生產伽馬-羧化的蛋白的方法
2023-11-01 04:09:02 5
專利名稱：生產伽馬-羧化的蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼Y-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列。本發明進一步涉及以高產量生產需要Y-羧化作用的蛋白的方法。
背景技術：
出血是常見的臨床問題。它是疾病、外傷、手術和藥物治療的結果。機械性地阻止出血是必要的。由於出血的位置或由於從許多(小)脈管散開，這是非常困難的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的試劑治療。這可以是血液衍生產品(血治療，heamotherapy)、引起內源止血劑的釋放的試劑、重組凝結因子(F)或延遲血液凝塊分解的試劑。通常從地方醫院獲得的血液衍生產品之中第一線的治療(first line treatment)是用於容量置換和支持止血的全血，包裝的紅細胞用於改善氧轉運容量，血小板濃縮物以提高血小板數量(如果數量低或有缺陷)和新鮮的冷凍血漿用於支持止血(血液凝結和血小板聚集)。支持止血的第二線的血漿衍生產品是血漿冷沉澱物、凝血酶原複合物濃縮物、活化的凝血酶原複合物濃縮物和純化的凝結因子。作為人類重組蛋白，無活性的 (凝結因子VIII和IX)和活化的(凝結因子Vila)，一些凝結因子當今是可獲得的。血友病是遺傳的或後天的出血失調，有異常的或缺陷的凝結因子或抑制促凝血功能的針對凝結因子的抗體。最常見的血友病是血友病A(缺乏凝結因子VIII)和血友病 B(因子IX)。提純的或重組的單獨的凝結因子是血友病病人的主要治療手段。有抑制性抗體的病人遇到了治療難題，因為抗體也可以中和向該病人施用的凝結因子。通過降解活化的凝結因子Va和Villa，蛋白C的活性形式(APC)是血漿凝結的抑制物。已經顯示重組的APC是敗血症病人中不適當的血漿凝結的有效治療手段。儘管純化過程並不簡單和需要許多步驟，某些步驟目的在於消除汙染的病毒，用於治療用途的凝結因子可以從人類血漿獲得。但是儘管有血液衍生產品的大量的安全性測量和測試，也無法排除感染性病毒或朊病毒的汙染。由於這種風險，非常期望從無動物衍生成分的培養基中生長的重組細胞中產生人類治療性蛋白。這不總是簡單的，因為許多蛋白需要哺乳動物宿主來以完全功能性的形式產生，即，被正確地翻譯後修飾。在重組細胞中商業化生產的凝結因子有FVII (NovoSeven)、FVIII (Kogenate，Recombinate, Refacto)和 FIX (BeneFix)(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11 :169-177，1997)和 Active Protein C(Xigris)。在獲取大量的全功能重組人凝結因子時的一個主要障礙在於FII、FVII, FIX、FX和蛋白C中存在的Gla結構域。這個結構域含有通過添加羧基基團翻譯後修飾的穀氨酸殘基。這些因子的生產受到如下事實的妨礙，即它們的過量表達引起羧化不足，由此產生無活性的蛋白。Gla修飾是被稱為Y-穀氨醯羧化酶(GGCX)的維生素K依賴性酶的作用的結果。許多科學家，特別是那些致力於凝結因子研究的科學家已經對這個酶進行了廣泛的研究(W0-A-8803^6 ;Wu et al. Science 254 (5038) 1634-1636，1991 ； Rehemtulla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 90 :4611-4615,1993 ；Stanley J. Biol. Chem. 274(24) : 16940-16944，1999 ；Vo et al.，FEBSletters 445 :256-260,1999 ；Begley et al. ,The Journal of Biological Chemistry 275(46) :36245-36249,2000 ；Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276 (11) :7769-7774,2001 ；Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3) : 1264—1269，2002 ；Czerwiec et al. ,EurJ Biochem 269 :6162-6172,2002 ；Hallgren et al. , Biochemistry 41 (50) :15045-15055,2002 ； Harvey et al. , The Journal of Biological Chemistry 278(10) :8363-8369,2003)。至少兩個科學團隊已經進行了通過與凝結因子FIX共表達GGCX來提高產量的嘗試，但是沒有成功(Rehemtulla, et al. 1993, ibid ；Hallgren et al. 2002，ibid)。考慮到在 Y _ 羧化蛋白方面的巨大興趣，可以推測有更多的共表達試驗失敗了並因此沒有被報導。對於人類FII (凝血酶原)，為了獲得全功能的凝血酶原，10個Glu殘基中的至少 8 個必需被正確地修飾(Malhotra，et al.，J. Biol. Chem. 260 :279-287,1985 ；Seegers and Walz' Prothrombin and other vitamin K proteins' , CRC Press, 1986)。獲得 rhFII的高生產水平的廣泛的努力已經利用了幾種不同的系統，例如，CHO細胞、BHK細胞、 293細胞和牛痘病毒表達系統，但是都失敗了或產生了羧化不足的產物，因而是功能上無活性的凝血酶原 ΦΕΘηβΘη et al.，J.Biol· Chem. 262 :6729-6734,1987 ；Russo et al.， Biotechnol Appl Biochem 14(2) :222-233,1991 ；Fischer et al.,J Biotechnol 38(2) 129-136,1995 ；Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3) :358-364,1996 ；Russo et al.,Protein Expr. Purif. 10 :214-225,1997 ；Vo et al. 1999,ibid；Wu and Suttie Thromb Res 96(2) :91-98,1999)。較早報導的羧化的重組人類凝血酶原的生產能力很低；突變凝血酶原 20mg/L (Cote et al.，J. Biol. Chem 269 :11374-11380,1994)，在 CHO 細胞中表達的人類凝血酶原0. 55mg/L(完全羧化的，J(trgensen et al. 1987，同上)，在CHO細胞中的 25mg/L(羧化的程度未顯示，Russo et al. 1997，同上)。WO 92/19636公開了人類和牛的維生素K依賴性羧化酶的克隆和序列鑑定。該申請建議在適合的宿主細胞中共表達維生素K依賴性羧化酶和維生素K依賴性蛋白來製備維生素K依賴性蛋白。沒有例舉羧化酶和維生素K依賴性蛋白的共表達。需要改進的方法來以高產量生產活化的凝血因子。本發明要解決這種需求。
發明內容
根據本發明的第一個方面，提供了包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的(associated)包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼Y-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和 Y-穀氨醯羧化酶以至少10 1的比例表達。
