病毒疫苗的製作方法

2023-11-01 16:53:27 1

專利名稱:病毒疫苗的製作方法
本發明是與血清學上可鑑定的病毒疫苗有關。本發明的疫苗可用以鑑別被有毒的野生型病毒感染的動物和用血清學上與疫苗病毒不同的病毒接種過的動物。
假狂犬病病毒(PRV)是一種能感染全球的多種動物的病毒。pRV感染被不同地稱為傳染性延髓麻痺，假狂犬病以及狂癢病(mad ilch)。已經知道它是在重要的家畜中傳染，如豬，牛，狗，貓，羊，大鼠及水貂。宿主範圍很廣，包括大多數哺乳類動物以及至少在實驗上還包括多種鳥類。(宿主詳見D.P.Gustafson，「Pseudorabies」，in Diseases of Swine，5th ed.，A.D.Leman et al.，eds.，(1981))。此病對大多數被感染動物是致命的。但成年豬，可能還有大鼠感染此病但並不死亡，因此是此病的帶毒者。
豬群對PRV特別敏感。儘管成年豬感染此病後極少出現症狀或死亡，但當小豬感染時則急性發病。結果常於24-48小時內死亡，且常無特異的臨床病症。(T.C.Jones and R.D.Hunt，Veterinary Pathology，5th ed.，Lea Febiger(1983))。
已用種種技術生產PRV疫苗並在歐洲流行地區接種已進行15年以上。接種後可使損失減少，但接種使在環境中仍保留病毒。尚未生產出預防感染的疫苗。把接過種的動物暴露於有毒性的病毒中可免於感染，然後散發更多的有毒性的病毒。由此接過種的動物可以懷有一個潛伏感染，它能再次突然發作(D.P.Gustafson，上述)。
PRV的減毒活疫苗或失活疫苗在美國已有市售，已被USDA批准，(見C.E.Aronson，ed.，Veterinary Pharmaceuticals Biologicals，(1983)〕。
由於成年豬是PRV的帶毒者，許多國家已建立測試感染動物的篩選方案。問題在於如何區別攜帶有毒性病毒的動物和接種過的動物。毒性病毒與疫苗中所用的病毒在抗原外形上是相同的，故不可能在感染動物與接種過的動物間加以區別。因此，對於血清學陽性的豬的處理的一些規定，將也適用於接種過的和以前感染PRV的豬兩者(C.E.Aronson，上述)。
PRV是一種皰疹病毒，通常瘡疹病毒是屬於動物病毒中最複雜的。其基因組至少編碼50種病毒特異性蛋白質，並含有150，000個以上的核苷酸。
糖蛋白是皰疹病毒中免疫活性最強的蛋白質，其中在病毒粒膜以及被感染的細胞膜中發現。論述PRV糖蛋白的文獻涉及至少四種病毒糖蛋白(T.Ben-porat and A.S.Kaplan，Virology，41，pp.265-73(1970);A.S.Kaplan and T.Ben-Porat，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，66，pp.799-806(1970))。
報導有幾種皰疹病毒分泌糖蛋白，進入被感染的細胞的培養基裡。單純皰疹病毒(HSV)釋放糖蛋白C和糖蛋白D的幾種截斷形式至培養基。(B.Norrild and B.F.Vestergaard，Intervirology，11，pp.104-10(1979);R.E.Randall，et al.，J.Gen.Virol.，48，pp.297-310(1980))。Marek病病毒釋放相當量的病毒粒子的糖蛋白A至培養基(D.Van Zaane，et al.，病毒學，121，116-32頁(1982);saimiri皰疹病毒也釋放一種病毒粒子糖蛋白至培養基(R.E.Randall and R.W.Honess，J.Gen.Virol.，51，pp.445-49(1980))。有報導PRV釋放出進入介質的一種糖蛋白並不與病毒顆粒結合(T.Ben-porat and A.S.Kaplan，Virology，41，pp.265-73(1970);T.J.Rea，et al.，J.Virol.，54，pp.21-29(1985))。
分泌至介質的PRV蛋白已被稱為3a(T.Ben-Porat and A.S.Kaplan，上述)，也被稱為糖蛋白X(gx)(T.J.Rea，et al.，上述)，由PRV感染的細胞中分離到的gx，具有以下特徵(1)它在PRV感染動物細胞培養的培養基中是主要蛋白質。
(2)它是一種糖蛋白。
(3)其分子量在SDS聚丙醯胺凝膠上約為95Kd。
(4)它是一種硫酸化的蛋白質。
(5)它溶於約1%過氯酸，以及(6)它在標準的實驗小鼠上是致免疫的。
本發明克服前述有關的問題，例如在篩選PRV感染豬時，通過提供一種免疫學不同於野生型病毒的PRV毒株，以區別被接種與受感染的動物，而不必殺死受試的動物。
這些抗原與疫苗病毒的不同是由於缺失一個或更多的可測定的抗原性多肽的結果。這些遺傳改變的結果，使有可能在血清形象的基礎上從免疫學上區別感染與接種過的動物，而不需殺死受試動物。
(M.W.Wathen and L.K.Watnen，J.Virol.，51，pp.57-62(1984)提到一種PRV，含有突變病毒糖蛋白(gp50)以及應用中針對GP50單克隆抗體的選擇突變體的方法。Wathen and Wathen並未敘述使用這種病毒做為疫苗。此外，被該病毒免疫的動物與受感染的動物在血清學上是難以區別的。
T.C.Holland，等，J.Virol.，45，pp.672-82(1983)提到用特異性糖蛋白單克隆抗體選出的HSV的抗原變種。兩種不能表達HSV糖蛋白gc的變種是包括在選出的變種中。Holland等也未講到或建議這些變種用作疫苗。
歐洲專利公開號0133200述及，一種診斷性抗原因子與某種外源凝集素結合的PRV糖蛋白亞單位疫苗一起，用於區別PRV的帶毒者與非帶毒者。
歐洲專利公開號0074808提及，在通過採用包括皰疹性病毒胸苷激酶基因的可選擇的DNA序列，特異性的DNA序列的插入、缺失或取代，可以穩定地在真核生物細胞或病毒基因組中穩定地產生。PRV位於所列舉容易操作的基因組中。其它有關的出版物也提出類似方法〔L.E.Post and B.Roizman，「在大基因組中刪除特異基因的通用技術1型單純皰疹病毒的α-基因22對生長是不必需的」，Cell，25，227-232(1981)〕，這些文件中提出的方法被用於生產本發明的PRV，見下述。
A.J.M.Berns和A.L.J.Gielkens，歐洲專利公開號0141458報導，PRV的缺失突變體，此項缺失不是在編碼分泌的糖蛋的基因裡。此外，Berns既未建議也未描述這類突變體用於在血清學上區別疫苗及野生型病毒。
