通過施用多peg化的粒細胞集落刺激因子(g-csf)變體來治療輻射誘發的嗜中性細胞減少...的製作方法

2023-11-01 04:12:17 7

專利名稱：通過施用多peg化的粒細胞集落刺激因子(g-csf)變體來治療輻射誘發的嗜中性細胞減少 ...的製作方法
技術領域：
本申請涉及通過施用多PEG化的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)變體來治療或預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症(neutropenia)的方法。
背景技術：
骨髓中白血球生長、分裂和分化的過程稱作造血(Dexter and Spooncer，Ann. Rev. Cell. Biol.，3 :423,1987)。每一種血細胞類型均源自多能幹細胞。體內生成的血細胞一般有三類紅血球(紅細胞)、血小板和白血球(白細胞)，後者的大多數涉及宿主免疫防禦。造血前體細胞的增殖和分化受到一族細胞因子的調節，包括集落刺激因子(CSF)諸如 G-CSF禾口白介素(Arai et al. ,Ann. Rev. Biochem. ,59 783-836，1990)。體內 G-CSF 的主要生物學效應是刺激稱作嗜中性粒細胞或嗜中性細胞的某些白血球的生長和發育(Welte et al.，PNAS82 1526-1530，1985 ；Souza et al.，Science, 232 :61-65,1986) 當被釋放入血流中時，嗜中性細胞發揮功能來抗擊細菌和其它感染。人G-CSF (hG-CSF)的胺基酸序列報告於 Nagata et al.，Nature 319:415-418， 1986。hG-CSF是一種單體蛋白，它通過形成2個G-CSF分子和2個受體分子的2 :2複合物來二聚化 G-CSF 受體(Horan et al. ,Biochemistry 35(15) :4886-96,1996) 一份更近的出版物(Tamada et al.，PNAS 103 :3135-3140,2006)記載了人 G-CSF 與 GCSF 受體之配體結合區之間的信號傳導複合物的晶體結構。白細胞減少症(白血球水平降低)和嗜中性細胞減少症(嗜中性細胞水平降低) 是導致對多種類型的感染的易感性升高的病症。對於具有重度嗜中性細胞減少症(也稱作熱性嗜中性細胞減少症，表現為絕對嗜中性細胞計數(ANC)低於約500個細胞/mm3)的患者，甚至相對輕微的感染也會變得嚴重，甚至危及生命。重組人G-CSF (rhG-CSF)常常被用於治療和預防多種形式的白細胞減少症和嗜中性細胞減少症。rhG-CSF的製劑已商品化， 例如Neupogen (非格司亭(Filgrastin)，它是非糖基化的且在重組大腸桿菌細胞中生產)和Neulasta (PEG非格司亭(pegfilgrastin)，它具有與Neupogen 相同的胺基酸序列但含有一個N端連接的20kDa聚乙二醇(PEG)基團)。此單PEG化rhG-CSF分子已經顯示出具有與非PEG化的G-CSF相比延長的半衰期且因此可以以比非PEG化的G-CSF產品要低的頻率施用，而且縮短嗜中性細胞減少症持續時間至與施用非PEG化的G-CSF大致相同的天數。急性輻射症候群(Acute Radiation Syndrome，ARS)(也稱作輻射病或放射病)涵蓋通過暴露於高劑量輻射而促成的一組複雜病理生理過程，影響血液、胃腸和心血管系統。 ARS —般在相對較短時間段裡全身或有效部分身體投遞約0. 7至1戈瑞(Gy)或更多輻照之後發生(Waselenko J. K. et al. , Annals oflnternal Medicine 140(12) :1037-1051, 2004 Jarrett D. G. et al. ,RadiationMeasurements 42 1063—1074，2007) 。ARS 禾中■ 現的潛伏期、嚴重性、和持續時間是輻射劑量、劑量率、和輻射類型，以及促成性暴露的異質性或同質性的函數。ARS遵循可某種程度預測的過程，而且以症狀來表徵，它們是多種細胞、組織、和器官系統對輻射的特定反應的表現(參見例如Waselenko et al.，supra，特別是其中的

圖1， 表1-3和表幻。與ARS有關的症狀包括噁心、嘔吐、腹瀉、嗜中性細胞減少症、皮膚灼傷和潰瘍、疲勞、脫水、炎症、脫髮、口腔黏膜和GI系統的潰瘍形成、口乾燥症、和出血(例如來自鼻、口和直腸)。以高速複製的細胞(諸如造血祖細胞、精母細胞、和腸隱窩細胞)最易受急性輻射暴露攻擊。可測量的臨床影響的概率隨總劑量或劑量率升高而升高。然而，如果在延長的時間段裡給予，可以耐受在一次快速暴露之後產生可觀察影響的總輻射劑量，所耐受的是很少的可測量影響。循環中的造血細胞和造血祖(骨髓)細胞屬於輻射敏感性最高的細胞。與輻射病有關的症狀的一個共同根本原因是輻射對此類細胞的影響。造血症候群(hematopoietic syndrome, H-ARS)見於暴露於一般超過約0. 7-1 Gy的有效部分身體或全身輻射水平的人 (Jarrett et al. , supra ；Waselenko et 已1.，supra)，胃以
有絲分裂活性造血祖細胞在2至3Gy的一劑全身輻射之後具有有限的分裂能力。ARS的造血症候群特徵在於血細胞數目一白血球(WBC ；嗜中性細胞和淋巴細胞)、血小板(也稱作凝血細胞)和紅血球(RBC)-減少及潛在的臨床重要後果。暴露於電離輻射可導致WBC計數降低，這表現為嗜中性細胞減少症(嗜中性細胞/粒細胞減少)和淋巴細胞減少症(淋巴細胞減少)。RBC減少可導致貧血症，而血小板減少可導致血小板減少症。輻射誘發的嗜中性細胞減少症、血小板減少症和貧血症的動力學依賴於接受的劑量、劑量率(dose rate)、和身體受輻照的程度(Waselenkoet al. ,supra)。輻射誘發的對骨髓中細胞生成的損害開始於暴露之時。雖然大多數骨髓祖細胞在足夠高的輻射劑量之後對細胞死亡易感，但是已經發現幹細胞或輔助細胞的一些亞群更加耐受輻射，大概是因為它們的非周期(Gtl)狀態，這可能在暴露於潛在致死劑量之後造血的恢復中發揮重要作用(Waselenko et al.，supra)。輻射效應還依賴於暴露的體表面積量。認為人體可以以全身面積吸收多至約2Gy 的單劑而不會有死亡的即時風險。如果不處理，由於骨髓衰竭，超過約2Gy的一劑導致可能的或必然的死亡。在較短的時間段裡給予全身約8Gy或更多的一劑幾乎是必然致命的。相反，當在較長的時間段裡投遞，和/或投遞至小體積的組織(如在例如癌症治療中)時，可耐受數十Gy。輻射誘發的嗜中性細胞減少症提高對腐生性和致病性生物體所致危及生命的感染的易感性，而且降低對在皮下組織中蔓延的和來自腸壁完整性破口的細菌的免疫抗性。 這種對感染和膿毒病/敗血病(sepsis)的易感性是暴露於2_8Gy範圍中的電離輻射的受試者死亡的主要原因。與嗜中性細胞減少症並發，還可觀察到不同程度的血小板減少症。如果不做處理，重度血小板減少症可提高對危及生命的出血的易感性。與ARS有關的輻射誘發的嗜中性細胞減少症在經例如核事故或意外輻射暴露而暴露於高水平輻射的患者中導致重大發病率和死亡率。需要可安全地施用來減輕與ARS有關的輻射誘發的嗜中性細胞減少症的長效G-CSF產品，特別是多PEG化的G-CSF，而且需要使用此類G-CSF產品來治療和預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症的方法。發明概述本發明的目的是提供一種在暴露於輻射(例如由於核爆炸或意外輻射暴露)的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的方法，以通過在此類患者中縮短和/或降低輻射誘發的嗜中性細胞減少症的持續時間和/或嚴重性及如此降低危及生命的感染的風險來提高存活力。本發明的一個方面如此涉及一種用於在經受輻射暴露的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的方法，包括以有效減輕輻射誘發的嗜中性細胞減少症，諸如與急性輻射症候群(ARS)，例如ARS的造血症候群(H-ARS)有關的輻射誘發的嗜中性細胞減少症的量對所述患者施用多PEG化的G-CSF變體。本發明的又一個方面涉及用於憑藉本文所述方法來治療或預防嗜中性細胞減少症的多PEG化的G-CSF變體。本發明的這個方面如此涉及用於治療輻射誘發的嗜中性細胞減少症的多PEG化的G-CSF變體。本發明的這個方面還涉及用於通過對暴露於輻射的患者施用多PEG化的G-CSF變體來在該患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的該多PEG化的 G-CSF變體。本發明的又一個方面涉及多PEG化的G-CSF變體在製備用於憑藉本文所述方法來治療或預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症的藥物中的用途。本發明的這個方面如此涉及多 PEG化的G-CSF變體在製備用於在暴露於輻射的患者中治療或預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症的藥物中的用途，其中以有效減輕輻射誘發的嗜中性細胞減少症的量對該患者施用該多PEG化的G-CSF變體。本發明的這個方面還涉及多PEG化的G-CSF變體在製備用於治療輻射誘發的嗜中性細胞減少症的藥物中的用途。本發明的這個方面還涉及多PEG化的 G-CSF變體在製備用於通過對暴露於輻射的患者施用該多PEG化的G-CSF變體來在該患者中治療或預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症的藥物中的用途。在一些實施方案中，多PEG化的G-CSF變體以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統(諸如非人靈長類動物模型系統)中在用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效縮短重度嗜中性細胞減少症持續時間的量對患者施用。