經修飾的核苷、核苷酸和核酸組合物的製作方法

2023-11-04 05:41:22 2

經修飾的核苷、核苷酸和核酸組合物的製作方法
【專利摘要】本公開尤其提供了包含可以編碼蛋白質、蛋白質前體或者所述蛋白質或蛋白質前體的經部分或完全加工的形式的經修飾的核酸分子的製劑組合物。所述製劑組合物還可以包括經修飾的核酸分子和遞送劑。本發明還提供了可用於編碼能夠調節細胞功能和/或活性的多肽的核酸。
【專利說明】經修飾的核苷、核苷酸和核酸組合物
[0001] 序列表引用
[0002] 本申請隨電子格式的序列表一起提交。名為M11PCTSQLST. txt的序列表文件是在 2012年12月14日創建且大小為25, 579個字節。電子格式的序列表中的信息以全文引用 的方式併入本文中。
[0003] 相關申請的交叉引用
[0004] 本申請要求以下美國臨時專利申請和國際公布的權益：2011年12月16日 提交的標題為"Modified Nucleoside，Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions" 的美國臨時專利申請號61/576, 705、2012年4月2日提交的標題為"Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions" 的美國臨時專利申請號 61/618, 957、2012 年 5 月 17 日提交的標題為"Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions"的美國臨時專利申請號61/648, 244、2012年8月10日提交 的標題為"Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions"的美國臨時專 利申請號 61/681，712 和 2012 年 9 月 4 日提交的標題為"Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions, and Nucleic Acid Compositions" 的美國臨時專利 申請號 61/696, 381、2012 年 10 月 3 日提交的標題為"Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions" 的美國臨時專利申請號 61/709,303、2012 年 10 月 11 日提交的標題為 "Modified Nucleoside, Nucleotide and Nucleic Acid Compositions" 的美國臨時專利申請號61/712, 490和2012年10月3日提交的標題為"Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, And Uses Thereof" 的國際公布號 PCT/ US2012/058519,所述美國臨時專利申請和國際公布的內容是以全文引用的方式併入本文 中。
[0005] 發明背景
[0006] -般來說，引入到細胞中的未經修飾的外源性核酸分子，特別是病毒核酸，會誘導 固有的免疫反應，由此導致產生細胞因子和幹擾素（IFN)且最終導致細胞死亡。對於能夠 向細胞中遞送核酸，例如核糖核酸（RNA)，以便引起所述核酸的細胞內翻譯且產生編碼蛋白 質而不是產生固有免疫反應的治療劑、診斷劑、試劑和生物測定非常感興趣。因而，需要開 發包含可以有效地促進核酸體內遞送到靶細胞而不產生固有的免疫反應的遞送劑的製劑 組合物。 發明概要
[0007] 本公開尤其提供了包含可以編碼蛋白質、蛋白質前體或者所述蛋白質或蛋白質前 體的經部分或完全加工的形式的經修飾的核酸分子的製劑組合物。所述製劑組合物還可以 包括經修飾的核酸分子和遞送劑。本發明還提供了可用於編碼能夠調節細胞功能和/或活 性的多肽的核酸。
[0008] 在一個方面，描述了在哺乳動物細胞或組織中產生目的多肽的方法。所述方法包 括使所述哺乳動物細胞或組織與包含編碼目的多肽的經修飾的mRNA的製劑接觸。所述制 劑可以是但不限於納米粒子、聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物（PLGA)微球體、類脂質、脂質復 合物、脂質體、聚合物、碳水化合物（包括單糖）、陽離子脂質、纖維蛋白凝膠、纖維蛋白水凝 膠、纖維蛋白膠、纖維蛋白密封劑、纖維蛋白原、凝血酶、快速消除型脂質納米粒子（reLNP) 和其組合。所述經修飾的mRNA可以包含經純化的IVT轉錄物。
[0009] 在一個實施方案中，包含所述經修飾的mRNA的所述製劑是可能包含至少一種脂 質的納米粒子。所述脂質可以選自但不限於DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、 DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG 和聚乙二醇化脂質。在另一個 方面，所述脂質可以是陽離子脂質，如但不限於DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、 DLin-KC2-DMA 和 DODMA。
[0010] 在所述製劑中，所述脂質與所述經修飾的mRNA的比率可以介於10:1與30:10之 間。包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑的平均尺寸可以介於60與225nm之間。 包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑的PDI介於0. 03與0. 15之間。所述脂質在 PH7.4下的ζ電位可以是-10到+10。
[0011] 經修飾的mRNA的所述製劑可以包含促融合脂質、膽固醇和PEG脂質。所述製劑可 以具有摩爾比為50:10:38. 5:1. 5-3. 0的陽離子脂質：促融合脂質：膽固醇：PEG脂質。所 述PEG脂質可以選自但不限於PEG-c-DOMG、PEG-DMG。所述促融合脂質可以是DSPC。
[0012] 可以使用如但不限於注射泵、內部滲透泵和外部滲透泵等裝置接觸所述哺乳動物 細胞或組織。
[0013] 經修飾的mRNA的所述製劑可以是PLGA微球體，所述PLGA微球體的尺寸可以介於 4與20 μ m之間。可以在48小時的時間段內從所述製劑中釋放不到50%的所述經修飾的 mRNA。所述PLGA微球體製劑在血清中可以是穩定的。穩定性可以在90%血清中相對於未 經配製的經修飾的mRNA而測定。
[0014] 所述經修飾的mRNA PLGA微球體的負載重量百分比可以是至少0. 05%、至少 0. 1 %、至少0. 2%、至少0. 3%、至少0. 4%或至少0. 5%。所述經修飾的mRNA在所述PLGA 微球體中的囊封效率可以是至少50%、至少70%、至少90%或至少97%。
[0015] 本發明的脂質納米粒子可以在如但不限於纖維蛋白密封劑等密封劑中配製。
[0016] 可以通過如但不限於靜脈內、肌肉內、玻璃體內、鞘內、腫瘤內、肺和皮下等施用途 徑接觸所述哺乳動物細胞或組織。可以使用分割給藥方案來接觸所述哺乳動物細胞或組 織。可以通過注射來接觸所述哺乳動物細胞或組織。所述注射可以對選自真皮內空間、表 皮、皮下組織和肌肉的組織進行。所述目的多肽可以在所述細胞或組織中從接觸位置起在 整體位置上產生。
[0017] 在接觸後可以在血清中檢測到所述目的多肽持續長達72小時。所述目的多肽的 水平可以高於給藥前的水平。所述目的多肽在雌性受試者的血清中的水平可以大於在雄性 受試者的血清中的水平。
[0018] 經修飾的mRNA的所述製劑可以包含超過一種經修飾的mRNA。所述製劑可以具有 兩種或三種經修飾的mRNA。
