乳腺癌早期診斷試劑盒的製作方法

2023-12-04 19:13:26 2

本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種乳腺癌早期診斷試劑盒。

背景技術：

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率佔全身各種惡性腫瘤的7％～10％，死亡率已經排在女性癌症死亡率之首。乳腺癌在40-60歲間、絕經期前後的婦女發病率較高，發病率正逐年上升，並且顯示出年輕化的趨勢。目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。乳腺並不是維持人體生命活動的重要器官，原位乳腺癌並不會致命，但是由於乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性，細胞之間粘著性發生變化，容易脫落。癌細胞一旦脫落，游離的癌細胞便可以隨血液或淋巴液播散全身，形成轉移，危及生命。手術、放療、化療和激素療法對乳腺癌有很高的治療性，這種病在早期階段被檢測到時很多時候是可治癒的。早期乳腺癌的治癒率高，晚期的治癒率低，據國內資料報導，乳腺癌i期的5年生存率在90％～95％以上，ii期是70％～80％，iii期是50％～60％，而iv期則是10％左右，其治癒率與臨床分期存在顯著相關性。目前對乳腺癌的發病機制尚未完全清楚，因此早期診斷、早期治療對於乳腺癌的防治具有重要意義，是提高療效的關鍵途徑。然而，由於乳腺癌早期診斷檢測技術的限制，多數乳腺癌患者確診時已處於晚期，錯過了最佳的治療時機。

循環腫瘤細胞(circulatingtumorcells,ctcs)是因自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落，進入外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，目前認為ctcs可能是腫瘤轉移的早期階段。腫瘤細胞侵入到原發腫瘤細胞的周圍組織中，進入血液和淋巴管系統，形成ctcs，並轉運到遠端組織，再滲出，適應新的微環境，最終「播種」、「增殖」、「定植」、形成轉移灶。因此早期發現血液中的ctc，對於癌症的早期診斷、療效評價、個體化治療和預後判斷都有著重要的指導作用。

目前對於乳腺癌的早期診斷主要依賴於臨床醫學影像(b超、ct、核磁共振成像等)及和其它生化指標的檢測，這些檢測方法都屬於腫瘤形成後診斷。臨床研究早已證實，腫瘤團塊一旦形成，癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長。雖然也有針對乳腺癌相關腫瘤基因的mrna早期篩查技術，如rt-pcr、real-timepcr和螢光原位雜交等，但目前的檢測主要基於pcr反應原理，具有易汙染、假陽性率高等缺陷，而傳統的rna螢光原位雜交本身具有 信號靈敏度低的缺點。此外，缺乏特異性的早期診斷分子標誌物也是限制乳腺癌早期診斷的重要因素。因此，急需一種針對乳腺癌早期診斷的分子標誌物，以及特異性強、靈敏度高的檢測方法，能在基因的一級轉錄功能產物(mrna水平)上做更精確的早期篩查和診斷。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種特異性強、靈敏度高的乳腺癌早期診斷試劑盒。

實現上述目的的技術方案如下。

一種乳腺癌早期診斷試劑盒，包括針對檢測目標基因mrna的捕獲探針、擴增探針和標記探針；所述目標基因包括有乳腺癌篩查基因、和乳腺癌ctc標誌基因，所述乳腺癌篩查基因選自muc1、her2、hmam、cea、cox2中的至少兩種；所述乳腺癌ctc標誌基因選自ck19、serpine1、epcam、htert中至少兩種；所述排除基因選自cd45、cd34、cd105、cd144、cd146、vwf中至少兩種；其中，所述捕獲探針連接目標基因mrna與擴增探針，每條捕獲探針從5』端到3』端的鹼基組成依次為：與待檢測的目標基因mrna結合的特異性序列p1、間隔臂序列、p2序列，所述p2序列為不存在髮夾結構，探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與p1、p4和目標基因mrna之間均不存在特異性結合的序列，針對同一類別目標基因的捕獲探針的p2序列相同；每條擴增探針從5』端到3』端的鹼基組成依次為：能與相應捕獲探針的p2序列互補配對的p3序列、間隔臂序列、p4序列；所述p4序列為不存在髮夾結構，探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與p1、p2、p3和總mrna之間均不存在特異性結合的序列；每條標記探針具有與相應擴增探針p4序列互補配對的p5序列，且末端修飾有螢光基團，不同細胞種類目標基因的螢光基團互不相同。

