用於分子生物學分析和診斷的自我可尋址自我裝配的微電子學系統及裝置的製作方法

2023-11-03 18:56:42

專利名稱：用於分子生物學分析和診斷的自我可尋址自我裝配的微電子學系統及裝置的製作方法
技術領域：
本發明有關一種能有效地進行和控制微觀形式的多步和複合反應的自我尋址、自我裝配的微電子系統的設計、製作和使用。更具體地說，這些反應包括分子生物學反應，如核酸分子雜交、核酸分子擴增、樣品製備、抗體/抗原反應、臨床診斷，和生物高分子合成。
背景技術：
分子生物學包含用於核酸和蛋白質分子分析的多種技術，大部分這些技術形成了臨床診斷分析的基礎。這些技術包括核酸分子雜交分析，限制酶切分析，基因序列分析，和核酸蛋白質分子分離和純化(參見，如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊，2nd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
大部分分子生物學技術包括在多種樣品間進行大量的反應。它們常是複雜和耗時的，而通常需要較高的精確度。多種技術因缺少靈敏度、特異性、或重現性而限制其的應用。例如，因靈敏性和特異性的不足已極大地限制了核酸分子雜交的實際應用。
核酸分子雜交分析通常包括在大量的非目標核酸分子中用探針識別極少數特殊的目標核酸分子(DNA和RNA)。為了保證高度的特異性，雜交試驗常在通過溫度、鹽類、洗滌劑、溶劑、離液序列高的介質和變性劑之間各種組合而獲得的高度嚴格條件下進行。
多倍的樣品核酸分子雜交分析已以種種濾膜和固體載體的形式進行(參見G.A.Beltz et al.，in酶學方法Vol.100，Part B，R.Wu.L.Grossmam，K.Moldave.Eds.，Academic Press，New York，19章，266-308頁，1985)。一種形式為「斑點印跡」雜交的形式，包括目標DNA分子非共價粘附在一種濾膜上，隨後與放射性同位素標記過的探針雜交。「斑點印跡」雜交技術獲得了廣泛的應用，並發展了多種改進方法(參見M.L.M.Anderson和B.D.Young，in核酸分子雜交一實用方法B.D.Hames和S.J.Higgins，Eds.，IRLPress，Washington DC，第4章，73-111頁，1985)。「斑點印跡」雜交技術已進一步發展能進行基因組突變複合分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，in EPA 0228075，July 8，1987)和重疊克隆的鑑別以及基因組圖譜的構建(G.A.Evans，in USP # 5，219，726，June 15，construction，1993)。
另一種被稱為「夾心」雜交的形式包括共價地粘附寡聚核苷酸探針於一種固體載體上然後用它們來捕獲和識別多種的核酸目標分子。(M.Ranki et al.，Gene，21，pp.77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，in UK Patent Application GB2156074A，Oct 2，1985；T.M.Ranki和H.E.Soderlund in USP#4，563，419，January 7，1986；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，in PCT WO 86/03782，July 3，1986；Y.Stabinsky，in USP#4，751，177，January 14，1988，T.H.Adams et al.，in PCT WO90/01564，Feb 22，1990；R.B.Wallace et al.，6 NucleicAcid Res.11，p.3543，1979；和B.J.Connor et al.，80 Proe.Natl.Acad.Sci.USA pp.278-282，1983)。這些形式多種改進方法統稱為「反向斑點印跡」方法。
使用通用的核酸分子雜交形式和嚴格控制方法，仍然難以識別低考貝數(即，1-100,000)核酸目標分子甚至使用靈敏度最高的標記物質(酶，螢光團，同位素，等)和配套的識別系統(螢光計，魯米諾儀，光子計數器，閃爍計數儀，等)。
這個難點是由直接探針雜交法本身帶有的一些不足之處引起的。一種不足涉及雜交反應的嚴格控制。雜交反應為了獲得雜交的特異性通常在嚴格的條件下進行。嚴格控制的方法基本地包括雜交反應溫度，離子強度和變性劑的優化和隨後的漂洗過程。不幸地，應用這些嚴格的條件導致用於識別的探針/目標分子雜交複合物的數量降低。
另一種問題涉及存在於大多數樣品，尤其是人類基團組DNA樣品中的高度複雜的DNA分子。當一個樣品中含有極大量的與特定的目標序列有緊密關係的序列時，即使最獨特的探針也會與非目標序列形成大量的部分雜交。
第三個問題涉及存在於探針與它的特殊目標分子間的不合適的雜交動力學。即使在最適合的條件下，大部分雜交反應是在相當低濃度的探針和目標分子間進行。此外，探針常不得不與互補鏈競爭目標核酸分子。
最常用雜交技術形式存在的第四種問題是高水平的非特異性背景信號。這是由DNA探針與幾乎所有物質親和性引起的。
上述這些問題，單個或聯合出現導致在上述幾種形式的核酸分子雜交反應中喪失靈敏度和/或特異性。這一點是不幸的因為在極大多數基於核酸分子的臨床診斷分析中識別考貝數的核酸目標分子是必不可少的。
鑑於識別低考貝數核酸目標分子的難度，研究者們極大地依靠聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目標核酸序列(參見M.A.Innis et al.，PCR方案、方法和應用的介紹，Academic Press，1990)。由PCR反應產生的極大量目標核酸序列促進了隨後的直接核酸探針技術，儘管操作過程變長麻煩和費用增加。
與在用直接探針識別低考貝數目標核酸分子中通常出現的難點完全不同的一種例外是原位雜交技術。這種技術使得低考貝數稀少的核酸序列能在單個細胞中被識別。在原位雜交形式中，目標核酸分子自然地限制在一個細胞(～20-50μm2)或一個細胞核(～10μm2)範圍內可達到相當高的區域濃度。而且，探針目標分子雜交信號被限制在微觀的形態上獨特的區域；這使得從人工的或非特異的信號中區分陽性信號比在固體載體上的雜交反應更加容易。
在某些方面模仿原位雜交反應，一些在形成的微小複合器或模型裝置(如，DNA晶片)上進行多倍的樣品核酸分子雜交分析的新技術正在發展起來。(參見M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp.757-758，1992)。這些方法通常把特殊的DNA序列結合在一種固體載體非常小的特定區域上，例如DNA晶片的微孔。這些雜交反應的形式是傳統的「反向斑點印跡」和「夾心」雜交系統朝微觀範圍的改進。
微觀形式雜交反應可用來進行「通過雜交測序」(SBH)(參見M.Barinaga，253 Science，pp.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，pp.757-758，1992)。SBH通過使用所有可能的n-核苷酸寡聚體(n-mers)來確定在未知DNA樣品中的n-mers，隨後通過規則系統分析而線性化進而確定DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yugoslav Patent Application #570/87，1987R.Drmanac et al.，4 Genomics，114，1989；Strezoska et al.，88Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10089，1991；和R.Drmanac和R.B.Crkvenjakov，USP #5，202,231，April 13，1993)。
有兩種形式可進行SBH。一種形式包括在一個載體上構建一個所有可能的n-mers列陣，然後與目標序列進行雜交。這是反向斑點印跡雜交的一種改進。另一種形式包括把目標序列結合在一個載體上，隨後用所有可能的n-mers來探測。兩種形式具有直接探針雜交的基本問題和與複合雜交有關的其它的難點。
在UK Patent Application GB 8810400，1988；E.M.Southernet al.，13 Genomics 1008，1992.中，Southern提議使用「反向斑點印跡」雜交形式來分析或測定DNA序列。Southern使用PCR擴增的基因組DNA確定了一個已知的單點突變。Southern也描述了一種用於SBH的在固體載體上合成一個寡聚核苷酸列陣的方法。然而，Southern沒有提出如何獲得列陣中每一個寡聚核苷酸的最適嚴格條件。
在364期Nature，pp.555-556，1993中，Fodor et al.，使用一個在固體載體上的1,024 8-mer寡聚核苷酸列陣進行了DNA序列測定。在這種情況下，目標DNA是一條螢光標記單鏈的12-mer寡聚核苷酸鏈僅含有A和C鹼基。一種濃度為1皮摩爾(～6×1011分子)的12-mer目標序列與列陣中8-mer寡聚體進行雜交反應是必需的。這結果表明了多個錯配序列。象Southern一樣，Fodor et al.，沒有提出直接探針雜交存在的問題，例如複合雜交反應的嚴格控制。這些問題與需要大量的簡單12-mer目標分子一起表明對這種SBH形式的嚴重限制性。
同時地，Drmanac et al.，260 Science 1649-1652，1993，應用上面討論的第二種形式測定了幾種短(116bp)的DNA序列。目標DNA分子結合在膜載體上(「斑點印跡」形式)。每一張膜順序地與272標記的10-mer和11-mer寡聚核苷酸進行雜交。廣範圍的嚴格條件用來獲得對每一個n-mer探針特殊的雜交反應；漂洗時間從5分鐘到隔夜不等，溫度從0℃到16℃不等。大多數探針需要在16℃漂洗3小時。每一張膜需要曝光2到18小時以便識別雜交信號。儘管是簡單的目標序列，還原的寡聚體探針和使用現有的最嚴格條件，總的假陽性雜交率是5％。
Fodor et al.，251 Science 767-773，1991，使用照相平版印刷的技術在基質上合成寡聚核苷酸。Pirrung et al.，在USP #5，143，854，Sept.1，1992中，介紹在矽基底上以列陣方式大規模照相平版印刷固相合成多肽。
在另一種基質雜交方法中，Beattie et al.，在1992年聖地牙哥會議基因識別，Nov.1992，使用一種微型機器人系統在玻璃基底上把含有特殊DNA序列的微滴滴入單個的微型構建的樣品孔內。每一個孔內雜交反應的檢測是通過在每一單個微孔周圍帶有交流(AC)電場的微型電極測試固定裝置的反映而進行的。
不管形式的不同，所有現今通用的微小規模DNA雜交和SBH方法都沒有克服與核酸雜交反應相聯繫的潛在困難。它們需要非常高濃度的相當短的單鏈目標序列或PCR擴增DNA分子，和即使在最嚴格條件下也產生高水平的假陽性雜交信號。在使用短的寡聚核苷酸序列的列陣複合形式這種情況下，對每一單個序列用任何傳統的方法優化嚴格的條件是不可能的，因為用於這些形式的列陣或裝置不能改變或調整單個位置相對其它位置的溫度，離子強度，或變性劑。因此，一個共同的嚴格條件必須用於裝置上所有的序列。其結果是大量非特異性的和部分的雜交信號的產生這就嚴重地限制了這種裝置的應用。這問題隨著列陣中不同序列數目的增加，隨著序列長度在10-mers以下或在20-mers以上時而成為更加複雜化。這是特別麻煩的對於SBH，它需要大量的短寡聚核苷酸探針。
不同大小、電荷，或結構的核酸分子通常是用電泳技術分離，電泳技術可通過它們在電場中不同的泳動能力來區分不同的雜交分子。脈衝場電泳利用在一種介質(如，凝膠)周圍複合電極的排列來分離那些用傳統凝膠電泳系統不能分開的非常大的DNA片段(參見R.Anand和E.M.Southern in核酸凝膠電泳-實用方法2ed.，D.Rickwood和B.D.Hames Eds.，IRL Press，New York，pp.101-122，1990)。
Pace，USP#4，908，112，March 13，1990，描述利用顯微製造技術在矽基底上產生一種毛細管凝膠電泳系統。在此裝置內，複合電極被結合入該系統中用於移動分子通過分離介質。
Soane和Soane，USP 5，126，022，June 30，1992，指明多個電極可用來控制混合物中帶電分子在管中通過凝膠分離介質的線性移動。所有電極必須裝入管中以便控制分離介質中分子的移動和位置。
Washizu，M.和Kurosawa，O.，在26 IEEET業應用學報6，pp.1165-1172，1990中介紹，應用高頻交流電(AC)場按照在微型製作的電極間形成的電場線來排列DNA分子。然而，應用直流電(DC)場則抑制了它們的功能。Washizu在25卷靜電學雜誌109-123，1990中，描述了利用介電電泳操作細胞和生物分子的方法。細胞間能融合，生物分子可按微電極結構間交流電壓產生的電場線排列。然而，介電電泳過程需要極高頻交流(1 MHz)電壓和低電導率介質。雖然這些技術能沿著交流(AC)電場線排列不同大小的DNA分子，但它們不能區別相同大小分子的雜交複合物。
從上述討論可知，已盡了很大的努力力求提供有效的技術進行多步、複合的分子生物學反應。然而，正因上述的原因，這些技術證明不夠完善。儘管對有效技術的需求已被充分認識到，但滿意的解決方法仍至今未提出來。
發明概述本發明涉及設計、製造和使用能編程的、自我尋址的和自我裝配的微電子系統以及能有效地進行控制的多步和複合的以微觀形式反應的裝置。這些反應包括，但不局限於，大多數分子生物學過程，例如核酸分子雜交，抗體/抗原反應，和有關的臨床診斷。此外，申請專利的裝置能進行多步組合的生物高分子合成，包括，但不局限於，在特定的微場所合成不同的寡聚核苷酸或多肽。
申請專利的裝置是採用微型平版印刷術和微機械加工技術製造的。這些裝置在其表面有一種可尋址的顯微場所的基質；每一單獨的微場所能夠用電子學方法控制和引導特異的結合實體(如，核酸分子、抗體)轉移和粘附至其身上。所有的微場所能夠被它們特異的結合實體尋址。應用這些裝置，這系統可在最小外界幹預下自我組裝。
這被尋址的裝置可以控制和有效地進行種種測定和反應。分析物或反應物通過自由場電泳可被轉移到任何特殊的微場所，在那裡分析物或反應物可有效地在所提的微場所濃縮並與特異的結合實體反應。因為濃縮效應，識別特殊分析物或反應物的靈敏度提高了，任何未結合的分析物或反應物可通過反向微場所的極性而去除。這樣，該裝置也提高了測定和反應的特異性。
裝置的積極特性對發生在每一個特殊的微場所的雜交反應(或任何其它的親和反應)的所有方面提供獨立的電子學控制。這些裝置為影響雜交反應提供了一種機理被稱為電子學嚴格控制(ESC)。對需要不同嚴格條件的DNA雜交反應，ESC克服了傳統列陣技術固有的限制。這種發明的有效裝置可在每一個微場所電子學地產生「不同的嚴格條件」。這樣，所有的雜交反應可在同一大批溶液中優化地進行。這些有效的裝置基本上不同於傳統的複合雜交列陣和DNA晶片。傳統的列陣法在每一位點有不同的探針或目標DNA分子；在列陣中所有位點具有相同的反應或溫度、緩衝液、鹽濃度、和pH的嚴格條件。反應或嚴格條件的任何變化影響列陣中所有位點。雖然複雜的照相平版印刷技術可用於製作列陣，或微電子傳感元件參與測定，傳統的裝置是被動的不能控制或影響實際的雜交過程。本發明的有效裝置使得每一個微場所的功能如同完全獨立的測定或分析位點(即它們在每一場所形成如同一個「測定管」)。複合的雜交反應可在最小的外界操作情況下進行。此外，改變溫度交換緩衝液是不需要的，複合漂洗過程也就不需要。
因此，申請專利的裝置能在完全和精確的電子學控制下，優選在完全微處理機控制下(即，由計算機控制)進行多步和複合反應。多步和複合反應的速率、特異性、和靈敏度在權利要求裝置的每一個特殊微場所都極大地提高了。
這裝置在每一微場所通過使用輔助的光學(螢光、化學發光、或紫外分光)圖象識別系統也促進雜交複合物的識別。可直接識別DNA的組合視電或電子傳感元件也可組裝入裝置內。
如果需要，一個由特異結合實體尋址的主裝置能用電子學方法複製或複製出另一個基本裝置。
本發明可應用與本發明目的一致的任何大小或形狀的微場所。在本發明優選的實施方案中，使用的微場所在亞-毫米範圍內。
「特異結合實體」通常表示一種生物或合成的分子，其具有對另種分子，大分子或細胞通過共價結合或非共價結合的特殊親和力。優選地，一個特異的結合實體包括(或是自然的或通過修飾的)一個功能的化學基團(伯胺、巰基、醛基等)，一段共有序列(核酸)，一個表位(抗體)，一個半抗原，或一個配基以便使其共價地反應或非共價地結合到微場所表面的共有的功能基團上。特異的結合實體包括但不僅局限於脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，合成的寡聚核苷酸、抗體、蛋白質、多肽、凝集素、修飾過的多糖、細胞、合成的複合大分子，超功能的納米結構、合成的高分子，修飾的/封閉的核苷酸/核苷，修飾的/封閉的胺基酸、螢光團、生成團、配基、螯合劑和半抗原。
通過「嚴格控制」來表示一種藉助改變一些物理學參數，來區別特異的和非特異的結合相互作用的能力。在核酸分子雜交時，溫度控制是常用來提高嚴格性。雜交反應是在或接近特殊雙鏈雜交對的解鏈溫度(Tm)下進行。