A.L.J.Gielkere等，「假狂犬病病毒的野外分離株及疫苗株的基因組差異」。J.Gen.Virol.，66，pp.69-82(1985)報導，通過BamHⅠ酶切圖譜比較PRV的修改活病毒疫苗株與不同的野外分離株的基因組，他們觀察到兩種變種，(1)PRV基因組的TRS及IRS區衍生的片斷中加入和/或缺失核苷酸序列，(2)在基因組的UL區內失去或獲得BamHⅠ酶切位點。他們推測用限制性核酸內切酶分析病毒DNA，可能提供區別PRV野外株的方法。
我們如同Mettenleiter等在J.Virol.，56，pp.307-11(1985)已報導的那樣，確定了一種目前市售的PRV疫苗，含有缺失糖蛋白I密碼的基因。我們也指出另一種市售毒株(Bantha)缺少gp63。這些疫苗在下述本發明的某些實施例中也許是有用的。
B.Lomniezi，等，「假狂犬病毒疫苗株的基因組缺失以及基因組的四種異構體的存在」。J.Virol.，49，pp.970-79(1984)中報導了兩種來自BarTha及Norden的市售的PRV疫苗株的特性，顯示它們在獨特的PRV基因組短序列中0.855-0.882圖單位之間是缺失的。這一區域位於PRV的BamHⅠ7的片段中。這些論文任何地方都沒有敘述或提到有缺乏分泌糖蛋白的PRV，一種含有這類突變體的疫苗或提出利用這種PRV突變體區別接種疫苗的動物和感染動物的方法。
美國專利4，574，497提到PRV tk-缺失，但未提出有缺失的PRV能在血清學上區別野生型病毒感染的動物和接種疫苗的那些動物。
本發明中表達「功能適當缺損的病毒」及該表達的變種以及「無毒體」都係指滅活的以及減毒的病毒而言。
本發明中「分泌糖蛋白」係指培養被感染細胞培養基中積累的糖蛋白。
本發明與疫苗有關，該疫苗包含一個至少缺失野生型病毒的可檢查出的抗原的功能缺損的病毒，它可供在血清學上區別接種疫苗的動物與被感染的動物。
更具體地說，本發明與一種假狂犬病病毒有關，該病毒缺少一種野生型病毒PRV的血清學上可檢查出的多肽。
更精確地說，本發明是與一種缺少野生型病毒PRV分泌的糖蛋白的假狂犬病病毒有關。
更精確地說，本發明是與一種缺少糖蛋白X的假狂犬病病毒有關。
本發明還提供出區別接種疫苗的動物和被感染的動物的方法，以及提供一種包含上述病毒及疫苗在內的多價疫苗。
本發明是關於一種疫苗，它能從血清學上鑑別接種的和被感染的動物，而不需殺死受試動物。該疫苗包含的一種病毒是缺少抗原性多肽的，具體地說是缺失分泌性多肽的，更具體地說是缺失分泌性糖蛋白的。
我們通過重組DNA技術生產這種PRV。從一種易得的含有希望缺失的gx基因的質粒(pPRXh1，亦稱pUC1129)以及另一種公開能得的質粒(pACYC184)起始，我們組建一個帶有亞克隆操作方便的gx基因的質粒(pPRXK4)。然後，從pPRXK4除去gx啟動子，並將它克隆到另一個公開可得到的質粒pUC9，以組建質粒pPGX1。隨後，我們從質粒pRB103除去HSV胸苷激酶(tk)基因，並將其插入pPGX1每一個位點上使與gx啟動子融合，以產生質粒pGXTK2。然後，我們從pPRXh1除去含有gx基因C-端編碼區的PRV的BamHⅠ7片段，並將它插入於pGXTK2的tk基因下遊，生成一種質粒(pGXTK3)，在其中HSV tk基因的側翼具有PRV gx啟動子及gx基因的C-端編碼區。然後，我們用tk-gx+PRV和pGXTK3(tk+gx-)通過L.E.Port及B.Roizman的方法(下文)共-轉染兔皮細胞，以產生一tk+gx-PRV。最後，將tk+gx-PRV轉變為tk-gx-PRV使之減毒用做疫苗。我們還證實了這種tk-gx-PRV作為抗假狂犬病疫苗的效能。
圖A-K表示的是本發明的質粒構建的插圖，為說明質粒及DNA片段採用如下的某些常規表示方法(1)單線表示環形及線形雙鏈DNA(2)星號(＊)表示該分子為環形，無星號者表示為線性分子。
(3)限制性核酸內切酶位點在線上表明。
(4)基因在線下方表示。
(5)基因與限制性酶切位點間的距離未標尺度，圖上只表明其相對位置。
質粒構建所用的方法是標準的重組DNA方法，為對這方面技術熟練者所熟知。
這些方法在T.Maniatis等，分子克隆，〔Cold Spring Harbor Laboratory(1982)〕以及B.Perbal分子克隆實用指南，〔John Wiley Sons(1984)〕，都有敘述，此二書在此已被編入作為參考資料。
此處用到的許多特殊方法在L.E.Post和B.Roizman的，「大基因組缺失特異基因的通法單純皰疹1型HSV的α基因22不是生長所必需的」，〔cell，25，pp227-32(1981)〕文中有敘述，此書在此處也被編入作為參考。特別是可在那裡找到共轉染和篩選的方法。
例 11.pPRXK4的構建現在參照圖A，我們敘述亞克隆完整gx基因的質粒的構建。
質粒pPRXh1〔也稱pUC1129，來自Northern Regional Research Laboratory，U.S.Department of Agriculture，Peoria，I llinois，其保存號碼B-15772)〕含有由PRV來的gx基因及gx啟動子，用限制性核酸內切酶XhoI及KpnI酶解。以產生的四個碎片段中，用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離得到。片段1用T4DNA多聚酶將末端變成齊頭，並加入ECORI連接子。
運載體PACYC184 (avalable as deposit No.37033 from the American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)用ECORI酶解，並再用細菌鹼性磷酸酯酶(BAP)處理，生成片段2，EcoRT切斷Crm基因。
然後連接片段1和2，生成質粒pPRXK4，此質粒含有完整的gx基因，包括可能的gx啟動子(見Rea等，上文)。
2，pPGX1的構建，現在參照圖B，我們敘述gx啟動子的亞克隆。
