一種蝶豆的組織培養方法

2023-12-04 13:30:51 2

一種蝶豆的組織培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種蝶豆的組織培養方法，該方法包括以下步驟：種子無菌萌發、初代培養、愈傷組織分化、生根培養和煉苗移栽。本發明的方法用於蝶豆的組織培養，具有繁殖速度快、繁殖係數大，繁殖後代整齊一致，移栽成活率高的優點。
【專利說明】一種蝶豆的組織培養方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及植物組織培養【技術領域】，具體的是一種蝶豆的組織培養方法。

【背景技術】
[0002]蝶豆(Clitoria ternatea L.)，又名藍蝴蝶，藍花豆，蝴蝶花豆，系蝶形花科(Papil1naceae)蝶豆屬(Clitoria)植物,原產印度、印度尼西亞等地,在世界熱帶和亞熱帶地區廣泛栽培。蝶豆具有廣泛的經濟價值，花可提取天然染料；嫩夾可食用；根可入藥；此外，蝶豆還可調製成乾草，用作飼料，尤其是近年來蝶豆作為庭園觀賞植物，廣泛用於園林植物造景配置中。
[0003]目前關於蝶豆的研究極少，國內的研究領域主要涉及一些特性的簡單描述，以及種子萌發和栽培技術的研究。蝶豆種子的發芽率普遍較低，採用常規的種子繁殖方法速度慢。組織培養技術具有繁殖速度快、繁殖係數大，繁殖後代整齊一致，能保持原有品種的優良性狀，不受季節的限制等優點，已廣泛應用各種觀賞植物中，目前尚未見有應用於蝶豆上。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種蝶豆的組織培養方法，解決了蝶豆因種子發芽率較低而繁殖速度慢的問題。本發明的方法用於蝶豆快速繁殖，具有繁殖速度快、繁殖係數大，繁殖後代整齊一致，移栽成活率高的優點。
[0005]本發明所提供的技術方案是:
[0006]一種蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟:
[0007](I)種子無菌萌發:選用飽滿的蝶豆種子，經自來水衝洗、酒精滅菌、無菌水衝洗、升汞滅菌、無菌水衝洗和催芽處理，然後播種，種子萌發出小苗；
[0008](2)初代培養；將種子萌發後小苗的下胚軸切成長為5-10mm的小段，然後接種在改良MS培養基上，得到愈傷組織；
[0009](3)愈傷組織分化:將獲得的愈傷組織切成0.5cmX0.5cm的小塊，然後接種在含有6-BA和NAA的改良MS培養基上，得到組培小苗；
[0010](4)生根培養:當組培小苗長至高約2.0-4.0cm時，轉接在含有IBA的改良MS培養基或者含有IBA的改良1/2MS培養基上，得到生根組培苗；
[0011](5)煉苗及移栽:將生根組培苗置於室溫下煉苗ld，然後除去瓶蓋再煉苗l-2d，洗去殘餘培養基，並將生根組培苗用50%多菌靈可溼性粉劑稀釋800-1000倍或者0.5%高錳酸鉀溶液浸泡1min後移栽至基質中。
[0012]其中，步驟(I)中所述播種，是將種子接入改良MS培養基中或播入經過滅菌處理保持溼潤的沙子中。
[0013]其中，步驟(2)中所述改良MS培養基:是將MS培養基中的大量元素增加至20倍，以6.7g/L的無水CaCl2替代8.8g/L的CaCl2.2H20，將MS培養基中的微量元素增加至200倍，以 0.0032g/L 的 CuSO4 替代 0.005g/L 的 CuSO4 *5H20,MnSO4.4Η20 的用量改為為 3.38g/L，並以自來水替代去離子水，蔗糖為20g/L，瓊脂3.5-4.0g/L，其餘成分及用量不變，PH值為 5.8-6.0。
[0014]其中，步驟(3)中所述含有不同濃度6-BA和NAA的改良MS培養基為MS+6-BA0.1-1.0mg/L+NAA0.01-0.lmg/L。
[0015]其中，步驟(4)中所述所述改良1/2MS培養基:是在步驟⑵所述的改良MS培養基的基礎上，將大量元素減至改良MS培養基中的1/2，蔗糖為10g/L，其餘成分及用量與改良MS保持一致；所述含有IBA的改良MS培養基為MS+IBA0.1-0.3mg/L ;所述含有IBA的改良 1/2MS 培養基為 1/2MS+IBA0.1-0.3mg/L。
[0016]其中，步驟(4)中所述生根組培苗，為真葉已長出，主根約有3-4條，根長約為
2.5-4.5cm 的苗。
[0017]其中，步驟(5)中所述移栽，是將生根組培苗移栽至50-72孔育苗穴盤中，穴盤的尺寸為540mmX 280mm，該穴盤中裝有基質。
[0018]作為優選，所述基質是由按體積比泥炭:珍珠巖=2:1所組成，其PH值為6.0_7.0 ο
[0019]作為優選，所述基質在移栽前I周需要用800-1000倍的多菌靈可溼性粉劑稀釋液或0.5%高錳酸鉀溶液進行消毒。
[0020]本發明的有益.效果
[0021]本發明的方法用於蝶豆組織培養，具有繁殖速度快、繁殖係數大，繁殖後代整齊一致，移栽成活率高的優點。

【具體實施方式】
[0022]下面結合具體例對本發明作進一步詳細的說明。
[0023]實施例1:
[0024]2012年7月2日，選用飽滿的蝶豆種子，自來水衝洗後，先用75%的酒精滅菌40s，無菌水衝洗3遍，再用0.1 %升汞滅菌lOmin，用無菌水衝洗3遍後進行催芽。催芽用50°C無菌水浸種15min後置於室溫下24h。然後接入改良MS培養基中並置於組培室中，溫度28±2°C，光照每天12h。
[0025]經過一段時間觀察，於7月17日進行統計:種子在第5d開始萌發，汙染率為0，萌發率為36.7%。7月25日將種子萌發後的小苗(子葉已展開)的上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段切成長為5mm的小段，分別接種於改良的MS培養基上。
[0026]經過一段時間觀察，於9月10日統計:上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段在改良MS培養基上均可直接從基部誘導出愈傷組織，愈傷組織在第15d開始形成，愈傷組織誘導率為100%，愈傷組織質地酥鬆，顏色為淡黃色。
[0027]9月22日將獲得的愈傷組織切成0.5cmX0.5cm大小，接種到附加了不同激素種類和濃度的改良MS培養基上，發現不同部位的愈傷組織分化能力不同，上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段的愈傷組織分化能力從高到低的順序為:下胚軸、上胚軸和帶子葉莖段的愈傷分化率分別為81^^20%和0%。愈傷組織分化的最佳培養基為:改良MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L,增殖係數達4.5，同時愈傷組織在繼續變大，質地酥鬆，分化出的小苗長勢好，健壯。愈傷組織分化所需時間約25-30d。當組培苗長至高約2.0-3.5cm時，轉接於附加了不同濃度的6-BA和NAA的改良培養基中，結果為:最佳生根培養基為MS+IBA0.lmg/L,生根率100%，小苗長勢好，主根平均數為3.5條，主根平均長度3.5cm，根系白色，部分偏黃，有少量鬚根。生根時間需要1cL
[0028]將生根良好的小苗(真葉已長出，主根有3條，根長約為4.5cm)置於室溫下煉苗ld，然後除去瓶蓋再煉苗ld，洗去殘餘培養基，並將小苗用1000倍多菌靈浸泡1min後，移栽入裝有基質的50孔育苗穴盤中(基質體積比為泥炭:珍珠巖=2:1，PH = 7.0)。並澆透定根水，置於全光照間歇式噴灌系統中養護管理。白天每間隔4h噴霧I次，7d後即可正常生長，成活率100%。
[0029]實施例2:
[0030]2012年7月2日，選用飽滿的蝶豆種子，自來水衝洗後，先用70%的酒精滅菌30s，無菌水衝洗4遍，再用0.1 %升汞滅菌lOmin，用無菌水衝洗4遍後進行催芽。催芽用60°C無菌水浸種15min後置於室溫下24h。然後播入經過滅菌的溼潤沙子中(種子萌發過程中，沙子要保持溼潤，但不能有積水)，並置於組培室中，溫度28±2°C，光照每天12h。
[0031]經過一段時間觀察，於7月17日進行統計:種子在第7d開始萌發，汙染率為0，萌發率為27.27%。7月25日將種子萌發後的小苗(子葉已展開)的上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段切成長為1mm的小段，分別接種於改良的MS培養基上。
[0032]經過一段時間觀察，於9月10日統計:上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段在改良MS培養基上均可直接從基部誘導出愈傷組織，愈傷組織在第15d開始形成，愈傷組織誘導率為100%，愈傷組織質地酥鬆，顏色為淡黃色。
[0033]9月22日將獲得的愈傷組織切成0.5cmX0.5cm大小，接種到附加了不同激素種類和濃度的改良MS培養基上，發現不同部位的愈傷組織分化能力不同，上胚軸、下胚軸和帶子葉莖段的愈傷組織分化能力從高到低的順序為:下胚軸、上胚軸和帶子葉莖段的愈傷組織分化率分別為70%、25%和0%。愈傷組織分化的最佳培養基為:改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L,增殖係數達4.0,同時愈傷組織在繼續變大，質地酥鬆，分化出的小苗長勢好，健壯。愈傷組織分化所需時間約25-30d。當組培苗長至高約2.0-3.5cm時，轉接於附加了不同濃度的6-BA和NAA的改良培養基中。結果發現:最佳生根培養基為1/2MS+IBA0.2mg/L,生根率100%，小苗長勢好，主根平均數為3.9條，主根平均長度4.1cm,根系白色，部分偏黃，有少量鬚根。生根時間需要12d。
[0034]將生根良好的小苗(真葉已長出，主根約有3條，根長約為3.5cm)置於室溫下煉苗ld，然後除去瓶蓋再煉苗ld，洗去殘餘培養基，並將小苗用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡1min後，移栽入裝有基質的50孔育苗穴盤中(基質按照體積比為泥炭:珍珠巖=2:1所組成，PH = 6.5)。並澆透定根水，置於全光照間歇式噴灌系統中養護管理。白天每間隔4h噴霧I次，1d後即可正常生長，成活率100%。
[0035]上述實施例中所涉及的公式如下:
[0036]汙染率)=汙染數/接種數X 100% ;
[0037]種子萌發率)=萌發數/接種數X 100% ;
[0038]愈傷組織誘導率(％ )=產生愈傷組織數/接種數X 100% ；
[0039]愈傷組織分化率(％ )=發生愈傷組織分化數/接種數X 100% ；
[0040]增殖係數=(增殖數+接種數)/接種數；
[0041]生根率(％ )=生根數/接種數X 100% ；
[0042]成活率)=成活的數量/總數量X 100%。
[0043]前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述並非想將本發明限定為所公開的精確形式，並且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在於解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現並利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的範圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。
【權利要求】
1.一種蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟: (1)種子無菌萌發:選用飽滿的蝶豆種子，經自來水衝洗、酒精滅菌、無菌水衝洗、升汞滅菌、無菌水衝洗和催芽處理，然後播種，種子萌發出小苗； (2)初代培養；將種子萌發後小苗的下胚軸切成長為5-10皿的小段，然後接種在改良18培養基上，得到愈傷組織； (3)愈傷組織分化:將獲得的愈傷組織切成0.5(311^0.50111的小塊，然後接種在含有6-8八和嫩八的改良13培養基上，得到組培小苗； (4)生根培養:當組培小苗長至高約2.0-4.00111時，轉接在含有18八的改良13培養基或者含有18八的改良1/213培養基上，得到生根組培苗； (5)煉苗及移栽:將生根組培苗置於室溫下煉苗1山然後除去瓶蓋再煉苗1-2(1，洗去殘餘培養基，並將生根組培苗用50%多菌靈可溼性粉劑稀釋800-1000倍或者0.5%高錳酸鉀溶液浸泡10111111後移栽至基質中。
2.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(1)中所述播種，是將種子接入改良13培養基中或播入經過滅菌處理保持溼潤的沙子中。
3.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(2)中所述改良13培養基:是將13培養基中的大量元素增加至20倍，以6.7^/1的無水0^12替代8.8^/1的 ?2！！20，將13培養基中的微量元素增加至200倍，以0.0032^/1的。304替代0.005^/I的。304 ? 5！！20，111304 ?祖20的用量改為3.388凡，並以自來水替代去離子水，蔗糖為2(^/1,瓊脂3.5?4.0^/1,其餘成分及用量不變，？！！值為5.8-6.0。
4.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(3)中所述含有不同濃度6-8八和嫩八的改良13培養基為13+6-840.1-1.0呢/1+嫩八0.01-0.1呢/1。
5.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(4)中所述所述改良1/218培養基:是在步驟(2)所述的改良13培養基的基礎上，將大量元素減至改良13培養基中的1/2，蔗糖為108/1，其餘成分及用量與改良13保持一致；所述含有18八的改良13培養基為13+1840.1-0.3呢/1 ；所述含有18八的改良1/213培養基為1/213+18八0.1-0.3^/匕
6.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(4)中所述生根組培苗，為真葉已長出，主根約有3-4條，根長約為2.5-4.50111的苗。
7.如權利要求1所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，步驟(5)中所述移栽，是將生根組培苗移栽至50-72孔育苗穴盤中，穴盤的尺寸為540111111X280111111，該穴盤中裝有基質。
8.如權利要求7所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，所述基質是由按體積比泥炭:珍珠巖=2:1所組成，其值為6.0-7.0。
9.如權利要求7或8所述蝶豆的組織培養方法，其特徵在於，所述基質在移栽前1周需要用800-1000倍的多菌靈可溼性粉劑稀釋液或0.5%高錳酸鉀溶液進行消毒。
【文檔編號】A01H4/00GK104304033SQ201410628076
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】閆海霞, 卜朝陽, 盧家仕, 黃昌豔, 何荊洲, 王曉國 申請人:廣西壯族自治區農業科學院花卉研究所