因此，本發明第一和最重要的方面是一種帶有一個電子學編程和能自我尋址顯微場所的列陣的裝置。每一個顯微場所含有一個由基質支持的基礎工作直流(DC)微電極。在每一個微場所的表面具有一層能自由轉移小相對離子的滲透層，和一個用於共價結合特定結合實體的粘附層。這些特別的設計特性提供了該裝置如下關鍵性的特性(1)允許可控制的具功能的DC電極被保持在微場所之下；(2)允許保持電泳樣的移動；和(3)區別發生在電極(金屬)表面間的電化學反應和反向電解反應以及親和或結合反應。應該強調這些裝置中應用的微電極的基本功能是提供結合的和反應物的實體朝特定場所電泳推進力。
「列陣」或「基質」用來表示裝置上可尋址場所的一種排列。場所可按二維列陣，三維列陣，或其它基質形式排列。場所的數目在從幾個到至少數十萬個的範圍內。每一個場所代表一個完全獨立的反應點。
在第二方面，本發明特別描述了一種轉移結合實體到裝置上任何特殊微場所的方法。當被活化後，微場所能影響自由場電泳轉移任何帶電功能化的特異結合實體到微場所本身處。一旦接觸到特定的微場所時，這功能化的特定結合實體立即變成共價結合到這個特定微場所表面的粘附層上。其它的微場所能同時通過保持它們處於帶電分子相反電勢而被保護。這個過程能迅速地重複，直至所有的微場所都被它們特異的結合實體尋址。
「帶電的具功能的特異結合實體」體用來表示一個特異的結合實體，它是化學上活潑的(即，能被共價結合到微場所上)和帶有淨電荷(正電或負電)。
在第三個方面，本發明特別描述一種在裝置中任何特定的微場所濃縮分析物和反應物並與其反應的方法。在特異的結合實體結合以後，在每一個微場所的基礎微電極以直流(DC)模式起作用。這獨有的特性使得溶液中自由存在的相對稀釋帶電的分析物或反應物被迅速轉移、濃縮，或在任何保持與分析物或反應物分子帶相反電荷的特定的微場所以系列或平行的方式進行反應。特異的微場所可通過保持它們帶有與分析物或反應物分子相同的電荷而被保護或防護。這種在選擇的微場所濃縮稀釋的分析物或反應物分子的能力極大地加速了在這些微場所的反應速率。
當所需的反應完成時，微電極電勢能被反轉，從而從微場所移去非特異的分析物或未反應的分子。
特定的分析物或反應產物可從任何微場所釋放出而轉移到其它場所進行進一步分析；或者在其它能尋址的場所貯存；或從該系統中全部移去。
在特定的微場所上隨後對分析物的分析，藉助從這些場所排斥非特異實體的能力也極大地改進。
在第四個方面，本發明特別描述了一種改進核酸分子雜交反應嚴格控制的方法，該方法由下列步驟組成——在雜交反應將發生的特定微場所快速濃縮稀釋了的目標DNA和/或探針DNA序列；——在雜交反應已發生的特定微場所快速移走非特異結合的目標DNA序列；——從雜交反應已發生的特定微場所快速移走競爭的互補目標DNA序列；——調整電子嚴格控制(ESC)以便移去部分雜交的DNA序列(多於一個鹼基的錯配序列)；
——調整ESC以使用8-mer到21-mer範圍內的探針改進單個錯配序列雜交反應的解析度(例如，識別單點突變)；——應用ESC有效地雜交寡聚核苷酸點突變探針儘管在傳統雜交過程使用的探針範圍以外(例如，長於21-mers和短於8-mers的探針)；——應用獨立的ESC到發生在相同容積溶液中和相同溫度下的單個雜交反應中；和——應用ESC促進未擴增的目標DNA序列雜交到捕獲寡聚核苷酸探針的列陣上。
在第五個方面，本發明特別描述了一種在微場所組合合成生物高分子的方法。
在第六個方面，本發明特別描述了一種複製主裝置的方法。
在第七個方面，本發明特別描述一種裝置它能電子學地進行樣品製備和轉移目標DNA到裝置的分析部分。
在第八個方面，本發明特別描述一種裝置它能電子學地輸送試劑和反應物而最小限度地使用射流。
在第九個方面，本發明特別描述一種裝置它能進行分子生物學和DNA擴增反應(例如，限制性切割反應；和DNA/RNA聚合酶和DNA連接酶目標擴增反應。)在第十個方面，本發明特別描述一種裝置它能電子學地確定大小和識別限制性片段(例如，進行電子學限制片段長度多態性和DNA指紋分析)。
在第十一個方面，本發明特別描述一種裝置，它能進行抗體-抗原和免疫診斷反應。
在第十二個方面，本發明特別描述一種裝置，它能進行組合的合成寡聚核苷酸和多肽。
在第十三個方面，本發明特別描述一種裝置，它能選擇性地結合細胞，為雜交反應加工細胞，從細胞中移去DNA，或在細胞內進行電子學的原位雜交。
在第十四個方面，本發明特別描述一種方法，該方法能識別和分析已發生在被尋址的微場所上的反應，應用自我尋址的微電子學裝置與聯合的光學、光電子學或電子學識別系統，或自我尋址的微電子學裝置與完整的光學、光電子學或電子學識別系統。
由於本發明的裝置是有效的可編程的電子學矩陣變換電路，首字母縮寫詞「APEX」用來描述或指明這些裝置的固有特性。這AREX首字母縮寫詞被用在顯微平版印刷技術生產的「晶片」和微機械加工生產的裝置中。
APEX微電子裝置和晶片的活潑的特性讓我們構建新的機理用於進行各種各樣的分子生物學反應。這些包括獲得線性和指數的增加或擴增目標DNA和RNA分子的新方法。
本裝置提供電子學機理進行(1)在相同緩衝液中室溫下有選擇性地變性DNA雜交子(例如，常在低於它們的解鏈溫度很多的溫度下進行)；(2)在兩個或更多的微場所間快速朝後和向前轉移或移動DNA；和(3)有選擇性地在所需要的微場所濃縮特定的反應物，試劑，和酶分子。這些都含有新的物理學參數用於進行分子生物學和目標分子擴增類型的反應。
大量電子學控制的分子生物學反應的實例已發展起來，這些包括(1)電子學直接的限制酶切特定的ds-DNA序列；(2)電子學的限制性片段分析；(3)通過DNA聚合酶反應的電子學的倍增目標DNA分子；(4)通過DNA和RNA連接酶電子學的連接和倍增目標DNA序列；和(5)通過RNA聚合酶電子學的倍增目標DNA分子。這些實例是能在這APEX裝置上進行的分子生物學反應和過程類型的代表。
本發明的其它特性和優點將從下列詳細的發明描述和權利要求中明顯地知道。附圖簡述

圖1是用微平版印刷技術組建的三個自我尋址的微場所截面圖。
圖2是單個微平版印刷組建的微場所截面圖，圖3一個自我尋址的64個微場所晶片的圖解的例子，它是實際上組建的，被寡聚核苷酸尋址的、和被測試的。
圖4表明特別的化學結合過程，它允許快速共價結合特異的寡聚核苷酸到微場所表面的粘附層上。
圖5是一個微加工的96個微場所的裝置的放大圖解。
圖6是一個微加工的裝置的截面圖。
圖7表明裝置用來電子學地濃縮分析物或反應物分子在某個特定的微場所的機理。
圖8表明一個裝置與三個特定的寡聚核苷酸結合實體(SSO-A、SSO-B和SSO-C)的自我引導的裝配過程。
圖9表明一個電子學地控制的雜交過程與在微場所被濃縮的含有特定的DNA捕獲序列的樣品/目標DNA分子。
圖10表明一個電子學地引導的系列雜交過程。
圖11表明為確定單個點突變的電子學嚴格控制(ESC)雜交過程。
圖12表明識別雜交了的DNA分子而不用標記過的DNA探針的圖解，即，電子學地控制螢光染料識別過程。
圖13表明電子學地控制的裝置複製的圖解。
圖14表明電子學地引導組合合成寡聚核苷酸的圖解。
圖15表明一個圖解，關於進行15-mer Ras 12點突變雜交反應應用電子學嚴格控制和傳統技術產生結果間的比較。
圖16表明電子學地控制限制片段切割DNA分子的圖解。
圖17表明電子學地控制應用DNA聚合酶進行DNA擴增的圖解。
圖18表明一個APEX裝置的圖解，該裝置設計用來進行樣品製備和DNA分析。發明詳述本裝置和本發明有關的方法學允許分子生物學和診斷反應在「完全電子控制」下進行。「電子控制」在本發明中的意思超過了這一術語傳統的涵義。大多數傳統的微電子裝置，儀器，和識別系統總是在一定程度上受電子學控制。本發明的微電子裝置不但在傳統電子控制下，而且更重要地它們也提供進一步直接電子學控制進行分子生物學和診斷反應的物理學方面。本發明基本概念是一個帶能編程的和尋址的顯微場所的微電子裝置。每一個微場所具有為共價結合特異結合實體的一個衍生上表面(即，粘附層)，一個中間滲透層，和一個基礎直流(DC)微電極。在基本的微電子學結構最初組建後，這裝置能自我引導每一個特殊的微場所與特異的結合實體的尋址。從這種意義上說，這裝置它自已自我組裝。這自我尋址裝置隨後能有效地進行在任何它的微場所上單個的多步和組合的反應。裝置能進行多路反應，但有在與真正獨立測試點相同的地點發生的每一個反應的重要優點。裝置能夠電子學地引導和控制分析物和反應物去或從裝置上任何微場所快速移動和濃縮。裝置電子學地控制各種反應動力學方面的能力提供了大量新機理和重要的優點和改進。
本發明觀念和實施方案以三部分來描述。第一部分，「設計和組建基本裝置」描述設計基本基礎微電子裝置和應用微平版印刷和微加工技術組建裝置。第二個部分，「裝置的自我引導尋址」，描述了裝置的自我尋址和自我裝配，特別是快速移動和結合特異的結合實體到每一個微場所。第三個方面，「裝置的應用」描述裝置如何提供各種多步，組合的，和多路反應電子學控制。這部分也描述本裝置的各種用法和應用。I.設計和組裝基本裝置一個裝置為了進行多步和多路反應，它的電子元件必須在水溶液中能夠保持活潑工作狀態。為滿足這一要求，每一個微場所必須有一個基礎的能控制的和具功能的DC式微電極。然而，對於裝置的操作，特別是靈敏度(信噪比)這是重要的即結合和親和反應不能受在活潑的DC電極表面發生的電解反應影響。其它為設計和組建該裝置的考慮包括，但不局限於，材料的兼容性，特異的結合實體的特性和隨後的反應物和分析物的特性，和微場所的數目。
「能控制的和具功能的DC式微電極」用來表明一個偏壓或正或負的微電極，以直流方式(或連續或脈衝)運行的，能夠以可控方式影響或引起帶電特異結合實體，反應物，或分析物去或從裝置上任何場所，或從樣品溶液的自由場電泳式移動。
在本發明範圍內，分子的自由場電泳式移動，不是實際上取決於產生的電場，該電場被絕緣材料圍起或限制。傳統的電泳分離技術需要用絕緣(不導電)材料限制或圍繞電場線。在自由場電泳式移動情況下，帶電的分子從一個微場所移動到任何其它微場所，或從大量溶液到特殊的微場所。因此，特有的排列或由絕緣材料的限制，不是本發明這方面必須的。
裝置可以設計成具有少至只有2個可尋址微場所，或有多至數十萬個微場所。一般來說，具大量微場所的複雜裝置是用微平版印刷技術製造的。製造的進行是在矽或其它合適基質材料，例如玻璃，二氧化矽，塑料，或陶器材料上。這些微電子「晶片」的設計可被認為是大範圍的列陣或多路分析裝置。裝置具有少數的微場所或大場所可用微加工技術來製造。
可尋址的微場所可以是任何形狀，優選圓形、方形、或長方形。可尋址微場所的大小可為任何大小，優選地範圍從亞-微米(～0.5μm)到幾釐米(cm)，從5μm到100μm是最優選的尺寸範圍使用微平版印刷技術製造裝置，從100μm到10毫米是最優選的尺寸範圍使用微機械加工技術來製造裝置。製造微場所小於微平版印刷方法的分辨能力將需要如下的技術例如電子束平版印刷，離子束平版印刷，或分子束外延。雖然顯微場所對分析和診斷類型反應是需要的。而較大的可尋址場所或大場所(例如，大於5mm)對一些應用例如，但不局限於，製備規模生物高分子合成，樣品製備，試劑的電子學分配是需要的。
在藉助微平版印刷和/或微加工技術微場所已構建後，化學修飾，聚合反應，或甚至進一步微平版印刷製造技術被用來建成特殊的粘附和滲透層。這些重要的層次把結合實體從電極的金屬表面隔離開。這些重要的結構允許在每一個微場所表面下的DC式微電極起如下的功能(1)影響或引起特異的(帶電)結合實體從一個微場所的表面自由場電泳式移動到另一個微場所的表面，或從大量溶液中移動到特異的微場所；(2)濃縮和共價結合特異的結合實體到一個特定微場所經特殊修飾過的表面；(3)在結合特定結合實體後繼續以DC方式有效地起作用以便其它的反應物和分析物能以可控制的方式被轉移到或從微場所轉移；和(4)非反向地影響與電化學反應和產物結合或親和反應。I(a)設計參數(微平版印刷)圖1表明應用微平版印刷技術製造自我尋址微場所的基本設計。三個微場所(10)(ML-1，ML-2，ML-3)形成在已沉積在一個絕緣層/基礎材料上的金屬位點(12)的表面。這金屬位點(12)作為基礎微電極結構(10)。絕緣材料把金屬位點彼此分隔開。絕緣材料包括，但不局限於，二氧化矽、氮化矽、玻璃、防染劑、聚醯亞胺、橡膠、塑料或陶瓷材料。
圖2表示在由微平版印刷技術製造的金屬位點(12)上形成的單個微場所(10)的基本特點。可尋址的微場所是在金屬位點(12)上形成的，結合上一氧化層(20)，一滲透層(22)，一粘附層(24)，和一個結合實體層(26)。金屬氧化層提供共價結合滲透層的基礎。金屬氧化物和羥基基團(單個或組合)，和其它表面塗蓋化學領域技術人員熟知的材料可以提供共價結合位點用於構建或支撐滲透層。這不是絕對必須的即滲透層實際上是共價結合到金屬電極表面。滲透層的物理塗蓋代表了另一種方法，它也在本發明的範圍內。
滲透層金屬表面和粘附/結合實體層提供了空間並允許溶劑分子，小相對離子，和電解反應氣體自由地通過去和離金屬表面。這是可能的在滲透層內包含有能降低電解反應相反物理和化學的影響的物質，包括，但不局限於，氧化還原反應截留物質，例如針對氫氣的鈀，和針對氧氣和過氧化物的含鐵複合物。對微平版印刷製造裝置和滲透層的厚度能從大約1納米(nm)到100微米(μm)間，最優選的厚度在2納米到10微米間。
粘附層為共價結合需要結合實體提供一個基架。對微平版印刷技術製造的裝置的粘附層厚度能從0.5nm到5μm，在1nm到500nm間是最優選的。在一些情況下，滲透層和粘附層可用同一材料製成。能進一步被活化用於結合需結合實體的特定滲透層材料也包括在本發明的範圍內。
特異的結合實體是共價地結合到粘附層上，形成特異的結合實體層。理想地，特異的結合實體層通常是特異的結合單層。然而，在一些情況下結合實體層能有幾個或甚至多層的結合分子。
滲透和粘附層的特定設計和功能的方面是由特異的結合實體分子物理的(如，尺寸和形狀)和化學特性支配的。它們也由反應物和分析物分子的物化性質支配到一定程度，這些反應物和分析物分子隨後移動和結合到微場所上。例如，寡聚核苷酸結合實體可被結合到一種類型的微場所表面而不引起喪失DC式功能，即，基礎微電極仍能引起快速自由場電泳式移動其它與分析物分子到或離開寡聚核苷酸結合實體結合的表面。然而，如果較大的球形蛋白結合實體(如，抗體)結合到相同類型的表面，它們可能使表面絕緣和引起降低或完全喪失DC式功能。粘附層合適的修飾將不得不進行以便降低較大結合實體(如，大的球形蛋白)的數目或提供在表面結合實體間的空間。
微場所間的空間的確定是通過製造的難易程度，微場所間所需要的識別解析度，和一個裝置上所需微場所的數量來進行的。然而，在微場所間，或特定排列間或微場所的幾何形狀間的特殊的空間對裝置的功能正是必須的，即任何微場所(即，基礎微電極)的組合能在整個裝置範圍內運行。實際上無需包圍裝置或完全地用絕緣或不導電的屏障來限制微場所。這是因為複雜的電子場型或不導電的邊界對於選擇性地移動、分離、承託，或調整特殊分子在任何電極間介質或空間中，是不需要的。裝置完成這個是通過結合特異的結合分子和隨後的分析物和反應物到一個能尋址的微場所的表面。自由場電泳推進力提供任何帶電分子在裝置任何或所有場所間；或從大量溶液到微場所快速和直接轉移。然而，必須指出裝置為了液體抑制和生物有害物的目的可被包圍起來。
隨著微場所的數目增加超過幾百，微場所基本迴路的複雜性增加。在這種情況下微場所組式樣必須改變的空間距離成比例地增加，或多層迴路能被製造到基本裝置內。
除了已被特異的結合實體尋址的微場所外，一個裝置將含有起到其它的功能非分析的微場所和大場所。這些微場所或大場所可被用於貯存試劑，短暫地承託反應物，分析物或細胞，或作為處理單位為多餘的反應物，分析物，或其它樣品中幹擾成份(即，試劑分配和樣品製備系統)。其它未被尋址的微場所可被用於與已被尋址的微場所組合影響或幹擾在這些特殊的微場所發生的反應。這些微場所加到裝置間和裝置內的活性和控制。因此，微場所在兩個分開的裝置間相互作用和轉移分子也是可能的。這為從一個貯存裝置中取結合實體或反應物加樣到工作裝置上，為樣品製備和為裝置的複製或倍增提供了一個機理。
圖3表示了一個含有64可尋址微場所的矩陣類型裝置(30)。一個64微場所裝置是個方便的設計，它剛好吻合於標準微電子晶片包裝組成。這種裝置是在大約1.5cm×1.5cm的矽晶片基質上製造的，在中心區域大約750μm×750μm含有64個微場所。每個微場所(32)大約是50μm的方形，在鄰近微場所間具50μm空間。每一獨立的基礎微電極連接迴路通向金屬接觸墊(300μm2)的外周(10mm×10mm)。一個凸起的內周可在帶有微場所區域和接觸墊之間形成，產生一個洞能裝大約2到10微升(μl)的樣品溶液。這晶片能被放入標準空鉛外殼中，和晶片接觸的墊(34)用線連到空鉛外殼引線上。含有多於1個晶片和附帶的外殼和外周組成的系統可用於設計成解決有關於臨床診斷的問題，即，樣品材料的加入，液體轉移，和生物有害物質的抑制。外殼包裝好的晶片然後可插入微處理機控制的DC電源和萬用表儀器它能控制和操作該裝置。本發明期望裝置製造(尋址前)將根本地包括三種基本成份的組合，這些成份將基本地夾心在一起。結合實體結合的基本晶片裝置將處在中間位置，樣品或液體限制成份將在基本晶片裝置的上方退火；和一個微電子識別和廣泛控制器成份將在基本晶片裝置的底部退火。這種策略解決了有關於製造技術和材料可容性的大量問題。I(b).微平版印刷製造程序I(b)(1)製造步驟通常微平版印刷或光平版印刷技術能被用於製造複雜「晶片」類型裝置，這類裝置有大量小的微場所。雖然裝置的製造不需要複雜的光平版印刷技術，材料的選擇和電子學裝置有效地在水溶液中起作用的需求極需要特殊的考慮。