在其中一個實施例中，所述目標基因還包括排除基因mrna，所述排除基因選自cd45、cd34、cd105、cd144、cd146、vwf中至少兩種

在其中一個實施例中，所述乳腺癌篩查基因的捕獲探針中：針對muc1基因的特異性序列p1選自seqidno.1～seqidno.10中的2條或2條以上，針對her2基因的特異性序列p1選自seqidno.11～seqidno.20中的2條或2條以上，針對hmam基因特異性序列p1的選自seqidno.21～seqidno.30中的2條或2條以上，針對cea基因特異性序列p1的選自seqidno.31～seqidno.40中的2條或2條以上，針對cox2基因特異性序列p1的選自seqidno.41～seqidno.50中的2條或2條以上；針對乳腺癌篩查基因的捕獲探針的特異性序列p2為seqidno.151；所述乳腺癌篩查基因mrna擴增探針中，p3序列為seqidno.154，p4序列為seqidno.157。

在其中一個實施例中，乳腺癌ctc標誌基因的捕獲探針中：針對ck19基因的特異性序列p1選自seqidno.51～seqidno.60中的2條或2條以上，針對serpine1基因的特異性序列p1選自seqidno.61～seqidno.70中的2條或2條以上，針對epcam基因特異性序列p1的選自seqidno71～seqidno.80中的2條或2條以上，針對htert基因特異性序列p1的選自seqidno.81～seqidno.90中的2條或2條以上；針對乳腺癌ctc標誌基因的捕獲探針的p2序列為seqidno.152；所述乳腺癌ctc標誌基因mrna擴增探針中，p3序列為seqidno.155，p4序列為seqidno.158。

在其中一個實施例中，排除基因的捕獲探針中：針對cd45基因的特異性序列p1選自seqidno.91～seqidno.100中的2條或2條以上，針對cd34基因特異性序列p1選自seqidno.101～seqidno.110中的2條或2條以上，針對cd105基因的特異性序列p1選自seqidno.111～seqidno.120中的2條或2條以上，針對cd144基因的特異性序列p1選自seqidno.121～seqidno.130中的2條或2條以上，針對cd146基因的特異性序列p1選自seqidno.131～seqidno.140中的2條或2條以上，針對vwf基因的特異性序列p1選自seqidno.141～seqidno.150中的2條或2條以上；針對排除基因的捕獲探針的p2序列為seqidno.153；所述排除基因mrna擴增探針中，p3序列為seqidno.156，p4序列為seqidno.159。

在其中一個實施例中，所述間隔臂序列為5－10個t。

在其中一個實施例中，所述螢光基團選自：fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texasred、lcred640、cy5、lcred705、alexafluor488和alexafluor750，且針對不同細胞種類目標基因的螢光基團互不相同。

本發明的主要優點在於：

(1)本發明提供了分子標誌物：乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因對乳腺癌進行早期篩查，解決了不同個體和不同類型乳腺癌相關基因表達差異造成的假陰性結果，以增加乳腺癌早期篩查的可靠性，同時，本發明還包括排除基因，以排除了其他一些非腫瘤疾病中某些相關基因表達增強造成的假陽性結果，進一步提高了檢測結果的特異性和準確性，避免造成誤診。同時本發明試劑盒能在基因和細胞水平上對乳腺癌做更精確的早期篩查和診斷，遠遠早於腫瘤團塊形成後的診斷，對乳腺癌患者的早期治療、提高治癒率和存活率具有重要的意義。

(2)本發明所選擇的乳腺癌篩查基因、乳腺癌ctc標誌基因和排除基因，是發明人經過大量試驗進行綜合評估、統計分析篩選得出的在乳腺癌循環腫瘤細胞上特異表達的基 因。本發明目標基因的選取，除了能實現單個目標基因的檢測外，更與其它目標基因一起使用，從而能夠最全面地檢測出乳腺癌循環腫瘤細胞，區分癌細胞和血液中的白細胞、造血幹細胞和內皮細胞，避免了假陰性和假陽性結果的出現，進一步提高檢測的準確性。