[0019] 包含所述經修飾的mRNA的所述製劑可以包含快速消除型脂質納米粒子（reLNP)， 所述快速消除型脂質納米粒子可以包含reLNP脂質、促融合脂質、膽固醇和PEG脂質，其摩 爾比為50:10:38. 5:1. 5(reLNP脂質：促融合脂質：膽固醇：PEG脂質）。所述促融合脂質 可以是DSPC且所述PEG脂質可以是PEG-c-DOMG。所述reLNP脂質可以是具有內酯或末端 酯的DLin-DMA或者具有內酯或末端酯的DLin-MC3-DMA。總脂質與經修飾的mRNA的重量比 可以介於10:1與30:1之間。
[0020] 包含經修飾的mRNA的所述製劑可以包含纖維蛋白密封劑。
[0021] 包含經修飾的mRNA的所述製劑可以包含類脂質，其中所述脂質是選自C12-200和 98N12-5。
[0022] 包含經修飾的mRNA的所述製劑可以包括聚合物。所述聚合物可以塗布有、覆蓋 有、環繞有、封圍有或包含一層水凝膠或外科用密封劑。所述聚合物可以選自PLGA、乙烯/ 乙酸乙烯酯共聚物、泊洛沙姆和G ELSITES。
[0023] 可以通過使哺乳動物細胞或組織與包含編碼所述目的多肽的經修飾的mRNA的緩 衝劑製劑接觸而在所述哺乳動物細胞或組織中產生目的多肽。所述緩衝劑製劑可以選自 但不限於生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水和林格氏乳酸鹽。所述緩衝劑製劑可以包含介於 1與10mM之間的鈣濃度。所述緩衝劑製劑中的經修飾的mRNA可以包含經純化的IVT轉錄 物。
[0024] 可以通過使靈長類動物與包含經配製的編碼目的多肽的經修飾的mRNA的組合物 接觸而在所述靈長類動物中產生藥理學作用。所述經修飾的mRNA可以包含經純化的IVT 轉錄物，和/或可以在以下各物中配製：納米粒子、聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物（PLGA)微 球體、類脂質、脂質複合物、脂質體、聚合物、碳水化合物（包括單糖）、陽離子脂質、纖維蛋 白凝膠、纖維蛋白水凝膠、纖維蛋白膠、纖維蛋白密封劑、纖維蛋白原、凝血酶、快速消除型 脂質納米粒子（reLNP)和其組合。所述藥理學作用可以大於與已知可產生所述藥理學作用 的治療劑和/或組合物相關的藥理學作用。所述組合物可以包含經配製的或未經配製的經 修飾的mRNA。所述藥理學作用可以對疾病、病症、病狀或感染產生在治療上有效的結果。所 述在治療上有效的結果可以包括但不限於治療、改善一種或多種症狀、診斷、預防和延遲發 作。所述藥理學作用可以包括但不限於細胞計數變化、血清化學性質變化、酶活性變化、血 紅蛋白增加和紅細胞壓積增加。
[0025] 在一個實施方案中，本公開提供了一種製劑組合物，其包含經修飾的核酸分子和 遞送劑。所述經修飾的核酸分子可以選自DNA、互補DNA (cDNA)、RNA、信使RNA (mRNA)、RNAi 誘導劑、RNAi劑、siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、核糖酶、催化DNA、誘導三螺旋形成的RNA、 適體、載體和其組合。如果所述經修飾的核酸分子是mRNA，則所述mRNA可以來源於cDNA。
[0026] 在一個實施方案中，所述經修飾的核酸分子可以包含至少一個修飾和一個可翻譯 區。在一些情況下，所述經修飾的核酸包含至少兩個修飾和一個可翻譯區。所述修飾可以 位於所述核酸分子的骨架和/或核苷上。所述修飾可以位於核苷與骨架鍵二者上。
[0027] 在一個實施方案中，修飾可以位於所述經修飾的核酸分子的骨架鍵上。所述骨架 鍵可以通過置換一個或多個氧原子而加以修飾。對所述骨架鍵的修飾可以包括用硫代磷酸 酯鍵置換至少一個磷酸二酯鍵。
[0028] 在一個實施方案中，修飾可以位於所述經修飾的核酸分子的核苷上。核苷上的修 飾可以位於所述核苷的糖上。對核苷的修飾可以在核苷上的2'位置發生。
[0029] 所述核苷修飾可以包括選自以下的化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、 2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、 3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假 尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺 酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫 代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿 苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫 代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲 基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、1-甲基-假 異胞苷、吡咯並-胞苷、吡咯並-假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫 代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脫氮-假異胞苷、1-甲 基-1-脫氮-假異胞苷、扎布拉林（zebularine)、5_氮雜-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、 5-氮雜-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞 苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-氨基嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、 脫氮-腺噪呤、7-脫氮_8_氮雜-腺噪呤、7-脫氮_2_氨基噪呤、7-脫氮_8_氮雜_2_氨 基嘌呤、7-脫氮-2, 6-二氨基嘌呤、7-脫氮-8-氮雜-2, 6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲 基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基）腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異 戊烯基）腺苷、N6-甘氨醯氨基甲醯腺苷、N6-蘇氨醯氨基甲醯腺苷、2-甲基硫代-N6-蘇氨 醯氨基甲醯腺苷、N6, N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺 嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷丁苷、7-脫氮-鳥苷、7-脫氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫 代 -鳥苷、硫代-7_脫氮-鳥苷、6-硫代_7_脫氮_8_氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫 代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2，N2-二甲 基鳥苷、8_氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫 代-鳥苷和N2, N2-二甲基-6-硫代-鳥苷。在另一個實施方案中，所述修飾是獨立地選自 5_甲基胞嘧啶、假尿苷和1-甲基假尿苷。
