炎。
57.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是腎病綜合症。
58.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是炎症性骨病。
59.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是骨吸收疾病。
60.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是酒精性肝炎。
61.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是病毒性肝炎。
62.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是凝結紊亂。
63.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是燒傷。
64.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是再灌注損傷。
65.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是瘢痕疙瘩形成。
66.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是瘢痕組織形成。
67.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是發熱。
68.權利要求4、5、6、7、36、37、38、39中任一權項的用途，其中分離的人抗體與藥用載體結合。
69.權利要求4、5、6、7、36、37、38、39中任一權項的用途，其中分離的人抗體與至少一種附加的治療藥劑一起施用。
70.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中受治療者是人。
71.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是膿毒症性休克。
72.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是內毒素性休克。
73.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是革蘭氏陰性膿毒症。
74.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是毒性休克綜合症。
75.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是瘧疾。
76.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是腦膜炎。
77.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是惡病質。
78.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是AIDS。
79.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是細菌性腦膜炎。
80.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是AIDS相關綜合症(ARC)。
81.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是移植繼發的巨細胞病毒感染。
82.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是因感染引起的發燒和肌痛和感染繼發的惡病質。
83.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是同種移植排斥。
84.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是刺激腫瘤生長。
85.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是在惡性腫瘤中增強轉移潛力和介導細胞毒性。
86.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是抑制腫瘤生長或轉移。
87.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是成人呼吸窘迫綜合症。
88.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是休克肺。
89.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是慢性肺炎。
90.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是肺結節病。
91.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是肺纖維化。
92.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是矽肺。
93.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是炎症性腸功能紊亂。
94.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是特發性炎症性腸病。
95.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是局限性迴腸炎。
96.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是潰瘍性結腸炎。
97.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是心臟局部缺血。
98.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是心臟功能不全。
99.權利要求36、37、38、39中任一權項的用途，其中紊亂是肝炎。
100.一種重組的人抗體或其抗原結合部分，其中和人TNFα而非人TNFβ活性。
101.編碼輕鏈CDR3域的分離核酸，所述CDR3域包含SEQ IDNO3的胺基酸序列，或包含通過於位置1、4、5、7或8的單丙氨酸置換或通過於位置1、3、4、6、7、8和/或9的一至五個保守胺基酸置換由SEQID NO3修飾得到的胺基酸序列。
102.權利要求101的分離核酸，其編碼抗體輕鏈可變區(LCVR)，優選地其中抗體LCVR的CDR2域包含SEQ ID NO5的胺基酸序列，更優選地其中抗體LCVR的CDR1域包含SEQ ID NO7的胺基酸序列。
103.編碼重鏈CDR3域的分離核酸，所述CDR3域包含SEQ IDNO4的胺基酸序列，或包含通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10或11的單丙氨酸置換或通過於位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12的一至五個保守胺基酸置換由SEQ ID NO4修飾得到的胺基酸序列。
104.權利要求103的分離核酸，它編碼抗體重鏈可變區(HCVR)，優選地抗體HCVR的CDR2域包含SEQ ID NO6的胺基酸序列，更優選地抗體HCVR的CDR1域包含SEQ ID NO8的胺基酸序列。
105.編碼CDR3域的分離核酸，所述CDR3域包含選自下列的胺基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQID NO34。
106.一種分離核酸，其編碼包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的抗體輕鏈可變區，優選地其編碼抗體輕鏈可變區和抗體輕鏈恆定區。
107.權利要求106的分離核酸，它位於重組表達載體中。
108.一種分離核酸，其編碼包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的抗體重鏈可變區，優選地其編碼抗體重鏈可變區和抗體重鏈恆定區。
109.權利要求108的分離核酸，其中抗體重鏈恆定區是IgG1恆定區或IgG4恆定區。
110.權利要求109的分離核酸，它位於重組表達載體中。
111.一種重組表達載體，其編碼a)具有包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的可變區的抗體輕鏈；和b)具有包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的可變區的抗體重鏈。
112.一種宿主細胞，其導入了權利要求111的重組表達載體。
113.一種合成人抗體的方法，所述人抗體結合人TNFα，所述方法包括在培養基中培養權利要求112的宿主細胞，直至細胞合成出結合人TNFα的人抗體。
全文摘要
公開了特異性與人腫瘤壞死因子α(hTNFα)結合的人抗體，最好為重組人抗體。這些抗體對hTNFα具有高親和性(例如，K
文檔編號A61K31/57GK1504752SQ03100958
公開日2004年6月16日 申請日期1997年2月10日 優先權日1996年2月9日
發明者J·G·薩菲爾德, J G 薩菲爾德, D·J·阿倫, 阿倫, Z·凱馬克卡蘭, 碸絲 , B·拉布科夫斯基, 伎品蛩夠, J·A·曼克維, 曼克維, B·T·麥圭內斯, 麥圭內斯, A·J·羅伯茨, 羅伯茨, P·薩克拉法斯, 死 ㄋ, H·R·J·M·霍根布姆, J M 霍根布姆, D·舍恩豪特, 骱撈, T·J·沃漢, 沃漢, M·懷特, 維爾頓, A·J·維爾頓 申請人:艾博特實驗室(百慕達)有限公司