根據本發明的另一個方面，提供了細胞，其被工程化以表達(i)需要伽馬-羧化作用的蛋白，和(ii) Y-穀氨醯羧化酶，其中所述蛋白(i)和( )以10 1到500 1之間的比例表達。根據本發明的另一個方面，提供了遺傳地修飾的真核宿主細胞，其包含(i)編碼Y-穀氨醯羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白編碼序列可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達Y-穀氨醯羧化酶蛋白；和(ii)編碼需要所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達所述需要羧化作用的蛋白；其中所述細胞能夠以至少1 10的比例表達所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。根據本發明的進一步的方面，提供了載體，所述載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包括第一啟動子的表達控制序列，和編碼Y-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶以至少10 1的比例表達。根據本發明的又另一個方面，提供了生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造(adapted)來以至少10 1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。在一個實施方式中，該方法用於生產伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中該方法用於生產伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述生產的伽馬-羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。根據本發明的另一個方面，提供了在哺乳動物細胞系中生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳動物細胞系中使所述需要伽馬-羧化作用的蛋白與Y-穀氨醯羧化酶共表達的步驟，其中表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量至少是表達的Y-穀氨醯羧化酶的數量的10倍，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。在一個實施方式中，該方法用於生產伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中該方法用於生產伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述生產的伽馬-羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。根據本發明的進一步的方面，提供了根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白，根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白在凝結治療中的用途，或根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白用於製造用於凝結治療(coagulation therapy)的藥物的用途。根據本發明的再進一步的方面，提供了生產適合於誘導血液凝固或促進增加的或減少的凝結的藥物組合物的方法，包括純化從宿主細胞表達的活性羧化的蛋白，所述宿主細胞被改造來以10 1到500 1之間的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，和將所述純化的羧化蛋白與一種或多種藥學上可接受的載體(carrier)或賦形劑混合，以及可從該方法獲得的藥物組合物。在一個實施方式中，所述活性羧化的蛋白是伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中所述活性羧化的蛋白是伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述活性羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。
附圖Ia說明了 PN32 (凝血酶原+GGCX)共表達載體的質粒圖。附圖Ib表示了 Ptext5 (凝血酶原)表達載體的質粒圖。附圖2表示了 PP6 (凝血酶原+GGCX)共表達載體的質粒圖。附圖3a表示了 F9NopA(因子IX+GGCX)共表達載體的質粒圖。附圖北表示了 F9hglx(因子IX+GGCX)共表達載體的質粒圖。
具體實施例方式我們設計了高水平表達適當羧化的重組維生素K依賴性凝血因子的不同方法，包括以不同的比例共表達維生素K依賴性凝結因子和Y-穀氨醯羧化酶(GGCX)。作為一個實例，我們表達了人類凝血酶原(rhFII)和人類GGCX。與其他人(Rehemtulla et al.，1993， 同上；Hallgren et al.，2002，同上)已經嘗試的對rhFII和GGCX都使用強啟動子不同，我們使用一種策略，旨在強表達FII結合弱或極弱表達GGCX，使得表達的GGCX的數量是表達的rhFII的1/10以下。出乎我們意料，這種策略引起了高水平的、分泌的正確修飾的rhFII 和宿主細胞的良好生存力，即使是細胞在無動物成分的化學成分明確的培養基中生長時。我們已經以這樣的方式將GGCX和人類凝血酶原克隆到表達載體中，以使凝血酶原mRNA水平超過GGCX mRNA水平的至少9倍。這引起了與GGCX蛋白相比產生大量過剩的凝血酶原蛋白。作為進一步的實例，我們使用相同的GGCX共表達載體表達了 rhFIX。這產生了細胞系，在一種情況中細胞系產生因子IX mRNA的水平超過GGCX mRNA水平的至少9倍。在另一個細胞系中，因子IX GGCX mRNA比例大約4-5 1。僅有產生至少10 1的比例的細胞系顯示了顯著提高的rhFIX生產力(表1)。表1.生產力和羧化的蛋白GGCX mRNA比例的總覽
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權利要求
1.一種包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼Y-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶以至少10 1的比例表達。
2.如權利要求1中所要求的宿主細胞，其中所述核酸分子在單個表達載體中。
3.如權利要求1或2中所要求的宿主細胞，其中所述第一啟動子是人類巨細胞病毒 (hCMV)即時-早期啟動子，和所述第二啟動子是SV40早期啟動子。
4.一種細胞，其被工程化以表達(i)需要伽馬-羧化作用的蛋白，和(ii) Y-穀氨醯羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10 1到500 1之間的比例表達。
5.如權利要求1到4中任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白選自由凝結因子VII、凝結FVII、凝結因子IX、凝結FIX、凝血酶原、凝結因子II、凝結FII、 凝結因子X、凝結FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基質Gla蛋白、生長停滯-特異性蛋白6和Acanthophiinae FXa-樣蛋白構成的組。
6.如權利要求1到4的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是維生素K依賴性凝結因子。
7.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子IX。
8.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子X。
9.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
10.如權利要求1到9的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是人類蛋白。
11.如權利要求1到10的任何一個所要求的細胞，其中Y-穀氨醯羧化酶是人類蛋白。
12.如權利要求1到11的任何一個所要求的細胞，其中所述細胞選自由哺乳動物細胞、 酵母細胞或昆蟲細胞構成的組。
13.如權利要求12所要求的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
14.一種遺傳修飾的真核宿主細胞，包括(i)編碼Y-穀氨醯羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白編碼序列可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達Y-穀氨醯羧化酶蛋白；和(ii)編碼需要所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達所述需要羧化作用的蛋白；其中所述細胞能夠以至少1 10的比例表達所述Y-穀氨醯羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。
15.一種載體，包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼Y-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶以至少10 1的比例表達。
16.如權利要求3中所要求的載體，其中所述第一啟動子是人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期啟動子，和所述第二啟動子是SV40早期啟動子。
17.如權利要求3或4中所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白選自由凝結因子VII、凝結FVII、凝結因子IX、凝結FIX、凝血酶原、凝結因子II、凝結FII、凝結因子 X、凝結FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基質Gla蛋白、生長停滯-特異性蛋白6和 Acanthophiinae FXa-樣蛋白構成的組。
18.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子IX。
19.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子X。
20.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
21.—種生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少 10 1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
22.—種在哺乳動物細胞系中生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳動物細胞系中使所述需要伽馬-羧化作用的蛋白與Y-穀氨醯羧化酶共表達的步驟，其中表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量至少是表達的Y-穀氨醯羧化酶的數量的10倍，和(ii) 分離伽馬-羧化的蛋白。
23.根據權利要求21或22中要求的方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白。
24.根據權利要求21或22生產的分離的羧化的蛋白在凝結治療中的用途。
25.根據權利要求21或22生產的分離的羧化的蛋白在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
26.—種生產適合於誘導血液凝固或促進增加的或減少的凝結的藥物組合物的方法， 包括純化從宿主細胞表達的活性羧化的蛋白，所述宿主細胞被改造來以10 1到500 1 之間的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和Y-穀氨醯羧化酶，和將所述純化的羧化蛋白與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合。
27.可從權利要求沈的方法獲得的藥物組合物。
28.—種生產伽馬-羧化的人類因子X的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10 1的比例表達人類因子X和人類Y-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的因子X。
29.根據權利要求觀生產的分離的因子X在凝結治療中的用途。
30.根據權利要求觀生產的分離的因子X在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
31.包含可從權利要求觀的方法獲得的伽馬-羧化的人類因子X的藥物組合物。
32.—種生產伽馬-羧化的人類因子IX的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10 1的比例表達人類因子IX和人類Y-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的因子IX。
33.根據權利要求32生產的分離的因子IX在凝結治療中的用途。
34.根據權利要求32生產的分離的因子IX在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
35.包含可從權利要求32的方法獲得的伽馬-羧化的人類因子IX的藥物組合物。
36.一種生產伽馬-羧化的人類凝血酶原的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10 1的比例表達人類凝血酶原和人類Y-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的凝血酶原。
37.根據權利要求36生產的分離的凝血酶原在凝結治療中的用途。
38.根據權利要求36生產的分離的凝血酶原在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
39.包含可從權利要求36的方法獲得的伽馬-羧化的人類凝血酶原的藥物組合物。
40.一種在受試者中促進提高或降低的凝結的方法，包括向有此需要的病人施用藥理學有效量的、通過權利要求21或22的方法獲得的分離的伽馬-羧化的蛋白。
全文摘要
本發明涉及生產大量的伽馬-羧化的蛋白的方法和工具，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
文檔編號C12N9/64GK102443548SQ20111024138
公開日2012年5月9日 申請日期2004年10月12日 優先權日2003年10月14日
發明者A·勒夫格倫, A·特林, C·芬格 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司