在其它實施方案中，多PEG化的G-CSF變體以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統(諸如非人靈長類動物模型系統)中在用所述多PEG化的G-CSF 變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效增加輻射暴露後30 天或60天的存活者數目的量對患者施用。當結合附圖閱讀以下詳述時，本發明的這些和其它方面和特徵會變得更加顯而易見。附圖簡述圖1顯示了恆河猴中的60天造血症候群致死劑量應答關係，呈現為概率單位百分比致死率(probit percent lethality)對對數尺度上以戈瑞(Gy)計的TBI劑量。暴露於 2MV LINAC光子並獲得支持護理的恆河猴/獼猴的所得LD50/60值表示為LD50UNA。(括號[] 中為95%置信區間)。此圖還顯示了兩個歷史數據集，顯示了暴露於Co-60伽馬和2MV X-輻射(分別表示為LD50。。6(1和LD50x|ia)的恆河猴/獼猴的TBI劑量應答和計算的LD50/30 值(括號[]中為95%置信區間)。該歷史研究中的動物沒有獲得支持護理(supportivecare)。圖2顯示了暴露於劑量近似LD30/60(720釐戈瑞(cGy))、LD50/60 (755cGy)、和 LD70/60(805 cGy)的全身輻照之後，並獲得支持護理的恆河猴中均值絕對嗜中性細胞計數 (ANC)變化的時程。圖3證明了本發明的一種例示性多PEG化的G-CSF變體(在本文中標識為 "Maxy-G21")相對於單PEG化的rhG_CSF改善非人靈長類動物中輻射暴露之後的嗜中性細胞恢復。恆河猴中的絕對嗜中性細胞計數(ANC)是在600 cGy (6. 00 Gy)輻照和輻照後一天施用Maxy-G2l、Neulasta 、或對照(血清)之後測定的。重度嗜中性細胞減少症(ANC < 500/ μ L)以水平線標示。圖4顯示了經600 cGy輻照，輻照後一天給予300 μ g/kg Maxy_G21或300 μ g/ kgNeulasta 的恆河猴的藥動學(PK)概況。圖5顯示了暴露於776 cGy輻射且隨後用本發明的一種例示性多PEG化的 G-CSF變體(「G34」，在本文中也標識為「Maxy-G34」)或稀釋劑(「媒介」)處理的小鼠的 Kaplan-Meier存活曲線。輻照C57BL/6小鼠，然後在暴露後M小時和7天時(空心菱形) 或在暴露後M小時、7天、和14天時(空心正方形)皮下注射G34 (1. Omg/kg = 20 μ g/20gm 小鼠)。在暴露後M小時、7天、和14天時給對照小鼠注射稀釋劑(實心三角形)。該小鼠不用抗生素處理。圖6顯示了暴露於796 cGy輻射且隨後用本發明的一種例示性多PEG化的 G-CSF變體(「G34」，在本文中也標識為「Maxy-G34」)或稀釋劑(「媒介」)處理的小鼠的 Kaplan-Meier存活曲線。輻照C57BL/6小鼠，然後在暴露後M小時和7天時(空心菱形) 或在暴露後M小時、7天、和14天時(空心正方形)皮下注射G34 (1. Omg/kg = 20 μ g/20gm 小鼠)。在暴露後M小時、7天、和14天時給對照小鼠注射媒介(實心三角形)。該小鼠不用抗生素處理。定義在說明書和權利要求書中，使用下述定義。術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸的聚合物，不限於任何特定長度的胺基酸序列。這些術語意圖不僅包括全長蛋白質，而且還包括任何給定蛋白質或多肽的例如片段或截短形式、變體、結構域、等。"G-CSF多肽」為具有SEQ ID NO 1所示人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)序列的多肽，或展現G-CSF活性的hG-CSF變體。「G-CSF活性」可以是結合G-CSF受體的能力(Fukunaga et al.，J. Bio. Chem，265 14008，1990，通過述及而收入本文)，但是優選是 G-CSF細胞增殖活性，這可以例如在使用鼠細胞系NFS-60(ATCC號CRL_1838)的體外活性測定法中測定。一種用於G-CSF活性的合適的使用NFS-60細胞系的體外測定法記載於 Hammerling et al. , J. Pharm. Biomed. Anal. 13 (1) :9_20，1995，通過述及而收入本文。當 「展現G-CSF活性的」多肽展示可測量的功能時，例如在體外測定法中可測量的細胞增殖活性，認為它具有此類活性。「變體」(例如「G-CSF變體」)為與親本多肽相差一個或多個胺基酸殘基的多肽，其中該親本多肽一般是具有天然、野生型胺基酸序列的多肽，通常是天然哺乳動物多肽，而且更通常的是天然人多肽。因此所述變體與天然多肽相比含有一處或多處替代、插入或刪除。這些可以例如包括N和/或C端截短一個或多個胺基酸殘基，或在N和/或C端添加一個或多個胺基酸殘基，例如在N端添加甲硫氨酸殘基。所述變體最通常的會與親本多肽相差多至15個胺基酸殘基，諸如多至12，10，8或6個胺基酸殘基。具體而言，一些G-CSF變體在N端有或未添加甲硫氨酸殘基的G-CSF序列中具有胺基酸替代。術語「經修飾的」G-CSF指具有人G-CSF或人G-CSF變體的序列的G-CSF分子， 其是通過例如改變聚糖結構而經過修飾的。例如，可以為了提供糖-PEG化的G-CSF分子的目的而修飾G-CSF的聚糖結構，其中將聚乙二醇模塊附著至糖基連接基團，諸如唾液酸模塊，如記載於WO 2005/055946的，通過述及而收入本文。經修飾的G-CSF分子的另一個例子是含有至少一個在野生型多肽中不存在的0連接的糖基化位點的分子。具有此類非天然發生的0連接的糖基化位點的G-CSF分子，以及G-CSF的經修飾的糖的PEG化記載於 W02005/070138，通過述及而收入本文。除非另外指明，術語「G-CSF」如本文中使用的意圖涵蓋具有天然人序列(SEQ ID NO 1)的G-CSF分子以及人G-CSF序列的變體。在任一情況中，術語「G-CSF」還意圖包括經修飾的G-CSF，諸如G-CSF糖基化變體。「包含多個聚乙二醇模塊的"PEG化的G-CSF (在本文中也稱作「多PEG化的G-CSF 」) 指有兩個或更多個PEG模塊直接地或間接地共價附著至所述多肽的胺基酸殘基的G-CSF 多肽，這不同於只有一個PEG模塊共價附著至所述多肽的「單PEG化的G-CSF」。合適的附著位點包括例如賴氨酸殘基的氨基或N端氨基、游離羧酸基團(例如C端胺基酸殘基的或者天冬氨酸或穀氨酸殘基的)、半胱氨酸殘基的硫醇基、適當活化的羰基、氧化的碳水化合物模塊和巰基。更多關於PEG附著位點和用於將PEG模塊附著至蛋白質的方法的信息可參閱例如 WO 01/51510 ；WO 03/006501 ；及 Nektar Advanced PEGylationCatalog 2005-2006 (Nektar Therapeutics)，都通過述及而收入本文。PEG化的另一種可能性是將 PEG模塊附著至G-CSF的聚糖結構，例如經由聚糖修飾(見上文)。「多PEG化的G-CSF變體」指有兩個或更多個PEG模塊直接地或間接地共價附著至變體的胺基酸殘基的G-CSF變體。在本申請中，胺基酸名稱和原子名稱(例如CA，CB, NZ, N, 0，C，等)如蛋白質資料庫(PDB)所定義的那樣使用，其基於IUPAC命名法(IUPACNomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138,9-37(1984)連同它們在Eur. J. Biochem.，152，1 (1985)中的更正)。術語「胺基酸殘基」意圖表示任何天然的或非天然發生的胺基酸殘基，特別是由20種天然發生的胺基酸組成的組中含有的胺基酸殘基，即丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或 D)、穀氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬醯胺(Asn 或N)、脯氨酸(Pro或P)、穀氨醯胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)、和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。本文中用於鑑別胺基酸位置/替代的術語學例示如下F13表示參照胺基酸序列中由苯丙氨酸殘基佔據的第13位。F13K表示第13位的苯丙氨酸殘基被賴氨酸殘基替代。 除非另外指明，本文中做出的胺基酸殘基編號方式是相對於SEQ ID N0:1所示hG-CSF胺基酸序列做出的。擇一替代用「/」來表示，例如K16R/Q意味著胺基酸序列中的第16位賴氨酸被精氨酸或穀氨醯胺替代。多重替代用「 + 」來表示，例如K40R+T1(^K意味著胺基酸序列包含第40位賴氨酸殘基用精氨酸殘基替代和第105位蘇氨酸殘基用賴氨酸替代。術語「功能性體內半衰期」以其常規含義使用，S卩如下的時間，此時身體/靶器官中仍然存在測試分子(例如PEG化的綴合物)的生物學活性的50%，或者如下的時間，此時多肽或綴合物的活性為初始值的50%。「血清半衰期」定義為如下的時間，其中50%的綴合物分子在被清除之前在血漿或血流中循環。血清半衰期的備選術語包括「血漿半衰期」、 「循環半衰期」、「血清清除」、「血漿清除」和「清除半衰期」。測試分子(例如PEG化的綴合物)通過網狀內皮系統(REQ、腎、脾或肝中一項或多項的作用，通過受體介導的降解，或者通過特異性或非特異性蛋白水解，特別是通過受體介導的清除和腎清除的作用被清除。通常，清除取決於尺寸(相對於腎小球過濾的截留)、電荷、附著的碳水化合物鏈、和針對蛋白質的細胞受體的存在。要保留的功能性通常選自增殖或受體結合活性。功能性體內半衰期和血清半衰期可通過本領域已知的任何合適方法來測定。術語「延長的」如述及體內半衰期或血清半衰期所使用的用於表示測試分子 (即多PEG化的G-CSF變體)的半衰期相對於參照分子諸如非綴合的(即非PEG化的) hG-CSF (例如Neupogen )或優選相對於單PEG化的G-CSFNeulasta 有統計學上顯著的延長，如在可比條件下測定的(通常在實驗動物，諸如大鼠、家兔、豬或猴中測定)。例如， 測試分子的血清半衰期(t1/2)可相對於參照分子延長至少約1.2倍(就是說(測試分子的 t1/2)/(參照分子的t1/2) = 1. 2)、例如至少約1. 4倍、諸如至少約1. 5倍、例如至少約1. 6倍、 諸如至少約1. 8倍、例如至少約2. 0倍、2. 5倍、3倍、5倍、或10倍，相對於參照分子而言。術語「AUC」或「曲線下面積」以其常規含義使用，即血清濃度對時間曲線下的面積， 其中已經對受試者施用測試分子。一旦確定了實驗濃度-時間點，可通過電腦程式諸如 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)方便地計算 AUC。術語「增大的」如述及 AUC 所使用的用於表示測試分子(即多PEG化的G-CSF變體)的AUC相對於參照分子諸如非綴合的hG-CSF (例如Neupogen )或優選相對於單PEG化的hG-CSF Neulasta 有統計學上顯著的增大，如在可比條件下測定的(通常在實驗動物，諸如大鼠、家兔、豬或腎中測定)。 例如，測試分子的AUC可相對於參照分子增大至少約1.2倍(就是說(測試分子的AUC)/ (參照分子的AUC) =1.2)，例如至少約1. 4倍、諸如至少約1. 5倍、例如至少約1. 6倍、諸如至少約1. 8倍、例如至少約2. 0倍、2. 5倍、3倍、5倍、或10倍，相對於參照分子而言。術語「受試者」指動物，諸如哺乳動物，包括非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、或犬)或靈長類動物(例如猴、黑猩猩、或人)諸如非人靈長類動物(例如猴或黑猩猩)、或人。在一些情況中，受試者是已經暴露於輻射的哺乳動物，諸如人。術語「受試者」與「患者」在本文中可互換使用。術語「急性輻射暴露」指在較短的時間段裡發生的暴露於輻射，即M小時以內(諸如不到20小時、不到16小時、不到12小時、不到10小時、不到8小時、不到6小時、不到2 小時、不到1小時、不到30分鐘、不到20分鐘、不到10分鐘、不到5分鐘、或不到1分鐘)。
急性輻射暴露可源自核事件(諸如核爆炸)；實驗室或製造事故；在幾分鐘或幾小時裡操作強放射源期間的暴露；或者意外的或有意的高醫療劑量。術語「輻射劑量」指被材料或組織吸收的總輻射量，一般以釐戈瑞(cGy)或戈瑞 (Gy)來表述。
術語「輻射劑量率」指單位時間吸收的輻射劑量。術語「 LDx/y 」指導致χ %的受試者到y天死亡的平均輻射劑量。例如，術語LD50/30 和LD50/60分別指導致50%的受試者到30天或60天死亡的平均輻射劑量。本文中定義或以其它方式表徵了多個別的術語。發明詳述本發明提供了一種用於在暴露於輻射的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的方法，其中該方法包括以有效減輕輻射誘發的嗜中性細胞減少症的量對所述患者施用多 PEG化的G-CSF變體。我們發現在經輻照的非人靈長類動物模型中施用多PEG化的G-CSF變體在縮短輻射誘發的嗜中性細胞減少症持續時間方面與施用單PEG化的hG-CSF(Neulasta ) 相比時更加有效。距絕對嗜中性細胞恢復(ANC)的時間的縮短與對照和單PEG化的 hG-csF(Neulasta )二者相比也有顯著改善。如本文中使用的，術語「距ANC恢復的時間」 定義為自化療第一天開始，直至受試者連續兩天計數超出0.切109個ANC細胞/L，即超出重度嗜中性細胞減少症的定義極限的第一天的天數。距ANC恢復的時間、白細胞減少症的持續時間/天數、和重度嗜中性細胞減少症的持續時間/天數都指示暴露於輻射的患者處於免疫遏制狀態的時段(術語「嗜中性細胞減少症的天數」和「重度嗜中性細胞減少症的天數」在本文中可互換使用)。在此時段期間，患者易受感染，這可加劇急性輻射症候群的其它症狀及可導致死亡。鑑於本文實施例中描述的結果，施用多PEG化的G-CSF變體比施用單PEG化的hG-CSF(Neulasta )在受試者中降低和縮短輻射誘發的嗜中性細胞減少症的程度和持續時間方面更加有效。本發明的方法有效地縮短距ANC恢復的時間、白細胞減少症的天數、和嗜中性細胞減少症的天數。在等同的劑量，該方法與單peg化的hG-CSF (Neulasta )相比時更加有效地縮短距ANC恢復的時間、白細胞減少症的天數、和嗜中性細胞減少症的天數。依照本發明的方法，多PEG化的G-CSF變體優選在輻射暴露之後7天之內施用。例如，多PEG化的G-CSF變體可以在輻射暴露之後約4天之內、諸如在輻射暴露之後3天之內、 例如在輻射暴露之後2天之內、諸如在輻射暴露之後1天04小時)之內施用。根據患者的預後，多PEG化的G-CSF變體可以在治療方案的過程裡施用兩次或更多次。例如，多PEG 化的G-CSF變體可以每周施用一次，持續例如兩周、三周或四周。由於多PEG化的G-CSF變體與非PEG化的hG-CSF (例如Neupogen )和單peg化的hG-CSF (例如Neulasta )相比卓越的生物利用度，多PEG化的G-CSF變體優選可以在較長的時間段裡施用，諸如例如每 10天、每2周、每18天、或每3周，這取決於患者的預後。多PEG化的G-CSF變體多PEG化的蛋白質可以以本領域公知的多種方式來製備。聚乙二醇(PEG)模塊對蛋白質或多肽的共價附著(即綴合)(「PEG化」)是一種用於改進此類蛋白質或多肽， 特別是藥用蛋白質的特性的公知技術，例如為了改善循環半衰期和/或遮蔽潛在表位及如此降低不想要的免疫原性應答的潛力。有眾多基於活化的PEG的技術可用於提供PEG模塊對蛋白質上一種或多種基團的附著。例如，mPEG-琥珀醯亞氨基丙酸酯(mPEG-SPA，可得自NektarTherapeutics) —般被看作選擇性地經醯胺鍵附著至N端和賴氨酸殘基的ε -氨基。如上所述，商品化的PEG化的G-CSF產品Neulasta 含有一個附著至G-CSF分子N端的20kDa PEG模塊。在一些實施方案中，本文所述多PEG化的G-CSF變體當在實驗動物諸如大鼠中測試時展現相對於單PEG化的G-CSFNeulasta (PEG非格司亭)改良的藥動學參數，諸如延長的血清半衰期和/或和增大的曲線下面積(AUC)。依照本發明，發現在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型中多PEG化的G-CSF變體優於單PEG化的G-CSFNeulasta ,在等同的劑量提供更短的距恢復的時間和更短的嗜中性細胞減少症/白細胞減少症時段。在一個實施方案中，依照本發明施用的多PEG化的G-CSF變體可以用胺特異性的活化的PEG來PEG化，該胺特異性的活化的PEG經醯胺鍵優先附著至N端氨基和/或賴氨酸殘基的ε-氨基。胺特異性的活化的PEG衍生物的例子包括mPEG-琥珀醯亞氨基丙酸酯 (mPEG-SPA)、mPEG_琥珀醯亞氨基丁酸酯(mPEG_SBA)和mPEG-琥珀醯亞氨基α -甲基丁酸酉旨(mPEG-SMB)(可得自 Nektar Therapeutics ；參見Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006,"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation，，)； PEG-SS(琥珀醯亞氨基琥珀酸酯)、PEG-SG(琥珀醯亞氨基戊二酸酯)、PEG_NPC(對硝基苯基碳酸酯)、和PEG-異氰酸酯，可得自SunBio Corporation ；及PEG-SCM，可得自NOF Corporation.聚乙二醇可以是線性的或分支的。用於獲得PEG化的蛋白質的方法是本領域公知的；參見例如NektarAdvanced PEGylation Catalog 2005-2006，通過述及而收入本文。PEG化的G-CSF變體和用於製備它們的方法例如記載於 WO 01/51510 ；WO 03/006501 ；US 6，646，110 ；US 6，555，660 和 US 6，831，158，每一篇通過述及而收入本文。在一個優選的實施方案中，多PEG化的G-CSF變體包含一個附著至N端的PEG模塊和至少一個附著至賴氨酸殘基的PEG模塊。在一個實施方案中，施用的多PEG化的G-CSF變體在SEQ ID NO 1的hG_CSF序列中包含至少一處替代以在想要PEG化的位置引入賴氨酸殘基。具體而言，賴氨酸殘基可經由一處或多處選自下組的替代來引入:T1K, Ρ2Κ，L3K，G4K，Ρ5Κ，Α6Κ，S7K，S8K，L9K，Ρ10Κ， Q11K, S12K, F13K, L14K, L15K, Ε19Κ, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, Α29Κ, Α30Κ, Ε33Κ, Α37Κ, Τ38Κ, Υ39Κ, L41K, Η43Κ, Ρ44Κ, Ε45Κ, Ε46Κ, V48K, L49K, L50K, Η52Κ, S53K, L54K, Ι56Κ, Ρ57Κ, Ρ60Κ, L61K, S62K, S63K, Ρ65Κ, S66K, Q67K, Α68Κ, L69K, Q70K, L71K, Α72Κ, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, Ε93Κ, G94K, S96K, Ρ97Κ, Ε98Κ, L99K, G100K, Ρ101Κ, Τ102Κ, D104K, Τ105Κ, Q107K, L108K, D109K, Α111Κ, D112K, F113K, Τ115Κ, Τ116Κ, W118K, Q119K, Q120K, Μ121Κ, Ε122Κ, Ε123Κ, L124K, Μ126Κ, Α127Κ, Ρ128Κ, Α129Κ, L130K, Q131K, Ρ132Κ, Τ133Κ, Q134K, G135K, Α136Κ, Μ137Κ, Ρ138Κ, Α139Κ, Α141Κ, S142K, Α143Κ, F144K, Q145K, S155K, Η156Κ, Q158K, S159K, L161K, Ε162Κ, V163K, S164K, Υ165Κ, V167K, L168K, Η170Κ，L171K，Α172Κ，Q17!3K和Ρ174Κ (其中殘基位置是相對於SEQ ID而1而言的)。優選的胺基酸替代的例子如此包括Q70K，Q90K, T105K, Q120K, T133K，S159K 和Hl 70K/Q/R中的一項或多項，諸如這些替代中的兩、三、四或五項，例如Q70K+Q90K， Q70K+T105K, Q70K+Q120K, Q70K+T133K, Q70K+S159K, Q70K+H170K, Q90K+T105K, Q90K+Q120K, Q90K+T133K, Q90K+S159K, Q90K+H170K, T105K+Q120K, T105K+T133K, T105K+S159K, T105K+H170K, Q120K+T133K, Q120K+S159K, Q120K+H170K, T133K+S159K, T133K+H170K, S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K, Q70K+Q90K+Q120K,Q70K+Q90K+S159K, Q70K+Q90K+H170K, Q70K+T105K+Q120K,
Q70K+Q90K+T133K, Q70K+T105K+T133K, Q70K+T105K+S159K, Q70K+Q120K+S159K, Q70K+Q120K+H170K, Q70K+S159K+H170K, Q90K+T105K+H170K, Q90K+Q120K+T133K, Q90K+T133K+S159K, Q90K+T133K+H170K, T105K+Q120K+S159K,
T105K+S159K+H170K, Q120K+T133K+S159K,
Q70K+T105K+H170K, Q70K+Q120K+T133K, Q70K+T133K+S159K, Q70K+T133K+H170K,
Q90K+Q120K+S159K, Q90K+Q120K+H170K, Q90+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K,
Q120K+T133K+H170K, Q120K+S159K+H170K,
Q90K+T105K+Q120K, Q90K+T105K+T133K, Q90K+T105K+S159K,
T105K+Q120K+H170K, T105K+T133K+S159K, T105K+T133K+H170K,
T133K+S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K+Q120K， Q70K+Q90K+T105K+T133K， Q70K+Q90K+T105K+S159K, Q70K+Q90K+T105K+H170K, Q70K+Q90K+Q120K+T133K, Q70K+Q90K+Q120K+S159K, Q70K+Q90K+Q120K+H170K, Q70K+Q90K+T 133K+S 159K, Q70K+Q90K+T 133K+H170K, Q70K+Q90K+S159K+H170K, Q70K+T105K+Q120K+T133K, Q70K+T105K+Q120K+S159K, Q70K+T105K+Q120K+H170K, Q70K+T105K+T133K+S159K, Q70K+T105K+T133K+H170K, Q70K+T105K+S159K+H170K, Q70K+Q120K+T133K+S159K, Q70K+Q120K+T133K+H170K, Q70K+T133K+S159K+H170K, Q90K+T105K+Q120K+T133K, Q90K+T105K+Q120K+S159K, Q90K+T105K+Q120K+H170K, Q90K+T105+T133K+S159K, Q90K+T105+T133K+H170K, Q90K+T105+S159K+H170K, Q90K+Q120K+T133K+S159K, Q90K+Q120K+T133K+H170K, Q90K+Q120K+S159K+H170K, Q90K+T133K+S159K+H170K, T105K+Q120K+T133K+S159K, T105K+Q120K+T133K+H170K, T105K+Q120K+S159K+H170K, T105K+T133K+S159K+H170K 或 Q120K+T133K+S159K+H170K。在任何上文所列變體中，替代 H170K可改為H170Q或H170R。引入賴氨酸特別優選的替代包括110 和S159K之一或二者ο 在又一個實施方案中，可改變G-CSF多肽以產生如下的G-CSF變體，其中消除位置16，23，34和40中的一個或多個天然賴氨酸殘基以避免這些位置的PEG化。例如，消除一個或多個這些賴氨酸殘基可經由替代，優選用精氨酸或穀氨醯胺殘基，更優選用精氨酸殘基。優選地，經由替代消除位置16，34和40處的一個或多個賴氨酸殘基，更優選消除兩個或三個這些賴氨酸，且最優選消除此位置的所有三個賴氨酸，通過替代。如此，在一個優選的實施方案中，G-CSF變體包含SEQ ID NO=I的序列及至少一處選自下組的替代 K16R，K16Q，K34R, K34Q, K40R 禾口 K40Q ；就是說，至少一處選自下組的替代K16R/Q，K34R/ Q和K40R/Q。在一個特別優選的實施方案中，變體包含替代K16R/Q+K34R/Q+K40R/Q，諸如例如 K16R+K34R+K40R 或 K16Q+K34R+K40R 或 K16R+K34Q+K40R 或 K16R+K34R+K40Q 或 K16Q+K34Q+K40R 或 K16R+K34Q+K40Q 或 K16Q+K34Q+K40Q。在另一個實施方案中，G-CSF變體包含至少一處替代以引入賴氨酸殘基連同至少一處替代以消除賴氨酸殘基，如上所述。在另一個實施方案中，多PEG化的G-CSF變體包含位置16，34和40處的一個或多個賴氨酸殘基的替代，諸如用精氨酸或穀氨醯胺殘基，例如精氨酸殘基，及一處或多處選自 Q70K，Q90K, T105K, Q120K, T133K，和S159K的替代，而且綴合有2-6個、諸如2-4個聚乙二醇模塊，每個具有約1000-10，OOODa的分子量。在另一個實施方案中，多PEG化的G-CSF變體含有一處或多處選自K16R，K34R和K40R的替代，及一處或多處選自Q70K，Q90K, T105K, Q120K, T13;3K和S159K的替代，而且綴合有2-6個、諸如2-4個聚乙二醇模塊，每個具有約1000-10，OOODa的分子量。在另一個實施方案中，多PEG化的G-CSF變體包含位置16，34和40處的一個或多個賴氨酸殘基的替代，諸如用精氨酸或穀氨醯胺殘基，例如精氨酸殘基，及至少一處選自110 和S159K的替代，而且綴合有2-6個、諸如2_4個聚乙二醇模塊，每個具有約 1000-10, OOODa 的分子量。在另一個實施方案中，多PEG化的G-CSF變體包含一處或多處選自K16R，K34R和 K40R的替代，及至少一處選自110 和S159K的替代，而且綴合有2_6個、諸如2_4個聚乙二醇模塊，每個具有約1000-10，OOODa的分子量。在一個特別的實施方案中，多PEG化的G-CSF變體包含替代K16R，K34R，K40R， T105K和S159K，而且綴合有2-6個、諸如2_4個分子量為約1000-10，OOODa的聚乙二醇模塊。在一個特別的實施方案中，多PEG化的G-CSF變體可附著有2_6個、通常2_5個、 諸如2-4個分子量約5000-6000Da的聚乙二醇模塊，例如分子量約5kDa的mPEG。優選地， 多PEG化的G-CSF變體附著有2-4個分子量約5000_6000Da的聚乙二醇模塊，例如5kDa mPEG。適合於在本發明的方法中使用的一種特別優選的多PEG化的G-CSF變體包含替代 K16R，K34R, K40R, T105K和S159K，而且含有2-4個PEG模塊，每個具有約5kDa的分子量， 諸如3個此類PEG模塊。在一個實施方案中，可生成多PEG化的G-CSF變體，使得只附著有一種數目的PEG 模塊，例如2，3，4或5個PEG模塊每個綴合物，或得到附著有不同數目的PEG模塊的期望的綴合物混合物，例如具有2-5，2-4，3-5，3-4，4-6,4-5或5_6個附著的PEG模塊的綴合物混合物。如上所述，一種優選的綴合物混合物的一個例子是如下的混合物，具有2-4個約5kDa 的PEG模塊，例如每個綴合物主要附著有3個PEG模塊的綴合物，但是有小比例的綴合物附著有2或4個PEG模塊。會理解，具有特定數目的附著的PEG模塊的綴合物，或具有限定範圍數目的附著的PEG模塊的綴合物的混合物可通過選擇合適的PEG化條件及任選地通過使用後續純化分出具有期望數目的PEG模塊的綴合物來獲得。分出具有不同數目的附著的PEG模塊的G-CSF 綴合物的方法以及用於測定附著的PEG模塊的數目的方法的例子記載於例如WO 01/51510 和TO 03/006501，均通過述及而收入本文。為了本發明的目的，如果在SDS-PAGE凝膠上進行的分開顯示沒有顯示或只是不顯著地顯示與給定數目的PEG模塊對應的條帶以外的條帶，那麼綴合物可視為具有給定數目的附著的PEG模塊。例如，如果運行綴合物樣品的 SDS-PAGE凝膠顯示與3個PEG基團對應的主要條帶，而且只是不顯著地顯示或優選不顯示與2或4個PEG基團對應的條帶，那麼該樣品視為具有3個附著的PEG基團。 在一些情況中，胺特異性活化的PEG衍生物諸如mPEG-SPA可能不是專門經醯胺鍵附著至N端和賴氨酸殘基的ε -氨基，而是還經酯鍵附著至絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基的羥基。因此，PEG化的蛋白質可能不具有足夠程度的均一性，而且可能含有意圖以外的多種不同PEG異構體。此類經酯鍵結合的PEG模塊通常會是不穩定的，而且可通過美國臨時專利申請No. 60/686，726 (通過述及而收入本文)中記載的方法來除去，其涉及使PEG化的多肽經受升高的PH，時間段足以除去不穩定的附著至羥基的PEG模塊。此方法還記載於USSN11/420，美國專利No. 7,381,805)和WO 2006/U8460，均通過述及而收入本文。在一個優選的實施方案中，多PEG化的G-CSF變體是PEG位置異構體種類的混合物。如本文中使用的，術語蛋白質的「PEG位置異構體」指蛋白質的不同PEG化形式，其中PEG 基團位於蛋白質的不同胺基酸位置。本發明的實踐中採用的一種優選的多PEG化的G-CSF 變體是賴氨酸/N端PEG異構體的混合物。蛋白質的術語「賴氨酸/N端PEG異構體」意味著 PEG基團附著於蛋白質的氨基端和/或蛋白質中的賴氨酸殘基的ε-氨基。例如，短語「具有3個附著的PEG模塊的賴氨酸/N端PEG位置異構體」，如應用於G-CSF的，意味著G-CSF PEG位置異構體的混合物，其中三個PEG基團附著至蛋白質的賴氨酸殘基的ε _氨基和/或 N端。典型地，「具有3個附著的PEG模塊的賴氨酸/N端PEG位置異構體」會有兩個PEG模塊附著至賴氨酸殘基和一個PEG模塊附著至N端。對PEG位置異構體的分析可使用陽離子交換HPLC來實施，如記載於W02006/U8460的，通過述及而收入本文。典型地，PEG位置異構體種類的混合物是賴氨酸/N端PEG位置異構體的基本上純化的混合物。多肽的「賴氨酸/N端PEG位置異構體的基本上純化的混合物」指已經經受層析或其它純化規程以清除雜質諸如非賴氨酸/N端PEG位置異構體的賴氨酸/N端PEG位置異構體混合物。「賴氨酸/N端PEG位置異構體的基本上純化的混合物」會例如不含最不穩定的附著於羥基的PEG模塊(它們在其它情況中在本文所述部分去PEG化步驟和後續純化缺失下會存在)，而且通常會含有少於約20%的含有不穩定的附著於羥基的PEG模塊的多肽，更通常為少於約15%。優選地，含有不穩定的附著至羥基的PEG模塊的多肽會少於約 10%，例如少於約5%。優選地，PEG位置異構體種類的混合物是G-CSF變體的PEG位置異構體的同質混合物。術語「多肽(G-CSF)變體的PEG位置異構體的同質混合物」意味著不同PEG位置異構體的多肽模塊是相同的。這意味著混合物的不同PEG位置異構體均基於一種多肽變體序列。例如，PEG化的G-CSF多肽變體的PEG位置異構體的同質混合物意味著混合物的不同 PEG位置異構體基於一種G-CSF多肽變體。典型地，G-CSF變體的PEG位置異構體的同質混合物展現實質性均一性。如本文中使用的，「均一性」指PEG化的多肽在不同位置異構體(即含有不同數目的在不同位置處附著的PEG模塊的不同多肽異構體)的數目以及這些位置異構體的相對分布方面的同質性。 對於意圖用於治療人或動物的藥用多肽，通常希望不同PEG位置異構體和不同PEG化種類的數目是最小限度的。在一個實施方案中(在下文實施例中稱作「MaXy-G21」)，多PEG化的G-CSF變體是PEG位置異構體的混合物，其中G-CSF變體構件具有SEQ IDNO 1的胺基酸序列及替代 K16R，K;34R，K40R，T1(^K和S159K (相對於SEQID NO 1)，包含每個具有4或5個附著的PEG 模塊的位置異構體，包括Ser66或Tyrl65之一或二者處的不穩定的PEG模塊，以及N端處及位置K23，K105和K159之一或之二處的穩定的PEG模塊。在本文中稱作Maxy-G21的多 PEG化的G-CSF變體包含的PEG模塊是mPEG_SPA (Nektar)，均具有5000Da的平均分子量。術語「部分去PEG化」在本文中指除去不穩定的附著至羧基的PEG模塊，而更加穩定的附著至N端或賴氨酸殘基的氨基的PEG模塊保持不動。用於進行此類工藝的方法記載於 USSN 60/686, 726 ；USSN 11/420，546 (美國專利 No. 7，381，805)；和 WO 2006/128460，均通過述及而收入本文。
在另一個實施方案中(在下文實施例中稱作「Maxy-G34」)，多PEG化的G-CSF變體是PEG位置異構體的混合物，其中G-CSF變體構件具有SEQ IDNO 1的胺基酸序列及突變 K16R, K34R, K40R, T105K和S159K(相對於SEQID NO :1)，而且其中至少80%的混合物含有 2種PEG位置異構體，每種附著有3個PEG模塊，其中一種異構體的PEG基團附著於N端、 Lys 23和Lys 159且另一種異構體的PEG基團附著於N端、Lysl05和Lysl59。在本文中稱作Maxy-G34的多PEG化的G-CSF變體包含的PEG模塊是mPEG_SPA (Nektar)，每個均具有 5000Da的平均分子量。對於上文所述任何實施方案，G-CSF變體和多PEG化的G-CSF變體可任選包括添加至N端的甲硫氨酸殘基。在別的實施方案中，要依照本發明施用的多PEG化的G-CSF變體可以如任何下述所述製備，均通過述及而收入本文· WO 89/058 (G-CSF的賴氨酸刪除變體)· US 5，824，778(有至少一個PEG分子共價附著至多肽的至少一個胺基酸的 G-CSF,附著經由所述胺基酸的羧基)· WO 99/03887 (PEG 化的 G-CSF 半胱氨酸變體)· WO 2005/055946( 「糖-PEG化」G-CSF綴合物，有經完整糖基連接基團連接的 PEG模塊)· WO 2005/070138(包含突變肽序列的G-CSF多肽，該序列編碼相應野生型多肽中不存在的0連接的糖基化位點)· US 2005/0114037 Al (有至少一個聚合模塊的G-CSF，該聚合模塊附著在多個不同規定胺基酸位置中的至少一個處)在另一個實施方案中，要依照本發明施用的多PEG化的G-CSF變體展現與單PEG 化的hG-CSF，Neulasta 相比改良的藥動學特性，諸如延長的血清半衰期和/或增大的 AUC0優選地，多peg化的G-CSF變體展現血清半衰期或AUC延長/增大Neulasta 血清半衰期或AUC至少約1. 2倍，例如延長/增大單peg化的hG-csF，Neulasta 的至少約1. 4 倍、諸如至少約1. 5倍、例如至少約1. 6倍、諸如至少約1. 8倍、例如至少約2. 0倍、2. 5倍、 3倍、5倍、或10倍。輻射暴露和處理A.輻射暴露對造血系統的影響。輻射事故情況提供了在設計緊急狀況準備模型和經重度輻照的個體的處理策略中有用的數項限定特徵。身體位置、偶然遮蔽和相對於源的距離會對任何個體組導致單側的、不均勻的和異質的暴露。另外，暴露與處理啟動之間的時間間隔可能不及最佳值。這些暴露方面強調了確定精確吸收劑量的難度；用於建立傷員鑑別分類和處理的基礎及另外處理對生物劑量確定法的影響未知。關於輻射暴露，合理的是假設上述特徵預報高度可變的劑量分布，有可能防護(sparing)骨髓衍生的造血幹和祖細胞(「BM衍生HSC和HPC」)和胸腺組織，由此增強造血和淋巴樣再生響應及時施用造血生長因子(「HGF」)的潛力。造血系統是急性全身輻照(TBI)後對輻射最敏感且限制劑量的器官系統。HSC和 HPC以劑量依賴性指數方式被殺死，具有最低限度修復能力，指示暴露劑量的適度增加就導致不成比例升高的HSC和HPC傷亡。成熟的、更加分化的細胞比高度增殖性幹和祖細胞對輻射更有抗性。已經提出HSC的一個子集對輻射有相對抗性。HSC和HPC的細胞殺死的指數式、劑量依賴性性質，連同不均勻輻射暴露及因此活躍骨髓間的可變劑量分布的現實，提示小或適度比例的HSC和HPC以及各BM(成骨細胞)、血管和胸腺(上皮細胞)小生境的細胞會在造血症候群中的潛在致死劑量的輻射後存活，而且順從本文所述治療辦法。源自核爆炸或事故的急性暴露有可能會是單側的，不均勻的，而且有一定程度的部分身體遮蔽。因此，位於骨髓和血管小生境(niche)內的一部分HSC和HPC可能不暴露或只暴露於顯著更低劑量的輻射。有動物模型中的一致資料庫，證明了部分身體或不均勻輻照的防護效應(sparing effect)。單側暴露能導致單側對雙側暴露的LD50/30值(導致 50%受試者在30天內死亡的平均輻射劑量)升高大約20%。還必須以生物學術語評估輻射源的方向。由於大部分活躍骨髓在年輕成人的肋骨和骨盆的背面及脊柱中，背側暴露使骨髓損害最大化。相反，由於大量活躍骨髓的腹側遮蔽，腹側暴露使骨髓損害最小化。不均勻暴露不應當視為像骨髓的部分身體遮蔽那樣有效。這是重要的，原因在於輻射劑量與HSC/ HPC存活之間的指數關係，例如全身劑量減半不是將HSC存活提高至50%，而只是至10%。B.輻射劑量非人靈長類動物(「NHP」)中急性的，輻射誘發的造血症候群的資料庫衍生自涉及 250千伏峰(kVp)X-輻射或Co-60伽馬和2兆伏(MV) X-輻射全身輻照(TBI)的實驗。Co-60 伽馬輻射誘發的致死率的資料庫是一項在1967年實施的未發表的實驗(n = 90 NHP)。 Dalrymple et al. Radiation Res. 25 :377_400，1965 使用 2MV X-輻射來建立TBI 和造血症候群致死率的劑量-應答關係。這兩項研究充當基礎來建立不接受支持護理的暴露於伽馬輻射或高能X-射線OMV)的NHP中輻射誘發的造血症候群致死率的劑量-應答關係。此資料庫充當對照分組，自其能選擇出單劑輻射和具有一定程度必然性的相關致死率。自這些較早研究獲得的 NHP 的 LD50/30 值分別為 6. 40Gy[6. 06，7. 75]和 6. 65Gy[6. 00，10. 17](括號[]中為95%置信區間(Cl))。為了比較，暴露於250kVp X射線TBI的NHP的各LD50/30 值為大約4. SOGy，證明了較低能量X-射線(即Dalrymple實驗中使用的2MV X-射線)的 X-輻照的相對生物學效果。關於人類全身或有效部分身體輻照的效果的數據必然是從過去的核事故收集的， 諸如廣島爆炸和車諾比事故。此類數據保存於輻射緊急狀況援助中心/培訓站(REAC/ TS) (Oak Ridge, Tennessee)處的登記簿。基於此數據，由於絕對淋巴細胞計數(ALC)在暴露於穿透輻射後不久下降，因此開發了一種通過測定48小時時段裡淋巴細胞計數的降低速率來評估個體中的輻射劑量的方法(Goans R. E.，et al. Health Phys. 81 =446-449, 2001)。此類評估需要兩次或更多次相距4至6小時間隔的ALC測定。在此類測量不切實際的情況中，諸如在大量傷亡的情況中，輻射劑量的另一項評估基於輻射暴露之後，受試者嘔吐之前的時間長度。Berger，Μ. Ε. et al. Occupational Medicine56 :162-172，2006)提供了一張表，顯示了暴露於至少2Gy的急性全身輻照的個體大多數(70-90% )會在暴露後 1至2小時內嘔吐，而基本上暴露於至少4Gy的輻射的個體100%會在1小時內嘔吐；而暴露於至少6Gy的輻射的個體會在30分鐘內嘔吐。嚴重性和距與急性全身輻射暴露有關的其它身體症狀(諸如體溫、頭痛、腹瀉)發作的時間也列表於Berger et al.，(supra) 0C.支持護理使用抗生素、流體、血液產品、鎮痛藥和營養物是暴露於骨髓抑制和致死劑量輻射的患者的「標準護理」。單獨的支持護理，諸如抗生素、全血或血小板輸注、流體和營養物能顯著增強經輻照受試者的存活。支持護理和暴露於致死劑量輻射的動物中造血症候群存活之間的關係已經在犬科動物中證明，但是在非人靈長類動物(NHP)中沒有。Byron等人的一項研究證明了單獨的抗生素方案在暴露於100%致死劑量的恆河猴/獼猴中顯著提高存活至72%的能力。另外，巴爾的摩的馬裡蘭大學(UMB)和武裝部隊放射生物學研究所 (AFRRI)的Mac Vittie/Farese實驗室確立了支持護理對自下文所述資料庫估算的單劑致死TBI(LD70/30)的效果。這些數據顯示，當施用支持護理時，經來自Co-60伽馬輻射，劑量等同於LD70/30 (即在支持護理缺失下導致70%受試者在30天中死亡的劑量)的TBI輻照的NHP將30天裡的死亡數降低至大約14%受試者(即LD 1V30)。用暴露於250kVp X-射線TBI的恆河猴/獼猴實施了相似的研究(MacVittie/Farese UMB實驗室)。添加單獨的支持護理將與6. OOGy TBI有關的估算70%致死率降低至9%。使用如上所述不接受支持護理的NHP中輻射誘發的造血症候群致死率的劑量-應答研究中獲得的結果來設計一項最近的盲的、輻射劑量隨機化的研究，以確定接受支持護理的NHP中的致死劑量應答關係(實施例1)。LD50/60的所得值為7. 52Gy，而無支持的歷史對照分組的LD50/60為大約6. 50Gy。這有助於確認支持護理的存活增強效果，以及提供劑量關係來確定施用支持護理(在其它情況中在造血症候群內稱作醫療管理)的暴露於致死劑量輻射的NHP的各LD30/60、LD50/60和LD70/60劑量。此存活增強效果取決於兩個條件。第一，存活的HSC和HPC必須能夠自發再生，第二，造血恢復必須在臨界的、臨床可管理的時間段內導致功能性嗜中性細胞和/或血小板的生成。D.造血生長因子在ARS的治療中的作用有骨髓抑制和/或致死輻射暴露的小型和大型動物模型的一個可觀且一致的資料庫，這些模型證明了造血生長因子(HGF)在以它們的最佳時間表施用且與支持護理組合時顯著改善存活及嗜中性細胞和血小板的恢復，超過對單獨的支持護理所記錄的。 MacVittie實驗室先前確立了單獨的以及與G-CSF施用聯合的支持護理在以誘發完全造血症候群的水平暴露於Co-60 TBI的犬中的效用。沒有支持護理時的LD50/30為2. 60Gy，它在有支持護理時提高至3. 38Gy，而且在以其最佳施用時間表添加G-CSF時進一步提高至 4. 88Gy。此研究使用輻照的標準實驗室模型，其涉及中等劑量率的均勻TBI。施用HGF的常規時間表是在輻照後M小時內早期啟動處理，及繼續每日施用以確保造血祖細胞的再生及嗜中性細胞和/或血小板的生成。然而，就核爆炸或事故後的處理而言一種更加現實的時間表是輻照後48-72小時延遲的施用。已經實施了多項臨床前研究來評估延遲的HGF施用的效果。大多數這些研究顯示造血應答的量級因HGF施用和輻照之間延長的時間間隔而顯著減輕。連同G-CSF和PEG化的G-CSF，ARS的治療中有時使用的其它HGF包括粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、FLT3配體(FL)、白介素-3 (IL-3)、巨核細胞生長和發育因子(MGDF)、血小板生成素(TPO)、TPO受體激動劑、 禾口紅細胞生成素(EPO) (Drouet, M. et al. ，Haematologica 93 (3) 465—466，2008 ；Herodin F.et al. ,Experimental Hematology；35 :1172-1181，2007)。在這些中，作為單一藥劑，只有 G-CSF和GM-CSF當前可用於治療經潛在致死輻照的人員，如果在標籤以外(「off-label」) 使用的話。這些HGF有可能會被首先建議FDA在FDA 「動物規則」(AR)下批准。對HGF 「雞尾酒」的考慮必須包括對各自毒性和暴露後施用時間的分析。E.動物模型系統中輻射誘發的嗜中性細胞減少症的治療中的多PEG化的G-CSF變體恆河猴中輻射誘發的血細胞減少症已經被證明是一種用於研究藥劑在治療血小板減少症和嗜中性細胞減少症中的功效的有效模型系統。在實施例2中描述的研究中，單次注射依照本發明的一種例示性多PEG化的G-CSF變體(在本文中鑑別為「MaXy-G21」)誘導顯著的外周血總的有核細胞、嗜中性細胞、單個核細胞增多，及顯著的集落形成細胞動員入外周血中。與暴露於6. OGy TBI的對照動物(它們展現14. 8-15. 2天的嗜中性細胞減少症時段)相比，在TBI後M小時以劑量300 μ g/kg施用Maxy-G21的動物展示顯著縮短的嗜中性細胞減少症時段，7.3士 1. 1天。嗜中性細胞減少症的持續時間以動物具有低於500/ μ L的觀察或估算ANC的天數來測定。ANC最低值(定義為第一劑測試化合物後至少2天發生的第一個最低觀察或估算ANC)也自對照動物中的49 士 22/ μ L顯著改善至140 士45/ μ L。 距恢復的時間(以自研究第1天至首次連續2天觀察或估算ANC為500/ μ L或以上的天數來測定)類似地自對照值21. 2士0. 4天改善至Maxy-G21處理分組中的15. 5士0. 3天。與包括研究內Neulasta 組和一個歷史分組(n = 9)的組合Neulasta 分組相比，Maxy-G21顯著縮短嗜中性細胞減少症的持續時間(p = 0. 02)以及距恢復的時間。抗生素需要也顯著不同於Neulasta 組，即Maxy-G21處理分組只需要抗生素9. 8天，而組合 Neulasta 處理分組需要抗生素支持14. 7天。實施例2中描述的研究證明了給恆河猴皮下施用依照本發明的一種例示性多PEG 化的G-CSF變體(在本文中鑑別為Maxy-G21)在經輻照的NHP中顯著縮短嗜中性細胞減少症時段。另外，當與包括研究內Neulasta 分組和一個歷史Neulasta 分組(N = 9)的分組相比時發現該效果超過Neulasta 。藥動學數據提供了證據，即在經輻照的獼猴中，多PEG 化的G-CSF變體展現與Neulasta 相比顯著延長的血漿半衰期(圖4)。Hi數據如此支持該工作假說，即在經歷重度輻射誘發的骨髓抑制狀態的NHP中以及在健康的(未輻照的) NHP中，多PEG化的G-CSF變體具有比單PEG化的hG_CSF，Neulasta 要大的生物利用度。總之，發現多PEG化的G-CSF變體在非人靈長類動物中顯著縮短輻射誘發的嗜中性細胞減少症時段。另外，當與一個歷史Neulasta 分組相比時發現嗜中性細胞減少症時段的縮短超過Neulasta 。通過依照本發明的方法施用多PEG化的G-CSF變體，顯著縮減了輻射誘發的嗜中性細胞減少症的程度和持續時間。在實施例3描述的研究中，小鼠暴露於多種足以殺死20%未處理對照動物(7. 76 Gy ；LD20/30)或45%未處理對照動物(7. 96Gy ；LD45/30)的劑量的輻射。在TBI後第一天， 動物以20 μ g/20g小鼠的劑量施用依照本發明的一種例示性多PEG化的G-CSF變體(在本文中鑑別為「Maxy-G34」)或稀釋劑。在第7天及在一些動物中在第14天重複服藥。在 LD20/30水平和LD45/30水平的輻照後施用多PEG化的G-CSF變體的小鼠展現與未處理動物相比顯著更大的30天後百分比存活(分別為圖5和6)。實施例2和3呈現的研究證明了依照本發明的多PEG化的G-CSF變體在兩種動物模型系統中有效縮減輻射誘發的嗜中性細胞減少症的程度和持續時間及延長存活。多PEG 化的G-CSF變體可如此有效治療與危及生命的輻射暴露有關的嗜中性細胞減少症，如發生核緊急情況事件時的ARS。
多PEG化的G-CSF變體的施用A.齊[Jfi依照本發明施用的多PEG化的G-CSF變體的劑量一般會是與單PEG化的 hG-csF (Neulasta )在化療應用中當前批准的劑量(為6mg/成人患者，例如100 μ g/kg 60kg患者)相似的數量級。多PEG化的G-CSF變體的一種適宜劑量因此涵蓋在約Img至約30mg、諸如約2mg至約20mg、例如約3mg至約15mg的範圍中。一種合適的劑量可以如此為例如約lmg、約2mg、約3mg、約6mg、約9mg、約12mg、約15mg、約20mg、或約30mg。或者， 劑量可以基於患者的重量，使得多PEG化的G-CSF變體的一種適宜劑量涵蓋在約20 μ g/kg 至約500 μ g/kg、諸如約30 μ g/kg至約400 μ g/kg、諸如約40 μ g/kg至約300 μ g/kg、例如約50 μ g/kg至約200 μ g/kg的範圍中。一種合適的劑量可以如此為例如約20 μ g/kg、約 30 μ g/kg、約 40 μ g/kg、約 50 μ g/kg、約 60 μ g/kg、約 75 μ g/kg、約 100 μ g/kg、約 125 μ g/ kg、約 150 μ g/kg、約 175 μ g/kg、約 200 μ g/kg、約 250 μ g/kg、約 300 μ g/kg、約 400 μ g/kg、 或約500 μ g/kg。多PEG化的G-CSF變體優選在輻射暴露後儘可能早地施用，例如在輻射暴露後7天內、在4天內、在3天內、在2天內(即在48小時內)或更優選在1天內(即在 24小時內)。根據疾病的性質及患者的預後和響應，可以在前次施用後1-4周之間(例如約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約M天、約觀天)給予多PEG化的G-CSF變體的第二次和可能的第三次施用。多PEG化的G-CSF變體的施用的精確劑量和頻率會取決於多種因素，諸如多PEG 化的G-CSF變體的比活性和藥動學特性，以及所處理的狀況的性質和嚴重性(諸如輻射暴露的水平和/或持續時間、暴露的身體的區域和量、輻射的類型、ARS相關症狀的嚴重性)及本領域技術人員知道的其它因素。通常，劑量應當能夠預防或減輕/縮短受試者中嗜中性細胞減少症的程度和/或持續時間。此類劑量可以稱作「有效」或「治療有效」量。對本領域技術人員會顯而易見的是，本發明的多PEG化的G-CSF變體的有效量取決於所處理的狀態的嚴重性，劑量，施用時間表，是單獨地還是與其它治療劑組合地施用多PEG化的G-CSF 變體，多PEG化的G-CSF變體的血清半衰期和其它藥動學特性，以及患者的體型、年齡、和一般健康，等等。施用的劑量和頻率可以由本領域技術人員使用已知技術來確定。B.藥物組合物依照本發明施用的多PEG化的G-CSF變體可以以包括一種或多種藥學可接受載體或賦形劑的組合物來施用。多PEG化的G-CSF變體可以以本身本領域已知的方式配製成藥物組合物，產生貯存足夠穩定且適合於對人或動物施用的藥劑。藥物組合物可配製成多種形式，包括液體或凝膠，或凍幹的，或任何其它合適形式。優選的形式會取決於所處理的具體適應症，而且對於本領域技術人員會是顯而易見的。「藥學可接受」意味著載體或賦形劑在所採用的劑量和濃度在施用它的患者中不引起任何不當效果。此類藥學可接受載體和賦形劑是本領域公知的(參見例如 Remington 『 s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A. R. Gennaro, Ed.，Mack Publishing Company(1990) ；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides 禾口 Proteins, S.Frokjaer and L Hovgaard， Eds. ， Taylor &Francis(2000)；及 Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A. Kibbe，Ed. ,Pharmaceutical Press (2000))。C.胃腸外組合物
藥物組合物的一個例子是設計用於胃腸外施用(例如通過皮下路徑)的溶液。雖然在許多情況中藥物溶液配製劑以適合於立即使用的液體形式提供，但是此類胃腸外配製劑也可以以冷凍的或以凍幹的形式提供。在前一種情況中，組合物必須在使用前融化。後一種常常用於提高組合物中含有的活性化合物在極其多種貯存條件下的穩定性，正如本領域技術人員認可的，凍幹製劑一般比它們的液體對應物要更加穩定。此類凍幹製劑在使用前通過添加一種或多種合適的藥學可接受稀釋劑諸如無菌注射用水或無菌生理鹽水溶液來重建。在胃腸外的情況中，它們通過恰當地混合具有期望純度的多肽與一種或多種本領域通常採用的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑(都稱作「賦形劑」)(例如緩衝劑、穩定劑、 防腐劑、等張劑(isotonifier)、非離子型去汙劑、抗氧化劑和/或其它多種多樣的添加劑) 來製備，作為凍幹配製劑或水溶液，供貯存。緩衝劑幫助將pH維持在近似生理條件的範圍中。它們通常以範圍為約2mM至約 50mM的濃度存在。適合與本發明一起使用的緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物、等)、琥珀酸鹽緩衝劑(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物、等)、酒石酸緩衝劑(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物、等)、延胡索酸鹽緩衝劑(例如延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物、等)、葡萄糖酸鹽緩衝劑(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物、等)、草酸鹽緩衝劑(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物、等)、乳酸鹽緩衝劑(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物、等)和乙酸鹽緩衝劑(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物、等)。別的可能有磷酸鹽緩衝劑、組氨酸緩衝劑和三甲胺鹽諸如Tris。添加防腐劑來延遲微生物生長，而且通常以約0. 2% -1% (w/v)的量添加。適合與本發明一起使用的防腐劑包括酚、苄醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、 氯化十八烷基二甲基苄基銨、苄烷胺(benzalkonium)滷化物(例如苄烷胺氯化物、溴化物或碘化物)、氯己雙銨、對羥基苯甲酸烴基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。添加等張劑來確保液體組合物的等張性，而且包括多羥基糖醇，優選三羥基或更高級的糖醇，諸如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。多羥基醇可以以介於 0. 和25% (以重量計)之間，通常至5%的量存在，考慮到其它組分的相對量。穩定劑指一大類賦形劑，其功能的範圍可以自增量劑至溶解治療劑或幫助防止變性或粘附至容器壁的添加劑。典型的穩定劑可以是多羥基糖醇(上文列舉的)；胺基酸，諸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸、等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油、等，包括環多醇諸如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫的還原劑，諸如脲、穀胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即< 10個殘基)；蛋白質，諸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；單糖，諸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，諸如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖，諸如棉子糖；和多糖，諸如右旋糖酐。穩定劑通常以基於活性蛋白質重量而言0. 1至10，000份重量的範圍存在。非離子型表面活性劑或去汙劑(也稱作「溼潤劑」)可以存在來幫助溶解治療劑以及保護治療性多肽免於攪動誘導的聚集，這還容許配製劑暴露於剪切表面應力而不引起多肽變性。合適的非離子型表面活性劑包括聚山梨酯(20、80、等)、？0170份11^1^(184、188、 等)、Pluronic 多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖單醚(Tween _20、Tween -80、等)。別的多種多樣的賦形劑包括增量劑或填充劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、 抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。活性組分也可封裝在例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠囊中(例如羥甲基纖維素、明膠或聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或在粗滴乳狀液中。此類技術披露於 Remington' s Pharmaceutical Sciences， supra。要用於體內施用的胃腸外配製劑必須是無菌的。這例如通過過濾穿過無菌濾膜來容易地實現。本發明通過下面的非限制性實施例來進一步描述。 實施例實施例1 致死輻射劑量應答及支持護理在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的非人靈長類動物模型中的效果。下面描述了一項初步研究，其設計用來在暴露於劑量漸增的全身電離輻射(TBI) 並接受支持護理(也稱作「醫療管理(medical management)")的恆河猴/獼猴(rhesus macaque)中限定劑量應答。此研究設計用來評估1.暴露於致死劑量的LINAC衍生6MV (平均能量，2MV)光子的TBI加醫療管理的恆河猴/獼猴的LD50/30和支持輻射-劑量存活曲線，和2.醫療管理對單獨的TBI的各LD50/30和劑量應答關係的影響，與歷史數據集相比。材料和方法使用6 兆伏(MV) LINAC 光子源(Varian model #EX_21)(平均 2MV 光子)以 80士2. 5cGy/min的劑量率使四十八08)只雄性恆河猴暴露於雙側、均勻、全身輻照(TBI)。 給動物(每種輻射劑量2-8隻的組)輻照六種隨機劑量的TBI 7. 20Gy，7. 55Gy，7. 85Gy, 8. 05Gy，8. 40Gy和8. 90Gy。提供的醫療管理包括抗生素、流體、輸血、營養支持、止瀉藥、抗潰瘍藥、解熱藥和疼痛管理。經輻照的動物在TBI後觀察60天。主要醫學相關參數是60天死亡率。次要中點是關鍵嗜中性細胞和血小板(PLT)相關參數，包括各嗜中性細胞和血小板最低值，嗜中性細胞減少症(ANC < 500/μ 1)和血小板減少症(PLT 1，000/ μ 1和PLT > 20, 000/ μ 1的時間。還記錄ANC < 100/μ 1的日子和持續時間。其它參數包括發熱(溫度彡103° F) 的天數、有記錄的感染的發病率、熱性嗜中性細胞減少症和死者的均值存活時間(MST)。對48隻暴露於TBI的雄性恆河猴/獼猴收集60天的數據，6個劑量組，每組8隻動物，為7.20, 7. 55，7. 85，8. 05，8. 40和8. 90Gy。計算每個劑量組的死亡率。使用SAS第9版來實施描述性分析和對數回歸，並使用SPLUS第6. 2版來實施LD 評估。對數回歸分析是雙側進行的，主效應的α水平為0.05而邊際效應為0.10。呈現了計數數據的頻率和百分比；呈現了連續數據的均值、標準偏差、中值、最小值和最大值。對數回歸分析及作為結果的60天死亡率測試劑量的影響，計算是使用劑量的自然對數實施的。結果Α.輻射劑量和致死率四十八08)只雄性恆河猴/獼猴在七個分組中(分組1，η = 2 ；分組2，η = 6 ； 分組3至7，n = 8)在7. 20Gy至8. 90Gy的劑量範圍上進行輻照並施用醫療管理。總共48 只動物中有三十二(32)只(66. 6% )死於造血症候群。劑量應答關係呈現於圖1和表1。 輻射劑量是死亡率的重要預報項(P = 0. 01)，升高的死亡率實現於較高的劑量。表1 恆河猴/獼猴中輻射暴露後的百分比存活和均值存活時間
權利要求
1.一種用於在經受輻射暴露的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的方法，包括在該輻射暴露之後對該患者施用多PEG化的G-CSF變體，其中該多PEG化的G-CSF變體包含展現G-CSF活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO :1所示胺基酸序列相差至多15個胺基酸殘基的胺基酸序列，和兩個或更多個聚乙二醇(PEG)模塊，每個PEG模塊直接地或間接地共價附著至該多肽的胺基酸殘基。
2.權利要求1的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體包含SEQID NO 1的胺基酸序列和至少一處選自下組的相對於SEQ ID NO 1的替代=TlK, Ρ2Κ，L3K，G4K，Ρ5Κ，Α6Κ，S7K， S8K, L9K, Ρ10Κ, Q11K, S12K, F13K, L14K, L15K, Ε19Κ, Q20K, V21K, Q25K, G26K, D27K, Α29Κ, Α30Κ, Ε33Κ, Α37Κ, Τ38Κ, Υ39Κ, L41K, Η43Κ, Ρ44Κ, Ε45Κ, Ε46Κ, V48K, L49K, L50K, Η52Κ, S53K, L54K, Ι56Κ, Ρ57Κ, Ρ60Κ, L61K, S62K, S63K, Ρ65Κ, S66K, Q67K, Α68Κ, L69K, Q70K, L71K, Α72Κ, G73K, S76K, Q77K, L78K, S80K, F83K, Q86K, G87K, Q90K, Ε93Κ, G94K, S96K, Ρ97Κ, Ε98Κ, L99K, G100K, Ρ101Κ, Τ102Κ, D104K, Τ105Κ, Q107K, L108K, D109K, Α111Κ, D112K, F113K, Τ115Κ, Τ116Κ, W118K, Q119K, Q120K, Μ121Κ, Ε122Κ, Ε123Κ, L124K, Μ126Κ, Α127Κ, Ρ128Κ, Α129Κ, L130K, Q131K, Ρ132Κ, Τ133Κ, Q134K, G135K, Α136Κ, Μ137Κ, Ρ138Κ, Α139Κ, Α141Κ, S142K, Α143Κ, F144K, Q145K, S155K, Η156Κ, Q158K, S159K, L161K, Ε162Κ, V163K, S164K, Υ165Κ, V167K, L168K, Η170Κ, L171K, Α172Κ, Q173K 和 Ρ174Κ。
3.權利要求2的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列包含至少一處選自下組的替代:Q70K, Q90K, T105K Q120K, T133K, S159K 和 H170K。
4.權利要求2的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列進一步包含至少一處選自下組的替代K16R/Q，K34R/Q和K40R/Q。
5.權利要求3的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列包含替代K16R， K34R, K40R, T105K 和 S159K。
6.權利要求5的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列由替代K16R， K34R，K40R, T105K和S159K以及任選和N端處的甲硫氨酸殘基組成。
7.權利要求1的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體包含2_6個PEG模塊，每個具有約I-IOkDa的分子量。
8.權利要求7的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體包含附著至N端的PEG模塊和附著至賴氨酸殘基的PEG模塊。
9.權利要求7的方法，其中所述多PEG化的G-CSF包含2_4個PEG模塊，每個具有約 4-6kDa的分子量。
10.權利要求1的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列包含一處或多處選自 K16R/Q，K34R/Q 和 K40R/Q 的替代和一處或多處選自 Q70K，Q90K, T105K, Q120K, T133K 和S159K的替代，且包含2-6個附著的PEG模塊，每個具有約I-IOkDa的分子量。
11.權利要求10的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列包含一處或多處選自K16R/Q，K34R/Q和K40R/Q的替代和至少一處選自110 和S159K的替代，且包含 2-4個附著的PEG模塊，每個具有約I-IOkDa的分子量。
12.權利要求11的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體的胺基酸序列包含替代K16R， K34R，K40R，T105K和S159K，且包含2_4個附著的PEG模塊，每個具有約4_6kDa的分子量。
13.權利要求13的方法，其中所述多PEG化的G-CSF變體是PEG位置異構體種類的混合物。
14.權利要求13的方法，其中所述PEG位置異構體種類混合物包含至少2種PEG位置異構體，每個具有3個附著的PEG模塊，其中所述異構體之一具有在N端，Lys23和Lysl59 處附著的PEG模塊，且其它異構體具有在N端，Lysl05和Lysl59處附著的PEG模塊。
15.權利要求14的方法，其中所述PEG模塊每個具有約I-IOkDa的分子量。
16.權利要求15的方法，其中所述PEG模塊每個具有約5kDa的分子量。
17.權利要求1的方法，其中當在動物模型中在可比條件下測試時所述多PEG化的 G-CSF變體展現與Neulasta (PEG非格司亭)相比改良的藥動學特性。
18.權利要求17的方法，其中在動物模型中所述多PEG化的G-CSF變體展現與 Neulasta 相比延長的血清半衰期。
19.權利要求17的方法，其中在動物模型中所述多PEG化的G-CSF變體展現與 Neulasta 相比增大的AUC。
20.權利要求1的方法，其中以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統中在用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效縮短重度嗜中性細胞減少症持續時間的量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
21.權利要求1的方法，其中以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統中在用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效增加輻射暴露後30天的存活者數目的量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
22.權利要求1的方法，其中以約20ug/kg患者體重至約300ug/kg患者體重的劑量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
23.權利要求1的方法，其中所述患者是成年人且以自約l_30mg每患者起的劑量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
24.權利要求1的方法，其中施用一種或多種別的造血生長因子。
25.權利要求M的方法，其中所述別的造血生長因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，幹細胞因子SCF)，FLT3配體(FL)，白介素_3(IL_3)，巨核細胞生長和發育因子(MGDF)，血小板生成素(TPO)，TPO受體激動劑和紅細胞生成素(EPO)。
26.權利要求1的方法，其中在所述輻射暴露之後約3天之內對所述受試者施用所述多 PEG化的G-CSF變體。
27.權利要求1的方法，其中所述輻射暴露等於或大於約IGy。
28.多PEG化的G-CSF變體在製備用於在經受輻射暴露的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的藥物中的用途，包括以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統中在用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效縮短重度嗜中性細胞減少症持續時間的量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
29.多PEG化的G-CSF變體在製備用於在經受輻射暴露的患者中治療或預防嗜中性細胞減少症的藥物中的用途，包括以在輻射誘發的嗜中性細胞減少症的動物模型系統中在用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組中相對於不用所述多PEG化的G-CSF變體處理的組有效增加輻射暴露後30天的存活者數目的量對所述患者施用所述多PEG化的G-CSF變體。
30.依照權利要求28或四的用途，其中所述動物模型系統是非人靈長類動物模型系統。
31.依照權利要求觀-30任一項的用途，其中所述多PEG化的G-CSF變體及其用途如權利要求1-27任一項中所限定的。
全文摘要
本發明涉及一種用於在暴露於輻射的患者中治療或預防輻射誘發的嗜中性細胞減少症的方法，其通過對該患者施用多PEG化的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)變體來進行。
文檔編號A61K47/48GK102215876SQ200980146030
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月18日 優先權日2008年9月19日
發明者託馬斯.J.麥克維蒂, 格蘭特.約尼希羅 申請人:馬克西根公司