圖3中表示的64微場所裝置(30)可應用相對簡單的蒙片設計和標準的微平版印刷技術製造。一般地，基本的基質物質是1到2釐米見方的矽片或晶片約0.5毫米厚。這矽晶片首先覆蓋1到2μm厚的二氧化矽(SiO2)絕緣層，它是由等離子體增強化學蒸汽沉積法(PECVD)製成。
在下一步，一個0.2到0.5μm金屬層(如，鋁)通過真空蒸發沉積而成。這也可能通過飛濺技術沉積金屬。除鋁以外，合適的金屬和材料用於迴路的包括金、銀、錫、鈦、銅、鉑、鈀、聚矽、碳，和各種金屬的組合。用於保證完全粘附到絕緣基質材料(SiO2)的特殊技術被用來粘附不同的金屬。不同的金屬和其它材料可被用作裝置不同的導電元件，例如，使用鋁用於周邊接觸墊，聚矽用於相互聯繫的迴路，和貴重金屬(金或鉑)用於微電極。
這晶片下一步覆蓋帶正電的光致抗蝕劑(Shipley，MicropositAZ 1350J)，用迴路的式樣蒙片(光場)修正，曝光和衝洗。光溶解的抗蝕劑被去除，曝光後鋁蝕刻掉。抗蝕劑小島現被去除，留下鋁迴路式樣在晶片上。這包括外周邊的金屬接觸墊，相連接電路(電線)和微電極中心列陣作為可尋址微場所下面的基礎。
應用PECVD，這晶片首先覆蓋0.2到0.4微米的SiO2層，然後0.1到0.2微米氮化矽(Si3N4)層。晶片再塗蓋帶正電的光致抗蝕劑，為接觸墊和微電極場所蒙片修正，曝光，和衝洗。光溶解的抗蝕劑被去掉，SiO2和Si3N4層蝕刻掉，曝光鋁接觸墊和微電極。周圍的抗蝕劑小島隨後被去除，位於接觸墊和微電極間的相連接線路由SiO2和Si3N4層保持絕緣。
SiO2和Si3N4層為裝置的功能提供了重要的特性。第二個SiO2層提供更好接觸和促進密封鋁電路。這也可能用抗蝕劑材料來絕緣和密封。這可防止微電極運行中電解反應引起的電路的逐漸損害。最後的Si3N4表層應用是因為它與隨後用於修飾粘附特異結合實體的微電極表面的試劑反應性能低。I(b)(2)滲透和粘附層形成的步驟在這步裝置上微電極場所已準備可用特殊的滲透和粘附層來修飾。這是本發明一個重要的方面。目的是在微電極上構建一個中間的滲透層並帶有選擇性的擴散特性和一個具有最佳的結合特性粘附表層。
最佳地，粘附層每平方微米(μm2)中具有105到107個具功能的微場所可用於粘附特異的結合實體。特異的結合實體的粘附必須不覆蓋或絕緣表層以防止下面的微電極喪失功能。一個具功能的裝置需要實際金屬微電極表面的部分(～5％到25％)保持與溶劑(H2O)分子接觸，和允許發生相反離子(如，Na+和Cl-)和電解氣體(如，氧氣和氫氣)的擴散。
中間的滲透層也設計成允許發生擴散。此外，滲透層必須有孔限特性以便抑制或阻止較大的結合實體、反應物，和分析物與微電極表面物理接觸。滲透層保持活潑的微電極表面物理學上性質不同於微場所的結合實體層。
這種設計允許因電泳移動需要的電解反應在微電極表面發生，但避免對於結合實體，反應物和分析物不利的電化學影響。
滲透層也可被設計成包括那些能清除在電解反應中產生的不利的物質(H2，O2，自由基團等)的基質。另一個滲透層的亞層可被設計用於這一目的。
許多種設計和技術可用於製造滲透層。常用的設計包括(1)「草坪法」，(2)「網眼法」，和(3)「多孔法」結構。
草坪式滲透層包括金屬表層和線性分子或高分子垂直排列，以一個類似於厚草坪的方式。這些結構可通過直接粘附線性或聚合和親水分子到金屬表面形成，其中在垂直分子間有最少量的交叉聯繫。理想地這些親水線性分子是雙功能的，即在一端適合共價結合到金屬墊上，而另一端適合結合實體的共價結合。
網眼式滲透層包括聚合分子隨機排列形成網眼狀結構，具有可由交叉聯繫的程度確定的平均孔徑。這些結構的形成可由含水凝膠類物質例如，但不局限於，聚丙烯醯胺，瓊脂糖，和種種其它能聚合和交叉連結的生物和非生物物質。
孔式滲透層包括應用能在金屬墊表面層的上面直接形成通道或孔的物質，包括，但不局限於，聚碳酸酯、聚碸、或玻璃物質。在所有的情況下滲透層必須物理地或化學地固定在金屬表面，並且必須含有功能基團或能夠轉化成功能化的基團用於粘附結合實體到它的表面。
一個用於產生草坪式結構的優選過程包括用氨基丙基三乙氧基矽烷(APS)衍生金屬微電極表面。APS容易與在金屬和矽表面的氧化物和羥基基團起反應。APS提供一組合的滲透層和粘附層，並帶有能與隨後結合實體共價結合的伯胺基團。就表面結合位點而言，APS在輕度氧化的鋁表面產生相當高水平的活化功能(即，大量的伯胺基團)，在SiO2表面產生一個中間水平的活化功能，和在Si3N4表面產生非常有限的活化功能。
APS反應的進行是通過用10％APS溶於甲苯的溶液在50℃處理整個裝置(如，晶片)表面30分鐘。然後晶片依次在甲苯、乙醇中衝洗然後在50℃乾燥1小時。微電極金屬表面用大量伯胺基團而被活化(每平方微米105到106)。結合實體現在能被共價地結合到衍生了的微電極表面。這種「草坪式」滲透層的深度也可通過應用聚氧乙烯雙(胺)，雙(聚氧乙烯雙(胺))，和其它聚乙烯醇或類似的化合物而增加。
APS過程對於寡聚核苷酸結合實體的結合很成功。圖4表示用於結合3′-末端醛基衍生了的寡聚核苷酸(40)到一個APS活化過的表面的機理(42)。雖然這代表一種方法，各種其它用於形成滲透和粘附層的方法是可能的。這些包括利用自我引導的尋址通過基礎電極本身進行(1)藉助電鍍到基礎微電極上形成第二種金屬層；(2)藉助電聚合反應到微電極場所形成滲透層；或(3)藉助自由場電泳過程轉移活化的聚合物和試劑到微電極表面形成隨後的滲透和粘附層。I(c)微加工的裝置的設計和製造這部分描述如何應用微加工技術(如，鑽孔、銑，等)或非平版印刷技術來製造裝置。一般地說，這些裝置比那些由微平版印刷技術製造的裝置有相對較大的微場所(＞100微米)。這些裝置能被用於分析應用和製備型應用，例如生物高分子合成，樣品製備，試劑分配，貯藏所，和廢物處理。大的尋址場所可被製造成三維形式(例如，管狀或圓柱狀)而攜帶大量的結合實體，這種裝置能應用各種材料製造，包括，但不局限於，塑料、橡膠、矽、玻璃(例如，微槽的，微毛細管的，等)，或陶瓷。低螢光材料是較理想的應用於分析應用。在微加工的裝置情況下，使用標準的電路版印刷技術連接電路和較大的電極結構能被印刷到材料上，而這種技術對本領域的技術人員是熟知的。
可尋址的微場所裝置能使用微加工技術被相當地容易地製造。圖5是一個代表性的96微場所裝置的圖解。這微場所裝置是從一個合適材料塊(2cm×4cm×1cm)製造的，藉助鑽孔96個成比例空間的孔(直徑1mm)穿過這材料。一個電極電路塊(52)在一薄層的塑料材料塊上形成，它準確地配合在微場所元件(54)頂部上方。電路板的背面含有(印刷電路)通向每個微場所(55)的單個電路。短的鉑電極結構(～3-4mm)(62)被設計成向下擴展進入單個的微場所腔(57)。這印刷的電路線路用一層合適的防水絕緣材料覆蓋。這印刷的電路線路匯聚到一個孔內，這允許連接到一個多路開關控制器(56)和DC電源供應器(58)。這裝置是部分地埋沒和操作在一個共同的緩衝液池(59)中。
雖然在由微加工和微平版印刷技術製造的裝置中微場所的原始功能都是相同的，但它們的設計是不同的。在由微平版印刷製造的裝置中，滲透和粘附層是在埋在下面的金屬微電極上直接形成的。在由微加工技術製造的裝置中，滲透層和粘附層是物理上從它們單個的金屬電極結構(62)分離的藉助單個的孔或池(57)中的緩衝液(見圖6)。在微加工的裝置中滲透和粘附層能通過使用功能性的親水凝膠，膜，或其它合適的多孔材料而形成。
一般地，組合的滲透和粘附層的厚度範圍從10μm到30mm。例如，一個修飾過的20％到35％的聚丙烯醯胺親水凝膠(帶0.1％聚賴氨酸)，能被用來部分填補(～0.5mm)裝置中每一個單個微場所腔。這些濃度的凝膠形成一個理想的滲透層其孔徑限度從2nm到10nm。聚賴氨酸組合入凝膠內為隨後的結合特異的結合實體提供伯胺功能基團。這種類型的凝膠滲透層允許電極有效地以DC模式起作用。當電極被活化後，這凝膠滲透層允許小的相反離子通過這滲透層，但較大的特異結合實體分子在外表面被濃縮。這兒它們成為共價地結合到外層的伯胺上，而有效地成為粘附層。
用於形成滲透和粘附層另一種技術是把一種多孔膜材料組合入每一個微場所腔基部。膜的外表面然後被衍生化用化學的功能基團形成粘附層。用於進行本方法的適合的技術和材料是對本領域的技術人員熟知的。
上面對於微平版印刷和微加工的裝置的設計和製造的描述必須不被認為是對其它改變或類型的基本裝置的限制。多個改變型的裝置並帶有較大或較小量的可尋址的微場所或組合的裝置能用於不同的分析和製備應用。改變型的裝置並帶有較大可尋址的場所能被設成用於製備生物高分子合成應用，樣品製備，細胞分類系統，原位雜交，試劑分配，貯存系統，和廢物處理系統。II.自我引導的尋址的裝置本發明的裝置能夠電子學地自我尋址每一個微場所與一個特異的結合實體。這裝置本身直接影響或引起移動一個帶電特殊結合實體到一個特異的微場所。結合實體一般地是功能化的以便它們迅速地反應和共價地結合到粘附層上。裝置自我裝配意謂著不需要外部過程，機械裝置或設備進行物理地引導，定位，或放置一個特異的結合實體在一個特殊的微場所上。這自我尋址過程是既快又特異。能以連續或平行的方式進行。
一個裝置能用特異的結合實體連續地被尋址通過保持被選擇的微場所以DC方式和與特異的結合實所帶電荷相反的電荷(電勢)。如果一個結合實體有一個淨負電荷，那麼這結合實體將轉移到的微場所必須帶正電荷。相反地，一個帶負電荷的微場所被用於轉移一個帶正電荷的結合實體。其它的選擇在連續的尋址過程中用於偏壓遺留的微場所包括偏壓所有在相反的電荷的其它微場所(與被尋址的微場所帶電荷相反)；在相反電荷偏壓微場所的一個有限基團；或在相反電荷偏壓僅一個微場所(或其它的電極)。在一些情況下，這將是希望的即強烈地偏壓一個或更多的微場所在相反的電荷，然而其它組的微場所僅較弱地偏壓。這個過程允許以前尋址的微場所在尋址遺留的微場所過程中被保護起來。在結合實體不多於微場所上結合位點的情況下，可能只需要去活化一個其它微電極去影響自由場電泳式移動到特異的微場所上。特異的結合實體能被快速地轉移通過大量溶液，和直接地濃縮在特定的微場所並在此處它們立即成為共價地結合到粘附層特定表面。轉移的速率取決於結合實體的大小和所帶的電荷，和在微場所間使用的電壓和電流水平。一般地，轉移速率能從數秒到數分鐘範圍。在一個特定的微場所(72)上的電子學地濃縮結合實體，反應物，或分析物(70)能力顯示於圖7。在特異的結合實體尋址過程中所有其它微場所能被保護起來和保持不受影響。任何未反應的結合實體被移去是通過轉換特殊微場所的極性，和電泳這實體到一個廢物場所。這循環被重複直到所有企望的微場所由它們特異的結合實體尋址。圖8表示用特異的寡聚核苷酸結合實體(82、84、86)尋址特殊的微場所(81、83、85)的連續過程。
為了尋址微場所的平行過程包含同時地活化多於一個微場所(一個特定組群)以便相同的特異結合實體被轉移，濃縮，和與多於一個特殊的微場所起反應。隨後的平行過程與連續的過程是相似的。III.裝置的應用一旦裝置已經用特定的結合實體自我尋址，各種分子生物學類型的多步和多路反應和分析能在裝置上進行。本發明的裝置能夠電子學地對大量重要反應參數提供活力的和動力學的控制。這種電子控制導致控制反應的新的物理學的機械裝置，和反應速率，特異性，和靈敏度重要的改進。這些參數的改進來自裝置電子學地控制和直接地影響(1)快速轉移反應物或分析物到一個含結合的特異結合實體的特定的微場所；(2)反應速率的增加是因為濃縮反應物或分析物與在特定微場所的表面上的特異的結合實體；(3)從微場所迅速和選擇性的移去未反應的和非特異性結合的成份；和(4)為最適結合條件的嚴格性。
本發明自我尋址的裝置能夠迅速地進行各種微形式的多步和/或多路反應和過程；它包括但不局限於——傳統形式的DNA和RNA雜交反應過程和分析；如，結合的目標DNA/探針DNA，結合的探針DNA/目標DNA，結合的捕獲DNA/目標DNA/探針DNA；——多倍的或多路的雜交反應以連續的和平行的方式；——限制性片段和一般DNA/RNA片段大小分析；——分子生物學反應，如，限制性酶反應和分析，連接反應，激酶反應，和DNA/RNA擴增；——抗體/抗原反應包括大或小抗原和半抗原；——診斷測定，如，雜交分析(包括原位雜交)，基因分析，指紋分析，和免疫診斷；——樣品製備，細胞分類，選擇和分析；——生物分子接合過程(即，共價和非共價標記核酸、酶，蛋白，或抗體，用報告基團，包括螢光團，化學發光劑，比色法，和同位素標記)
——生物高分子合成，如，組合的合成寡聚核苷酸或多肽；——水溶合成的高分子的合成，如，碳水化合物或線狀的聚丙烯酸酯；和——大分子和納米結構(納米大小顆粒和結構)的合成和製造。III(a)核酸雜交核酸雜交被用作本發明主要的實例因為它們在診斷中的重要性，和因為它們是多種結合(親和)反應難的類型中具特徵性的一種。這是特別真實的當它們以多路形式進行，這兒每個單獨的雜交反應需要不同的嚴格條件。
權利要求的裝置和方法允許核酸雜交以各種傳統的和新的方式進行。裝置電子學地控制反應參數的能力極大地促進核酸雜交分析，特別是裝置對列陣上每一單獨微場所提供電子學的嚴格控制(ESC)的能力。本質上，這允許每個單個雜交反應在同一列陣上能進行如同一個單個試管測定。
術語「核酸雜交」用來表示包括在所有天然的和合成形式以及衍生的核酸分子間的所有雜交反應，包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，聚核苷酸，寡聚核苷酸。
傳統的雜交形式，例如「斑點印跡」雜交和「夾心法」雜交，能用權利要求的裝置以及大範圍列陣或矩陣形式進行。
作為一實例，一臺用於DNA雜交分析的APEX裝置被設計，製造，和以如下方式使用。微場所的列陣首先用微平版印刷(或微加工)技術製造。在一個列陣上可尋址微場所的數目取決於最終的用途。裝置用一組特異寡聚核苷酸以連續的方式迅速地自我尋址。在這種情況下，特異的寡聚核苷酸是3′-末端醛基功能化的寡聚核苷酸在6-mers到100-mers的範圍內，如需要的話較大的聚核苷酸能被結合。醛基功能的基團允許共價結合到特定的微場所粘附表層(見圖4)。這個特異寡聚核苷酸組能可容易地應用傳統的技術在一個傳統的DNA合成儀上合成。合成每一個特異寡聚核苷酸是從一個核糖核苷酸控制的多孔玻璃(CPG)載體上起始的。這樣，3′-末端含有一個核糖核苷酸，在合成和純化後它隨後容易地被經高碘酸氧化轉變成一個末端的二醛衍生物。含有醛基的寡聚核苷酸(40)將很容易地通過席夫鹼反應過程與微場所表面的伯胺功能基團起反應。
裝置的用特異的寡聚核苷酸的電子學尋址圖解在圖8。第一個特異微場所(ML-1)(81)與它的特殊的序列寡聚核苷酸(SSO-1)(82)的尋址的完成是通過保持特定的微電極(ML-1)在一個正的DC電勢，同時所有其它微電極保持在一個負的電勢(圖8(A))。在水的緩衝液中醛基功能化特殊序列(SSO-1)自由場電泳到ML-1地址，在那裡它濃縮(＞106倍)和快速地變成共價地結合到ML-1的表面(81)。所有其它微電極保持在負電，和處在受保護或掩蓋，不與SSO-1序列起反應(82)。然後ML-1電勢相反到負(-)去電泳任何未反應的SSO-1到一個廢棄系統。這周期被重複，SSO-1(84)……＞ML-2(83)，SSO-3(86)……＞ML-3(85)，SSO-n……＞ML-n直到所有期望的微場所被用它們特異DNA序列尋址(圖8(D))。
另一種用於尋址裝置的方法是從一個電子學的試劑提供裝置轉移特定的結合實體例如特異的寡聚核苷酸。這提供裝置必須保持大量結合實體或試劑和必須被用於加樣到分析裝置。結合實體必須在兩個裝置間電子學地轉移。這個系統消除了物理學操作的需求，例如微移液，並消除了在裝置內或裝置間的複雜的流體輸送系統。
然而用於尋址裝置另一種方法是進行組合的在特定的微場所合成特異的寡聚核苷酸。組合的合成在後面部分描述。
在裝置已被特異的DNA序列尋址後，這一點是重要的即在列陣裝置微場所下面的微電極保持作為獨立的工作直流(DC)電極。這是可能的，因為結合到電極表面是在這種方式下進行的即下面的微電極不被化學地或物理地絕緣。每一個微電極仍能產生強的直流電足夠向和從微場所表面上自由場電泳式轉移其它帶電的DNA分子。因此，DNA列陣裝置提供完全電子學控制DNA雜交和任何其它隨後反應的所有方面。
電子學地控制的雜交方法的一個實例表示在圖9。在這種情況下，每一個可尋址的微場所有一個特異的捕獲序列(90)。含有目標DNA(92)的樣品溶液被用到裝置上。所有的微場所被活化並且樣品DNA在微場所被濃縮(圖9(B))。稀釋了的溶液中的目標DNA分子在微場所被高度濃縮，允許迅速雜交到表面上的特異互補DNA序列上。反向微電極的電勢從微場所上排除所有未被雜交的DNA，而目標DNA保持被雜交狀態(圖9(C))。以相同的類型，在隨後步驟中報告探針被雜交去識別雜交的複合體。
雜交過程的電子學控制通過提高總的雜交效率和通過從微場所區域移走非特異DNA極大地促進隨後識別目標DNA分子。這是期望的即在未擴增的基因組DNA中10,000到100,000考貝數的目標序列將可被識別。這種類型的雜交反應能在幾分鐘甚至更短的時間內進行，在大大低於探針Tm的等溫條件下，和最少外界操作次數下(即，傳統的漂洗步驟完全被省掉)。