被限制性核酸內切酶MstI(TGCGCA)識別的核苷酸順序位於推測的編碼gxmRVA的5′端未翻譯區的DNA順序中(Rea等，上述)。用MstI酶解pPRXK4，分離出第二大片段(片段，3，約2、1Kb)，片段3再用EcoRI酶切，分離出較小片段(片段4，約400bp)。質粒PUC9(可從Pharmacia P/L，Inc，Piscataway.NJ，USA得到)用EcoRI及SmaI酶解，分離到較大片段(片段5，約2.6kb)。然後將片段4及5於EcoRI位點上連接，再行MstI/SmaI融合，生成pPGXI，此質粒含有在緊接其下遊帶有BamHⅠ酶切位點的gx啟動子。
3，PGXTR2的構建現在參閱圖C，我們描述一種質粒的構建，在其中gx啟動子與HSV tk基因融合。
上述的pPGX1用BamHⅠ酶解，BAP處理，生成片段。質粒pPB103含有從HSV-1株F來的BamHⅠQ片段(L.E.Post，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，pp.4201-05(1980))。(或用質粒PHSV106，市售品來自Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD，USA，也含有BamHⅠQ片段，並能應用在這個構建中)，pRB103用BamHⅠ加上BglⅡ酶解，分離出第二大片段(片段7，約2.9kb)，此片段含有無tk啟動子的HSV tk基因。將酶解的pPGX1(片段6)與含有tk基因的片段(片段7)於BamHⅠ位點連接，並用BglⅡ/BamHⅠ融合，得到兩種含有tk片段方向相反的質粒。通過BamHⅠ加EcoRⅠ酶解式樣的檢查，篩選到帶有緊接gx啟動子下遊的TK基因的質粒，並稱為pGXTK2。
4，pGXTK3的構建，現在參照圖D，我們描述一種包含HSV tk基因和位於側面的PRV序列的質粒。
pPRXh1(見1，上述)用BamHⅠ酶解，分離出片段8(約6.9kb)，〔此片段於文獻中稱BamHⅠ7(見Rea等，上述)〕。pGXTK2經BamHI酶解，BAP處理，產生片段9，片段8連接到pGXTK2(片段9)的BamHⅠ位點上，最後生成的質粒含有與啟動子gx方向相同的片斷8稱為pGXTK3，此質粒具有緊接在gx啟動子下遊的tk基團以替代編碼gx的N-端胺基酸的DNA。
5，共轉染(Co-transfection)現在參照圖E，pGXTK3用ClaI切斷，這樣生成的DNA片段，含有gx(實際為gx-)C-端區，以及與gx啟動子融合的整個HSV tk基因，連同來自PRV的tk-gx+突變體的DNA共轉染兔皮細胞，而PRV的tk-gx+突變體(稱為PRVHR)是按Tbtarov，Zentralblatt Veterinarmedizin，15，pp.847-53(1968)的方法，通過生長在碘苷存在下而選育到的。
此tk+gx-病毒重組體(經適當減活後，可用做疫苗)系在tk-人143細胞在HAT培養基(L.E.Post和B.Roizman，上述)中篩選到的，(J.P.Weir，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.1210-14(1982);Panicali and Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.4927-31(1982);Campione-Piccardo，et al.，J.Virol.，31，pp.281-87(1982);K.L.Poffenberger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.-USA，80，pp.2690-94(1983);M.F.Stinski，et al.，J.Virol.，55，pp.431-41(1985)〕我們稱由此生長的病毒為PRV△gx1或DT-A。DT-A系tk+，並完全有殺死小鼠的能力。
在HAT中選擇生長的病毒(例如DT-A)用35S-蛋氨酸或14C-葡萄糖胺標記的病毒蛋白，接著用抗gx血清進行免疫沉澱以分析其gx的合成。未測出gx。
tk+gx-病毒感染的細胞的蛋白質，以抗gx血清Western印漬法進行分析，在突變病毒感染的細胞中未測出gx。
除去整個gx基因也是可能的，例如，片段8用NarI酶解，可生成一種gx基因完全缺失的片段(見圖D)，然後用此片段可替代片段8，以產生一種gx基因完全缺失的gx-PRV。
已有相當時間知道tk-PRV是無毒的，可製成優良疫苗，故用Tatarov方法誘變和篩選tk-PRV，使DT-A功能適當缺損製作用為疫苗的tk-病毒(例如見G.Tatarov「假狂犬病毒在5-碘苷(IUDR)誘導下的非病原突變體」，Zentralblatt Veterinarmedizin，15，pp.847-53(1968);G.Tatarov等「MK株假狂犬病毒無害性及免疫原理的研究」。Vet.Nauhi.6，pp.49-54(1969);G.Tatarov「活疫苗MK-25用於抗假狂犬病的結果」。Vat.Sbirka，7，pp 10-12(1974)，G.Tatarov「保加利亞MK-25疫苗抗假狂犬病」，Cah.Med.Vet，43，pp.347-52(1974);G.Tatarov等「在5-溴脫氧尿苷的影響下，假狂犬病毒的無毒突變體的發育。Veterinary Science，18，pp.3-12(1981);V.Khristova等「假狂犬病毒的毒力株及疫苗株的胸苷激酶活性」。Vetrinary Science，22，pp.15-22(1985));或用類似技術(W.C.Topp，Virology，113，pp.408-11(1981);S.Kit等;Exp.Cell Res.，31，pp.297-312(1963);S.Kit等;Virology，130，pp.381-89(1983)〕。
含有HSV tk基因的PRV△gx1也可通過重組法，用tk+gx-PRV及一種帶有gx缺損的質粒共轉染兔皮細胞，除去HSV tk基因，並用araT按照L.E.Post及B.Roizman的方法，(上述)選擇tk-重組基因，而轉變成tk-PRV，方法如下現在參照圖F，質粒pPGX1經BamHⅠ酶解並用BAP處理，如圖C，步驟(a)所述，產出包含gx啟動子的片段6。如同前述和在圖D，步驟(a)，質粒pPRXh1經BamHⅠ酶解，產生包含gx的C-端編碼區的片段8，此片段也稱做PRV BamHⅠ片段7，然後把片段6和8連接一起，對大腸桿菌進行轉化，再用EcoRⅠ和PvuⅡ酶解，篩選出附合方位要求的BamHⅠ片段7。通過酶解產生2.0kb片段表明方位適宜，這樣產生的質粒稱做P△GXB7。