[0030] 在一個實施方案中，修飾可以位於所述經修飾的核酸分子的核鹼基上。核鹼基上 的修飾可以選自胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核鹼基上的修飾可以選自脫 氮-腺苷和脫氮-鳥苷，且連接子可以連接在所述脫氮-腺苷或脫氮-鳥苷的C-7或C-8 位置。經修飾的核鹼基可以選自胞嘧啶和尿嘧啶，且連接子可以在N-3或C-5位置連接到 經修飾的核鹼基。連接到核鹼基的連接子可以選自二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二 醇、四乙二醇、四乙二醇、二價烷基、烯基、炔基部分、酯、醯胺和醚部分。
[0031] 在一個實施方案中，核酸分子的兩個修飾可以位於所述經修飾的核酸分子的核苷 上。經修飾的核苷可以選自5-甲基胞嘧啶和假尿苷。
[0032] 在一個實施方案中，經修飾的核酸分子的兩個修飾可以位於核苷酸或核苷上。在 一個實施方案中，本公開提供了一種製劑，其包含如但不限於SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、 SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10等核酸分子和遞送劑。所述核酸分子可以包含長度為約160 個核苷酸的多聚腺苷酸尾。此外，所述核酸分子可以包含至少一個5'末端帽，如但不限於 0&卩0、0&口1、41^^、肌昔、1^1-甲基-鳥昔、2'-氣-鳥昔、7-脫氣-鳥昔、8-氧代-鳥昔、2-氛 基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。
[0033] 在一個實施方案中，本公開提供了具有SEQ ID N0:6的核酸、5'末端帽Capl、長度 為約160個核苷酸的多聚腺苷酸尾和遞送劑。
[0034] 在一個實施方案中，本公開提供了具有SEQ ID N0:7的核酸、5'末端帽Capl、長度 為約160個核苷酸的多聚腺苷酸尾和遞送劑。
[0035] 在一個實施方案中，本公開提供了具有SEQ ID N0:9的核酸、5'末端帽Capl、長度 為約160個核苷酸的多聚腺苷酸尾和遞送劑。
[0036] 在一個實施方案中，本公開提供了具有SEQ ID N0:10的核酸、5'末端帽Capl、長 度為約160個核苷酸的多聚腺苷酸尾和遞送劑。
[0037] 在一個實施方案中，所述遞送劑包含至少一種用以改良選自以下各項的遞送的方 法：類脂質、脂質體、脂質納米粒子、快速消除型脂質納米粒子（reLNP)、聚合物、脂質複合 物、肽、蛋白質、水凝膠、密封劑、化學修飾、綴合、細胞和增強子。可以用作遞送劑的類脂質、 脂質納米粒子和快速消除型脂質納米粒子可以包括可能選自以下各項的脂質：C12_200、 MDl、98N12-5、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、 聚乙二醇化脂質和其類似物。快速消除型脂質納米粒子可以在脂質鏈末端具有酯鍵，或酯 鍵可以是位於脂質鏈中的飽和碳的右側或左側的內部鍵。可以用作遞送劑的快速消除型脂 質納米粒子可以是但不限於DLin-MC3-DMA和DLin-DMA。
[0038] 在一個實施方案中，脂質納米粒子可以包含PEG和至少一種如但不限於膽固醇、 陽離子脂質和促融合脂質等組分。
[0039] 在一個實施方案中，脂質納米粒子可以包含PEG、膽固醇、陽離子脂質和促融合脂 質中的至少一者。
[0040] 在一個實施方案中，促融合脂質是二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC)。在另一個實施方 案中，PEG脂質是PEG-DMG。在又一個實施方案中，陽離子脂質可以是但不限於DLin-DMA、 DLin-MC3-DMA、C12-200、98N12-5 和 DLin-KC2-DMA。
[0041] 在一個實施方案中，脂質納米粒子組合物可以包含50摩爾％陽離子脂質、10摩 爾％ DSPC、1. 5摩爾％到3. 0摩爾％ PEG和37摩爾％到38. 5摩爾％膽固醇。
[0042] 在一個實施方案中，經修飾的核酸可以與PLGA -起配製以形成持續釋放製劑。在 另一個實施方案中，經修飾的核酸可以與PLGA和其它活性和/或非活性組分一起配製以形 成持續釋放製劑。在一個實施方案中，經修飾的核酸分子可以包括但不限於SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO:10。
[0043] 在一個實施方案中，持續釋放製劑可以包含持續釋放微球體。所述持續釋放微球 體的直徑可以為約10到約50um。在另一個實施方案中，所述持續釋放微球體可以含有約 0. 001重量％到約1. 0重量％的至少一種經修飾的核酸分子。
[0044] 在一個實施方案中，本發明的經修飾的核酸可以在3'未翻譯區（UTR)之前包括至 少一個終止密碼子。所述終止密碼子可以選自TGA、TAA和TAG。在一個實施方案中，本發 明的經修飾的核酸包括終止密碼子TGA和一個額外的終止密碼子。在另一個實施方案中， 所述額外的終止密碼子可以是TAA。在另一個實施方案中，本發明的經修飾的核酸包括三個 終止密碼子。
[0045] 在一個實施方案中，本公開提供了一種控制釋放製劑，其包含可以編碼目的多肽 的經修飾的核酸。所述經修飾的核酸可以囊封或基本上囊封在遞送劑中。所述遞送劑可以 塗布有、覆蓋有、環繞有、封圍有和/或包含一層聚合物、水凝膠和/或外科用密封劑。在另 一個實施方案中，所述控制釋放製劑可以包含第二層聚合物、水凝膠和/或外科用密封劑。
[0046] 在一個實施方案中，所述控制釋放製劑的遞送劑可以包括但不限於類脂質、脂質 體、脂質納米粒子、快速消除型脂質納米粒子、脂質複合物和自組裝脂質納米粒子。
[0047] 可用於控制釋放製劑中的聚合物可以包括但不限於PLGA、乙烯/乙酸乙烯酯共聚 物、泊洛沙姆和GELSITE?。可用於控制釋放製劑中的外科用密封劑可以包括但不限於纖 維蛋白原聚合物、TISSEELL?、基於PEG的密封劑和COSEAL?。
[0048] 在一個實施方案中，控制釋放製劑的遞送劑包含脂質納米粒子或快速消除型脂質 納米粒子遞送劑。在一個方面，脂質納米粒子或快速消除型脂質納米粒子可以塗布有、基本 上塗布有、覆蓋有、基本上覆蓋有、環繞有、基本上環繞有、封圍有、基本上封圍有和/或包 含一層聚合物、水凝膠和/或外科用密封劑。在另一個方面，所述遞送劑可以是脂質納米粒 子，其可以塗布有、基本上塗布有、覆蓋有、基本上覆蓋有、環繞有、基本上環繞有、封圍有、 基本上封圍有和/或包含一層PLGA。
[0049] 附圖簡述
[0050] 前述和其它目標、特徵和優點將從以下對本發明的特定實施方案的描述中顯而易 見，如附圖中所說明，其中在所有不同的視圖中，同樣的參考標號是指相同部分。這些圖未 必按比例繪製，而是將重點放在說明本發明的各個實施方案的原則上。
[0051] 圖1說明可用於本發明的現有技術的脂質結構。顯示了 98N12-5(TETA5-LAP)、 DLin-DMA、DLin-K-DMA(2, 2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊環）、 DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA 和 C12-200 的結構。
[0052] 圖2是可用於本文中所教示的IVT反應中的代表性質粒。所述質粒含有由本發明 的發明人設計的插入序列64818。
[0053] 圖3是囊封在PLGA微球體中的經修飾的mRNA的凝膠譜。
[0054] 發明詳述
[0055] 將核酸遞送到細胞中會有許多不希望有的複雜狀況，包括將核酸整合到靶細胞基 因組中可能導致表達水平不精確、核酸不利地被轉移到後代和相鄰細胞中，和有相當大的 造成突變的風險。本公開的經修飾的核酸分子能夠降低引入了所述經修飾的核酸分子的細 胞群體的固有免疫活性，因而提高該細胞群體中的蛋白質產生效率。此外，本文中描述了本 公開的核酸和蛋白質的一種或多種額外有利的活性和/或性質。