另一個DNA雜交測定的常用方式包括把目標DNA固定在表面，隨後用特異的探針與這些目標DNA分子雜交。這種形式能包括在複雜的場所的相同目標DNA，或在特定的場所的不同的目標DNA。圖10表示這一連續雜交形式一個改進方式。在這種情況下微場所(101-107)被不同的捕獲DNA分子尋址。這些是以連續的形式與不同的序列特異寡聚核苷酸(108，109)雜交。微場所隨後被偏壓成正去轉移分子到其自身，然後偏壓成負去轉移分子到下一個微場所。在合適的電極電勢下，特異地雜交了的DNA探針將保留在那微場所，而未雜交的探針被轉移到下一個微場所。這序列特異寡聚核苷酸探針能被合適的報告基因如螢光團所標記。
權利要求的裝置能夠提供電子學的嚴格控制。嚴格控制對雜交特異性是必須的，對識別點突變單個鹼基錯配序列特別重要。圖11表示電子學嚴格控制如何能被用於單個鹼基錯配序列分析。電子學嚴格控制也能被應用於多數鹼基錯配序列分析。在圖11(A)中完全地配合的DNA雜交子(110)是比錯配DNA(112)雜交子略更加穩定。通過偏壓微場所負電(圖11(B))和在一定時間傳送一固定量的電泳電力，這是可能的即變性或移走錯配DNA雜交子而保持完全配合的DNA雜交子(圖11(C))。圖(15)比較應用電子學嚴格控制所得的電子學雜交過程的結果與傳統的雜交過程的結果。雜交包括為了Ras 12癌基因突變的15-mer G 和A點突變探針。電子學雜交結果表明與傳統的過程比較極大地提高了單個鹼基錯配的雜交效率和有一個非常高的辨別率。
更準確地說，權利要求的裝置對每一個發生在裝置上的特異的雜交反應提供獨立的嚴格條件。實際上每一個雜交是一個獨立的反應。
用傳統的或被動的列陣形式，不可能對所有發生在相同的雜交溶液中的雜交反應獲得最適合的嚴格性。然而，本發明主動的列陣裝置能夠對不同微場所上的雜交提供不同的電子學嚴格性，甚至是那些在同一容積雜交溶液中。這屬性克服了對傳統矩陣或列陣雜交形式，通過雜交測序(SBH)形式，和其它多路分析的固有限制。
除提高雜交的特異性(即，辨別率)和靈敏度(例如單點突變識別)外，電子學嚴格性控制允許在正常尺寸範圍外的寡聚核苷酸能用於這些應用。寡聚核苷酸序列範圍從8-mer到21-mer被認為是用傳統的雜交方法進行點突變檢測可接受的。在應用傳統雜交方法現行的實踐中，寡聚核苷酸在10-mer到19-mer是最常用於這些傳統方法中，而傳統方法應用溫度和鹽濃度達到嚴格性控制。寡聚核苷酸短於10-mers已被發現對多路雜交不合適；序列短於8-mers因為其低雜交效率甚至不能考慮使用。序列長於21-mers不能應用因為它們在配合和錯配探針之間具有極差的辨別率。隨著序列長度超過21-mer，區別配合和錯配探針間的差異性的能力極大地下降了。
我們發現在APEX裝置上採用電子學嚴格控制進行的雜交允許較短的(7-mer和更短的)和較長的(22-mer和更長的)寡聚核苷酸能被應用並具非常高的辨別率。使用較短寡聚核苷酸序列(7-mer和更短)對利用雜交測序(SBH)具有優點。較短長度序列允許具有極少數寡聚核苷酸(8－mers＝65,536，7－mers＝16,384，6－mers＝4,096)的列陣能被使用於這種SBH應用。使用較長序列(22-mer和更長)與電子學嚴格控制使更靈敏和選擇性更強的點突變分析能進行。使用較長探針在具有高複雜性的DNA樣品中能提供更高的靈敏度，和更高的總雜交效率。
電子學雜交技術能被用於進行原位雜交。原位代表一個基本地不同的雜交形式，不同點在於其中目標DNA(or RNA)不從細胞中移走，而直接在細胞內被識別。原位雜交方法一般是複雜和耗時的，識別短的目標序列(即，單點突變)幾乎是不可能的。電子學控制原位雜交能在APEX裝置上進行，該裝置直接地在裝置活性表面上吸附和處理細胞(見實例14有關樣品製備技術)。然而，而不是從細胞中提取出DNA，這APEX裝置直接地在細胞內電子學地雜交報告探針到DNA上。電子學嚴格控制被用於通過消除大量非特異性結合和促進總雜交外效率增加選擇性和靈敏度。
對雜交提供電子學嚴格控制的能力也提供新的機理用於識別DNA雜交而不使用報告基團標記過的DNA探針。這提供了一種方法進行更直接識別雜交過程它本身。一個螢光染料識別過程在圖12中圖解並在實例4和6中描述。直接識別DNA雜交子能通過使用DNA結合染料例如溴化乙錠獲得。這染料結合到雙鏈的和單鏈的DNA上但對前者親和性更大。在圖12(B)帶正電荷的染料(122)能轉移到負電偏壓的微場所上。染料結合到雜交的(120)和未雜交的(121)DNA序列上(圖12(C))。通過偏壓微場所帶正電和在一定時間內輸送一定量的電力，結合在未雜交的微場所上的染料分子被選擇性地移走。一個合適量的電勢能被使用只要不相反地影響DNA雜交子。雜交子的DNA與結合的染料分子然後能使用聯合的或結合的光學系統螢光地識別出來。
如下重申本發明的裝置為核酸雜交反應和分析提供的重要優點(1)迅速轉移稀釋的目標DNA和/或探針DNA序列到將發生雜交的特定的微場所上。這一過程能在5到120秒的時間範圍內發生。
(2)在將發生雜交的特定的微場所濃縮稀釋的目標DNA和/或探針DNA序列。濃縮效果能大大超過一百萬倍(＞106)。
(3)從已發生雜交的特定的微場所迅速轉移非特異性結合的目標DNA序列。這一過程能在5到120秒的時間範圍內發生。
(4)從已發生雜交的特定的微場所迅速轉移競爭的互補目標DNA序列。這一過程能在5到120秒的時間範圍內發生。
(6)在數分鐘時間內進行大量獨立雜交反應的能力。
(7)在大大低於探針Tm的等溫條件下進行雜交過程的能力，以及最少的外界操作或漂洗步驟。
(8)使用電子學嚴格控制(ESS)移走部分雜交的DNA序列。
(9)對在1000到100,000考貝數範圍內的未擴增的基因組目標DNA序列進行雜交分析的能力。
(10)使用ESC提高單個鹼基錯配雜交的解析度(即，分辨能力)和靈敏度(點突變)。
(11)使用短於(7-mer和更短)長(22-mer或更大)於那些被用於傳統雜交過程中者白單點突變探針的能力。
(12)在矩陣雜交中使用ESC提供單個嚴格控制。
(13)通過移去非特異性背景成份而改進雜交反應的識別能力。
(14)在固定細胞上進行電子學原位雜交的能力。
(15)發展了一種分析方法，它去除了需要使用共價地標記的報告探針或目標DNA來識別雜交。III(b)裝置的重複生產除了用特異的結合實體分別地尋址單個裝置外，也可能生產一種主控裝置，它能夠為其它裝置複製特異的結合實體。這代表另一種生產或製造裝置的方法。複製裝置的過程圖解在圖13。一個含有已被特異的結合序列尋址的微場所的主控裝置與期望的互補DNA序列(130)雜交。這些互補序列被活化因此能夠共價地結合到粘附層的微場所上。
一個含有粘附層的未被尋址的姐妹裝置(132)與已雜交的主控裝置排成一線(圖13(B))。主控裝置的微場所被偏壓成負而姐妹裝置的微場所被偏壓成正。DNA雜交子被電子學地變性和被轉移到姐妹裝置上，在那兒被活化的DNA序列共價結合到微場所上(圖13(C))。這過程能以平行的或連續的方式進行，這取決於裝置的表面結構以便在微場所間的交叉結構減少到最低。雜交子能通過使用一個足夠的負電勢或通過使用帶正電荷的離液劑或變性劑被變性。III(c)元件裝置和集成的APEX系統大量分離的APEX裝置或晶片能被組合形成一個集成的APEX系統。因為APEX型裝置能進行許多不同的功能，和反應物能在裝置間藉助自由場電泳被移動，集成的系統能發展起來。例如，分離的APEX裝置或晶片具有(1)選擇性地結合和裂解細胞，(2)電子學地分配試劑，(3)進行前期雜交，(4)用作廢棄處理單元，(5)為DNA片段提供貯存，和(6)進行雜交分析可被組合形成一個樣品製備和雜交分析系統(見實例14和圖19)。這些集合的APEX微電子學系統是完善臨床分析儀或可編程的分子生物學實驗室的相等物(即，晶片上的實驗室)。然而，它們超過了自動化(機器人)或其它微分析裝置，因為它們需要最少量的射流或物理學操作樣品。試劑，和反應物。另外集成的APEX系統類型將包括，但局限於那些能進行原位雜交，細胞選擇和處理系統，和免疫診斷分析儀。III(d)識別系統和報告基團在結合反應包括螢光標記的報告基團情況下，這是可能的即應用落射螢光式顯微鏡識別系統在APEX裝置上分析結合反應。該系統的總靈敏度取決於聯合的識別元件(冷卻充電耦合裝置(CCD)，增強充電耦合裝置(ICCD)，微通道平板識別器，或光子記數光電倍增管(PMT)系統)。此外，靈敏的CCD晶片識別儀或雪崩光電二極體(APD)識別儀能被更直接地與APEX裝置聯合。這些系統能在一定程度上減少複雜的光學裝置的需求性。更先進的系統將包括集成光電子或電子識別元件進入APEX晶片。用這些系統進行光學的和直接電子學的DNA識別是可能的。這一點是本發明期望的即最先進的系統將最終包括夾心一個微電子識別儀和板上控制儀元件到基礎APEX晶片元件。電子學的和光學的(波導)連接將被製成直接穿過APEX元件的底部。這個策略解決了有關製造技術，材料兼容性，和用於製造可處理的APEX元件的有效性成本的一系列問題。
除了各種螢光染料和報告基團能用於標記DNA探針，目標DNA，或抗體以外；其它類型的標記或報告基團也可被使用。這些包括化學發生標記，非線性光學(頻率倍頻器)材料，生物素/親和素複合物和各種酶類。III(e)組合的生物高分子合成本發明的裝置也能進行組合的合成生物高分子例如寡聚核苷酸和多肽。這種過程允許自我引導的合成進行無需任何外界引導、影響、或機械移動。組合的合成的其它方法需要物理的遮蔽和複雜的光平版印刷過程，微機械自動移樣系統用於試劑輸送，或複雜的元件的物理移動以便在顯微場所進行實際的合成。本發明描述的組合合成允許極大量的序列能在一個裝置上合成。組合合成的基本概念包含使用自由場電泳式轉移到輸送器上，濃縮，和反應單體連接試劑，或去封閉試劑在裝置的特異的可尋址的微場所上。利用裝置的固有能力去電子學地保護其它微場所避免附近試劑和反應物的影響的概念。對此概念也重要的是鑑別在這些化學合成過程中選擇的步驟，在化學合成過程中一個或多個反應物具有一個淨正電或負電，或構建用於這些過程的合適試劑。
組合的寡聚核苷酸合成的一種方法圖解在圖14。這方法開始於一系列選擇性的可尋址的微場所(140)，其表面已被用封閉的伯胺(X-NH-)基團(142)衍生過。這方法的起始步驟包含使用一種帶電的去封閉試劑(144)選擇性的去除一些微場所的封閉。在這種情況下，試劑必須帶正(+)電荷。這過程進行通過使那些被去封閉的微場所帶負電勢，而那些仍被保護的微場所帶正電勢(圖14(B))。應用正和負電勢到選擇的電極上引起帶電的試劑從一個試劑輸送位點移動和在所期望的被去封閉的微場所濃縮，同時從其它微場所上清除試劑。
在第二步，第一個鹼基，在這例子是胞嘧啶，化學連接到去封閉的微場所上是通過簡單地暴露這系統於氨基磷酸酯試劑(X-C)(146)上而進行的。該(C)核苷酸連接到去封閉的微場所表面，而不是任何封閉的電極表面(圖14(C)和(D))。在這點正常的磷醯胺化學是進行著直到下一個去封閉步驟。
在第二個去封閉步驟(圖14(D))，那些準備連接下一個鹼基的電極位置被賦予負電，而那些保留被保護的被賦予正電。該系統現在接觸將被連接的下一個鹼基，在這種情況下為(X-A)(148)、並獲得選擇的連接到去封閉的微場所上(圖14(E)和(F))。這連接和去封閉步驟交替重複，直到所有不同DNA序列在每一個可尋址的微場所表面合成完。
上述的實例代表了一種用於核酸的合成可能的方法。另一種方法包含一個完全水溶DNA合成。在這種情況下，帶電的水溶連接試劑，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDCA)，用於與水溶核苷酸衍生物進行寡聚核苷酸的合成。這種方法比現在基於有機溶劑的方法應有極大的優越性，基於有機溶劑的方法需要廣泛地封閉鹼基分子。水溶合成應是低花費的和取消了使用多個用於當今基於有機溶劑的方法中的毒性的物質。第三種方法，另一種水溶合成，包括應用帶電的單體和酶類。III(e)(1)用末端轉移酶的寡聚核苷酸合成本方法用於組合合成寡聚核苷酸包含使用核酸聚合酶。這方法應用末端轉移酶，5′-脫氧核糖核苷酸三磷酸的3′-單磷酸酯，和一種磷酸化酶。末端轉移酶被用於連接核苷酸。這3′-磷酸酯作為一種封閉基團以防止在每一連接步驟中加上多於一個核苷酸。3′-磷酸化酶被用來去除3′-磷酸酯以供下一步的連接。
因為所有試劑是水溶和帶電的，一般APEX技術能被用於這種組合合成過程的所有步驟。在這種方法中，一個APEX矩陣被使用，這矩陣具有A、T、G和C核苷酸通過它們的5′-羥基位點連接在裝置上合適數量的尋址的微場所上。用標準APEX尋址的技術連接最先的核苷酸。
連接反應的第一個周期的開始是通過偏壓正電所有那些在它們第二位點能夠連接一個A核苷酸的微場所，和偏壓負電含有末端轉移酶和脫氧腺苷三磷酸的3′-磷酸酯的二個電子學的試劑分配單元進行的。試劑是被自由場電泳到合適的微場所和這A核苷酸通過末端轉移酶連接到矩陣上第一個核苷酸上。因為核苷酸三磷酸是在它們的3′位與一個磷酸基團酯化而成，末端轉移酶每一次僅增加一個核苷酸。
在核苷酸連接完成後，微場所被偏壓負電和廢棄處理系統偏壓正電以及酶和使用過的試劑被移走。這過程為第一個周期連接G、C和T核苷酸重複直到所有的微場所被連接上。
當第一個整周期連接(A、T、G和C)過程完成所有的微場所被偏壓正電而試劑分配器與3′-磷酸化酶被偏壓負電。這3′-磷酸化酶被自由場電泳到微場所上並水解3′-磷酸酯。移去磷酸酯露出3′-羥基團準備為連接反應的下一步周期。連接反應被進行直到所期望的寡聚核苷酸序列在APEX裝置上被合成出來。
除了DNA合成之外，一個類似方法可發展起來用於RNA的合成，多肽的合成，和其它複雜高分子的合成。III(f)電子學地控制的分子生物學和擴增反應包括線性和指數的倍增或擴增目標DNA和RNA分子的各種分子生物學反應能用APEX微電子學的裝置和晶片進行。
限制性酶切反應和DNA片段分析可在完全電子學的控制下進行。用APEX裝置進行核酸倍增或擴增反應是本質不同於其它「DNA晶片」裝置它們是基本地被動的微矩陣基質用於傳統的擴增過程(PCR，LCR等等)。用於擴增的新機理直接來自於APEX裝置的主動特性。主動的裝置提供唯一的電子學的機理去(1)在等溫反應條件和大大低於它們Tm點(解鏈溫度)下選擇性地變性DNA雜交子；(2)在二個或多個微場所間迅速地向後和向前轉移或移動DNA；和(3)在裝置任何期望的微場所上選擇性地濃縮DNA修飾酶，例如，但不局限於，限制性內切酶，DNA或RNA聚合酶，和連接酶。在APEX裝置上能進行的電子學控制的分子生物學和擴增反應的實例包括(1)電子學地引導限制性酶切ds-DNA序列；(2)通過DNA聚合酶電子學的倍增目標DNA；(3)通過DNA和RNA連接酶電子學的連接和倍增目標DNA序列，和(4)通過RNA聚合酶電子學的倍增目標DNA。III(g)電子學的限制性片段分析除了進行限制性酶切ds-DNA外，APEX裝置和電子學技術能被用於分析和測定DNA片段的相對大小。這是可能的當不同長度的DNA片段能被雜交到在單個微場所上一個共同捕獲的序列上時。或者當DNA長度的DNA片段能被雜交到不同的捕獲序列上，而這些序列具有相同的雜交或結合能量的時候。在這些情況下，電子學的嚴格控制能被用來選擇性地使不同的DNA片段按照它們未-雜交或突出端序列的長度去-雜交。具有較長突出序列的片段上的電泳力使它們在具有較短的突出序列前被去雜交。因此，如果片段被標記用於識別，和尋址到特定的微場所，它們的大小可被測定，通過電泳的電勢或電力水平需要來從這些微場所上去-雜交這些片段。這也是可能的去進行電子學的限制性片段長度多態性分析的同等分析。
現在通過參考如下關於製造和應用APEX裝置的無-限制性實施例本發明將被更詳細地描述。
在如下實施例中緩衝液、溶液和培養基的配方在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989.中被描述。
IV.實施例實施例1寡聚核苷酸的合成和修飾合成的DNA探針的製造是應用常規的氨基磷酸酯化學在AppliedBiosystems自動DNA合成儀上進行。寡聚體被設計成含有5′-氨基或3′-核糖核苷末端。5′功能團是通過使用ABI氨基連接2號試劑被結合入而3′功能團是通過從RNA CPG載體上起始合成而引入。3′-核糖核苷酸末端通過高碘酸氧化方法能被轉化成一個二醛末端，它能與伯胺反應形成席夫鹼。
反應條件如下在水中溶解20～30O.D寡聚體達終濃度1OD/μl。加入1體積0.1M醋酸鈉，pH5.2和1體積0.45M高碘酸鈉(在水中新配製)。攪拌保持反應至少2小時在周圍溫度中，在黑暗中。把反應混合液加樣到Sephadex G-10柱上(巴氏吸管，0.6×5.5cm)，柱子平衡用0.1M磷酸鈉，pH7.4緩衝液。收集200μl級分，將2μl等分試樣在薄層層析(TLC)上點樣並收集紫外(UV)吸收級分。
如下的寡聚體含有3′-核糖核苷末端(U)ET-12R 5′-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCUCP-1 5′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAUAT-A15′-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GAC TGC CTG UAT-A25′-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GUAT-A35′-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CUAT-A45′-GTC TCC TTC CTC TCC AGUAT-A55′-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GUAT-A65′-CTG GAG AAG AAG GAG ACUAT-A75′-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC UAT-A85′-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TUAT-A95′-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CUAT-A10 5′-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU
含有5′-胺基團的寡聚體一般地與螢光團反應，例如Texas紅(TR，激發590nm，發射610nm)。磺醯氯是非常活潑的對伯胺形成一個穩定的氨磺醯鏈。
德克薩斯紅-DNA結合物形成過程如下德克薩斯紅磺醯氯(分子探針)被溶解在二甲基甲醯胺(DMF)中達最終濃度為50mg/ml(80mM)。寡聚體溶解在0.4M碳酸氫鈉，pH9.0-9.1中達最終濃度為1O.D./μl(對21-mer為5.4mM)。在一個微試管中，混合10μl寡聚體和20μl Te克薩斯紅。在黑暗中讓反應進行1小時。用氨或羥胺中止反應，凍幹樣品並用PAGE純化(Sambrook et al.，1989，supra)。
如下的寡聚體含有5′-氨基末端ET-21A 5′-氨基-TGC GAG CTG CAG TCA GAC ATET-10AL 5′-氨基-GAG AGA CTC ATG AGC AGGET-11AL 5′-氨基-CCT GCT CAT GAG TCT CTCT-2 5′-氨基-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TRC-A15′-氨基-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGG TCC ACGTAGRC-A25′-氨基-CTC CAA ATT TGC TGA ACT CRC-A35′-氨基-GGA GAT GAG GAG TTC TAC GRC-A45′-氨基-CTG GAG AGG AAG GAG ACRC-A55′-氨基-CCA CGT AGA ACT GCT CAT CRC-A65′-氨基-GTC TCC TTC TTC TCC AGRC-A75′-氨基-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAARC-A85′-氨基-ATC TTC TAA ATC TGC GGA ARC-A95′-氨基-GTC TGA GAA CAG GCA AAC ARC-A10 5′-氨基-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G實施例2在一個微製造的試驗裝置上的電子學地可尋址的微場所-聚賴氨酸方法微場所從微毛細管(0.2mm×5mm)製造。這微毛細管充滿18-26％聚丙烯醯胺含有0.1-1.0％聚賴氨酸讓其聚合。多餘的毛細管被劃痕和去除防止在管中陷入的空氣泡以及使管的長度標準化。毛細管以它們共使用一個上緩衝液貯槽而具有單個低緩衝液貯槽的形式被安放。每一個低緩衝液貯槽含有一個鉑線電極。
在上貯槽中的微毛細管的頂表面被認為是可尋址的微場所。這上和下貯槽被充滿0.1M磷酸鈉，pH7.4緩衝液並先電泳10分鐘在0.05mA電流使用BioRad 500/1000電源。大約2μl(0.1O.D.)的高碘酸氧化的ET-12R捕獲序列被加入進上貯槽將電源加上並在恆電流下電泳2-5分鐘。這ET-12R捕獲序列變成濃縮的和很快地共價結合到微場所表面的伯胺基團上。極性隨後被反轉使得測試毛細管現在被偏壓負壓並電泳另外2-5分鐘。任何保留的未結合DNA序列被排斥而共價結合DNA保留在微場所。
上面緩衝液貯槽被吸出液體並用緩衝液衝洗。儀器被拆卸並且一個新參考試驗裝置被安放。貯槽被重新充滿和螢光地標記的完全DNA序列被加入，即，ET-10AL-TR。寡聚體在0.05mA恆流下被電泳地濃縮在正電荷偏壓的試驗微場所達2-5分鐘。極性被反轉並且未結合的被完全移走。試驗裝置被移走並用落射螢光顯微鏡檢查。一個為了非-特異性結合的陰性對照被如同上述用一個非-互補的DNA序列ET-21A-TR代替ET-10AL-TR進行。
毛細管微場所表面的交叉部分用與Hamamatsu ICCD照像成像系統相配合的Jena落射螢光顯微鏡檢測。螢光分析結果表明互補ET-10AL-TR序列雜交到結合實體/捕獲序列和保持雜交狀態，甚至當電勢被偏壓成負電時。ET-21A-TR非-受體序列當電勢被反轉時不保持在試驗裝置表面。實施例3在微機械製造的試驗裝置上的電子學地可尋址的微場所-丙烯酸琥珀醯亞胺法本實施例描述另一種共價結合寡聚核苷酸5′-末端的粘附化學。毛細管的製備除了1％丙烯酸琥珀醯亞胺(分子探針)代替聚賴氨酸外同上述。毛細管新鮮製備因為用於與伯胺基團反應的琥珀醯亞胺酯是相對不穩定的，尤其在pH8.0以上。毛細管的安放同上，貯槽充滿0.1M磷酸鈉，pH7.4。毛細管在0.05mA下預先電泳10分鐘。大約2μl ET-10AL(0.1O.D.)並含有5′-氨基末端的樣品在電源接通下加入到上貯槽並電泳式移動進行2-5分鐘。極性被反轉以便試驗裝置被偏壓成負電並電泳繼續2-5分鐘。未結合的DNA被排斥，然而共價結合的DNA保留在微場所。
上緩衝液貯槽被吸出液體並用緩衝液衝洗。參考試驗裝置被取出而一個新的參考裝置被裝入。這貯槽重新充滿並加入螢光標記的互補寡聚體ET-11AL-TR並電泳如同上。為非-特異結合的陰性對照被同上一樣實施，用一個非-互補DNA序列ET-21A-TR代替ET-11AL-TR。
每一個試驗裝置的螢光分析表明互補ET-11AL-TR雜交到捕獲序列(ET-10AL)上，並保留雜交的甚至當電勢變換成負的。非-互補的序列，ET-21A-TR，當電勢被反轉時不被保留在微場所上。實施例4電子學地控制的螢光DNA/染料識別方法有些染料例如溴化乙錠(EB)當結合(嵌入)到雙-鏈DNA中時成為高度螢光的。然而當結合入雙-鏈DNA時螢光和結合親和力較大，這染料對單-鏈DNA也有一定程度的親和力當結合時產生低水平的螢光。如下的實施例表明一個電子學控制的DNA/染料識別方法怎樣能被產生出來。
微毛細管試驗裝置的製備和雜交同實施例2和3中描述一樣。溴化乙錠(EB)加入到緩衝液中(～0.05mMEB終濃度)這試驗裝置被偏壓成負以在雜交的和未雜交微場所上濃縮EB(帶正電荷)。試驗裝置通過落射螢光顯微鏡在550nm激發和600nm發射處被觀察。雜交的和未雜交的微場所都從濃縮的EB上顯示強烈紅色螢光。
試驗裝置被重新裝入並偏壓正恆電流在0.05mA達0.03伏一小時，去選擇性地移走EB。未雜交微場所的螢光減弱然而雜交的微場所保持非常高水平的EB螢光。這結果如下捕獲目標 標準化信號ET-10AL ET-11AL(+)＞200ET-10AL ET-21A(-) 1螢光信號是應用ICCD成像照像系統測定的並代表螢光密度峰。如果整個螢光信號區被積分的話信噪比應大於1000倍。這示範了一種使用嵌入染料用於增加信噪比和DNA測定的動態範圍的方法。實施例5在金屬基質上電子學可尋址場所鋁(Al)和金(AU)線(0.25mm Aldrich)與溶於甲苯中的10％3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APS)反應。APS試劑容易與金屬表面的氧化物和/或羥基團反應形成在氧化物和/或羥基團與伯胺基團間的共價鍵。無需對鋁任何前期處理。金線在5×SSC溶液中電解以形成氧化層。或者金屬線能通過高氯酸浴被氧化。
APS反應的實施如下線被切割成3英寸放入玻璃皿中。加入甲苯完全浸沒線並在一加熱板上加溫到50～60℃，加入APS到終濃度10％。混合溶液繼續反應達30分鐘。用大量甲苯衝洗3次，然後用大量乙醇衝洗3次並在50℃烘箱中乾燥。
APS處理過的線能與一種醛反應形成席夫鹼。結合實體ET-12R被高碘酸氧化如同在說明書中其它地方描述的一樣。電極被放入含有去空氣水的貯槽中。加上電源在0.05mA恆流下保持約30秒。迅速加入活化了的ET-12R。加上電源，液體被抽吸掉，加入新鮮水隨後再被抽吸掉。試驗(偏壓成正)和參考電極被放入含有螢光標記的互補DNA，ET-10-TR的雜交緩衝液(HB，5×SSC，0.1％SDS)中。經過2分鐘電極用漂洗緩衝液(1×SSC，0.1％SDS)漂洗3次每次1分鐘並用螢光法(激發590nm，發射610nm)來觀察。
結果表明ET-12R被特異性地結合到處理過的金屬表面上。試驗電極是螢光的然而參考電極不是。非-特異性吸附DNA到金屬上被在雜交緩衝液中含有的SDS抑制。粘附到金基質上通過電解和隨後的APS處理是有效的。得到的信號比由非-氧化的金觀察的信號有意義地強。更重要地，這實例表明金屬表明能被化學地活化和與結合實體衍生而不成為與溶液是絕緣的。這APS方法代表多個可用的形成DNA-金屬結合物的化學方法中的種。實例6電子學控制的螢光染料識別方法-金屬線DNA鋁電極基質的製備和雜交如例5中描述的。一個雜交的和一個未雜交的DNA-AL電極被用一根未衍生過的鋁線加工作為參考物。在溶液中加入溴化乙錠(EB)試驗的DNA電極被偏壓成負以吸引染料。這溶液被抽吸掉並加入新鮮緩衝液。金屬表面在顯微鏡下檢查。
重新安裝裝置加上一個正電勢達一定量伏特一小時。緩衝液被抽吸掉，電極用落射螢光來觀察。這過程重複直到在雜交的和未雜交的金屬表面之間的螢光出現顯著的區別。
捕獲 目標 標準化的信號ET-12RET-10AL(+)＞140ET-12R無(-) 1未雜交金屬表面的螢光減弱而雜交的金屬表面保持螢光。螢光信號是用ICCD照像成像系統測定的其代表螢光密度峰如果整個螢光信號區被積分的話信噪比將遠遠大於1000倍。這實施例表明一種用於增加信噪比和如此測定的動態範圍的方法。應用毛細管凝膠構型獲得了類似的結果，表明電化學影響不在重大程度上影響測定的實施。實施例7有功能的可編程電子學矩陣(APEX)——微機械製造6個可尋址的250μm毛細管場所的一個放射狀列陣是從塑料基質材料微加工成的。該裝置具有一共同的上貯槽和分離的下貯槽以便每一個微場所是單個可尋址的。一個唯一的寡聚體序列結合實體被定位和結合到用以前描述的方法從高度交叉連接的聚丙烯醯胺製得的特異微場所上。試驗微場所具有一正電勢而其它微場所具有負電勢以防止非-特異性相互作用。
列陣被漂洗然後與一個互補螢光標記的DNA探針雜交。列陣被漂洗移走多餘探針然後在落射螢光顯微鏡下觀察。只有特異性地尋址的微場所是螢光的。這過程在另一場所用另一結合實體重複進行並用一個標記了另外一個螢光團的探針雜交以便證實。
DNA序列被特異地定位於預定的位置，與其它場所間的交叉可忽視。這使得製造在預定位置帶有幾個到數百個獨特的序列的微矩陣成為可能。
為了挑選合適的低螢光背景的塑料基質，不同的塑料基質被測試在600nm處的螢光特性。塑料用落射螢光顯微鏡成像系統和螢光儀進行測試。下表提供基質目錄和用LS50B螢光儀測得的螢光讀數
實驗表明黑色丙烯，ABS，和聚碳酸酯具有最低的螢光本底水平。實例8有功能的，可編程的電子學矩陣(APEX)——微平版印刷製造一個在一矽片上8×8矩陣(64位點)的50平方微米的微場所(見圖3)被設計出，製造和用一個開關盒包裝(詳見裝置製造部分)。數種材料和方法的改進，如下描述，被用來增加APEX DNA晶片裝置的選擇性和有效性。
8a)頂端層的選擇APS(3-氨基丙基三乙氧基矽烷)方法包含晶片整個表面的反應。這起始功能化方法的選擇性取決於晶片表面各種材料的相對反應性。為了減少功能化和隨後的DNA結合到微場所周圍區域，一種比SiO2或金屬氧化物具有低反應性的材料是需要的。抗光蝕劑和氮化矽被測試。不同的頂端層被用於二氧化矽晶片。晶片由落射螢光檢測然後APS處理接著共價結合高碘酸氧化的poly-ARNA序列(Sigma，M100,000)。這晶片與200nM德克薩斯紅標記過的20-mer(T2-TR)在雜交緩衝液中在37℃雜交5分鐘。晶片用漂洗緩衝液漂洗3次並用1×SSC漂洗1次。晶片在590nm激發和610nm發射下進行螢光檢查。
氮化矽被選中因為它與二氧化矽比較具有較少的對APS的反應性同時並不象所試的抗光蝕劑那樣具固有的螢光性。其它方法例如背景區域紫外燃燒也是可能的。
8b)APEX物理學的特性一個完成的矩陣晶片用探針測試平臺(微操作型號6000)配有B L顯微鏡和CCD照相機進行光學的檢查。晶片被測試在受試墊和外界接觸墊間的連續性。這測試是通過用連接著萬用表的操作探測頭與墊接觸而進行的。連續性保證了墊已被浸蝕到金屬表面。墊然後被檢查在電解環境中的穩定性。金屬線被評價承擔1mA電流在正常乾燥條件下。
一滴(1-5μl)緩衝液(1×SSC)被取到8×8矩陣上。表面張力使得液體在一處留下四周接觸的墊區域乾燥。將一個探測頭接觸到一個接觸的墊而另一個探測頭與液體接觸。使用HP6625A電源和HP3458A數字萬用表在50V最大電壓下電流遞增地增加到50nA。
最初的製造包含矽基質，一個二氧化矽絕緣層，鋁沉積和模型化，和一個氮化矽頂端層。
第二個製造過程包括在鋁金屬和氮化矽層間的二氧化矽絕緣層。二氧化矽和鋁具有更多的兼容物理學特性和可形成一個更好的化學分界面以便提供一種比由原始製造方法製造的晶片更加穩定和堅強的晶片。
8c)DNA的結合一個8×8矩陣晶片被功能化用如同實例5中描述的APS試劑。這晶片然後用高碘酸氧化過的poly-ARNA(Sigma，平均M 100,000)處理。晶片用漂洗緩衝液(WB)漂洗以便移去多餘的和未結合的RNA。這一步用捕獲序列覆蓋了整個晶片，然而在暴露的金屬表面比在氮化物覆蓋的區域有更高的密度。晶片用200nM T2-TR在雜交緩衝液(HB)中在37℃雜交5分鐘。然後用WB漂洗3次和用1×SSC漂洗1次，每次1分鐘，在周圍的溫度下。晶片在590nm激發和610nm發射下進行螢光測試。
開放的金屬區域是輕微螢光的並有50μm見方墊形狀(微場所)。低螢光密度和/或不規則的邊緣表示一些墊是不完全地開放的。在這些情況下額外的等離子體浸蝕時間應是需要的。
8d)電子學控制的雜交活性的雜交被實施通過使用從實例8c中的一個晶片和偏壓一個特定的微場所為正電。通過使用也能自動地偏壓其餘微場所為負電的開關盒或通過使用在外界溶液中的一個電極來進行。3微升緩衝液僅放置在矩陣墊(微場所)上。一個1～5nA的電流被加上達數秒鐘並加0.1皮摩爾的T2-TR到溶液中。液體被移走晶片被乾燥然後在激發光590nm和發射光610nm下檢測德克薩斯紅的螢光。只有特定的被偏壓或正的微場所是螢光的。這一實驗被重複多次，使用APEX晶片上其它特定的微場所。另外，在一個微場所上螢光的DNA通過偏壓原始場所負電和目的微場所正電而被電子學地去雜交和轉移定位到另一個微場所上。
8e)電子學控制的尋址和裝置製造8×8APEX矩陣被用APS功能化如同前述。寡聚核苷酸結合實體CP-1被高碘酸氧化法活化。矩陣中4個微場所被偏壓成正電而其餘的被偏壓成負電。2微升緩衝液放置在矩陣上並加上電流。結合實體CP-1被加入並在設計的場所濃縮。液體被移走，晶片用緩衝液簡單衝洗然後2微升緩衝液加在晶片上。電流再次加上達數秒鐘並加入0.1皮摩爾的T2-TR。經短暫時間後液體被移走而整個晶片用WB漂洗3次。乾燥晶片並檢查螢光。
結果表明4個正電偏壓的微場所部是螢光的。這個實施例顯示應用特定的結合實體的微場所的選擇的尋址，定位和共價結合粘附的序列到微場所，和互補的目標序列特異性雜交到衍生的微場所上。
8f)基因的模式APEX晶片對HLA基因dQa多態性特異的帶有3′-核糖核苷末端的DNA結合實體被合成出。結合實體通過高碘酸氧化被活化如上所述。反向補體被合成帶有5′-氨基末端並與螢光團，例如德克薩斯紅，羅丹明或Bodipy染料結合，如上所述。微場所通過APS處理被功能化帶有伯胺基團，如上所述。
數微升溶液置於8×8矩陣之上。通過偏壓微場所正電一個特定的微場所被尋址；高碘酸氧化的DNA寡聚體以～0.1皮摩爾被加入，然後被轉移和共價地結合到那個場所上。極性被反轉未結合的結合實體分子被移走。在另一個尋址的微場所對另一種結合實體重複該過程直到所有特有的粘附結合實體被結合到晶片上。
然後將該晶片與單個螢光標記互補序列雜交以便確定結合反應的特異性以及立刻觀察所有被尋址的微場所。
在這晶片被電子學地變性去移走互補的寡聚體(在90℃ 0.05％SDS中10分鐘)的同一晶片上，被尋址的微場所被與未標記的目標DNA或基因組DNA雜交。識別是通過本說明書上面已描述的螢光染料識別分析。
結果將表明微場所是用特定的結合實體特異性地尋址的。對負電偏壓的微場所非特異性的結合是微不足道的。裝置和聯合的結合實體的化學組成和性質在變性條件下是穩定的，因此使得尋址的和製造的裝置可重複使用。變性雜交子的電子學方法是增加電流和/或增加電流加上的時間。實施例9電子學嚴格限制9A)用15-mer Ras-12探針(測定)單點突變裝置影響高水平的電子嚴格控制的能力是用15-mer探針來測定Ras-12癌基因型系統來表明的。在DNA雙螺旋中一單個鹼基對錯配在雜交對中引起僅僅極微量的不穩定與配合的雙螺旋相比較。這極微量的不穩定引起這錯配的雙螺旋在略較低於配合的雙螺旋的Tm下變性。當配對子(配合和錯配的)都在配合配對子最適嚴格性條件下雜交時，錯配配對子雜交效率較低。錯配的雜交信號將一定程度的低於配合雜交信號。用傳統的雜交方法，單點突變分析能用8-mer到21-mer範圍的探針進行。10-mer到20-mer範圍的探針最常用。當突變特異性探針變成短於8-mers或長於20-mers時，可信地區分配合和錯配變得非常地困難。這是因為在配合和錯配配對子之間的雜交信號上幾乎無區別。在點突變分析中應用的雜交嚴格控制的傳統方法依賴於溫度和鹽濃度。我們已發現嚴格控制也能受電泳電勢的影響。