質粒P△GXB7與PRV△gx1病毒的DNA用磷酸鈣轉染技術(Mocarski等，Cell，22，243(1980)對兔細胞按上面Mocarski等所描述，把轉染所得到的病毒，鋪蓋在有100μg/ml araT存在下的Vero細胞上。挑出個別的空斑，並按上面Mocarski等所述的方法，用限制性內切酶酶解DNA以分析所要的tk-重組病毒。此病毒稱作PRV△GXTK-或DT-B(圖G)，如下面例2所述這些tk-PRV可以做疫苗有用的減毒病毒。
為應用這些病毒以區別被感染動物與接種的動物，可採用，例如ELISA測定法。通常，例如通過DNA重組技術(Rea等上述)把大腸桿菌中所產生的gx蛋白質，加到合適的塑料板的孔中，允許足夠的時間吸附在塑料上(過夜，20-25℃)，將塑料板洗滌後，加入阻斷劑(例如BSA)，以中和在塑料板表面上任何未反應位點，接著洗滌，再將豬血清加至孔中，於20-25℃溫孵約1小時後，洗孔，每孔中加入蛋白質A-辣根過氧化酶結合物，並於20-25℃溫孵1小時。再洗滌，向孔內加酶的底物(鄰苯二胺)，用酸終止反應，於492毫微米波長處測吸光度，以測定血清中gx的含量。若無gx抗體，說明該動物未被感染。測試其它抗元，則能決定該動物是否接種過疫苗。
雖然PRV△GXTK-是一種有效的疫苗，但在碘苷中生長選得的PRV tk-突變則是一種點突變。假設它是一種點突變，則可以回復到tk+，而可能成為毒力株、因此一種具有缺失的tk-PRV是更好的。美國專利4，514，497述及在那裡應用的標記挽救方法以製作tk-PRV，首次在單純皰疹病毒中應用以製作tk-的缺失〔(J.R.Smiley，Nature，285∶333-35(1980)和L.E.post等，Cell，24∶555-65(1981)〕。
現在參照圖H，PRV tk-基因已繪於PRV的BamHⅠ11片段處(T.Benportt等，Virology，127∶194-204(1980))。BamHⅠ11片段系由PRV Rice株經BamHⅠ酶解的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳而分離到的，並把它克隆到PBR322上以產生質粒PTK11。PTK11在tk基因內有一個單xhoⅠ酶切位點，PTK11用XhoⅠ切斷，並用核酸外切酶Bal31不同時間酶解，用連接酶再使環化，並對大腸桿菌DHⅠ進行轉化(Maniatin如上述p.505)這就產生帶有tk基因缺失不同的一組質粒。
選用其中兩個質粒，以Cscl密度梯度離心提純並以Maxam及Gilbert的方法，(酶學的方法，65(部分Ⅰ)，pp.497-559(1980))測定順序。質粒P△tk-3在tk基因中缺失329鹼基對，質粒P△tk-4缺失275鹼基對。
在tk缺失可被雜交到gx-病毒以前，首先必需製作病毒tk+，這樣tk-缺失重組體才能被選擇出來。PRV△GXtK-DNA與質粒pTK11共轉染到兔皮細胞。分離出所產生的重組病毒，並使在培養基HAT及143細胞中生長，所選出的tk+病毒，我們稱之為PRV△GXtK+PRV，然後把此病毒的DNA與P△tK-4DNA共轉染到兔皮細胞。產生的病毒在araT存在下，放在Vero細胞上，以選育tk-重組體。通過用DNA製備及限制性內切酶分析法，從得到的病毒中篩選合適的重組體。這些重組體已經摻入tk缺失。其中一個病毒我們稱之為PRV△gX△tK或DT-C。它包含有期望的tk缺失及一種gx缺失。我們測定DT-C對小鼠LD50大於107空斑單位，相比之下，PRV△gXPRVK+的LD50為3空斑單位。
雖然這裡敘述的特別的實施方案和重組DNA技術的應用，但對熟悉此技術者很清楚，採用其它技術以及應用其它病毒，例如Marek氏病病毒及傳染性牛鼻氣管炎病毒也能生產類似的含有分泌性糖蛋白缺損的疫苗。
雖然這裡公開的主要是PRV，但這裡應用的技術，可用於產生血清上獨特的皰疹病毒，在任何情況下象PRV那樣，有利於區別接種疫苗的動物和被感染的動物。包括例如馬立克氏病病毒及傳染性牛鼻氣管炎病毒。
當我們將HSV tk基因置於gx啟動子的控制之下，含tk DNA片斷能被插入，如此使其受另一個PRV啟動子或能表達tk基因功能的任何一個啟動子控制。例如，其它HSV啟動子，例如，亦能用HSV ICP4啟動子，後者能在PRV-感染的細胞中表達。例如，可將PRV tk基因插入到gx基因或不啟動子的控制下任何其它tk基因中，都能在PRV-感染的細胞中表達。
在我們用tk基因作為插入的標記基因中，任何標記基因也都能被插入gx基因以使之失活，只要該標記基因允許把攜帶該標記的病毒從不帶標記的病毒選出。例如，耐抗生素的抗藥性基因可用作抗G418或潮黴素的標記基因。
除可選擇的標記外，亦可插入其它基因到gx基因中。為構建這類病毒也可以把外源基因插入象PGXTK3的質粒中，以外源基因替換tk序列。此質粒可與圖E中所述的來自tk+gx-病毒的DNA共轉染。以araT選擇，可得到帶有外源基因插入並表達的病毒重組體。這種基因能編碼其他類型病毒的抗原，例如，可傳播的腸胃炎病毒或豬微小病毒或編碼一種細菌，例如大腸桿菌，它能產生對抗其它病毒的免疫原反應。故本發明的施例已生產出一種「多價疫苗」，它包含有兩種或更多的病毒或其它病原體的抗原。
作為上述的一個例子，我們用下法將組織血清蛋白溶酶原激活因子(tPA)基因插入gx基因中pPSA18是含有tpA完整密碼區的質粒，在編碼區的5′-來翻譯區具有一特異的BamHⅠ切點，它可按同時未決的美國專利申請SN758，517，於七月26，1985提出申請中所述的方法構建。參照圖Ⅰ，pPSA18用BalⅠ切斷，加入BamHⅠ連接子以生成片段11，然後片段11用BamHⅠ酶解，生成含有tpA的整個編碼區的1.95Kb片段(片段12)。然後質粒pPGX1(圖B)用BamHⅠ酶切，生成片段6。片段12和6連接生成質粒pGXTPA。採用EcoRⅠ進行酶解測定tpAcDNA與gx啟動子有關的合適方向。當方向正確時則產生1∶1Kb片段。
參照圖J，質粒PGXTPA用HindⅢ酶解，產生片段13，PRVDNA的BamHⅠ7片段按以上所述(片段8)分離得到。加HindⅢ連接子以產生片段14，把片段13及14連接在一起，生成PGXTPAB7。BamHⅠ7片段插入此質粒的合適方向可以用EcoRI和SphⅠ進行酶解來測定。當方向正確時則生成5.8Kb片段。