[0056] 另外，本文中提供了治療患有或疑似患有某種疾病、病症和/或病狀的受試者的 方法，所述方法包括以足以治療所述疾病、病症和/或病狀的量向需要所述治療的受試者 施用本文中所描述的組合物。
[0057] 除非另外定義，否則本文中所使用的所有技術和科學術語的含義都與本發明所屬 領域的技術人員通常所理解的含義相同。儘管與本文中所描述的方法和材料類似或等效的 方法和材料可以用於實施或測試本發明的特徵性方法，但下文描述合適的方法和材料。
[0058] 經修飾的核酸分子
[0059] 本公開提供了如本文中所描述的核酸，包括RNA，如mRNA，其含有一個或多個經修 飾的核苷或核苷酸（稱為"經修飾的核酸分子"、"經修飾的mRNA"或"經修飾的mRNA分子")。 對本發明的核酸分子的修飾可以具有有用的性質，包括但不限於引入了經修飾的mRNA的 細胞中的固有免疫反應顯著減小或對其缺乏實質性誘導。與未經修飾的核酸分子相比，經 修飾的核酸分子還可以展現升高的蛋白質產生效率、核酸的細胞內滯留和所接觸細胞的活 力，以及具有降低的免疫原性。
[0060] 提供了含有一個可翻譯區和一個、兩個或多於兩個不同的核苷修飾的經修飾的核 酸分子。用於本公開的示例性核酸包括核糖核酸（RNA)、脫氧核糖核酸（DNA)、蘇糖核酸 (TNA)、二醇核酸（GNA)、鎖核酸（LNA)或其雜交物。在優選實施方案中，經修飾的核酸分子 包括信使RNA (mRNA)。如本文中所描述，本公開的經修飾核酸分子可能基本上不會誘導引入 了所述經修飾的mRNA的細胞的固有免疫反應。在另一個實施方案中，與未經修飾的核酸相 t匕，經修飾的核酸分子可以在引入了所述經修飾的核酸分子的細胞中展現減少的降解。
[0061] 術語"核酸"包括已併入或可以併入寡核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質。根 據本公開使用的示例性核酸包括但不限於以下中的一項或多項：DNA、cDNA、RNA(包括信使 RNA(mRNA))、其雜交物、RNAi誘導劑、RNAi劑、siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、核糖酶、催化 DNA、誘導三螺旋形成的RNA、適體、載體等等。
[0062] 在某些實施方案中，需要使引入到細胞中的經修飾的核酸分子在細胞內降解。舉 例來說，如果需要蛋白質產生的精確定時，則將會需要使經修飾的核酸分子降解。因而，本 公開提供了一種含有降解域的經修飾的核酸分子，其能夠在細胞內以定向方式受作用。
[0063] 在一些實施方案中，經修飾的核酸分子可以在糖、核鹼基（例如在核鹼基的5'位 置）或磷酸酯骨架（例如用另一個部分，如硫代磷酸酯置換磷酸酯）上被化學修飾。在一 些實施方案中，所述修飾可能會破環大溝-結合伴侶相互作用，這可能會促成固有的免疫 反應。在一些實施方案中，相對於施用經修飾的核酸分子而不併入遞送劑，所述製劑組合 物在施用到受試者時可以改良經修飾的核酸分子的生物利用率、治療窗或分布體積。在 一些實施方案中，本發明的經修飾核酸分子的經修飾核苷和核苷酸可以使用國際公布號 W02012138530中所描述的0-經保護的化合物來合成，所述國際公布的內容是以全文引用 的方式併入本文中。
[0064] 在某些實施方案中，經修飾的核酸分子可以包含mRNA。在特定的實施方案中，經修 飾的mRNA(_RNA)可能來源於cDNA。在某些實施方案中，_RNA可以包含至少兩個核苷修 飾。在一個實施方案中，所述核苷修飾可以選自5-甲基胞啼陡和假尿苷。在另一個實施方 案中，所述核苷修飾中至少一個不是5-甲基胞嘧啶和/或假尿苷。在某些實施方案中，遞 送劑可以包含允許_RNA的局部化和全身性遞送的製劑。經修飾的核酸分子和/或_RNA 的製劑可以選自但不限於類脂質、脂質體和脂質納米粒子、快速消除型脂質納米粒子、聚合 物、脂質複合物、肽和蛋白質、至少一個化學修飾和綴合、增強子和/或細胞。
[0065] 在一個實施方案中，本發明的經修飾的核酸分子可以在3'未翻譯區（UTR)之前包 括至少兩個終止密碼子。所述終止密碼子可以選自TGA、TAA和TAG。在一個實施方案中， 本發明的核酸包括終止密碼子TGA和一個額外的終止密碼子。在另一個實施方案中，所述 額外的終止密碼子可以是TAA。在另一個實施方案中，經修飾的核酸分子可以包含三個終止 密碼子。
[0066] 在經修飾的核酸分子中，核酸的其它組分是任選的，但在一些實施方案中，這些組 分可能是有益的。
[0067] 未翻譯區（UTR)
[0068] 基因的未翻譯區（UTR)經過轉錄而未經翻譯。5'UTR開始於轉錄開始位點且延續 到起始密碼子，但不包括起始密碼子；而3' UTR在終止密碼子之後立即開始且一直延續到 轉錄終止信號為止。關於UTR在核酸分子的穩定性和翻譯方面所起的調控作用存在越來越 多的證據。UTR的調控特徵可以併入到本發明的經修飾mRNA分子中以增強所述分子的穩定 性。還可以併入特定的特徵以便確保轉錄物在其被誤導到不希望的器官部位的情況下的受 控下調。
[0069] 5' UTR和翻譯起始
[0070] 天然5'UTR具有在翻譯起始時起作用的特徵。它們擁有如Kozak序列等特徵序列， 通常已知這些特徵序列與核糖體起始許多基因的翻譯所經歷的過程有關。Kozak序列具有 一致CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID N0:1)，其中R是距起始密碼子（AUG)上遊三個鹼基的嘌呤 (腺嘌呤或鳥嘌呤），其後為另一個'G'。還已知5' UTR形成了與延長因子結合有關的二級 結構。
[0071] 通過對典型地在特定靶器官的豐富表達的基因中發現的特徵進行工程改造，我們 可以增強本發明的經修飾mRNA分子的穩定性和蛋白質產量。舉例來說，引入肝臟表達的 mRNA(如白蛋白、血清澱粉樣蛋白A、載脂蛋白A/B/E、轉鐵蛋白、α胎兒蛋白、促紅細胞生成 素或因子VIII)的5'UTR可以用來增強經修飾的核酸分子（如_RNA)在肝細胞系或肝臟 中的表達。同樣，對於肌肉（MyoD、肌球蛋白、肌紅蛋白、肌細胞生成素、生肌調節因子）、內 皮細胞（Tie-1、CD36)、骨髓細胞（C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CDllb、MSR、Fr-1、i-NOS)、 白細胞（〇)45、〇)18)、脂肪組織（〇)36、61^^'4、4〇^30、脂聯素）和肺上皮細胞（5?4/%/(：/ D)來說，使用來自於其它組織特異性mRNA的5' UTR來改良在該組織中的表達是有可能的。
[0072] 其它非UTR序列可以併入到本發明的經修飾核酸分子的5'UTR(或3'UTR)中。舉 例來說，內含子或部分內含子序列可以併入到本發明的經修飾mRNA的側翼區。併入內含子 序列可以增加蛋白質產量以及mRNA水平。
[0073] 3' UTR和富含AU的元件
[0074] 已知3' UTR中嵌入有腺苷㈧和尿苷⑶延伸段。這些富含AU的特徵在高轉換率 基因中特別普及。基於其序列特徵和功能性質，富含AU的元件（ARE)可以分成三類（Chen 等，1995):第I類ARE在富U區內含有AUUUA基序的若干個分散的拷貝。C-Myc和MyoD含 有第I類ARE。第II類ARE具有兩個或更多個重疊 UUAUUUA(U/A) (U/A) (SEQ ID N0:2)九 聚物。含有這種類型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。第III類ARE的定義不那麼明 確。這些富U區不含AUUUA基序。c-Jun和肌細胞生成素是這個類別中已得到充分研究的 兩個實例。已知與ARE結合的大部分蛋白質會使得信使不穩定，而已經記錄ELAV家族的成 員（最值得注意的是HuR)會增加 mRNA的穩定性。HuR結合所有三類ARE。將HuR特異性 結合位點工程改造到核酸分子的3'UTR中將引起HuR結合，且因而體內穩定信息。