在Ras-12的實例中，15-mer點突變特異探針被電子學地雜交到粘附在試驗裝置微場所上30-mer目標序列上。微場所上的極性被偏壓成負，所有雜交子被受到恆電流達一定時間，提供使錯配變性而不影響完全配合的一定的電力水平。
如下序列被合成並在一套3種試驗結構上試驗，每一種結構帶有250μm表面微場所。下劃線的/黑體的鹼基表明錯配位點。
粘附的序列是Ras-G 5′-GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAU-3′-微場所Ras-T 5′-GGT GGTGGG CGC CGT CGG TGT GGG CAA GAU-3′-微場所報告探針序列(用德克薩斯紅標記)是Ras-1 3′-CC-GCG-GCC-GCC-ACA-C-5′- (TR)Ras-2 3′-CC-GCG-GCA-GCC-ACA-C-5′- (TR)Ras-3 3′-CC-GTG-GCA-GCC-ACA-C-5′- (TR)試驗裝置如同在前說明書中所述從微毛細管制成。粘附序列Ras-G和Ras-T被高碘酸氧化並共價結合到被尋址的微場所上。
Ras-G微場所然後與Ras-1，Ras-2或Ras-3雜交。Ras-1是完全配合Ras-G。Ras-2是單個鹼基對錯配(G-A)。Ras-3是二個鹼基對錯配(G-A和G-T)。G-A錯配對DNA雙螺旋產生最小的不穩定性，因此是最困難與完全配合區分的。
首先進行傳統的雜交並螢光地檢查微場所以便測定互補序列被雜交到什麼程度。試驗裝置(微毛細管)被重新安裝並隨後進行電子學雜交。試驗裝置都被受到相同的電子嚴格性通過偏壓它們在負電勢(恆電流)上而獲得直到這錯配的雜交子被完全移走而不有意義地影響完全配合的雜交子。方法和結果如下傳統的雜交方法——在40℃在5×SSC中雜交15分鐘——在20℃在1×SSC中漂洗3次每次5分鐘——進行螢光分析——觀察完全配合(Ras-G/Ras-1)和單個鹼基對錯配(Ras-G/Ras-2)的信號比約10比1電子學嚴格控制(ESC)方法——在20℃在5×SSC中雜交5分鐘——「無漂洗過程」——應用在150伏(V)0.15微安(MA)的電子學嚴格性達4分鐘
(20℃)——進行螢光分析——觀察完全配合(Ras-G/Ras-1)和單個鹼基對錯配(Ras-G/Ras-2)的信號比＞100比1所有實驗的全部結果被圖示在圖(15)。這些結果表明這不但可能用電泳電勢在DNA雜交反應中達到嚴格控制，而且表明ESC比傳統雜交方法提供較高的雜交效率和更高的解析度。此外，ESC能被應用到每一單個微場所上，在同一容積溶液中提供獨立的嚴格控制。
(9B)應用7-mers和22-mer探針進行單點突變分析在單點突變分析中經常使用的正常大小範圍以外的7-mer和22-mer探針，被製備出來去進一步證明電子學雜交和ESC的優越性。如下列出的點突變特異寡聚體探針能被配對而導致具有0、1或2個鹼基錯配的雜交子。互補寡聚體序列被結合到微場所上並如同上述一樣雜交。微場所上的極性被反轉(偏壓負電)雜交子受到恆電流達一指定時間，提供一個特定的電力水平以便變性錯配而不移走完全配合。
Ras-G或Ras-GA寡聚體(如下所示)被結合到微場所上用作目標序列。如下所示的22-mer和7-mer Ras特異寡聚體的系列被用德克薩斯紅螢光團標記如同本說明書其它地方描述。「下劃線的和黑體」鹼基表示錯配和/或潛在的錯配位點Ras-G 5′-GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAURas-GA 5′-氨基-GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGGCAA GARas-22C-TR(TR)-5′-TGC CCA CAC CGC CGG CGC CCA CRas-22A-TR(TR)-5′-TGC CCA CAC CGA CGG CGC CCA CRas-TA(TR)-5′-TGC CCA CAC CGA CGG TGC CCA CRas-7C(TR)-5′-ACA CCG CRas-7A(TR)-5′-ACA ACG C從微毛細管制造試驗裝置如同本說明書中上面描述的。寡聚體目標序列Ras-G或Ras-GA被共價地合到微場所上。一個微場所然後與德克薩斯紅標記的完全22-mer補體Ras-22C-TR雜交。第二個微場所與Ras-22A-TR即一個帶有一個鹼基對錯配(G-A)的22-mer；或Ras-22-TA即帶有二個鹼基對錯配(G-A和G-T)的22-mer雜交。
如本說明書上面所述，試驗裝置被同時地以雙通道方式電泳即兩個微場所同時經受相同的電流或電力水平。試驗裝置首先用傳統方法雜交並且微場所被螢光檢測以確定已經雜交的互補序列的數量。然後試驗裝置被用於進行電子雜交達一控制時間在恆定電流下直到錯配的雜交子被移走而不有意義地影響完全配合的雜交子。Bio-Rad 1000/500電源裝置被典型地調到0.02到0.1mA而在恆流下電泳達0.02到0.04伏特一小時。裝置被拆開並在配有矽增強的CAD照像機(Hamamatsu)的Jena顯微鏡下進行落射螢光觀察。影像用Hamamatsu Argus 10影像處理機處理並用Sony影視印表機記錄。當額外的電子控制是需要時毛細管被再次電泳。
單個鹼基對錯配的辨別如上所述用7-mers進行。然而，鑑於它們較低的Tm，裝置在4-6℃的冷盒中電泳而不是在室溫下運行。
結果表明當用7-mers和22-mers時電子雜交和嚴格控制可以辨別單個鹼基對錯配配合∶錯配的比例是100∶1或更大。這個信噪比一般是優於由任何使用溫度和離子強度控制嚴格條件的雜交方法報告的結果。
電子嚴格控制能夠從完全配合中區別一個鹼基G-A錯配，即使這G-A錯配是最穩定的錯配因為G的亞氨基質子能參與和A的氫鍵從而穩定雙螺旋。
能量的消耗計算和測量表明僅產生極少量溫度變化，這一點證明嚴格性不是由微場所的溫度變化引起的。微場所是被動地雜交如上所述(不受到電子雜交)表明在配合和錯配間無區別證明擴散不是引起區別的原因。
這些實例也證實每個微場所能有單個的嚴格控制，因此克服了大範圍多重雜交技術其中被限制在單個共同的嚴格水平下所面臨的主要障礙。這也是可能的即電子嚴格能量水平與溫度解鏈(Tm)數據相互聯繫而產生預言的電子解鏈(Em)曲線和方程式。
(9C)在高基因組背景下電子雜交實例的目標DNA序列通常僅佔一個基因組DNA樣品總DNA中非常小的一部分。通過在APEX裝置一個非常小的場所上濃縮總DNA，本發明在存在有過量異源DNA情況下提高目標雜交效率。
在本實例中，具有5′-氨基的結合序列被結合到含有22％PAGE，1％琥珀醯亞胺丙烯酸酯的試驗裝置上。毛細管由ET-23AL或ET-11AL捕獲序列衍生。目標探針ET-12R用德克薩斯紅標記。ET-12R-TR能分別地與試驗序列ET-23AL而不是對照ET-11AL捕獲序列雜交。
異源基因組DNA，小牛胸腺DNA(CT DNA，Sigma)，被溶解在水中達終濃度為1mg/ml，超聲和加熱去變性DNA。樣品在含有1010考貝數的ET-12R-TR目標和0、0.1μg、或1.0μg變性的CT DNA的0.5×TBE中製備終體積為100μl。這代表著相對於目標DNA 0、1000或10000倍過量的CT DNA。
試驗裝置預電泳5分鐘在0.03mA下0.5×TBE中使用Bio-Rad1000/500電源裝置。裝置被以雙通道方式電泳以便試驗和對照毛細管能在同一時間準確的完全相同條件下電泳。加入樣品(100μl)毛細管被偏壓成正電勢而在0.03mA下吸引DNA達5分鐘。極性被反轉並使用相同的電力從試驗裝置表面移走所有未雜交的ET-12R-TR目標分子。緩衝液被吸掉，試驗裝置用配有矽增強CAD照像機的Jena顯微鏡(Hamamatsu)進行落射螢光觀察。影像用Hamamatsu Argus 10影像處理機處理並用Sony影視印表機記錄。
在存在和缺少每100μl0.1μgCT DNA時沒有區別存在於直接雜交信號和信/噪比。信號強度是相同的信號是一致地分布在活性區域中。
在每100μl 1μg CT DNA的水平，信號大量地沿著毛細管周邊分布，提示捕獲序列被封閉或被飽和。這種假象通過在雜交步驟中擺動極性容易被克服。這能脈衝總DNA朝向和離開活性區域，允許目標分子更加有效地和一致地雜交。
(9D)與電子控制雜交相對的被動雜交因為電子控制雜交的濃縮效應電子控制雜交是更有效和更快於被動雜交。
微毛細管試驗裝置由ET-23AL和ET-11AL結合序列構建分別作為試驗和對照裝置。含有1×1010考貝數ET-12R-TR並有1μg CTDNA總體積為100μl的雜交溶液製備的。
被動雜交一套試驗和對照裝置被在50℃放入一個含有100μl雜交溶液的小試管中雜交15分鐘。樣品然後用1×SSC，0.1％SDS在45℃漂洗3次，每次5分鐘。
電子控制雜交試驗裝置被放好並在0.06mA預電泳5分鐘。吸掉緩衝液加入100μl雜交溶液。試驗裝置在0.06mA被偏壓成正達3分鐘。極性然後被反轉30秒，並再次反轉以便使試驗裝置被再次偏壓成正達另外3分鐘。試驗裝置被偏壓成負達3分鐘進行電子漂洗。
雜交效率和程度用主動形式獲得是有意義地好於用被動形式獲得的。在主動(電子的)形式中的直接信號是超過100倍高於在被動形式中的信號。主動形式的信/噪比比被動形式的信號增加了10倍。主動雜交測定可在10分鐘內需要極少的人工操作下完成。被動雜交形式需要約30分鐘需要大量試管和緩衝液的人工操作。
傳統的雜交方法使用2.5nM探針在3次Cot，達15分鐘，完成反應的90％。在我們實驗中使用濃度為0.17nM操針，被動雜交反應動力學正常下需要約4小時。
主動雜交使能夠使用引起較低本底的較低的探針濃度。傳統的方法取決於擴散因此必須使用較高探針濃度去推動反應動力學。主動的方法能夠濃縮樣品在一個非常小的體積內從而產生非常高的區域探針濃度及隨後的非常快的雜交反應動力學。實施例10用螢光的DNA納米結構進行雜交正常地，非擴增型雜交測試的總靈敏度是由非特異性結合產生的本底限制。當多倍的報告基團，或多倍報告基團帶有第二種複合物，被用來標記DNA探針時這通常是一個主要問題。因此，在報告標記物實際的或固有的識別極限被達到之前測試的識別極限通常已達到。
使用電子控制雜交方法，我們已發現高度螢光的亞-微米或納米-範圍的顆粒可與結合的DNA探針一起被用於超-靈敏的測試。我們已經能夠使用自由場電泳來控制DNA-探針-螢光納米結構的運動。由於電子嚴格控制提供高水平的分辨力從未雜交結構中區別雜交，DNA探針-螢光納米結構能有意義地提高雜交靈敏度。電子嚴格控制允許我們應用這些高度螢光納米結構或其它多倍標記的方案解決低考貝數(50到1000目標分子)識別，而無需擴增。到如今，用傳統的雜交方法和步驟這是不可能的。
螢光納米顆粒，螢光球，可從分子探針Inc.獲得。這顆粒是由附有螢光染料的例如德克薩斯紅或螢光素羧甲基膠乳球組成。膠乳球能被獲得而帶有不同的功能基團在其表面，例如胺和醛。大小從0.01到5μm直徑的顆粒是能獲得的。
1)螢光納米顆粒的特性納米顆粒，未修飾的，胺基修飾的，或醛基修飾的，具有一個淨正電荷。在電場中這些顆粒朝負電偏壓的微場所移動。
2)DNA結合到螢光球上的化學胺基修飾過的顆粒能被結合到含有末端醛基的核酸上。這後者能通過帶有本說明書前面介紹的高碘酸方法一系列氧化的3′-末端核苷的DNA探針被產生出。
顆粒以2％懸浮在蒸餾水中貯存。一滴25到50μl的0.02-1.0μm胺修飾過的紅色螢光的螢光球被離心沉澱並再懸浮在0.1M磷酸鈉，pH 7.4中。過量的高碘酸氧化過的聚ribo-A被加入到懸浮液中。反應在室溫下進行90分鐘。顆粒在1×SSC，0.1％SDS(0.15mMNaCl，0.015mM檸檬酸鈉，0.1％(w/v)SDS，pH 7.0)中被漂洗並沉澱數次每人移走未結合和非特異性結合的聚ribo-A。
在緩衝液中的DNA-螢光球被放入一個直流電場中。被觀察到DNA-螢光球朝正電極移動，表明它們的淨電荷現在是負。這是確定DNA結合反應是否成功的一個簡單和方便的方法。傳統的雜交方法需要使用放射性同位素標記報告探針因為顆粒的強螢光能遮掩任何雜交信號。
3)DNA結合到試驗裝置上試驗裝置用含有1％琥珀醯亞胺丙烯酸酯的高度交聯的聚丙烯醯胺進行聚合，琥珀醯亞胺丙烯酸酯隨後能與5′-氨基末端的DNA探針起反應。結合捕獲序列，寡聚體T，是通過與螢光標記的互補探針CP-1-TR雜交而證實的。試驗裝置表面是高度螢光的，表明該表面已被捕獲序列衍生了。
4)電子雜交和DNA-螢光球的識別雜交反應的實施是在一種能安裝2個微毛細管試驗裝置並共用一個上貯槽和獨立的下貯槽的結構中進行。反應表面被暴露在共同的上貯槽中。
試驗裝置被安放在這結構中並預電泳15分鐘在0.5×TBE和0.05mA下。一個試驗裝置有T2互補結合序列，而另一個具有ET-10AL非-互補結合序列。1μl DNA-螢光球被加入到上貯槽中。試驗裝置在0.02mA被偏壓成正達5分鐘，以吸引DNA-螢光球(螢光納米顆粒)。試驗裝置被檢查以確定顆粒在表面上。極性被反轉以便試驗裝置現被偏壓成負和未雜交的DNA-螢光球必須被排斥。
在試驗和對照裝置間沒有區別。經反覆試嘗顆粒能夠被移走而不管使用的電量。
5)被動雜交和DNA-螢光球的識別未放任何理論或假設限制，我們相信顆粒的電子雜交物理地在試驗裝置凝膠基質的表面埋置或抓住顆粒。因此被動地雜交到凝膠表面的結合序列上的DNA-螢光球須非常容易地由電子去-雜交移走。
新的試驗裝置同上述一樣被安裝。0.05％的DNA-螢光球懸浮液被加入到上貯槽中並被動地雜交5分鐘。吸掉緩衝液加入新鮮的1×TBE緩衝液。試驗裝置現在被偏壓成負去排斥顆粒。試驗裝置在0.02mA操作5分鐘，然後用螢光法檢查。
在進行室溫下ECS 10分鐘後在試驗和對照裝置間現在有一個有意義的區別。信號不是一致地分布在試驗表面，而是濃縮在信號袋中。這暗示表面結合序列的可用性是有限的。使用較長的具有疏水、親水，或混合特性的空間臂可使雜交有改進。這種空間臂例如可用己二胺、琥珀酐，和本領域中熟知的各種其它空間基團來構建。實例11特異的ds-DNA序列的電子引導的限制性酶切兩個實例被用來證實APEX裝置選擇性地進行ds-DNA序列限制性內切酶切的能力。M13mp18(具有一個Xba I限制性位點)和M13mp8(不具有Xba I限制性位點)載體被用於這些實例中。這些載體常被用於多個克隆DNA序列分析程序中。
第一個實例證實(1)電子雜交M13mp序列到試驗裝置的特異微場所上，(2)自由場電泳式轉移Xba I限制性酶到微場所上，和(3)在另一微場所上捕獲已切割的片段。這實例也證實裝置用特異結合實體(寡聚核苷酸捕獲序列，等)自我組裝自身能力。
這過程中的基本步驟圖解在圖(16)共價地結合寡聚核苷酸捕獲序列的四個特異的微場所(ML-1、ML-2、ML-3和ML-4)被用在這過程中。電子輸送系統被用於輸送試劑(寡聚核苷酸，限制性酶等等)和處理反應物。
第一步包括轉移和共價結合M13-1寡聚核苷酸捕獲序列到ML-1和ML-2微場所上，以及轉移和結合M13-2寡聚核苷酸捕獲序列到ML-3和ML-4微場所上。由於核酸在pH＞4時是帶負電的，在pH5-9的緩衝液中電泳時它們總是朝帶正電的電極處移動。
第二步包括在ML-1微場所上自由場電泳式轉移和雜交M13mp18序列到M13-1捕獲序列，和在ML-2微場所上M13mp8序列到M13-1序列。
第三步包括轉移Xba I限制性酶到ML-1(M13mp18)微場所和ML-2(M13mp8)微場所上。Xba I切割ML-1上的M13mp18，而不切割ML-2上的M13mp8。被切割的片段從ML-1上被轉移和雜交到ML-3上的M13-2序列上。作為實驗對照，在ML-2和ML-4之間也進行自由場電泳。由於ML-2上的M13mp8序列未被酶切，在ML-4上無片段被識別到。
應用在這實施例中的各種M13結合和探針序列如本說明書上面所述一樣被製備。這些序列如下所示M13-C15′-CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG UM13-C25′-GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTG UMP18-40C 5′-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG-GGT ACC GMP8-40C 5′-TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGA TCC- CCGGGA ATT CMP18-R1 (TR)-5′-AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGCMP8-R2(F)-5′-ACA CAA CAT ACG AGC CGG AAG CAT
步驟1結合M13捕獲序列一臺APEX試驗裝置帶有胺基活化的高度交聯的(26％)聚丙烯醯胺表面或聚碳酸酯(5-10nm)多孔膜表面的200μm微場所被用在這步驟中。