(3)本發明所述鑑定方法採用多重rna探針，能夠同時標記多種乳腺癌篩查基因及ctcs特異性基因，並區分癌細胞和正常細胞，進一步提高了檢測結果的準確性。本發明所設計的各種探針，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，且各種探針之間基本不存在非特異性結合；所設計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使鑑定試劑盒和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統。本發明使用的是探針的多位點特異配對、級聯放大的方式來實現信號的放大，而不是pcr擴增的方法，提高了檢測信號，實現了檢測的特異性，避免了逆轉錄pcr和實時螢光定量pcr技術的假陽性。

(4)rna原位雜交方法本身具有螢光信號靈敏度低的缺點，但是本發明採用新型的rna原位雜交方法，通過信號放大體系提高螢光信號強度。本發明檢測流程能夠在8h內完成，單一拷貝的mrna雜交探針通過信號放大系統，與相應的螢光探針結合，顯著提高rna原位雜交的檢測靈敏度。

附圖說明

圖1是本發明陽性乳腺癌循環腫瘤細胞鑑定結果示意圖。

具體實施方式

為了便於理解本發明，下面將對本發明進行更全面的描述。本發明可以以許多不同的形式來實現，並不限於本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。

下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。

除非另有定義，本發明所使用的所有的技術和科學術語與屬於本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用於限制本發明。本發明所使用的術語「和/或」包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。

實施例1

本實施例所述的乳腺癌早期診斷試劑盒，有兩種類型，分別為具有標記探針與不具有標記探針。

其中，具有標記探針的乳腺癌早期診斷試劑盒a，主要包括有：

一、捕獲探針

捕獲探針由三部分組成，5』端至3』端依次是與對應的目標基因的mrna互補配對的p1序列，間隔臂序列，與對應的擴增探針p3序列互補配對的p2序列，同一類別的目標基因其捕獲探針中的p2序列相同。所述間隔臂為用於將捕獲探針p2序列與目標mrna間隔開來，通過在探針內部設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。本發明捕獲探針的間隔臂優選為5－10個t，本實施例優選為5個t。每個目標基因分別設計10條捕獲探針，以提高檢測的特異性。(具體使用時，針對每種目標基因，選擇2條或2條以上捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩定性都很好，可參考實施例5)，本實施例優選為使用10條捕獲探針，以使特異性達到最好。針對相應的目標基因捕獲探針的特異性p1序列見表1，不同類型的目標基因的捕獲探針的p2序列見表2。

表1目標基因捕獲探針的p1序列

表2捕獲探針的p2序列

二、擴增探針

擴增探針是連接捕獲探針與信號檢測組分之間的序列，擴增探針由三部分組成，5』端是能與捕獲探針p2序列互補配對的p3序列，間隔臂序列，3』端是能與標記探針互補配對的序列p4(如不運用標記探針檢測時，則p4序列的3』端修飾有螢光基團，如試劑盒b)，中間是5個寡聚核苷酸t的間隔臂序列(本發明的擴增延伸探針間隔臂優選為5－10個t，本實施例優選為5個t)。所述目標基因的擴增探針的p4序列內部不存在髮夾結構，探針內部和探針間都不形成二聚體、不存在錯配，與p1、p2、p3和總mrna之間均不存在非特異性結合的序列。

表3擴增探針的p3序列

表4目標基因的擴增探針的p4序列

三、標記探針

標記探針由兩部分組成，其5』端是能與擴增探針序列p4互補結合的p5序列，3』端帶有螢光基團標記，通過與擴增探針p4序列的結合實現目標mrna信號的級聯放大。(當檢測體系中使用標記探針時，擴增探針的p4序列3』端不帶有螢光基團標記，而由標記探針的3』端帶有螢光基團標記，如試劑盒a)標記探針的螢光基團可以選自：fam、tet、joe、hex、 cy3、tamra、rox、texasred、lcred640、cy5、lcred705、alexafluor488和alexafluor750，標記探針的fl1、fl2和fl3選擇的螢光基團互不相同，且所選擇的螢光基團的顏色互不相同或發射波長互不相同，以便於區分不同類型的目標基因。