[0075] 3'UTR富AU元件（ARE)的引入、去除或修飾可以用於調節本發明的經修飾的mRNA 的穩定性。當工程改造特定經修飾的mRNA時，可以引入ARE的一個或多個拷貝以使本發明 的經修飾的mRNA不太穩定，且從而縮減翻譯並且降低所得蛋白質的產量。
[0076] 同樣，可以鑑別ARE並將其去除或使其突變以增加細胞內穩定性且因而增加翻譯 和所得蛋白質的產量。轉染實驗可以在相關細胞系中使用本發明的經修飾的mRNA來進行， 且可以在轉染後在不同的時間點測定蛋白質產量。舉例來說，可以利用不同的ARE工程改 造分子且通過針對相關蛋白質使用ELISA試劑盒來轉染細胞，且在轉染後6小時、12小時、 24小時、48小時和7天測定所產生的蛋白質。
[0077] 併入微RNA結合位點
[0078] 微RNA (或miRNA)是19到25個核苷酸長的非編碼RNA，其結合核酸分子的3' UTR 且通過降低核酸分子穩定性或通過抑制翻譯來下調基因表達。本發明的經修飾的mRNA可 以包含一個或多個微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA種子。所述序列可能對應於任何已 知的微RNA，如美國公布US2005/0261218和美國公布US2005/0059005中所教示的那些，所 述美國公布的內容是以全文引用的方式併入本文中。
[0079] 微RNA序列包含"種子"區，即，成熟微RNA的位置2到8的區域中的序列，所述序 列與miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互補性。微RNA種子可以包括成熟微RNA的位 置2到8或2到7。在一些實施方案中，微RNA種子可以包含7個核苷酸（例如成熟微RNA 的核苷酸2到8)，其中對應miRNA靶的種子互補位點是通過與微RNA位置1相對的腺嘌呤 (A)側接。在一些實施方案中，微RNA種子可以包含6個核苷酸（例如成熟微RNA的核苷酸 2到7)，其中對應miRNA靶的種子互補位點是通過與微RNA位置1相對的腺嘌呤（A)側接。 參見例如 Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP ;Mol Cell. 2007年7月6日；27(1) :91-105 ;各自以全文引用的方式併入本文中。微RNA種子的 鹼基與靶序列具有完全互補性。通過將微RNA靶序列工程改造到本發明的經修飾的mRNA 的3' UTR中，我們可以靶向所述分子以便降解或減少翻譯，前提條件是所討論的微RNA是可 利用的。這一過程將降低在遞送核酸分子時發生脫靶效應的危險性。已經報導了微RNA、微 RNA祀區及其表達模式和在生物學中的作用的鑑別（Bonauer等，Curr Drug Targets2010 11:943-949 ;Anand 和 Cheresh Curr Opin Hematol2011 18:171-176 ;Contreras 和 Rao Leukemia2012 26:404-413(2011 年 12 月 20 日.doi:10.1038/leu. 2011.356) ;Bartel Cell2009 136:215-233 ;Landgraf 等，Cell, 2007 129:1401-1414 ;各自以全文引用的方式 併入本文中）。
[0080] 舉例來說，如果經修飾的核酸分子是經修飾的mRNA且並不意在遞送到肝臟但最 終到達那裡，則miR-122, 一種在肝臟中非常豐富的微RNA，可以在miR-122的一個或多個靶 位點被工程改造到經修飾的mRNA的3' UTR中的情況下抑制相關基因的表達。可以進行工 程改造以針對不同的微RNA引入一個或多個結合位點，以便進一步降低經修飾的核酸分子 和/或經修飾的mRNA的壽命、穩定性和蛋白質翻譯。
[0081] 如本文中所使用，術語"微RNA位點"是指微RNA靶位點或微RNA識別位點，或者微 RNA所結合或締合的任何核苷酸序列。應了解，"結合"可以遵循傳統的Watson-Crick雜交 規則，或可以體現微RNA與微RNA位點處或與微RNA位點相鄰的靶序列的任何穩定的締合。
[0082] 反之，出於本發明的經修飾的mRNA的目的，微RNA結合位點可以工程改造到其天 然存在的序列以外（即，從中去除），以便增加特定組織中的蛋白質表達。舉例來說，可以移 除miR-122結合位點以改良肝臟中的蛋白質表達。多個組織中的表達的調控可以通過引入 或去除一個或若干個微RNA結合位點來實現。
[0083] 已知微RNA調控mRNA且從而調控蛋白質表達的組織的實例包括但不限於：肝臟 (miR-122)、肌肉（miR-133、miR-206、miR-208)、內皮細胞（miR-17-92、miR-126)、髓樣細胞 (miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪組織（let-7、 miR-30c)、心臟（miR-ld、miR-149)、腎（miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮細胞（let-7、 miR-133、miR-126)。微RNA還可以調控複雜的生物學過程，如血管生成（miR-132)(Anand 和Cheresh Curr Opin Hematol2011 18:171-176;以全文引用的方式併入本文中）。在本 發明的經修飾的mRNA中，可以去除或引入與所述過程有關的微RNA的結合位點以便針對生 物學上相關的細胞類型或針對相關生物學過程的情形定製經修飾的mRNA的表達。
[0084] 最後，通過對微RNA在不同的細胞類型中的表達模式的理解，可以對經修飾的 mRNA進行工程改造以便在特定細胞類型中或僅在特定生物學條件下更具靶向性地表達。通 過引入組織特異性微RNA結合位點，可以設計將會對於某一組織中或生物學條件情形下的 蛋白質表達來說最佳的經修飾的mRNA。
[0085] 轉染實驗可以使用經工程改造的經修飾的mRNA在相關細胞系中進行，且可以在 轉染後在不同的時間點測定蛋白質產量。舉例來說，可以利用不同的微RNA結合位點工程 改造修飾的mRNA且通過針對相關蛋白質使用ELISA試劑盒來轉染細胞，且在轉染後6小 時、12小時、24小時、48小時、72小時和7天測定所產生的蛋白質。還可以使用微RNA結合 位點工程改造化的分子進行體內實驗，以檢查經配製的經修飾mRNA的組織特異性表達的 變化。
[0086] 5' 加帽
[0087] mRNA的5'帽結構參與核輸出，從而增加 mRNA穩定性，並且結合mRNA帽結合蛋白 (CBP)，所述mRNA CBP通過CBP與poly (A)結合蛋白締合以形成成熟環狀mRNA物質來負責 細胞中的mRNA穩定性和翻譯能力。所述帽還有助於在mRNA剪接期間去除5'近端內含子。
[0088] 內源性mRNA分子可以經過5'端加帽，從而在所述mRNA分子的末端鳥苷帽殘基與 5'末端轉錄有義核苷酸之間產生5'-ppp-5'-三磷酸酯鍵。然後，這一 5'鳥苷酸帽可以被 甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。mRNA的5'端的末端和/或前端轉錄的核苷酸的核 糖還可以任選地被2'-0-甲基化。通過鳥苷酸帽結構的水解和裂解進行的5'脫帽可以靶 向核酸分子（如mRNA分子）以便降解。
[0089] 對本發明的經修飾mRNA的修飾可以產生不可水解的帽結構，從而防止脫帽且因 而增加 mRNA半衰期。因為帽結構水解需要使5'-ppp-5'磷酸二酯鍵裂解，所以在加帽反應 期間可以使用經修飾的核苷酸。舉例來說，得自於New England Biolabs (Ipswich，MA)的牛 痘病毒加帽酶可以根據製造商說明書與α -硫代-鳥苷核苷酸一起使用，以便在5' -ppp-5' 帽中建立硫代磷酸酯鍵。可以使用其它經修飾的鳥苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代磷 酸核苷酸。
[0090] 其它修飾包括但不限於在糖環的2' -羥基上對mRNA的5'末端和/或5'前端核 苷酸的核糖進行2'-0-甲基化。可以使用多個獨特的5'帽結構來產生核酸分子（如mRNA 分子）的5'帽。
[0091] 帽類似物，在本文中也稱為合成帽類似物、化學帽、化學帽類似物或者結構或功能 帽類似物，在其化學結構上不同於天然（即，內源性、野生型或生理性）5'帽，不過保留了帽 功能。帽類似物可以用化學方式（即，非酶方式）或酶方式合成，和/或連接到核酸分子。
[0092] 舉例來說，抗-反向帽類似物（ARCA)帽含有由5'_5'_三磷酸酯基連接的兩個鳥 嘌呤，其中一個鳥嘌呤含有N7甲基以及3'-0-甲基（S卩，N7, 3'-0-二甲基-鳥苷-5'-三磷 酸酯-5'-鳥苷〇1^-3'111--?-6);其可以等效地稱為3'0, 61176(5'）？?？(5'）6)。另一個未 經修飾的鳥嘌呤的3' -0原子連接到經加帽的核酸分子（例如mRNA或mmRNA)的5'末端核 苷酸。N7-甲基化和3' -0-甲基化鳥嘌呤提供了經加帽的核酸分子（例如mRNA或_RNA) 的末端部分。
[0093] 另一個示例性帽為mCAP，其類似於ARCA但在鳥苷上具有2'-0-甲基（即， N7, 2' -0-二甲基-鳥苷-5' -三磷酸酯-5' -鳥苷，m7Gm-ppp-G)。
[0094] 儘管帽類似物允許核酸分子在體外轉錄反應中的伴隨性加帽，但多達20%的轉錄 物可能仍然未被加帽。此現象以及由內源性細胞轉錄機制產生的帽類似物與核酸內源性5' 帽結構的結構差異可能導致翻譯能力下降和細胞穩定性下降。
[0095] 本發明的經修飾的mRNA還可以在轉錄後使用酶進行加帽，以便產生更逼真的5' 帽結構。如本文中所使用，短語"更逼真的"是指某一特徵在結構上或功能上很能反映或模 擬內源性或野生型特徵。也就是說，與現有技術的合成特徵或類似物等相比，"更逼真的"特 徵更好地代表了內源性、野生型、天然的或生理的細胞功能和/或結構，或在一個或多個方 面的性能優於相應的內源性、野生型、天然的或生理的特徵。本發明的更逼真的5'帽結構 的非限制性實例為與本領域中已知的合成5'帽結構（或野生型、天然的或生理的5'帽結 構）相比尤其具有增強的帽結合蛋白結合、增加的半衰期、降低的5'核酸內切酶敏感性和/ 或減少的5'脫帽現象的5'帽結構。舉例來說，重組牛痘病毒加帽酶和重組2'-0-甲基轉移 酶可以在mRNA的5'末端核苷酸與鳥嘌呤帽核苷酸之間建立典型的5' -5' -三磷酸酯鍵，其 中所述帽鳥嘌呤含有N7甲基化且所述mRNA的5'末端核苷酸含有2'-0-甲基。所述結構稱 為Capl結構。這種帽產生較高翻譯能力和細胞穩定性且減少細胞促炎性細胞因子的活化， 例如與本領域中已知的其它5'帽類似物結構相比。帽結構包括但不限於7mG(5'）ppp(5'） N，pN2p(capO)、7mG(5,）ppp(5,）NlmpNp(capl)和 7mG(5,）-ppp(5,）NlmpN2mp(cap2)。
[0096] 因為經修飾的mRNA可以在轉錄後被加帽，且因為這個過程更有效，所以可以將幾 乎100%的經修飾mRNA加帽。這與當帽類似物在體外轉錄反應過程中連接到mRNA時的約 80 %形成對照。
[0097] 根據本發明，5'末端帽可以包括內源性帽或帽類似物。根據本發明，5'末端帽可 以包含鳥嘌呤類似物。可用的鳥嘌呤類似物包括但不限於肌苷、N1-甲基-鳥苷、2' -氟-鳥 苷、脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-氨基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。
[0098] 病毒序列
[0099] 其它病毒序列，如但不限於大麥黃矮病病毒（BYDV-PAV)的翻譯增強子序列，可以 經工程改造並插入本發明的經修飾的mRNA的3'UTR中，並且可以在體外和體內刺激所述 mRNA的翻譯。可以在相關細胞系中進行轉染實驗，且在轉染後12小時、24小時、48小時、72 小時和第7天，可以利用ELISA測定蛋白質產量。
[0100] IRES 序列
[0101] 此外，提供了可能含有內部核糖體進入位點（IRES)的經修飾的mRNA。IRES最初 被鑑別為細小的核糖核酸病毒RNA的特徵，它在不存在5'帽結構的情況下引發蛋白質合成 方面起重要作用。IRES可以充當唯一核糖體結合位點，或可以充當mRNA的多個核糖體結合 位點之一。含有超過一個功能性核糖體結合位點的經修飾的mRNA可以編碼若干種由核糖 體獨立地翻譯的肽或多肽（"多順反子核酸分子")。當經修飾的mRNA具備有IRES時，還任 選地提供第二可翻譯區。可根據本發明使用的IRES序列的實例包括但不限於得自於小核 糖核酸病毒（例如FMDV)、害蟲病毒（CFFV)、脊髓灰質炎病毒（PV)、腦心脊炎病毒（ECMV)、 口蹄疫病毒（FMDV)、C型肝炎病毒（HCV)、經典豬瘟病毒（CSFV)、鼠類白血病病毒（MLV)、猴 免疫缺陷病毒（SIV)或蟋蟀麻痺病毒（CrPV)的IRES序列。
[0102] 多聚腺苷酸尾
[0103] 在RNA加工期間，可以將腺嘌呤核苷酸的長鏈（多聚腺苷酸尾）加入到經修飾的 核酸分子（如經修飾的mRNA分子）中以便增加穩定性。在轉錄後可以立即裂解轉錄物的 3'端以釋放3'羥基。然後多聚腺苷酸聚合酶將腺嘌呤核苷酸鏈加入到RNA中。所述過程 稱為聚腺苷酸化，加入了多聚腺苷酸尾，所述多聚腺苷酸尾的長度可以介於例如約100與 250個殘基之間。
[0104] 已經發現，獨特的多聚腺苷酸尾長度為本發明的經修飾的mRNA提供了某些優點。
[0105] 一般來說，本發明的多聚腺苷酸尾的長度多於30個核苷酸。在另一個實施方案 中，多聚腺苷酸尾的長度多於35個核苷酸（例如至少或多於約35、40、45、50、55、60、70、 80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1，000、 1，100、1，200、1，300、1，400、1，500、1，600、1，700、1，800、1，900、2, 000、2, 500 和 3, 000 個核 苷酸）。在一些實施方案中，經修飾的mRNA包括約30到約3, 000個核苷酸（例如30到 50、30 到 100、30 到 250、30 到 500、30 到 750、30 到 1，000、30 到 1，500、30 到 2, 000、30 到 2, 500、50 到 100、50 到 250、50 到 500、50 到 750、50 到 1，000、50 到 1，500、50 到 2, 000、50 到 2, 500、50 到 3, 000、100 到 500、100 到 750、100 到 1，000、100 到 1，500、100 到 2, 000、100 到 2, 500、100 到 3, 000、500 到 750、500 到 1，000、500 到 1，500、500 到 2, 000、500 到 2, 500、500 至IJ 3, 000、1，000 到 1，500、1，000 到 2, 000、1，000 到 2, 500、1，000 到 3, 000、1，500 到 2, 000、 1，500 到 2, 500、1，500 到 3, 000、2, 000 到 3, 000、2, 000 到 2, 500 和 2, 500 到 3, 000)。