M13-C1捕獲序列是含有3′-核糖核苷酸的31-mer的DNA寡聚核苷酸。M13-C1序列是與M13mp18和M13mp8單鏈(+)載體3′-末端互補的。M13-C1捕獲序列被設計成能雜交和牢固地結合所有未切割的M13載體。
M13-C2序列是一個含有3′-核糖核苷酸的31-mer寡聚核苷酸。M13-C2是與M13序列中含有Xba I限制性位點的克隆區域的上遊部分互補。M13-C2捕獲序列被設計成能雜交和牢固地結合Xba I切割的M13片段。
M13-C1和M13-C2捕獲序列用paraded氧化而活化以便結合到APEX微場所的胺基衍生物上。3′-核糖核苷酸末端通過paraded氧化而轉化成一個末端二醛它能與伯胺基團反應形成席夫鹼。
反應條件如下溶解10-20O.D.的M13-C1或M13-C2寡聚體在水中達終濃度為10D/μl。加入1體積0.1M醋酸鈉，pH 5.2和1體積0.45MSodium paraded(水中新鮮配製)。攪拌保持反應在周圍溫度黑暗下達至少2小時。把反應混合物加樣到平衡在0.1M磷酸鈉，pH 7.4中的Sephadex G-10柱(巴氏吸管0.6×5.5cm)上。收集200μl級分，點樣2μl在薄層層析(TLC)上並收集紫外(UV)吸收級分。
四個APEX試驗裝置的頂端表面被稱為可尋址的微場所ML-1、ML-2、ML-3和ML-4。
M13-C1被共價地結合到ML-1和ML-2微場所上通過如下的步驟用0.1M磷酸鈉，pH 7.4緩衝液充滿上下貯槽並在0.05mA恆電流下預電泳5分鐘，使用Bio-Rad 500/1000電源。含有約0.1O.D.單位的paraded氧化過的M13-C1寡聚核苷酸的電子輸送系統頂端被放入低貯槽。電子輸送系統是一個內部帶有一個鉑電極的特殊地修飾過的塑料吸管頭。電子輸送系統在0.1mA下被偏壓為負(-)而微場所ML-1和ML-2被偏壓成正(+)。M13C-1在恆流下被電泳到ML-1和ML-2達2分鐘，在那兒它共價地結合到表面。極性被反轉，達約4分鐘，使得未反應的M13C-1從ML-1和ML-2微場所上移走。
M13C-2序列是按上面描述的相同步驟結合到ML-3和ML-4微場所上。
步驟2-雜交M13載體，互補序列，和螢光報告探針由於限制性內切核酸酶需要雙鏈DNA用於切割，位於單鏈M13mp18(從6240到6280)和M13mp8(從6230到6270)上的克隆/限制性位點區域必須與互補DNA序列雜交。電子雜交被用於分別地雜交一個40-mer互補片段(MP18-40C序列)到ML-1/M13C-1微場所上的M13mp18載體上；以及雜交一個40-mer互補片段(MP8-40C序列)到ML-2/M13C-1微場所上的M13mp8載體上。
電子雜交進行通過負地偏壓含有0.05 O.D.單位的M13mp18的電子輸送系統，和正地偏壓ML-1/MP13C-1微場所在0.1mA達2分鐘。極性被反轉達4分鐘未雜交的M13mp18從微場所上被移走。同樣的過程被用於電子雜交M13mp8載體到ML-1/M13C-1微場所上。
M13mp18和M13mp8序列然後與二種不同的螢光報告探針電子雜交。在ML-1/M13C-1微場所上的M13mp18載體與一個24-mer德克薩斯紅標記的報告探針(MP18-R1序列)電子雜交，該探針能雜交到克隆/限制性位點的5′-末端。M13mp8載體與一個24-mer螢光素標記的報告探針(MP8-R2序列)電子雜交，該探針能雜交到克隆/限制性位點的5′-末端。
步驟3-應用Xba I限制性酶限制性酶切M13mp18載體取決於它們的等電點(pI)，多個蛋白和酶在pH 5-9範圍中能帶負電荷(pH＞pI)，中性(pH＝pI)，或帶正電荷(pH＜pI)。大量限制性內切核酶酶的pI在6～7範圍內。在pH大於pI時，這些酶將攜帶一個淨負電荷。因此，當自由場電泳在緩衝液pH＞7中進行時，這些酶將朝帶正電荷的微場所移動。
在多個DNA修飾酶的情況下，類似限制性內切核酶酶，總希望選擇一種緩衝溶液它能提供一種pH能平衡最適酶活力和相對快的電泳遷移。在一些情況下在pI上面和下面時都具有適當的酶活性是可能的。取決於選擇的pH，這些酶能朝正地或負地偏壓的微場所移動。
在ML-1上Xba I酶切M13mp18載體按如下進行。
Xba I內切核酶酶應用電子輸送系統首先被自由場電泳到ML-1/M13mp18微場所上。含有100單位Xba I pH 7.6緩衝液的電子輸送系統被偏壓成負而ML-1/M13mp18微場所被偏壓成正在0.1mA達2分鐘。電流然後被減少到0.02mA達3分鐘。電子輸送系統去掉電源，而ML-1/M13mp18微場所被偏壓成負以及ML-3/M13C-2微場所被偏壓成正在0.1mA達5分鐘。ML-3/M13C-2微場所現在被偏壓成負而電子輸送系統接上電源並被偏壓成正在0.1mA達2分鐘以便從ML-3/M13C-2微場所上移走Xba I和未雜交的片段。
落射螢光顯微鏡觀察表明ML-1/M13mp18微場所上的紅色螢光信號消失而在ML-3/M13C-2微場所上出現紅色螢光信號，這證明Xba I酶切了M13mp18載體。相同的基本Xba I切割過程被重複用在ML-2/M13mp8微場所上，這作為一個陰性對照。由於M13mp8載體上沒有Xba I位點，酶切和產生片段是不可能的。因此ML-2/M13mp18微場所上保持它的綠色螢光信號，而在ML-4/M13C-2微場所上觀察不到螢光信號。
第二個實例包括應用被共價地結合在裝置上可尋址微場所上的限制性酶進行限制性酶切反應。這種情況，限制性內切核酸酶被衍生並被自由場電泳到APEX裝置的可尋址微場所上在那兒它們共價地結合。用於衍生和共價結合限制性酶到固體支持物上的方法是本領域的技術人員熟知的。各種不同的限制性酶能被尋址到APEX裝置上。特異的酶切反應可通過使用自由場電泳來濃縮ds-DNA載體或DNA樣品到已含有所需限制性內切核酸酶的微場所上而被進行。ds-DNA被酶切而片段然後被移到裝置的其它微場所上。當所需或有用時其它DNA修飾酶能被結合到APEX裝置的可尋址微場所上。而且，不應認為本實施例限制於DNA修飾酶，因為大多數其它酶能被結合到APEX裝置的可尋址微場所上。實例12電子擴增方法在用非常低目標序列考貝數(如，HIV，腐敗性的血液侵染，等)進行雜交分析的情況下，倍增或擴增目標DNA序列能通過直接在APEX裝置上擴增純化的目標DNA和/或RNA使得靈敏度提高。擴增也能降低對在雜交分析前極高產率製備步驟的需求。
APEX擴增步驟提供完全電子控制的DNA移動，變性、和合成反應。最重要的是，DNA雜交子放電子地變性而不需要應用高溫或無需耐熱聚合酶或其它熱穩定性酶。
作為第一個實例，DNA合成能用DNA聚合酶(Klenow大片段)非常精確地獲得而不需要加熱循環。在這實例中，一條DNA鏈以讓其共價結合到一個微場所上的方式被擴增。過程按如下進行1)所知的目標序列被電子雜交到被尋址的微場所上一個已知序列的捕獲探針上，2)通過DNA聚合酶和捕獲探針作引物進行合成初生的互補鏈DNA(-)，3)新合成的DNA雜交子被電子變性，4)進行目標鏈DNA到未-伸長的捕獲探針的退火和負鏈互補探針到初生的負鏈DNA的退火，5)通過DNA聚合酶進行合成初生的目標鏈DNA(+)並伴隨進行同2)一樣的合成負鏈DNA，因此每次加倍正和負的數目這些步驟重複進行，和6)通過雜交到特異地設計的互補探針上來進行被擴增目標的大小選擇。完整的步驟。圖解在圖17，並詳細描述如下步驟1)結合目標序列到捕獲探針上目標序列被電泳地轉移到含有共價地結合的捕獲探針的微場所上(1)。目標序列能在非目標(基因組的)序列的背景中出現但在退火到捕獲探針前必須被變性。被開始地捕獲的目標序列可為各種長度。
步驟2)合成對目標互補的DNADNA聚合酶和dNTP′s被電泳地轉移到微場所1上。捕獲探針為DNA聚合酶提供3′-末端而被捕獲的目標序列提供模板。足夠保持能夠合成所需試劑濃度的電流被應用。電流可以是恆流或脈衝式的。這些參數能被操作去獲得不同範圍長度的初生互補(-)鏈。
步驟3)電子變性新合成的鏈微場所1的極性被反轉並加電壓以分離兩條鏈。電壓量和使用的時間將取決於雜交DNA複合物的長度和鹼基組成。這些參數可從電子變性曲線中經驗地或計算而確定。
步驟4)引物(捕獲和互補探針)到DNA鏈上的退火寡聚體需要被退火到+和-DNA鏈上以提供DNA聚合酶的引物位點。對目標或+鏈這是通過電泳轉移+鏈到未-延長的捕獲探針上完成的。只要未-延長的捕獲探針是比已延長的，共價地結合-鏈DNA過量這將要發生。現在+和-鏈都有引物結合著而作為DNA聚合酶催化合成的模板(見圖)。結合互補探針也可與非共價結合的-鏈DNA發生，然而這些雜交子將不被電子變性因此對總的擴增不產生影響。
步驟5)合成DNA的兩條新鏈重複步驟2並由於+和-鏈是被引物結合的模板，序列特異DNA的量加倍。這些步驟每重複一次DNA量這種幾何級數的增加將發生。
步驟6)擴增的目標序列的大小選擇互補探針的核苷酸序列將決定被擴增目標DNA的大小和序列。因此，被擴增DNA能通常被設計成增加隨後分析和/或操作的效率。
其它酶能被用於本發明的擴增方法中，包括，但不局限於，其它DNA聚合酶，T7或SP6 RNA聚合酶，反向轉錄酶，DNA連接酶，和聚核苷酸磷酸化酶，和組合使用其它核酸修飾酶(內切酶，外切酶，等)。實例13電子控制器和數據系統所有裝置，是APEX晶片還是微機械裝置，將是可尋址矩陣的微場所(或大場所)的同類，計算機控制/數據採集系統已被設計出提供獨立地應用電子勢能到矩陣上任何墊上並測定在微場所-電解系統中流動的結果電流。計算機控制/數據採集聯繫的方法提供
a)代表微場所的矩陣。高水平和低水平的描述提供所有微場所的全景，提供了在最高水平解決微場所的障礙，和在低水平微場所的完全解決的障礙。
b)一個微場所的成功將躍出微場所的窗式顯示詳細描述微場所的特性，允許各種形態的用時間序列信號建立微場所的控制、電勢強度和符號，等，顯示控制序列覆蓋其它微場所的等。這系統出提供顯示數據和信號收集著為帶有統計和數據比較的微場所形成其它微場所。菜單為控制設計、觀察的實際控制信號和數據收集提供分析、文獻編集和檔案作用。
c)軟體提供整個開關和數據收集通過硬體交界由從描述在b)中的矩陣控制軟體的輸入來控制。
d)一個分離的硬體和軟體系統提供影像收集和處理能力。這系統成像微場所矩陣和記錄在活性的微場所從DNA結合之間反應的螢光信號以提供DNA結合實驗結果的記錄。成像處理軟體提供定量處理這些圖像和提取定量測定結果的能力。這個軟體是完全與矩陣控制器/數據收集軟體有聯繫以便提供一個組合系統它能記錄從成像數據來的所有APEX裝置控制/電解電流數據和測定結果，分析這些數據以便為伴隨關於這些結果的一致性和可靠性輔助信息的測定，和獲得所有數據和分析提供經歸納的結果。
e)一個APEX控制器將組合所有這軟體加上一個頂端層它提供僅僅「測定」和「結果」顯示，加上一個按鍵如果需要的話通過c)接道a)，但通過c)到a)將被收集並在所有情況下被獲得。
f)用於發展項目的控制器初版應用Macintosh Quadra 950作為宿主計算機並用National Iustruments boards與 Quadra 950聯用以便提供上述的硬體聯繫器。這些面版應用可變的電勢到APEX微-場所上並測定在電解系統中流動的結果電流。用在這控制器上的國家儀器面版(National Iustruments boards)是高分辨力多功能I/O面版，NB-MIO-16XL-18，模擬輸出面版，NB-AO-6，同步輸入/輸出面版，NB-TIO-10，阻閉式DMA和GPIB聯繫面版，NB-DMA-2800，和模擬信號調節組件面版和熱電偶組件，和其它環境傳感器，5B系列，在Qudra中的NuBus面版和APEX裝置間的連接部分將是安裝在SCXI-1001機殼中的整個SCXI 16-通道SPDT繼電器元件面版。實例14電子控制的樣品製備和雜交分析—一個組合的APEX系統樣品製備一般地包括選擇細胞，細胞材料的破碎(如，裂解)以及一系列的製備步驟和親和反應。樣品製備對分子生物學反應是重要的。例如，雜交分析常常被限制是因為在樣品製備過程中的無效率而損失足夠量的實際目標DNA序列。
用於電子控制的基本APEX概念能在DNA雜交測定中用於樣品製備。電子方法將允許樣品製備，細胞選擇和分析在APEX元件的一個主動電子系統上進行。樣品製備開始於細胞篩選和裂解，並從樣品的細胞和體外的材料中粗的分離DNA。電子裝置能電子地處理樣品DNA並有效地轉移它到裝置的分析元件上，同時移走其它材料。這系統為有效的處理目標DNA提供合適的測量因子。對人類基因組分析，電子樣品製備能包括一個高效的預雜交步驟通過此步驟大部分複雜的非特異性DNA能與目標DNA分離開。
一臺帶有樣品製備的組合裝置或完全的APEX裝置能取得相對粗糙的樣品(血液，唾液，尿液等)，並用最少的機械操作和射流來處理它，然後電子地輸送目標DNA到裝置的分析元件上。這「主動的電子處理」不同於自動化或機械化處理，它們通常是人工處理和技術的機械化翻版。
一個為DNA樣品製備和分析的組合APEX系統能用多個全基於一般APEX概念的元件製造。這個系統的元件包括(1)一個電子細胞篩選單元；(2)一個電子試劑分配單元(3)一個電子廢物處理單元；(4)一個粗DNA篩選單元；(5)一個第二DNA或限制性片段篩選單元；(6)一個DNA片段貯存單元；和(7)APEX分析單元(晶片)。這組合的APEX系統被圖解在圖18。
這種系統能在一個大矽片上製造。此外，單個元件能通過微平版印刷或微加工技術製造並被安排在(如，插入)一個特殊設計平板單元上。完全系統的元件被設計成它們活性的區域的大小取決於相關樣品中的材料量和大小(例如，細胞)。例如，細胞篩選器的活性部位一般地應大於粗DNA篩選器活性區域，它依次應大於限制性片段篩選器活性區域，它應該是大於APEX分析晶片活性區域。
在實例中，細胞篩選器「活性區域」能是數平方釐米，而一個64微場所APEX分析元件的總「活性區域」能是少於一平方毫米，平板單元被設計成在一個密封的共同緩衝液貯槽中支持所有的元件單元。多至數百微升的合適樣品通過靠近細胞篩選器元件的加樣口被加入到系統中。細胞篩選元件是一種較大規模的APEX裝置它能對不同細胞類型具有一個或多個經篩選的親和性。這些親和性篩選能基於細胞表面電荷，半抗原，和抗原被建立。
作為實例，對全血樣品的親和性選擇能被用於篩選從紅血細胞中自血細胞(白血球，等)。高選擇性的過程能用於從材料血液樣品中選擇胎兒細胞。這也可能去提供傳染性微生物(酵母，真菌，細菌，和病毒)的親和性和選擇。當被選擇的細胞保持結合在細胞篩選器元件上時；所有其它細胞和蛋白質的材料被轉移到廢料處理單元上。在這點上細胞能被裂解通過自由場電泳式轉移帶電去汙劑，和/或離液劑，和/或合適的裂解酶和蛋白酶(溶菌酶，蛋白酶K，胃蛋白酶，等)從電子試劑分配單元到細胞篩選器單元上的細胞上。合適的偏壓電子廢物處理系統能被用於移走一定的裂解廢物材料。正地偏壓粗DNA篩選器單元現在能被用來轉移粗核酸(DNA/RNA)材料到這元件上。
粗DNA篩選器是一種具有一般DNA親和力的APEX裝置。這種親和力能是一種帶正電的表面，或者含有一個共同的或重複的DNA序列的表面。例如，Alu重複捕獲序列能有效地捕獲從人類細胞提取的粗DNA。當傳染性疾病分析是工作對象時一個普通的或一般的細菌或病毒序列能被使用。除了從DNA中移走體外的材料以外；APEX系統也被設計成去降低樣品DNA的複雜度。這能被獲得通過使用限制性酶去選擇性地切割DNA在粗DNA選擇器單元上。限制性酶從試劑分配器單元上被轉移。被切割的限制性片段通過偏壓為正現在能被轉移到第二個DNA或限制性片段選擇器單元上。這個單元被設計成選擇性地結合DNA大片段，使用其表面的合適捕獲序列。
在這點上，被選擇的DNA片段能被轉移到APEX分析晶片以進行雜交分析。這也可能轉移DNA片段到貯存單元或甚至該系統以外。上面的實施例僅代表樣品製備和成倍雜交分析一些可能的方案。元件的結合親和性編程能力和組合不同元件的可變性及功能允許進行大量過程。
當DNA被用作初始實例時，上述的裝置和方法也能用於處理和分析目標DNA分子，蛋白質，多糖，脂類和其它大分子。
所有參考文獻在此引入作為參考，包括在每篇文獻記錄的核酸序列和胺基酸序列。
其它實施方案在下面的權利要求書中。
序列目錄(1)一般信息(i)申請人Michael J.HellerEugene TuGlen A.EvansRonald G.Sosnowski(ii)發明題目 為分子生物學分析和診斷的自我-尋址自我-組裝的微電子系統和裝置(iii)序列數目45(iv)聯繫地址(A)收信人 Lyon Lyon(B)街道611 West Sixth Street(C)城市Los Angelrs(D)州名加利福尼亞(E)國家USA(F)郵編90017(v)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5"磁碟，1.44Mb內存(B)計算機 IBM兼容機(C)作業系統IBM P.C.DOS(5.0版)(D)軟體Wordperfect(5.1版)(vi)現行申請數據(A)申請號 08/271,882(B)歸檔日期July 7，1994
(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號 08/146,504(B)歸檔日期Nov.1，1993(viii)律師/代理人信息(A)姓名Murphy，David B.