把質粒PGXTPA-B7與來自PRV△GX1的病毒DNA共轉染入兔皮細胞。在araT存在下，生成的病毒鋪蓋在Vero細胞上，以選育tk-重組體我們稱照此選得的一個病毒為PRV-GXTPA。當此病毒感染細胞時，通過用以TpA抗血清的免疫沉澱法檢查細胞產生並分泌tpA，以纖維蛋白溶解法測定在20毫微克/毫升tpA活性(Unkeless，et al.，J.Exp.Med.，137，pp.85-111(1973);Luskutoff，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，3903-07(1977))。
例2在本例中我們敘述用胸苷激酶缺損及糖蛋白×缺失的PRV炎變體(tk+gx-)為疫苗接種以保護小鼠及豬由PRV所引起的死亡。
1.動物雌性CF-1小鼠，5-6周齡，來自Charles.River公司。
18隻交叉繁殖的豬，5-6周齡的雌和雄性，來自J.Gilmore企業公司。隨機將豬分別置於三個房間內，每間六頭豬。
豬和小鼠餵予無藥食料和水任意攝取。
2.病毒及細胞PRV缺失炎變體DT-A(HSV tk+gx-)及DT-B(tk-gx+)均來自上述的親代PRV(HR株;tk-gx+)。DT-B不能合成胸苷激酶，所以也不能合成gx。由於缺失gx基團，全部保護研究中均用致病的PRV(Rice株)作為攻擊病毒。病毒在vero細胞或豬腎-15(PK-15)細胞中繁殖。
3.微量中和分析法微量中和分析系按T.C.Hollard等敘述的方法進行的。(J.Vriol，45，pp672-82(1983))。鼠血清與病毒及10%兔補體於37℃溫孵3小時，但豬血清則與病毒在無補體存在下，於37℃溫孵1小時。中和滴度以保護50%以上的細胞不發生致病效應的血清最大稀釋度的倒數表示。
4.酶連免疫吸附分析法(ELISA)用Voller氏緩衝液(50毫摩爾NaHCO3，0.03% NaN3，用NaOH調pH到9.6)稀釋gx融合蛋白(p60-11，如美共同未決專利申請號SN853087，1986年4月17日提交的專利申請中所述的方法生產)到20微克/毫升以製備抗原稀釋液。此溶液通過0.45微米無菌過濾器(Sartorias SM 165 55K)，過滬，如需要，過濾液可在使用前再用Voller氏緩衝液稀釋。
將100微升蛋白p60-11的緩衝液(濃度約2微克/毫升)加至96孔培養板的每個孔中(Costar 3590，EIA)。於室溫下溫孵過夜時發生吸附，每孔約用300微升Dulbecco氏PBS(8克/升Nacl，0.2克/升KCl，0.2克/升KH2PO4，和1.14克/升Na2HPO4;最終PH7.3-7.4)洗三次。於塑料表面未反應部位在與3%BSA的在Dulbecco氏PBS中(每孔200微升)於37℃溫孵2小時期間得以中和。每孔用300微升Dulbecco氏PBS液洗一次。然後，吸附的抗原與在100微升的稀釋血清中的抗體反應(由暴露於PRV的豬中得到的)在4℃溫孵過夜。未反應的抗體用Dulbecco氏PBS(300毫升/每孔)洗三次而除去的。然後每孔加入100Ml蛋白A-辣根過氧化酶結合體(對小鼠血清稀1/800，對豬血清稀釋，1/15.00;稀釋在50毫克分子Tris，0.05%吐溫20，1%BSA，0.02%NaN3，pH8.0的液中)於37°溫孵2小時，孔再用Dulbecoo氏PBS液洗3次(300毫升/每孔)，每孔加入100微升底物溶液，此溶液由10毫克鄰苯二胺(事先溶於0.5毫升甲醇)和25微升30%(w/v)H2O2加至49.5毫升緩衝液(17毫克分子檸檬酸，65毫克分子磷酸鹽及0.01%硫柳汞用NaOH調節pH至6.3)配製。酶反應於室溫持續十分鐘，熱後每孔加入100微升4.5克分子H2SO4，用Titartek Multiokan儀於492nm波長處測定生色團的吸光度。
5.鼻拭子的病毒分離試驗豬的鼻拭子分別置於1毫升加有用3%胎牛血清(FBS)及抗生素補充的Eagles基本培養基(BME;M.A.生物製品)中。拭子在檢查其病毒的存在試驗前存貯於-70°。進行病毒分離鑑定時，鼻拭子於BME中解凍，棄去拭子，將樣品(0.1毫升)接種至單層豬腎-15-細胞(Pk-5;ATCC CCL33)中，重複兩份，於37°溫孵1小時，使病毒吸附，於細胞培養物上續加培養基-199(Flow實驗室)補充以4% FBS，抗生素，1%瓊脂的復蓋物。三天後，單層細胞用中性紅染色，空斑計數。
6.用於小鼠研究的實驗設計四株PRV的毒力由測定各病毒株的小鼠的半數致死值(LD50)來評定的。四株PRV為1)野生型(Rice株)2)DT-A3)DT-B及4)HR。每一株病毒以不同劑量給予5或6組小鼠(每組10隻)。小鼠由腳墊途徑給予50微升相應病毒10天。給病毒後14天(第14天)測定其LD50值，對接受最高劑量的相應病毒的存活動物組取其血清，用Spearman-Karber法計算各株病毒的LD50值。
LD50毒力試驗中存活動物於第14天再由腹腔給予十倍於LD50(由腹腔途徑測定)的PRV Riee株病毒(10 LD50＝5.4×102pfu/小鼠)本實驗於給毒株後第14天(第28天)結束。
7.對豬研究的實驗設計實驗豬於第0天肌肉注射2毫升DT-B株(約1.5×107pfu/豬只)，按製造者的建議給2毫升Norden活疫苗(PR-Vac)，或生理鹽水，所有的豬均於第20天給以大約40×LD50毒力的PRV(Rice株)(40LD50＝1.1×105pfu/豬只)研究於第34天結束。
取得血清樣品，並於第1，20及34天分別對每隻豬稱體重，於第19天至34天期間，每天取鼻拭子。
8.效價評定的標準PRV DT-B株(tk-gx-)作為疫苗，其效價的評定基於對PRV誘發的死亡率的保護作用以及在血清學上區別PRV-DT-B處理的豬以及暴露於野型病毒的豬只的能力。
表1m相應LD50測定值來表示四株PRV對小鼠的相對毒力。DT-B及HR與野生型株及DT-A相比，毒力大為降低，至少低1000倍。
給予各種PRV株病毒後存活的小鼠，於第14天由腹腔用十倍於LD50(5.4×102pfu/小鼠)的劑量的毒力的野生型PRV進行攻擊。如表2所示，給予1×103pfu或更高劑量的DT-B的小鼠，以及給予2.3×103pfu或更高劑量的HR能保護小鼠對有毒力的野生型PRV的攻擊。此外，對接受DT-B的小鼠，於攻擊前取的血清中和抗體滴度較高(中和滴度＝1024)，但根據ELISA數據與gx抗原決定子反應則意義較小，(ELISA吸光度＝0.05)，對接受HR的小鼠，於攻擊前取的血清中和抗體滴度(中和滴定＝2048)。但與gx抗原決定子反應是顯著的(ELISA吸光度＝0.60)。