[0106] 在一個實施方案中，相對於整個經修飾的mRNA的長度設計多聚腺苷酸尾。這一設 計可以基於編碼區的長度、特定特徵或區域（如側翼區）的長度或基於由經修飾的mRNA表 達的最終產物的長度。
[0107] 在這種情形下，多聚腺苷酸尾的長度可能比經修飾的mRNA、其區域或特徵的大 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。多聚腺苷酸尾還可以設計為 其所屬經修飾mRNA的一部分。在這種情形下，多聚腺苷酸尾可以是所述分子的總長度或所 述分子減去所述多聚腺苷酸尾後的總長度的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或90 %或更多。此外，經工程改造的結合位點和經修飾的mRNA與多聚腺苷酸結合蛋白的綴 合可以增強表達。
[0108] 另外，多個不同的經修飾的mRNA可以使用經修飾的核苷酸在多聚腺苷酸尾的3' 末端經由3'端一起連接到PABP(多聚腺苷酸結合蛋白）。可以在相關細胞系中進行轉染實 驗，且在轉染後12小時、24小時、48小時、72小時和第7天，可以利用ELISA測定蛋白質產 量。
[0109] 在一個實施方案中，對本發明的經修飾的mRNA進行設計而包括polyA-G四聯體。G 四聯體是四個鳥嘌呤核苷酸的環狀氫鍵鍵結陣列，其可以由DNA和RNA中的富G序列形成。 在這個實施方案中，G四聯體被併入多聚腺苷酸尾的末端。在不同的時間點測定所得_RNA 分子的穩定性、蛋白質產量和其它參數，包括半衰期。已經發現，P〇lyA-G四聯體使得蛋白質 產量相當於單獨使用具有120個核苷酸的多聚腺苷酸尾時所見的蛋白質產量的至少75%。
[0110] 修飾
[0111] 本發明的經修飾的核酸和經修飾的mRNA(_RNA)可以含有一個、兩個或更多個不 同的修飾。在一些實施方案中，經修飾的核酸和_RNA可以含有一個、兩個或更多個不同的 核苷或核苷酸修飾。在一些實施方案中，引入到細胞中的經修飾的核酸或mmRNA (例如具有 一個或多個_RNA分子）與未經修飾的核酸或_RNA相比可以在所述細胞中展現減少的降 解。
[0112] 經修飾的核酸和_RNA可以包括任何可用的修飾，如對糖、核鹼基（例如對核鹼基 的一個或多個修飾，如通過用任選地經取代的氨基、任選地經取代的硫醇基、任選地經取代 的烷基（例如甲基或乙基）或滷基（例如氯基或氟基）置換或取代嘧啶核鹼基的原子）或 核苷間鍵（例如對磷酸二酯骨架的一個或多個修飾）的修飾。在某些實施方案中，修飾存 在於糖與核苷間鍵二者中（例如一個或多個修飾，如存在於核糖核酸（RNA)、脫氧核糖核酸 (DNA)、蘇糖核酸（TNA)、二醇核酸（GNA)、肽核酸（PNA)、鎖核酸（LNA)或其雜交物中）。本 文中描述了其它修飾。
[0113] 如本文中所描述，本發明的經修飾的核酸和mmRNA基本上不會誘導引入了所述 mRNA的細胞的固有免疫反應。在某些實施方案中，可能需要使引入到所述細胞中的經修飾 的核酸分子或經修飾的核酸分子在細胞內降解。舉例來說，如果需要蛋白質產生的精確定 時，則可能優選使經修飾的核酸分子或經修飾的mRNA降解。因而，在一些實施方案中，本發 明提供了一種含有降解域的經修飾的核酸分子，其能夠在細胞內以定向方式受作用。在另 一個方面，本公開提供了包含可以破壞大溝相互作用（例如結合）伴侶與核酸的結合（例 如在與未經修飾的核苷酸相比，經修飾的核苷酸與大溝相互作用伴侶的結合親和力有所降 低的情況下）的核苷或核苷酸的核酸。
[0114] 經修飾的核酸和_RNA可以任選地包括其它試劑（例如RNAi誘導劑、RNAi劑、 siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、核糖酶、催化性DNA、tRNA、誘導三螺旋形成的RNA、適體、載 體等）。在一些實施方案中，經修飾的核酸或_RNA可以包括一種或多種信使RNA (mRNA)和 一種或多種經修飾的核苷或核苷酸（例如mmRNA分子）。這些經修飾的核酸和_RNA的詳 情如下。
[0115] 經修飾的核酸
[0116] 本發明的經修飾的核酸或_RNA可以包括編碼目的多肽的連接核苷的第一區、位 於所述第一區的5'末端的第一側翼區和位於所述第一區的3'末端的第二側翼區。
[0117] 在一些實施方案中，經修飾的核酸或_RNA包括η個具有式（la)或式（Ia-Ι)的 連接核苷：
[0118]
【權利要求】
1. 一種在哺乳動物細胞或組織中產生目的多肽的方法，所述方法包括使所述哺乳動物 細胞或組織與包含編碼所述目的多肽的經修飾的mRNA的製劑接觸，其中所述製劑是選自： 納米粒子、聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物（PLGA)微球體、類脂質、脂質複合物、脂質體、聚合 物、碳水化合物（包括單糖）、陽離子脂質、纖維蛋白凝膠、纖維蛋白水凝膠、纖維蛋白膠、纖 維蛋白密封劑、纖維蛋白原、凝血酶、快速消除型脂質納米粒子（reLNP)和其組合。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述經修飾的mRNA包含經純化的IVT轉錄物。
3. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑是納米粒子且其 中所述納米粒子包含至少一種脂質。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述脂質是選自：DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、 C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG 和聚乙二醇化脂質。
5. 如權利要求3所述的方法，其中所述脂質是陽離子脂質。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述陽離子脂質是選自：DLin-DMA、DLin-K-DMA、 DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA 和 DODMA。
7. 如權利要求3所述的方法，其中所述脂質與所述經修飾的mRNA的重量比介於10:1 與30:1之間。
8. 如權利要求7所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑的平均 尺寸介於60與225nm之間。
9. 如權利要求8所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑的Η)Ι 介於0.03與0. 15之間。
10. 如權利要求3所述的方法，其中所述脂質在pH7. 4下的ζ電位為-10到+10。
11. 如權利要求7所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑還包 含促融合脂質、膽固醇和PEG脂質。
12. 如權利要求11所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述納米粒子製劑具有 摩爾比為50:10:38. 5:1. 5-3. 0的陽離子脂質：促融合脂質：膽固醇：PEG脂質。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述PEG脂質是選自PEG-c-DOMG和PEG-DMG且所 述促融合脂質是DSPC。
14. 如權利要求1所述的方法，其中接觸是通過使用選自注射泵、內部滲透泵和外部滲 透泵的裝置來進行。
15. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑是聚（乳酸-羥 基乙酸）共聚物（PLGA)微球體。
16. 如權利要求15所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述PLGA微球體製劑 的微球體尺寸介於4與20 μ m之間。
17. 如權利要求15所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述PLGA微球體製劑 在48小時的時間段內釋放不到50%的所述經修飾的mRNA。
18. 如權利要求15所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述PLGA微球體製劑 在血清中是穩定的。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述穩定性是在90%血清中相對於未經配製的經 修飾的mRNA而測定。
20. 如權利要求15所述的方法，其中負載重量百分比為至少0. 05%、至少0. 1 %、至少 0. 2%、至少0. 3%或至少0. 4%。
21. 如權利要求15所述的方法，其中所述經修飾的mRNA在所述PLGA微球體中的囊封 效率為至少50%。
22. 如權利要求15所述的方法，其中所述經修飾的mRNA在所述PLGA微球體中的囊封 效率為至少70%。
23. 如權利要求15所述的方法，其中所述經修飾的mRNA在所述PLGA微球體中的囊封 效率為至少90%。
24. 如權利要求15所述的方法，其中所述經修飾的mRNA在所述PLGA微球體中的囊封 效率為至少97%。
25. 如權利要求11所述的方法，其中接觸所述哺乳動物細胞或組織是經由選自靜脈 內、肌肉內、玻璃體內、鞘內、腫瘤內、肺和皮下的施用途徑而發生。
26. 如權利要求25所述的方法，其中在接觸後在血清中可檢測到所述目的多肽持續長 達72小時，其水平高於接觸前的水平。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述目的多肽可在雌性受試者的血清中檢測到， 其水平高於雄性受試者的血清中的水平。
28. 如權利要求1所述的方法，其中所述製劑還包含第二經修飾的mRNA。
29. 如權利要求28所述的方法，其中所述製劑還包含第三經修飾的mRNA。
30. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑包括快速消除 型脂質納米粒子。
31. 如權利要求30所述的方法，其中所述快速消除型脂質納米粒子包含reLNP脂質、促 融合脂質、膽固醇和PEG脂質，其摩爾比為50:10:38. 5:1. 5 (reLNP脂質：促融合脂質：膽 固醇：PEG脂質）。
32. 如權利要求31所述的方法，其中所述促融合脂質是DSPC且所述PEG脂質是 PEG-c-DOMG。
33. 如權利要求31所述的方法，其中所述reLNP脂質是選自：具有內酯的DLin-DMA、具 有末端酯的DLin-DMA、具有內酯的DLin-MC3-DMA和具有末端酯的DLin-MC3-DMA。
34. 如權利要求30所述的方法，其中總脂質與經修飾的mRNA的重量比介於10:1與 30:1之間。
35. 如權利要求1所述的方法，其中接觸是使用分割給藥方案經由注射而發生。
36. 如權利要求35所述的方法，其中所述注射是對選自真皮內空間、表皮、皮下組織和 肌肉的組織進行。
37. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑包含纖維蛋白 密封劑。
38. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑包含類脂質且 其中所述脂質是選自C12-200和98N12-5。
39. 如權利要求1所述的方法，其中包含所述經修飾的mRNA的所述製劑是聚合物且所 述聚合物塗布有、覆蓋有、環繞有、封圍有或包含一層水凝膠或外科用密封劑。
40. 如權利要求39所述的方法，其中所述聚合物是選自PLGA、乙烯/乙酸乙烯酯共聚 物、泊洛沙姆和GELSITE?。
41. 如權利要求40所述的方法，其還包括另一層聚合物、水凝膠或外科用密封劑。
42. 如權利要求2所述的方法，其中所述經修飾的mRNA包含選自以下的至少一個5'末 端帽：CapO、Capl、ARCA、肌苷、N1-甲基-鳥嘌呤核苷、2' -氟-鳥嘌呤核苷、7-脫氮-鳥嘌 呤核苷、8_氧代-鳥嘌呤核苷、2-氨基-鳥嘌呤核苷、LNA-鳥嘌呤核苷和2-疊氮基-鳥嘌 呤核苷。
43. 如權利要求42所述的方法，其中所述5'末端帽是Capl。
44. 如權利要求43所述的方法，其中所述經修飾的mRNA包含至少兩個修飾。
45. 如權利要求44所述的方法，其中所述至少兩個修飾是獨立地選自：5_甲基胞苷、假 尿苷和1-甲基-假尿苷。
46. -種在哺乳動物細胞或組織中產生目的多肽的方法，所述方法包括使所述哺乳動 物細胞或組織與包含編碼所述目的多肽的經修飾的mRNA的緩衝劑製劑接觸。
47. 如權利要求46所述的方法，其中所述緩衝劑製劑是選自：生理鹽水、磷酸鹽緩衝生 理鹽水和林格氏乳酸鹽。
48. 如權利要求46所述的方法，其中所述緩衝劑製劑所包含的鈣濃度介於1到10mM之 間。
49. 如權利要求46所述的方法，其中所述經修飾的mRNA包含經純化的IVT轉錄物。
50. 如權利要求46所述的方法，其中接觸所述哺乳動物細胞或組織是經由選自靜脈 內、肌肉內、玻璃體內、鞘內、腫瘤內、肺和皮下的施用途徑而發生。
51. 如權利要求25或50所述的方法，其中所述目的多肽是在所述細胞或組織中從接觸 位置起在整體位置上產生。
52. 如權利要求51所述的方法，其中所述施用途徑是經由肌肉內或皮下的途徑。
53. 如權利要求3所述的方法，其中還在密封劑中配製所述脂質納米粒子製劑。
54. 如權利要求53所述的方法，其中所述密封劑是纖維蛋白密封劑。
55. -種在靈長類動物中產生藥理學作用的方法，所述方法包括使所述靈長類動物與 包含經配製的編碼目的多肽的經修飾的mRNA的組合物接觸。
56. 如權利要求55所述的方法，其中所述經修飾的mRNA包含經純化的IVT轉錄物。
57. 如權利要求56所述的方法，其中所述製劑是選自：納米粒子、聚（乳酸-羥基乙酸） 共聚物（PLGA)微球體、類脂質、脂質複合物、脂質體、聚合物、碳水化合物（包括單糖）、陽離 子脂質、纖維蛋白凝膠、纖維蛋白水凝膠、纖維蛋白膠、纖維蛋白密封劑、纖維蛋白原、凝血 酶、快速消除型脂質納米粒子（reLNP)和其組合。
58. 如權利要求57所述的方法，其中所述藥理學作用大於與已知可產生所述藥理學作 用的治療劑相關的藥理學作用。
59. 如權利要求57所述的方法，其中所述藥理學作用大於由包含未經配製的編碼所述 目的多肽的經修飾mRNA的組合物所產生的藥理學作用。
60. 如權利要求57所述的方法，其中所述藥理學作用大於由包含經配製的編碼所述目 的多肽的未經修飾的mRNA的組合物所產生的藥理學作用。
61. 如權利要求57所述的方法，其中所述藥理學作用對疾病、病症、病狀或感染產生在 治療上有效的結果。
62. 如權利要求61所述的方法，其中所述藥理學作用是選自：細胞計數變化、血清化學 性質變化、酶活性變化、血紅蛋白增加和紅細胞壓積增加。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述在治療上有效的結果是選自：治療、改善一種 或多種症狀、診斷、預防和延遲發作。
【文檔編號】C07H21/02GK104114572SQ201280069609
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月14日 優先權日:2011年12月16日
【發明者】安東寧·德富熱羅勒, K·M·伍德, S·M·伊巴希爾, 努巴爾·B·埃非揚, P·瓦倫西亞, 傑森·P·斯洛姆 申請人:現代治療公司