表5標記探針

本實施例所述不具有標記探針的乳腺癌早期診斷試劑盒b，主要包括有：

一、捕獲探針：與上述具有標記探針的乳腺癌早期診斷試劑盒a中的捕獲探針相同。

二、擴增探針：與上述具有標記探針的乳腺癌早期診斷試劑盒a中的擴增探針的序列相同，但p4序列的3』端修飾有螢光基團。所述擴增探針p4序列的3』端優選的螢光基團標記中：針對乳腺癌篩查基因muc1、her2、hmam、cea和cox2的螢光基團為cy3(紅色螢光信號)，針對乳腺癌ctc標誌基因ck19、serpine1、epcam和htert的螢光基團為alexafluor488(綠色螢光信號)，針對排除基因cd45、cd34、cd105、cd144、cd146和vwf的螢光基團為alexafluor750(白色螢光信號)。

實施例2運用實施例1中的試劑盒a對乳腺癌患者外周血循環腫瘤細胞進行檢測

所述各種溶液的配方如下：

本實施例中的探針混合液、擴增混合液、顯色混合液均使用實施例1具有標記探針的乳腺癌早期診斷試劑盒a相應基因列表中的全部探針。

一、樣本預處理，將乳腺癌ctcs過濾至濾膜上

1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清，去除紅細胞。

2.加入4mlpbs和1ml固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。

3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mlpbs，洗滌管壁後抽濾液體。

4.將濾膜轉移至24孔板中，加入400μl4％甲醛溶液，室溫固定1h。

5.去除液體，每孔加入1mlpbs洗滌三次，每次浸泡2min。

二、透化處理

1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化劑，將濾膜從pbs中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多餘的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。

2.去除液體，每孔加入1mlpbs洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在pbs中至下一步實驗操作。

三、消化細胞，暴露mrna，使其與探針雜交

1.配製相應濃度的消化酶工作液：對於每個樣本，消化酶工作液組成如下：48.75ul的pbs、1.25ul的消化酶，總體積50ul。

2.按實驗需要配製一定體積的消化酶工作液，渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。

3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。

4.去除液體，每孔加入1mlpbs洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在pbs緩衝液中至下一步實驗操作。

四、探針雜交，探針特異性序列與目標mrna序列結合

1.探針緩衝液、擴增緩衝液和顯色緩衝液使用前需40℃水浴預熱20min。

2.配製探針工作液：對於每個樣本，探針工作液組成如下：8ul探針混合液、42ul探針緩衝液(40℃預熱)，總體積50ul。按實驗需要配製一定體積的探針工作液，渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。

3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。

4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。

5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。

五、擴增雜交，目標mrna序列信號放大

1.配製擴增工作液：對於每個樣本，擴增工作液組成如下：2ul擴增混合液、48ul擴增緩衝液(40℃預熱)，總體積50ul。按實驗需要配製一定體積的擴增工作液，渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl

2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中擴增工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。

3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。

4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。

六、顯色，螢光標記目標信號

1.配製顯色工作液：對於每個樣本，顯色工作液組成如下：2ul顯色混合液、48ul顯色緩衝液(40℃預熱)，總體積50ul。按實驗需要配製一定體積的顯色工作液，避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。

2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。

3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。

4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。

七、螢光顯微鏡觀察ctcs

本發明的對照品使用dapi作為細胞核螢光基團，其發射藍色螢光信號。

1.將濾膜細胞面朝上置於載玻片上，沿鐵圈內環將濾膜割下，加10μl含dapi的抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置於-20℃保存。

2.通過20倍物鏡計數ctc異性核數量。

3.根據10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結果，並拍照記錄結果。

4.然後再根據10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結果並視野拍照記錄結果。

5.重複操作至拍完所有的異性核，數量與20倍物鏡計數結果一致。

顯微鏡使用通道如下：

表6螢光基團的激發波長和發射波長

八、檢測結果判斷及分析

1.陽性乳腺癌ctc鑑定標準

在濾膜上，富集有少量的乳腺癌循環腫瘤細胞以及殘留的白細胞、造血幹細胞和內皮細胞，本試劑盒陽性的判定標準為(參見圖1)：

1)表達乳腺癌篩查基因和ctc標誌基因，在本試劑盒中表現為在cy3通道和/或alexafluor488通道下能夠顯示紅色螢光信號點和/或綠色螢光信號點。

2)不具有排除細胞特異性標識物，在本試劑盒中表現為在alexafluor750通道下不顯示螢光信號點。

3)細胞核dapi染色陽性。

4)乳腺癌循環腫瘤細胞核形狀不規則，直徑大於10μm，明顯大於濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細胞大小與濾膜孔大小相近。