為評價PRV DT-B株的保護效能以及診斷意義，給豬肌內接種DT-B。Norden活疫苗(PR-Vac)或生理鹽水(0天)，於14天從鼻內用野生型Rice株攻擊，表3所示的結果表明在引起有意義的中和抗體反應以及對毒力型Rice株的攻擊提供保護方面DT-B株與Norden活疫苗(PR-Vac)兩者相類似，ELISA用gx融合蛋白所得數據表明用DT-B免疫的豬不產生抗gx抗體，曾暴露於野生型Rice株的恢復期豬血清則產生該抗體。本研究中，由給予Norden活疫苗(PR-Vac)的豬取出的血清與gx抗原決定子的反應無統計學意義(P＞0.05)。但基於前面的研究，給予Norden活疫苗(PR-Vac)的豬可能產生抗gx抗體。這是因為Norden株具有編碼gx的基因，因此由接種Norden活疫苗(PR-Vac)的豬取出的血清對gx抗原決定子的反應性可以變動。
用DT-B及Norden活疫苗處理的豬於攻擊後，偶而散發病毒，而生理鹽水處理的豬，大多數都不斷地散發病毒，直至死亡。在用DT-B處理的一個豬以及一個用Norden活疫苗(PR-Vac)處理的豬的鼻排洩物中未檢出病毒，這些結果表示免疫的豬不像未免疫的豬那樣快地散發病毒。
用DT-B處理的豬在第20天時(攻擊前)的體重平均值與用生理鹽水處理的豬的體重平均值無明顯差別(P＞0.05)，這表明用DT-B免疫對豬的生長無不利影響。
這些結果表明DT-B對毒力型PRV攻擊的豬有保護作用，並可在血清學上對免疫的豬以及曾暴露於毒力型PRV的恢復期豬加以鑑別。DT-B並不降低處理豬的生長。此外，對小鼠的毒力學研究表明在豬以外的動物中，DT-B較tk+PRV株毒力低。
表1小鼠LD50病毒株 基因特徵 LD50Rice株 PRVtk+gX+40pfu/小鼠DT-A HSVtk+gX-34pfu/小鼠DT-B tk-gX-9.4×104pfu/小鼠HR tk-gX+＞2.3×106pfu/小鼠表2用減弱的PRV株接種小鼠的保護作用病毒株 基因特徵 劑量 攻擊後的 中和 ELISA(pfu/小鼠) 死亡率滴度吸光度bDT-B tk-gX-1.0×1050/6 1024 0.051.0×1040/101.0×1030/101.0×1024/101.0×1017/101.0×1009/10HR tk-gX+2.3×1060/10 2048 0.602.3×1050/102.3×1040/102.3×1030/102.3×1022/10對照 - 10/10 0.00
a.中和滴度＝存活動物(用PRV Rice株攻擊前)的血清保護50%以上細胞不受致細胞病變作用的最大稀釋度的倒數b.用血清1/10稀釋度的代表ELISA反應的吸光值。血清與中和試驗時所用的相同。
表3用減毒PRV DT-B接種豬的保護作用製品死亡率幾何平均值滴度bELISA吸光度的算術平均值DT-B 0/6 91 0.072±0.016ePR-Vac 0/6 36 0.130±0.061eSaline 6/6 ＜4c 0.093±0.024Ricea - - 0.942±0.228fa.前一實驗中，對五隻存活的暴露於Rice株的恢復期豬取血。他們包括在這裡以提供在ELISA中作對照用的gx反應性血清。
b.幾何平均滴度系對各組六隻中每隻動物於被攻擊前所得的中和滴度的幾何平均值。中和滴度則是保護50%以上細胞不受致細胞病變作用的最大稀釋度的倒數值。
c.沒有可檢出的抗體。
d.ELISA吸光度的算術平均值系對各組六隻動物的每隻在被攻擊前所取血清的ELISA吸光度。(血清稀釋至1/40)的算術平均值，最後的數值除外(見上面的注a)。
e.與生理鹽水處理豬無顯著差別(P＞0.05;雙尾T試驗)。
f.與生理鹽水處理豬有顯著差別(P＜0.05雙尾T測定)例3.
按照前面例2所述大致相同的方法，我們還對PRV的DT-C進行了類似實驗，DT-C缺失PRV tk基因，因而是本發明的更好的實例。這些實驗的結果述於表4-8，表4及8表明DT-C在豬，羊，及小牛中毒力降低，表5及6表明DT-C的保護能力。表7表明DT-C對豬的劑量滴定。
表4小鼠LD50病毒株 基因特徵 LD50Rice株 PRVtk+gX+ 9 pfu/小鼠DT-C tk-gX-＞1.0×107pfu/小鼠HR tk-gX+＞1.5×107pfu/小鼠表5用減毒的PRV株免疫對小鼠的保護作用病毒株 基因特徵 劑量 攻擊後的中和 ELSA(pfu/小鼠) 死亡率滴度a吸光度bDT-C tk-gX-1.0×1070/8 5120 0.0511.0×1060/81.0×1050/81.0×1040/81.0×1030/81.0×1022/71.0×1017/8
表5(續)病毒株 基因特徵 劑量 攻擊後的 中和 ELSA(pfu/小鼠) 死亡率滴度a吸光度bHR tk-gX+1.5×1070/6 2560 0.9741.5×1060/71.5×1050/81.5×1040/81.5×1030/81.5×1023/81.5×1015/8對照 - 7/8 ＜20 0.000表6用減毒的PRV DT-C免疫對豬的保護作用製品a死亡率幾何平均滴度bELISA 吸光度c的算術平均值DT-C 0/6 26 0.072d0.388ePR-Vac 0/6 16 0.105e0.645eBME 3/6 ＜8 0.059d0.250ea.接受DT-C，PR-Vac及BME的豬於本試驗的0-35天內存活的豬體重分別由8.1增至27.1，6.5增至23.0，及6.0增至11.4kg。
b.在攻擊前各組六隻豬的每一隻所得的中和滴度的幾何平均值，每個中和滴度系保護50%以上細胞不受細胞病變作用的血清最高稀釋度的倒數。
c.在攻擊前各組六隻豬中每隻所取的血清，(血清1/40稀釋度)的ELISA吸光值的算術平均值。不同注的平均值與第20天的BME對照值(Eagle基本培養基)有顯著不同(P＜0.05)，第一數是攻擊前的，第二數是攻擊後的。
表7劑量死亡率a幾何平均值(pfu/豬) (Rice免疫後) 滴度b1×1070/6 231×1060/6 251×1050/6 181×1040/6 181×1030/6 181×1020/6 20對照 5/6 ＜4a.於第0天時，按所示劑量給豬肌肉注射各製劑2毫升，於第21天用大約80×LD50(2.2×105pfu/只豬)PRV Rice株進行攻擊。
b 見表6注b.