(B)登記號 31，125(C)文獻/摘要號207/263(ix)電信信息(A)電話(213)489-1600(B)傳真(213)955-0440(C)電傳67-3510(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO1GCT ACG CCC TGC TCA TGA GTC TCU 24(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度 21(B)類型 核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO2AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAU 21(2)關於SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO3CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GAC TGC CTG U34(2)關於SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO4GAG TTC AGC AAA TTT GGA GU20(2)關於SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO5CGT AGA ACT CCT CAT CTC CU 20(2)關於SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度18(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO6GTC TCC TTC CTC TCC AGU18(2)關於SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO7GAT GAG CAG TTC TAC GTG GU 20(2)關於SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度18(B)類型核酸
(C)鏈型 單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO8CTG GAG AAG AAG GAG ACU 18(2)關於SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO9TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC U 22(2)關於SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO10TTC CGC AGA TTT AGA AGA TU20(2)關於SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO11TGT TTG CCT GTT CTC AGA CU 20(2)關於SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO12CAG CGC TGT GAC AAA ACA TU 20(2)關於SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO13TGC GAG CTG CAG TCA GAC AT 20(2)關於SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度18(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO14GAG AGA CTC ATG AGC AGG 18(2)關於SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度18(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO15CCT CGT CAT GAG TCT CTC 18(2)關於SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO16TTT TTT TTT TTT TTT TTT T 19(2)關於SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度33(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO17CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGG TCC ACG TAG 33(2)關於SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO18CTC CAA ATT TGC TGA ACT C 19(2)關於SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO20GGA GAT GAG GAG TTC TAC G 19(2)關於SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度17(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO21CTG GAG AGG AAG GAG AC 17(2)關於SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO22CCA CGT AGA ACT GCT CAT C19(2)關於SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度17(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO23GTC TCC TTC TTC TCC AG17(2)關於SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO24GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAA 21(2)關於SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO25ATC TTC TAA ATC TGC GGA A 19(2)關於SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO26GTC TGA GAA CAG GCA AAC A 19(2)關於SEQ ID NO27的信息(i)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO27ATG TTT TGT CAC AGC GAT G 19(2)關於SEQ ID NO28的信息(i)序列特徵(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO28GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAU 30(2)關於SEQ ID NO29的信息(i)序列特徵(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO29GGT GGT GGG CGC CGT CGG TGT GGG CAA GAU 30(2)關於SEQ ID NO30的信息(i)序列特徵(A)長度15(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO30CC GCG GCC GCC ACA C15(2)關於SEQ ID NO31的信息(i)序列特徵(A)長度15(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO31CC GCG GCA GCC ACA C15(2)關於SEQ ID NO32的信息(i)序列特徵(A)長度15(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO32CC TGT GCA GCC ACA C 15(2)關於SEQ ID NO33的信息(i)序列特徵(A)長度30(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO33GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GAU30(2)關於SEQ ID NO34的信息(i)序列特徵(A)長度29(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO34GGT GGT GGG CGC CGG CGG TGT GGG CAA GA 29(2)關於SEQ ID NO35的信息(i)序列特徵(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO35TGC CCA CAC CGC CGG CGC CCA C22(2)關於SEQ ID NO36的信息(i)序列特徵(A)長度22(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO36TGC CCA CAC CGA CGG CGC CCA C 22(2)關於SEQ ID NO37的信息(i)序列特徵(A)長度？(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO37TGC CCA CAC CAC CGA CGG TGC CCA C 22(2)關於SEQ ID NO38的信息(i)序列特徵(A)長度7(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO38ACA CCG C 7(2)關於SEQ ID NO39的信息(i)序列特徵(A)長度7(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO39ACA ACG C 7(2)關於SEQ ID NO40的信息(i)序列特徵(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO40CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG U31(2)關於SEQ ID NO41的信息(i)序列特徵(A)長度31(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO41GTA ATC ATG GTC ATA CGT GTT TCC TGT GTG U31(2)關於SEQ ID NO42的信息(i)序列特徵(A)長度40(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO42GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG GGT ACC G40(2)關於SEQ ID NO43的信息(i)序列特徵(A)長度40(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO43TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGA TCC CCT GGA ATT C40(2)關於SEQ ID NO44的信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO44AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGC 24(2)關於SEQ ID NO45的信息(i)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學 線形(ii)序列描述SEQ ID NO45ACA CAA GAT ACG AGC AGC CGG AAG CAT 2權利要求
1.一臺用電子學方法自我尋址的裝置，它包含一種基質；一個電極，該電極由上述基質支持著；一個操作地連接著該電極的電源和一種靠近該電極的粘附層，這裡所說的粘附層可滲透反荷離子但不滲透一種能夠絕緣或結合到該電極上的分子並且粘附層能夠結合大分子。
2.權利要求1的電子學裝置，進一步包括一個滲透層，該滲透層置於所說的粘附層和電極之間。
3.權利要求1的電子學裝置，其中所提的電源包括一個直流電源。
4.權利要求1的電子學裝置，其中所提的基質包括從矽、玻璃、二氧化矽、塑料和陶瓷組成的材料組中挑選的一種。
5.權利要求1的電子學裝置，其中所提的基質包括一個底層和一個覆蓋絕緣層。
6.權利要求5的電子學裝置，其中所提的底層包括從矽、玻璃、二氧化矽、塑料和陶瓷組成的材料組中挑選的一種。
7.權利要求5的電子學裝置，其中所提的底層由矽組成。
8.權利要求5的電子學裝置，其中所提的絕緣層包括二氧化矽。
9.權利要求1的電子學裝置，其中所提的基質包括一種電路模型或電路板。
10.權利要求1的電子學裝置，其中所提的電極是能夠轉移一個帶電大分子到該粘附層上。
11.權利要求1的電子學裝置，其中所說的電極能夠同時地移動帶電的第一個大分子到該粘附層上，並從該粘附層上轉移帶相反電荷的第二個大分子到該粘附層中的第一個大分子上。
12.權利要求2的電子學裝置，其中所提的滲透層包括氨基丙基三乙氧基矽烷。
13.權利要求2的電子學裝置，進一步包含一個位於所說的滲透層和電極間的緩衝液貯槽。
14.權利要求1的電子學裝置，其中結合該大分子到該粘附層上不會使該電極絕緣。
15.權利要求1的電子學裝置，其中提到的電極包括選自鋁、金、銀、錫、銅、鉑、鈀、碳和半導體材料的一種材料。
16.權利要求1的電子學裝置，其中電極包括選自鋁、金、銀、錫、銅、鉑、鈀、碳和半導體材料的一種材料。
17.權利要求1的電子學裝置，其中使一個結合實體結合到該粘附層上不會使該電極絕緣。
18.一臺用電子學方法自我尋址的裝置，它包含一種基質；多個電極，每個電極置於所說的基質上；一個與所說的多個電極操作地連接著的電源；和一個接近著每個所說電極的粘附層，這裡所說的粘附層可滲透反荷離子但不滲透一種能夠絕緣或結合到該電極上的分子，並且該粘附層能夠結合大分子。
19.權利要求18的電子學裝置，進一步包含一個連接著電源和所說的多個電極的開關控制器。
20.權利要求18的電子學裝置，進一步包含一個位於該粘附層和每一個電極間的滲透層。
21.權利要求18的電子學裝置，其中每個電極包括選自鋁、金、銀、錫、銅、鉑、鈀、碳和半導體材料的一種材料。
22.權利要求18的電子學裝置，進一步包含位於多個電極之間的電子絕緣材料。
23.權利要求18的電子學裝置中所提的多個電極以矩陣式排列。
24.權利要求18的電子學裝置，進一步包括一個能容納一種含實體的溶液的腔，該實體選自結合實體、試劑和分析物。
25.權利要求18的電子學裝置，其中特異結合實體已被選擇性地轉移和結合到所說的多個可尋址的結合場所上，而形成一個已尋址的活性場所裝置。
26.權利要求18的電子學裝置，其中裝置上結合場所的寬度是在0.5微米和200微米之間。
27.權利要求18的電子學裝置，其中裝置上結合場所的寬度是在5微米和100微米之間。
28.權利要求18的電子學裝置，其中所提的多個結合場所被安排在一個二維的矩陣中。
29.權利要求18的電子學裝置，其中所提的多個結合場所被安排在一個三維的矩陣中。
30.權利要求18的電子學裝置，進一步包含一個計算系統，這裡所說的系統是用電子學方法連接到所說的多個結合場所上。
31.權利要求30的電子學裝置，其中提到的計算系統被連接到所說的電極上。
32.電子控制核酸雜交的方法，包括下列步驟提供一個連接著電源的場所；使一個第1核酸和一個第2核酸接觸，其中的第2核酸是結合在所說場所上的；和放置該場所在一個負電勢下達足夠時間，其中所說的第1核酸如果對於第2核酸是一個非特異性核酸序列，則將其從第2核酸上移走，但如果第1核酸對於第2核酸是一個特異的核酸序列則不將其移走。
33.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸和第2核酸都處在一種溶液中。
34.權利要求32所述方法，進一步包括一個在放置所說的場所在負電勢中之前，放置該場所在正電勢的步驟，這樣在該場所上濃縮第1核酸。
35.權利要求32所述方法，其中提到的負電勢是逐漸增加或減少的。
36.權利要求32所述方法，其中提到的非-特異性核酸序列與第2核酸序列有一個鹼基錯配。
37.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由不多於7個核苷酸組成。
38.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由不少於22個核苷酸組成。
39.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由在7至22個的核苷酸組成。
40.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸包括一個可識別的元件。
41.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸包括一個螢光團。
42.權利要求41所述方法，其中提到的螢光團是從德克薩斯紅和螢光素組成的組中挑選的。
43.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸包括一個脫氧核糖核苷酸。
44.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸包括一個核糖核苷酸。
45.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸包括一個修飾過的核苷酸。
46.權利要求33所述方法，進一步包括下列步驟在所述溶液中加入可識別的染料，其中所述的染料結合到雙-鏈核酸上比結合到單鏈核酸上的親和力高；和通過測定在該場所上染料的水平而確定在第1核酸和第2核酸間在該場所上雜交的水平。
47.權利要求46所述方法，其中提到的染料包括溴化乙錠。
48.權利要求33所述方法，進一步包括下列步驟在所說溶液中加入一個可識別染料，其中當該染料與雙鏈核酸接觸時，該染料產生一個比與單鏈核酸接觸時更強的可識別信號；和通過測定在該場所上染料產生可識別信號的水平，來確定在該場所上在第1核酸和第2核酸間發生雜交的水平。
49.權利要求48所述方法，其中提到的染料包括溴化乙錠。
50.權利要求33所述方法，其中提到的溶液包括由對於第2核酸的非特異性核酸序列組成的一種第3核酸。
51.權利要求50所述方法，其中的第3核酸的濃度是高於第1核酸濃度的1000倍。
52.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由7個核苷酸組成。
53.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由5至7個核苷酸組成。
54.權利要求32所述方法，其中提到的第1核酸由22個核苷酸組成。
55.電子控制核酸雜交的方法，包括下列步驟提供一個連接著電源的場所；將多個核酸與一個目標核酸接觸，其中所說的目標核酸是結合在該場所上的；和放置該場所在一個負電勢下達足夠時間，其中對於所說目標核酸的非特異性核酸序列，而不是從所說的多個核酸中來的特異性核酸序列，被從所說的目標核酸上移走。
56.在場所上並在溶液中用電子學方法濃縮一個帶電實體的方法，包括下列步驟將所說的溶液與包括第1下埋的電極的第1場所，和包括第2下埋電極的第2場所接觸；和在相對於第二場所的第一場所，放置與所說實體相反的電荷，從而在第1場所上而不是第2場所上濃縮所說的實體。
57.權利要求56所述方法，進一步包括在第二場所放置與所說實體相同的電荷。
58.權利要求56所述方法，進一步包括在第1場所上的實體和粘附層之間形成共價鍵的步驟。
59.權利要求56所述方法，其中提到的實體是一個核酸分子，並且第1場所是帶正電勢。
60.權利要求59所述方法，其中提到的第2場所是帶負電勢。
61.權利要求56所述方法，其中在第1場所的實體濃度高於在第2場所所說實體的濃度10倍。
62.權利要求56所述方法，其中在第1場所的實體濃度高於在第2場所實體的濃度100倍。
63.權利要求56所述方法，其中在第1場所的實體濃度高於在第2場所實體的濃度106倍。
64.權利要求56所述方法，進一步包括結合實體到第1場所的步驟。
65.用電子學方法將溶液中的一個帶電實體從第1場所轉移到第2場所上的方法，包括下列步驟將所說溶液與第1和第2場所接觸；在相對於第2場所的第1場所，放置與所說實體相反的電荷，從而使該實體轉移到第1場所；和此後，在相對於第1場所的第2場所，放置與實體相反的電荷，從而將所說的核酸從第1場所轉移到第2場所。
66.權利要求65所述方法，其中提到的實體是一個核酸。
67.權利要求65所述方法，進一步包括將所說實體結合到第2場所的步驟。
68.在多個場所用電子學方法控制合成生物高分子的方法，包括下列步驟在基質上提供多個反應場所，其中每個反應場所是單個地用電子學方法可尋址的；在每個反應場所上形成一個粘附層；使多個反應場所與包含一個帶電單體-A的溶液接觸；選擇性地將一個要發生反應A的被命名為A的場所偏壓在與單體-A相反的電荷，和將另一個無反應A發生的場所偏壓在與單體-A相同的電荷，因此在所說的A場所上使單體A濃縮和反應；此後，從多個反應場所上移走未反應的單體A；使多個反應場所與包含一個帶電的單體-B的溶液接觸；選擇性地將所說的A場所偏壓在單體B相反電荷下，和將另一個無反應B發生的場所偏壓在與單體B相同的電荷下，從而在所說的A的場所上濃縮和反應單體B以形成二聚體A-B。
69.權利要求68所述方法，其中提到的單體A由一個核苷酸組成並且提到的單體B由一個核苷酸組成。
70.權利要求68所述方法，其中提到的單體A由一種胺基酸組成並且提到的單體B由一種胺基酸組成。
71.複製一個由特異性核酸序列尋址的一個主要自我可尋址的電子學裝置的方法，包括下列步驟對所說的特異性核酸序列提供互補序列，並雜交該互補序列到尋址在主要裝置上的特異性核酸序列；用在主要裝置上的尋址場所排列在一個受體自我可尋址電子裝置上的未尋址場所；和偏壓在所說的主要裝置上的場所成負和在所說的受體裝置上的場所成正，從而將所說的互補序列轉移到受體裝置上的未尋址場所上。
72.權利要求71所述的複製模式序列的方法，進一步包括提供一個帶正電的離液劑試劑或變性劑，從主要的模板上變性互補序列的步驟。
73.一臺用於遺傳分型的自我可尋址的電子學裝置，包括多個用電子學方法可尋址的每個場所包括一個電極；和一個結合到每個場所上的結合實體，其中每個實體能夠識別基因序列的存在。
74.權利要求73所述的自我可尋址電子裝置，其中所說的基因序列是一個核苷酸序列。
75.權利要求74所述的自我可尋址電子裝置，其中所說的核苷酸序列是一個CDNA序列。
76.權利要求74所述的自我可尋址電子學裝置，其中所說的核苷酸序列是一個基因組DNA序列。
77.權利要求74所述的自我可尋址電子學裝置，其中所說的核苷酸序列是一個mRNA序列。
78.權利要求74所述的自我可尋址電子學裝置，其中所說的核苷酸序列是一個cRNA序列。
79.權利要求73所述的自我可尋址電子學裝置，其中所說的基因序列是一個胺基酸序列。
80.權利要求73所述的自我可尋址電子學裝置，其中結合到每個場所上的每個結合實體是相同的。
81.權利要求73所述的自我可尋址電子學裝置，其中一個結合實體是不同於其它所說的結合實體。
82.用於電子學方法控制遺傳分型的方法，包括下列步驟提供多個電子可尋址的場所，每個場所含有一個電極；使一種結合實體結合到每個場所上，其中每個實體能夠識別某個基因序列的存在；用一個樣品接觸多個場所；通過識別在每個場所上存在或缺乏所說的基因序列，來確定該樣品的遺傳圖譜。
83.在某個可尋址場所用電子學方法控制酶反應的方法，包括下列步驟提供一個含有一個電極的電子學可尋址場所；使一個底物與所說的場所接觸；放置該場所在與該底物相反的電荷下，因此在該場所上濃縮該底物；結合該底物到該場所上；使一種酶與該場所接觸；放置該場所在與該酶相反的電荷下，因此在該場所上濃縮該酶；和允許該酶在該場所上與該底物起反應。
84.權利要求83所述方法，其中提到的底物包括一種核酸。
85.權利要求83所述方法，其中提到的酶包括一種限制性酶，一種連接酶，一種蛋白酶，一種糖苷酶，或一種磷酸化酶。
86.權利要求83所述方法，其中提到的酶包括一種DNA聚合酶。
87.權利要求83所述方法，其中提到的酶包括一種RNA聚合酶。
88.權利要求83所述方法，其中提到的酶反應包括一種核酸的酶消化。
89.權利要求83所述方法，其中提到的酶反應包括一種核酸的合成。
90.權利要求83所述方法，其中提到的酶反應包括一種多肽的合成。
91.用電子學方法控制擴增核酸的方法，包括下列步驟(1)提供一個含有一個電極的電子學可尋址場所；(2)提供一個結合在該場所上的寡聚核苷酸引物Y；(3)使一種單鏈核酸X與該場所接觸，其中該引物Y特異地與該核酸X雜交；(4)置該場所於與該核酸X相反的電荷下，從而在該場所上濃縮該核酸X並且將該核酸X與該引物Y雜交；(5)使一種核酸聚合酶與該場所接觸；(6)置該場所於與該聚合酶相反的電荷下，從而在該場所上濃縮該聚合酶並且在該場所上允許該聚合酶從該引物Y合成一個核酸Y；(7)置該場所於一個負電勢下達足夠時間以便從該場所上移走該核酸X；(8)使一個寡聚核苷酸引物X與該場所接觸，其中該引物X與該核酸Y特異性地雜交；(9)置該場所於與該引物X相反的電荷下，從而在該場所上濃縮該引物X並且將該引物X與該核酸Y雜交；(10)置該場所於與該聚合酶相反的電荷下，因此在該場所上濃縮該聚合酶，並且在該場所上允許該聚合酶從該引物X合成一種核酸。
92.在大分子間用電子學方法控制結合的方法，包括下列步驟在一個直流電場中使一種帶電第1大分子與一種第2大分子接觸，其中所說的第2大分子被結合在一個場所上；置該場所於與該第1大分子所帶電荷相反的電勢下達足夠時間，其中該第1大分子如果非特異性地與該第2大分子結合，則將其從該第2大分子處移走，但如果所說的第1大分子特異性地與該第2大分子結合則它不被移走。
93.權利要求92所述方法，其中提到的第1大分子是一種多肽。
94.權利要求92所述方法，其中提到的第1大分子是一種核酸。
全文摘要
設計和製造了一臺可自我尋址，自我組裝的微電子裝置，它能以顯微形式主動地進行和控制多步和多路的分子生物學反應。這些反應包括核酸雜交，抗體/抗原反應，診斷，和生物高分子合成。該裝置能藉助微平版印刷和微加工技術而製造。該裝置能電子控制特異性結合實體的轉移和結合到特異性微場所上。特異性結合實體包括分子生物學分子例如核酸和多肽。該裝置能在被尋址的特異性微場所上逐次地控制分析物或反應物的轉移和反應。該裝置能濃縮分析物和反應物，移走非特異性結合的分子，為DNA雜交反應提供嚴格控制，和提高對分析物的識別力。該裝置能電子地被複製。
文檔編號C12N15/09GK1135220SQ95190860
公開日1996年11月6日 申請日期1995年7月5日 優先權日1994年7月7日
發明者M·J·赫勒, E·杜, G·A·艾文斯, R·G·索斯諾斯基 申請人:內諾金有限公司