本試劑盒採用多重rna探針，分別針對乳腺癌篩查基因、ctc標誌基因和排除基因，通過不同顏色螢光信號，判斷檢測的細胞是否為篩查基因、ctc標誌基因陽性。乳腺癌ctcs鑑定標準如下：

2.使用上述檢測方法，對15例乳腺癌患者外周血樣本(編號1-15)進行檢測。同時，選用乳腺癌細胞株mcf-7作為陽性對照、淋巴母細胞ccrf-hsb-2、造血細胞株kg-1a和人肝竇內皮細胞hhsec作為陰性對照，本領域技術人員只要知道細胞株的名稱即可通過購買得到。分別各取約1000個mcf-7、ccrf-hsb-2、kg-1a和hhsec細胞(通過細胞計數器確定)，混合均勻後將樣本各均分為5份，編號16-20、21-25、26-30和31-35，讀取每個細胞株樣本中有dapi藍色螢光信號的50個細胞，統計其表達紅色/綠色螢光的細胞數量，同時表達兩種螢光的細胞分別在紅色陽性、綠色陽性細胞數量中列出，其中，樣本中的細胞數通過螢光顯微鏡自動掃描來選取。具體結果為：

表6樣本檢測結果

通過分析檢測結果可知，本發明試劑盒能實現乳腺癌患者外周血中乳腺癌篩查基因、ctc標誌基因和排除基因的檢測，具體很好的特異性和靈敏度。同時本發明試劑盒能將樣本中50個乳腺癌細胞mcf-7和淋巴母細胞ccrf-hsb-2、造血細胞株kg-1a以及人肝竇內皮細胞hhsec全部檢測。其中，乳腺癌篩查基因、ctc標誌基因僅在乳腺癌細胞株中檢測到mrna表達，而在淋巴母細胞、造血幹細胞和內皮細胞中均沒有表達，由此可見，本發明試劑盒能夠檢出乳腺癌篩查基因、乳腺癌ctc標誌基因和排除基因mrna表達情況，同時，本發明試劑盒採用的乳腺癌篩查基因，其檢出具有癌種特異性，也就是說，乳腺癌篩查基因的檢出，能有效區分樣本中的癌細胞的種類，在檢測到乳腺癌ctc標誌基因的前提下，進一步確定早期癌症的種類，提高了檢測結果的準確度和可信度。

實施例3目標檢測基因數量和種類的選擇

一、試劑盒製備的設計(目標檢測基因數量和種類的選擇)

本發明試劑盒乳腺癌篩查基因選自：muc1、her2、hmam、cea、cox2，根據實驗組做相應的選擇，乳腺癌ctc標誌基因使用：ck19、serpine1、epcam和htert；排除基因使用：cd45、cd34、cd105、cd144、cd146和vwf。

乳腺癌篩查基因的選擇參見實驗組1-4，分別選取一種、兩種、三種及五種的目標基因，對比其檢測效果，而乳腺癌ctc標誌基因和排除基因使用全部的目標基因，具體設計如表7所示。

本實施例每組相應目標基因的所述捕獲探針、擴增探針與標記探針的組成和數量、檢測方法等如實施例1試劑盒a和實施例2所述。

表7乳腺癌篩查基因基因的選擇

二、樣本檢測

本實施例選用乳腺癌細胞株mcf-7、mda-mb-453和hcc38進行實驗，本領域技術人員只要知道細胞株的名稱即可通過購買得到。分別各取約1000個mcf-7、mda-mb-453和hcc38細胞(通過細胞計數器確定)，混合均勻後將樣本各均分為5份，依次編號36-40、41-45和46-50。採用表7目標基因製備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本36-50進行檢測，讀取每個樣本中有dapi藍色螢光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數通過螢光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標誌物的螢光信號強度，分別讀取這50個乳腺癌細胞的相應顏色的螢光點數量，並計算平均點數。具體檢測結果如下(表8中數據為細胞數目，表9中數據為平均螢光點數)：

表8使用不同數量乳腺癌篩查基因檢測效果的比較

表9使用不同數量乳腺癌篩查基因平均螢光信號點數檢測效果的比較

對比實驗組1-4的實驗結果可知，當乳腺癌篩查基因分別選取一種、兩種、三種及五種，乳腺癌ctc標誌基因和排除基因使用全部基因時，乳腺癌ctc標誌基因和排除基因檢測結果穩定，而乳腺癌篩查基因檢測結果有差異：由於不同乳腺癌細胞標記基因表達的差異，只選用一種目標基因進行檢測時，會造成一定程度的漏檢，使用2種或2種以上時，檢測效果達到穩定，且紅色螢光信號點從實驗組1到實驗組4隨著乳腺癌篩查基因數量的增加而逐漸增加，檢測效果更優，其中，選用全部的乳腺癌篩查基因時，檢測信號最強最穩定，效果最優，同時，乳腺癌篩查基因的增加並不影響乳腺癌ctc標誌基因和排除基因的檢測結果，由此可知，本發明試劑盒所設計的各種類型探針之間基本不存在非特異性結合，特異性好。乳腺癌ctc標誌基因和排除基因基因數量的選擇實驗結果與乳腺癌篩查基因一致。其它針對使用不同數量和種類的乳腺癌篩查基因、乳腺癌ctc標誌基因和排除基因的試劑盒，其結果依然穩定可靠，具體數據省略。

實施例4：標記探針的運用

一、試劑盒製備的設計(信號檢測組分)

本發明試劑盒信號檢測組分有兩種選擇，1)擴增探針p4序列的3』端修飾有螢光基團；2)擴增探針3』端p4序列與標記探針的p5序列通過鹼基互補配對結合，同時標記探針的3』端帶有螢光基團。這兩種信號檢測組分均能實現信號放大，檢測到正常信號。其中，使用螢光基團修飾的標記探針，檢測信號更加穩定，效果較優。

以所述試劑盒的檢測乳腺癌篩查基因的兩種信號檢測組分為例，具體設計如表10所示。即所述試劑盒的組成為：

實驗組5：相應捕獲探針和擴增探針組成和數量同實施例1試劑盒a，但擴增探針3』端修飾有螢光基團cy3；沒有標記探針；

實驗組6：相應捕獲探針、擴增探針和標記探針組成和數量同實施例1試劑盒a，擴增探針不具有螢光基團，但配置有標記探針，標記探針的p5序列3』端修飾有螢光基團cy3。

表10信號檢測組分

二、樣本檢測

本實施例選用乳腺癌細胞株mcf-7、mda-mb-453和hcc38進行實驗，本領域技術人員只要知道細胞株的名稱即可通過購買得到。分別各取約1000個mcf-7、mda-mb-453和hcc38細胞(通過細胞計數器確定)，混合均勻後將樣本各均分為5份，依次編號51-55、56-60和61-65。採用上述設計製備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本51-65進行檢測，讀取每個樣本中有dapi藍色螢光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數通過螢光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標誌物的螢光信號強度，分別讀取這50個乳腺癌細胞的相應顏色的螢光點數量，並計算平均點數，具體實驗結果如下：

2個實驗組中使用不同信號組分的試劑盒均能將三種細胞株樣本中含有的50個細胞全部檢出，對細胞數目的檢測結果沒有差異，因此，這兩種信號檢測組分對信號的檢測是等效的。但是使用標記探針的試劑盒(實驗組6)檢測到的乳腺癌篩查基因平均螢光點數更多，信號更加穩定，效果較優，具體螢光點數檢測結果見表11：

表11乳腺癌篩查基因使用不同信號檢測探針平均螢光點數檢測結果比較

其他針對乳腺癌ctc標誌基因和排除基因標記探針的運用檢測結果與乳腺癌篩查基因檢測結果一致，具體數據省略。

實施例5目標基因的捕獲探針的數量選擇

一、試劑盒製備的設計(捕獲探針數量的選擇)

本發明乳腺癌早期診斷試劑盒，針對不同細胞種類的每個目標基因分別設計了10條捕獲探針，且同一細胞種類的目標基因的捕獲探針中的p2序列相同。在實際使用時，可以針對每種目標基因，選擇對應的至少2條捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩定性都能達到需求。

為考察捕獲探針數量的選擇對試劑盒檢測效果的影響，以乳腺癌篩查基因muc1的捕獲探針數量選擇為例，參見實驗組7-9，分別選取1條、2條及10條的捕獲探針，對比其檢測效果。在該對比實驗中，乳腺癌篩查基因僅使用muc1(參見表12)，而乳腺癌ctc標誌基因和排除基因使用如實施例1實驗組a所列出的全部的基因和探針。

表12乳腺癌篩查基因muc1的捕獲探針的選擇

二、樣本檢測

本實施例選用乳腺癌細胞株mcf-7、mda-mb-453和hcc38進行實驗，本領域技術人員只要知道細胞株的名稱即可通過購買得到。分別各取約1000個mcf-7、mda-mb-453和hcc38細胞(通過細胞計數器確定)，混合均勻後將樣本各均分為5份，依次編號66-70、71-75和76-80。採用上述設計製備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本66-80進行檢測，讀取每個樣本中有dapi藍色螢光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數通過螢光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標誌物的螢光信號強度，分別讀取這50個乳腺癌細胞的相應顏色的螢光點數量，並計算平均點數。具體檢測結果如下(表13中數據為細胞數目，表14中數據為平均螢光點數)：

表13乳腺癌篩查基因muc1使用不同數量捕獲探針的檢測結果比較

表14乳腺癌篩查基因muc1使用不同數量捕獲探針平均螢光點數檢測結果比較

通過三組實驗對比可知，當僅選用乳腺癌篩查基因muc1，使用1條、2條和10條的捕獲探針均可完成檢測，將當捕獲探針使用2條或以上時，其特異性和穩定性都很好。其中， 當使用全部10條的捕獲探針時，乳腺癌篩查基因檢測到的螢光信號點數更多，信號更強更穩定，檢測效果最佳。

其它針對乳腺癌篩查基因、乳腺癌ctc標誌基因和排除基因的使用不同數量捕獲探針的試劑盒，其結果依然穩定可靠，具體數據省略。

實施例6目標檢測基因類型的選擇

一、試劑盒製備的設計(目標檢測基因類型的選擇)

本發明試劑盒提供3種類型的目標檢測基因，包括乳腺癌篩查基因(muc1、her2、hmam、cea、cox2)、乳腺癌ctc標誌基因(ck19、serpine1、epcam、htert)和排除基因(cd45、cd34、cd105、cd144、cd146、vwf)。

本發明提供的乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因，即可與排除基因聯合三者一起使用，也可兩者聯合使用實現乳腺癌的早期診斷。設計實驗組10-11，其中實驗組10選用全部類型的標誌基因，實驗組11隻選用乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因，對比其檢測效果，具體設計如表15所示。

表15目標檢測基因類型的選擇

二、樣本檢測

採用上述設計製備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本81-90進行檢測，讀取每個樣本中有dapi藍色螢光信號的50個細胞，統計其表達紅色/綠色螢光的細胞數量，同時表達兩種螢光的細胞分別在紅色陽性、綠色陽性細胞數量中列出，其中，樣本中的細胞數通過螢光顯微鏡自動掃描來選取。具體結果為：

表16試劑盒選擇不同類型檢測基因的檢測結果比較

通過上述檢測結果可知，本發明試劑盒提供的乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因，既可兩者聯合使用，也可與排除基因一起三者聯合使用，均能實現乳腺癌的早期診斷，說明試劑盒所選用的乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因具有很好的特異性。乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因與排除基因三者聯合使用，有利於排除白細胞、內皮細胞和造血幹細胞的對結果判斷的幹擾(實驗組10)，但僅使用乳腺癌篩查基因和乳腺癌ctc標誌基因也可完成檢測(實驗組11)，實現乳腺癌的早期診斷，且兩者檢測結果沒有差異。

以上所述實施例的各技術特徵可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特徵所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特徵的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的範圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。