表8DT-C對羊和小牛的致病力動物接種物方法a死亡數/受試數陽性(pfu/動物) 鼻拭子b羊 4×107鼻內 1/3c0/3
表8(續)動物接種物方法a死亡數/受試數陽性(pfu/動物) 鼻拭子b4×107肌內 0/3 0/3小牛 4×107鼻內 0/3 0/34×107肌內 0/3 0/3a.鼻內或肌肉途徑給予總體積為2毫升(每個鼻孔1毫升)的病毒懸液，給藥後的動物21天內，觀察其假狂犬病症狀。
b.試驗結束時每隻動物取鼻黏膜拭子，照上述方法試驗PRV。
c.14天時死亡一隻羊，但無假狂犬病症狀，也未散發病毒。此動物的可能死因是球蟲病。兩實驗組的其它羊中，均診斷出此病。
本發明的另一方面，為保證gx-tk+有毒性PRV不是由在理論上可能是本發明gx-tk-PRV與野生型PRV間的重組的結果，所以將gx-tk-PRV進一步工程化，按照前述一般方法，在PRV gp50基因的原始座位造成缺失，將一種gp50基因副本插至tk基因閉合連鎖中或插至tk基因之內，為造成原始gp50基因缺失，可用片段8(見圖D)的Pvu Ⅱ/Bam HⅠ片段照前述的方法進行標誌營救試驗，產生的病毒將是gx-tk-和具有與tk基因序列的殘留部分緊密相連或者在殘留物內的gp基因的副本。由於gp50對病毒的活力是必要的，重組所得的任何gx-病毒也會是gp50-，但是無活力。因此，不可能用重組法將野外生成有毒性的gx-PRV使gx-及tk-缺失分開。
參照圖K，進一步的細節為上面得到的P△TK-4用SPHⅠ及BamHⅠ酶解，產生含tk缺失的片斷，然後分離該片斷。PUC19(可由Pharmaia/PL得到)用BamHⅠ及SphⅠ酶解，可分離出由此生成的較大的片斷。然後連接此兩片斷生成一個單一SalⅠ位點毗鄰於tk缺失的質粒PUC△TK4-V。然後PUC△TK4-V用SalⅠ切割，末端用T4DNA多聚酶處理變成齊頭，生成片斷A。
上面得到的片斷8(Bam HⅠ7)用NdeⅠ(它在gx和gp50基因之間切割)和StuⅠ(它在gp63基因內切割)酶解，生成一含有gp50基因(片斷B，約1.8kb)的NdeⅠ/StuⅠ片斷，用T4DNA多聚酶把這片段末端補齊，然後連接片斷A及B，生成質粒P△TK4gp50-8。
質粒P△TK4gp50-8用HindⅢ切斷，再與PRV DNA共轉染入兔皮細胞。生成的病毒在含有araT的選擇培養基中生長以分離出具有圖K(C)所示結構的tk-重組體。我們稱此病毒為PRV△TKgp50。
然後把PRV△TKgp50再與上面得到的PGXTK3共轉染，並在HAT培養基中143細胞上選擇tk+病毒，此病毒稱為PRV△TKgp50 tk+(HSV)，為gx-。
然後用含經這些酶酶解BamHⅠ7製得的gp63及gⅠ基因的PvuⅡ/BamHⅠ片斷亞克隆化至PBR322的PvuⅡ/BamHⅠ片斷上，以產生質粒pPR28-1(見共同未決的U.S.專利申請SN844，113，申請日3月26，1986)。質粒pPR-28-1用PvuⅡ切割加入BamHⅠ連接子，由此生成的片斷再用BamHⅠ酶解，將5kb PvuⅡ/BamHⅠ片斷轉變成一BamHⅠ片斷。然後把此BamHⅠ片斷克隆到pPGXI(上面所得的)的BamHⅠ位點上。把生成的質粒與PRV△TKgp50tk+(HSV)共轉染，生成的病毒在araT上生長，篩選tk-表型。選得的病毒具有插入在tk基因的保留部分上的gp50基因以及在其正常座位上是缺失的。他們也系gx-。故與產生tk-gx-病毒的野型病毒進行任何重組將產生缺失gp50基因的病毒。因為gp50是一必要的基因，這樣的病毒是無活力的。
雖然我們的例子與PRV有關，但這對熟練這項技術者該是清楚的，這同樣的技術在對其他皰疹病毒生產類似的防重組病毒疫苗是有用的。一般地，步驟包括1)在鄰近授予無毒性突變處插入重要基因，及2)使必要的基因從正常座位上丟失，此座位是與缺失的分泌蛋白質基因相連接。更為普遍的是，從正常位置上，移去必要基因，將使減少與野生型病毒重組的可能性，為構成一種缺乏gx的PRV，不是絕對需要插入一個可選擇的標記，例如，包含在gx編碼區有缺失的質粒可在gx基因內使缺失鹼基對Bam HⅠ片斷製備出來。然後把此質粒與PRV DNA共轉染。接著從轉染產生的病毒中用核酸雜化法篩選出短少DNA缺失小片斷的病毒或用抗體篩選法篩選出gx缺乏的病毒。(Holland等，J.Virol.，46，649-52頁(1983))。
本發明疫苗中應用的缺失多肽(如gx-)病毒也可由其它方法產生，如誘變接著篩選缺失多肽的病毒(如gx)或用其它使產生有缺失的病毒的任何技術，該缺失使疫苗病毒在血清學上能與野生型病毒區別。例如，雖然人們不能選出gx-PRV(抗gx抗體並不中和PRV)，但人們可用上述Holland等方法選出在本發明的疫苗中有用的缺失gⅠ或gⅢ的PRV(Wathen J.Virol 58，173-78(1986)。
雖然通過滅活或缺失tk基因(Tatarov，上述;Post及Roizman上述)來減毒是較好的方法。但是本發明中的gx-病毒可經過普通的化學或物理的滅活過程，而使病毒無致病性但仍保留其抗原性。這些滅活疫苗可以用適當的佐劑配製，例如，明礬，各種疫苗製備技術的一般敘述見J.I.Duffy。疫苗製備技術，Noyes Data Corporation(1980)及G.W.Warr，「抗原的製備及免疫原理」。J.J.Marchalonis G.W.Warr編。工具抗體-免疫化學的應用。21-58頁，John Wiley Sons(1982)。
毒力型PRV可在動物組織培養中傳代，直至病毒無致病性，即無毒力的。PRV可在許多種類組織培養系統中增殖，包括例如雞胚，鴨胚，豬腎，豬睪丸，牛胚腎，貓腎，犬腎，及猴腎，也可在已建立的細胞系如Madin Darby牛腎(MDBK)及Madin Darby犬腎(MDCK)。
PRV的減毒化可由標準的連續傳代法完成，包括終端稀釋傳代技術，於此採用在易感染的組織培養中進行足夠數的傳代。直至病毒無致病性而不失去免疫原性。
傳代時間間隔應當使病毒在兩代間有足夠的時間複製，溫孵溫度宜在約30～38℃。最佳傳代時間視不同病毒，培養系統及所用溫度而不同。
最終疫苗產品應含有一定量的無毒的PRV，而其量足以刺激易感動物產生免疫反應並仍是無致病性的。推薦用於易感動物的病毒滴度大約為103～105空斑形成單位以104空斑形成單位更相宜。
本發明的病毒製劑可用水稀釋以調節其效力，可加入穩定劑諸如右旋糖，乳糖或其它無毒物質。此病毒製劑為儲存目的亦能例如再冷凍乾燥使之乾燥，或隨後配成液體疫苗。
疫苗可由種種途徑給予動物，包括肌肉，靜脈，皮下，氣管內及鼻內，較好的途徑是肌肉。
給大母豬接種，可用雙劑量方案，第一劑可在下小豬前約數月至約5～7周給予。第二劑疫苗則在第一劑後數周給予，例如約2～4周後給予，然後疫苗能一直給到下小豬但在下小豬前。或者，可單次給予2毫升劑量的疫苗，例如在產前約5～7周給予。但為使豬仔最有效的免疫認為雙劑給藥法是較好的。對生育的動物建議半年後再接種。公豬可在任何時間再接種，同樣，母豬可在生育前再接種。未接種的母豬所生的小豬可在約第三天接種。
疫苗也可與其他疾病的疫苗合併，產生多價疫苗並可用前述的任何途徑接種，它可與其他藥物例如抗生素合用。
按照本發明製備的疫苗可刺激對此疾病易感的動物產生免疫反應而不發生任何明顯的由毒力型病毒所致的臨床症狀。藥物學有效疫苗量可與藥物學接受的載體或稀釋劑一起應用，於接種動物，例如豬，牛，羊，山羊，以及其它哺乳動物。
圖A.pPRXK4的構建(a)pPRXhl用xhoⅠ和KpnⅠ酶解，生成片斷1(2.6kb)
片斷1(b)用T4 DNA多聚酶使片段1成齊頭末端並加入EcoRⅠ連接子。
(c)PACYC184用EcoRI酶解，並用BAP處理，生成片斷2。
(d)連接片斷1和2，生成pPRXK4
X＝糖蛋白X基因cmr＝氯黴素抗性基因Tetr＝四環素抗性基因Pgx＝gx啟動子圖B.pPGX1構建(a)pPRXK4用MstⅠ酶解，生成片斷3(2.1kb)
(b)片斷3用EcoRⅠ切割以生成片斷4(400bp)
(c)PUC9用EcoRⅠ和SmaⅠ酶解，生成片斷5(2.6kb)
(d)連接片斷4和5，生成pPGXⅠ
圖C.pGXTK2的構建(a)pPGXⅠ用BamHⅠ酶解，用BAP處理，生成片斷6.
(b)pRB103用BamHⅠ和BgⅢ酶解，生成片斷7(2.9kb)
片斷7(c)片斷6和7相連接，生成pGXTK2
Ptk＝胸苷激酶啟動子t＝胸苷激酶基因。
圖D.pGXTK3構建(a)pPRXh1用BamHⅠ酶解，生成片斷8(6.9kb)
(b)pGXTK2用BamHⅠ酶解，用BAP處理，產生片斷9
(c)片斷8和9相連接，生成pGXTK3
gx-ct＝gx基因的C-端編碼區50＝糖蛋白50基因63＝糖蛋白63基因Ⅰ＝糖蛋白Ⅰ基因圖E.用pGXTK3和一個tk-PRV共轉染(a)pGXTK3和一個tk-gx-PRV共轉染生成產物tk+gx-的PRV△gx1(或DT-A)。
圖F.p△GXB7構建(a)pPGXⅠ用BamHⅠ酶解，並用BAP處理，生成片斷6
(b)pPRXh1用BamHⅠ酶解，產生片斷8(6.9kb)
(c)片斷6和8連接，生成質粒p△GXB7
圖G.用重組法構建PR△GXTK-(a)PRV△GX1和p△GXB7共轉染，並重組，生成
＝交換區，(右邊交換區的比例非常不正常)圖H.tk缺失質粒的構建(a)BamHⅠ11克隆到PBR322中，生成質粒PTK11
(b)pTK11用XhoⅠ酶解，產生片斷10。
(c)片斷10用Bal31酶解，然後再環接生成在tk基因中，有不同長度缺失的質粒。
tk＝胸苷激酶基因d＝在胸苷激酶基因中缺失。
圖Ⅰ.PGXTPA的構建(a)質粒pPSA18用BAlⅠ切割，加入BamHⅠ連接子，生成片斷11。
pPSA18
(b)片斷11用BamHⅠ酶解，生成片斷12(1.95kb)。
(c)質粒pPGXI(圖B)用BamHⅠ切割，生成片斷6.
(d)片斷6和12連接，生成質粒pGXTPA。
tp＝纖維蛋白溶酶原組織激活因子基因L＝BamHⅠ連接子圖J.質粒pGXTPA-B7的構建(a)質粒pGXTPA用HindⅢ酶解，生成片斷13。
(b)HindⅢ連接子加到片斷8中(圖D)，生成片斷14。
HL＝HindⅢ連接子圖K.抗重組病毒的生產(a)p△TK-4
(b)BamHⅠ 7
(c)PRV△TKgp50
權利要求
1.一種生產皰疹病毒疫苗的方法，此疫苗含有適當缺殘的病毒，具有缺失編碼分泌糖蛋白的基因，此糖蛋白能使血清學鑑別接種病苗和其野生型原始病毒。
2.按照權利要求
1的方法，其中的病毒是從由假狂犬病病毒，馬立克氏病病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒組成的類群中選育出來的。
3.按照權利要求
2的方法，其中的病毒是假狂犬病病毒。
4.按照權利要求
1的方法，其中的病毒是假狂犬病病毒以及其中的分泌性糖蛋白是糖蛋白X。
5.產生一種包含缺失至少一個編碼分泌性糖蛋白基因的突變型皰疹病毒的方法。
6.按照權利要求
5的一種方法，其中皰疹病毒是從由假狂犬病病毒，馬立克氏病病毒及傳染性牛鼻氣管炎病毒組成的類群中選育的。
7.按照權利要求
5的方法，其中皰疹病毒是假狂犬病病毒。
8.按照權利要求
7的方法，其中分泌性的糖蛋白是糖蛋白X。
9.按照權利要求
8的皰疹病毒，其中的病毒不產生胸苷激酶的功能。
10.一種能區別被病毒感染的和用抗所說病毒接種過動物的方法，包括用疫苗接種對病毒敏感的動物，接種的疫苗包含至少編碼野生型原始病毒的一種抗原基因有缺失的所說病毒，然後，在血清學上區別這些免疫的動物和用致病性病毒感染過的動物，而不必殺死動物。
11.按照權利要求
10的一種方法，其中的病毒是皰疹病毒。
12.按照權利要求
10的一種方法，其中的病毒是從由假狂犬病病毒，馬立克氏病病毒及傳染性牛鼻氣管炎病毒組成的病毒類群中選育出來的。
13.按照權利要求
10的一種方法，其中的病毒是假狂犬病病毒。
14.按照權利要求
10的一種方法，其中抗原是一種糖蛋白。
15.按照權利要求
10的一種方法，其中的抗原是一種分泌性的糖蛋白。
16.按照權利要求
10的一種方法，其中的病毒是假狂犬病病毒以及糖蛋白是糖蛋白X。
17.一種生產多價疫苗的方法，包括功能適當殘缺的病毒，插入在編碼抗原的基因內，一個編碼能提高免疫反應的異原多肽的DNA序列。
18.按照權利要求
17的方法，其中的病毒是一種皰疹病毒以及抗原是一種分泌性的糖蛋白。
19.按照權利要求
17的方法，其中的病毒是從由假狂犬病病毒，馬立克氏病病毒以及傳染性牛鼻氣管炎病毒組成自病毒類群中選育出的。
20.按照權利要求
18的方法，其中的皰疹病毒是假狂犬病病毒，以及其中的分泌糖性蛋白系糖蛋白X。
21.按照權利要求
20的方法。其中能提高免疫反應的多肽是從一組包括可傳染胃腸炎病毒或豬微小病毒的多肽中選到的。
專利摘要
提供一種病毒疫苗，包括功能適當殘缺的病毒 缺乏野生型病毒的抗原，此疫苗在血清學上區別免 疫動物與感染動物中是有用的，提供區別免疫動物 與感染動物的方法以及多價疫苗的方法。
文檔編號A61P31/22GK86105450SQ86105450
公開日1987年3月4日 申請日期1986年7月29日
發明者倫納德·E·波斯特, 達雷爾·R·湯姆森 申請人:厄普約翰公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan