肝素輔助因子Ⅱ製劑及其製備方法
2023-11-30 16:46:31 2
專利名稱：肝素輔助因子Ⅱ製劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及高純度肝素輔助因子Ⅱ(以下稱作「HCⅡ」)製劑及其製備方法。更詳細地說，本發明涉及基本上不含低分子化因子特別是蛋白酶，進而不含低分子化HCⅡ的含高純度HCⅡ的製劑及其製備方法。
背景技術：
HCⅡ是由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到的分子量約72 KDa的單鏈血漿糖蛋白，其cDNA的鹼基序列也已經鑑定(J.Biol.Chem.，257，2162-2169，1982；Nucleic Acids Res.，14，1073～1088，1986)。HCⅡ的生理功能尚未完全闡明，但它是一種特異性抑制凝血酶的抗凝物質。在血中具有抗凝血酶作用的蛋白質人們知道的主要是抗凝血酶Ⅲ(以下稱作「ATⅢ」)。但認為HCⅡ與ATⅢ的作用部位不同，作為血管內皮細胞下的血管中膜的凝血酶抑制物質起作用，而非存在於血管內皮細胞上。(Thromb.Res.，62，409-419，1991)HCⅡ可用於預防及治療引起血流異常的各種疾病、敗血症和各種臟器功能損害及各種炎症等(特開平9-176040號公報)。
HCⅡ是從全血漿、血漿級分或重組宿主細胞培養物等純化而成。在純化時除去其中的雜物，例如HCⅡ以外的血漿成分和宿主細胞內成分。除此之外還有多聚化及片段化(低分子化)HCⅡ。多聚化HCⅡ沒有活性，而且一般情況下，施用蛋白多聚體時能引起休克，血壓降低等不希望出現的副作用。據報導，低分子化的HCⅡ是在以人血漿為原料純化時混入的(J.Biol.Chem.，260，2218～2225，1985)。而且，在肝素或硫酸皮膚素存在下，缺少N末端67殘基的HCⅡ可大幅度降低凝血酶抑制速度(Thoromb.Haemost.，74，1209-1214，1995)。也就是說，低分子化的HCⅡ活性低。進而就低分子化蛋白的一般性質來看，低分子化HCⅡ可能具有抗原性，並且因為其半衰期短，不可能顯示長期效果。
基於以上報導及發明人的預備知識，導致HCⅡ低分子化的最重要因素(即低分子化因子)，是血漿或宿主細胞內的蛋白酶。例如，從人血漿的Cohn’s乙醇分級分離法得到級分Ⅰ上清液和級分Ⅱ+Ⅲ上清液，以此為原料純化HCⅡ時，除72 KDa分子之外混入了66 KDa和60 KDa的低分子化HCⅡ片段。因為是HCⅡ分子內賴氨酸殘基的羧基側肽鍵被切斷，所以推斷這些低分子化HCⅡ片段是由於血漿中特異性肽鏈內切酶的作用生成的。
即使將低分子化HCⅡ從完整HCⅡ中分離除去，如果在最後的製劑中夾雜了蛋白酶的話，在保存期間也會進一步發生HCⅡ的低分子化。也有在製劑中添加蛋白酶抑制劑的手段，但是，從臨床使用的角度考慮，還是希望儘可能將蛋白酶除掉。而且，從抗原性這一因素考慮，也有必要把來自於重組宿主細胞的蛋白酶除掉。然而，以往的HCⅡ純化法是不能夠將HCⅡ與蛋白酶完全分離的。
因此，本發明的目的就是提供基本上不含蛋白酶等低分子化因子的HCⅡ製劑及其製備方法。進而提供基本上不含低分子化HCⅡ的HCⅡ製劑及其製備方法。本發明的另一個目的是提供基本上不含多聚化HCⅡ或著色劑的HCⅡ製劑。進而，本發明的另一個目的是提供純度在98％以上。優選超過99％的純化HCⅡ製劑及其製備方法。另外，本發明的另一個目的是提供基本上不含具有感染力病毒的上述各HCⅡ製劑及其製備方法。
發明公開本發明基於以下的發現，即使用疏水性層析分離、水溶性多聚體處理、鹽析以及用鹼性胺基酸為配體的親和性層析分離技術中的一種或兩種以上的處理法，處理含HCⅡ和蛋白酶等低分子化因子的溶液，能高效率地分離HCⅡ和低分子因子。進而，在上述步驟前或後，進行經肝素固定的親和性層析分離及陰離子交換層析分離，並接著進行超微過濾及/或凝膠過濾層析分離等項處理，能夠得到基本上不含低分子化因子、多聚化或低分子化HCⅡ及著色劑並且純度超過98％，最優選為超過99％的HCⅡ溶液。該HCⅡ溶液經除病毒或滅活處理能夠製備出對製劑中HCⅡ無不良影響並且不含具有感染力病毒的HCⅡ製劑。
也就是說，本發明提供基本上不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HCⅡ及著色劑中至少一種的HCⅡ製劑。優選基本上不含有低分子化因子及低分子化HCⅡ的HCⅡ製劑，更優選基本上不含多聚化HCⅡ及/或著色劑的HCⅡ製劑。而且，本發明提供HCⅡ純度超過98％；優選超過99％的HCⅡ製劑。進而，本發明提供基本上不含具有感染力病毒的上述各HCⅡ製劑。
另外，本發明的其他部分是HCⅡ製劑的製備方法。這種造法包含由HCⅡ及低分子因子的溶液中分離HCⅡ和低分子因子的步驟，特別是由下述一種或兩種以上處理法組成的步驟。這種處理法包括疏水性層析分離處理、水溶性多聚物分離處理、鹽析及以鹼性胺基酸為配體的親和性層析分離處理。本發明還包括除去低分子化HCⅡ的步驟，特別是包括凝膠過濾處理步驟的HCⅡ製備法。另外，本發明是上述HCⅡ製劑的製備方法。它包括通過過濾處理，加熱處理或表面活性劑處理中至少一種方法除去病毒或失活處理的步驟，優選包含用多孔性中空纖維進行過濾處理的步驟。
附圖簡述
圖1顯示的是含有HCⅡ級分的凝膠過濾層析圖。其中該HCⅡ級分是經固相化肝素處理及陰離子交換層析分離得到的。
圖2顯示的是凝膠層析分離設計的有效HCⅡ純化部分的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳圖(1，3道分子量標記，2道非還原HCⅡ，道4還原HCⅡ)。
圖3顯示的是凝膠層析分離得到的有效HCⅡ純化級分的高效液相層析分析圖。
實施發明的最佳方式本發明HCⅡ製劑中所含的HCⅡ指的是一種蛋白質。該蛋白質須SDS-PAGE分離時，在分子量72 KDa的位置上用肉眼觀察顯示一個單一的條帶，並且在高效液相層析圖中給出一個單一的峰，等電點約為5，具有抑制凝血酶、糜蛋白酶及組織蛋白酶的作用。因此，本發明的HCⅡ(以下為區分多聚化及低分子化HCⅡ，有時特意稱作「有效HCⅡ」)只需滿足上述各性質即可，而並不限定於具有全長的胺基酸序列的分子(完整分子)。
本發明的HCⅡ製劑的原料-含有HCⅡ的溶液，只要是含有適當量的與上述各項性質相符的HCⅡ即可，而並不特殊限定其來源，可以包括來自於天然血漿的或經基因技術重組宿主細胞產生的HCⅡ。作為來源於血漿的HCⅡ，例如從全血漿、高活性HCⅡ的血漿級分得到。優選Cohn’s乙醇分級分離上清液Ⅰ、上清液Ⅱ+Ⅲ或上清液Ⅳ得到。而且，對於血漿的生物起源也不作限制，例如從人或牛得到，但最好使用人的血漿。
來源於重組宿主細胞的HCⅡ溶液，可以從培養宿主細胞的培養物中獲得，例如，培養液、細胞提取液、培養液上清部分。上述培養宿主細胞已經用編碼天然血漿中HCⅡ的基因進行轉化得到的。宿主細胞沒有特別限制。較優選的有大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌等細菌、酵母等真菌、動植物細胞、昆蟲細胞等。另外，也有以自組入編碼HCⅡ基因的轉基因動物的體液得到。
在本發明中，低分子化因子指的是能引起HCⅡ片段化的化學及酶的因素，而不包括高溫、低溫、物理性切割力等物理性因素。具體而言，如蛋白酶、糖鏈或者是唾液酸分解酶及強酸，強鹼等。在以含HCⅡ溶液作為原料來源時，主要的低分子化因子是蛋白酶。
本發明的製備方法的特點是包含一種從HCⅡ及低分子化因子混合液中分離該兩者的步驟。該步驟包括疏水性層析分離、水溶性多聚物分離處理、鹽析或以鹼性胺基酸為配體的親和性層析分離。這些方法既可單獨使用，也可組合起來使用。
疏水性層析分離處理是在pH6～9的條件下，將含有HCⅡ及低分化因子的溶液與疏水性層析用載體接觸，進行分離。疏水性層析用載體典型例子有碳數為4～18的烷基型(例如，丁基型、辛基型、辛癸基型等)、苯基型。丁基型有丁基瓊脂糖、丁基聚乙烯(商品名Bytyl-Toyopearl，Tosoh產)等。辛基癸基型有辛基癸基瓊脂糖。苯基型有苯基纖維素(商品名Phenyl celofine，生化學株式會社)等。使用該處理法，HCⅡ在未吸附部分被回收，低分子化因子則吸附到載體上。
水溶性多聚分離處理是將水溶性多聚物加入到HCⅡ及低分子化因子的混合液中，進行分離處理。其中水溶性多聚物的濃度為1～30％(w/v)，優選濃度為3～20％(w/v)，更優選的濃度為6～12％(w/v)。通過該法處理，HCⅡ留在溶液中，低分子化因子被沉澱。將處理液離心分離或過濾，回收上清液，即可將低分子化因子從HCⅡ中分離除去。在此所指的水溶性多聚物是指聚乙二醇(PEG)和非離子性表面活性劑。PEG的平均分子量以4000～6000為好。另外表面活性劑有聚氧乙烯(160)聚丙(30)二醇、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯等。
鹽析處理是將0.05M～0.25M的鹽類加入到HCⅡ及低分子化因子的混合液中進行處理。其中鹽類為鈉、鉀、鋇、銨等的鹽類，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等。優選鹽析處理法可舉例表示為加入0.05～0.2M的氯化鋇溶液。通過該法處理，HCⅡ留在溶液中，低分子化因子被沉澱。經離心分離或過濾該處理液，回收上清液，可將低分子化因子從HCⅡ中分離除去。
以鹼性胺基酸為配體的親和性解說分離是在pH 6-9的條件下，將HCⅡ及低分子化因子的混合液與固相化的解說載體接觸進行的分離方法。其中，固相化的層析載體是以賴氨酸、精氨酸等鹼性胺基酸作配體，但是，最好用賴氨酸、該載體為多糖類、矽膠、纖維等構成的不溶性支持物。詳細地講它們為瓊脂、瓊脂糖、交聯瓊脂糖，纖維素、二氧化矽、尼龍、親水性乙烯聚合物等。通過該處理，HCⅡ在未吸附級分被回收，低分子化因子吸附到載體上。
為使低分子化HCⅡ的生成限制在最小程度，並使其後的純化更容易進行。同時提高HCⅡ的回收率，分離HCⅡ與低分子化因子的步驟在純化的早期階段進行最優選。
本發明的優選實施方案為，HCⅡ及低分子化因子的混合液先接觸固相化肝素。使HCⅡ結合到肝素上。固相化肝素是結合到固相上的單體肝素。其中，固相為多糖類、矽膠、纖維素等不溶性支持物。舉例說明有瓊脂、瓊脂糖、交聯瓊脂糖、纖維素、二氧化矽、尼龍、親水性乙烯聚合體以及在該領域內眾所周知的其他物質。進行固相化肝素處理並不限於分離HCⅡ與低分子化因子的步驟之前，在分離之後也可以進行。經該項處理，一部分多聚體HCⅡ及低分子化HCⅡ可與單體HCⅡ(有效HCⅡ)分級分離並被除去。在本發明中，多聚化HCⅡ指的是無生理活性、對肝素的親和力低的HCⅡ的聚合體。更具體地說，是二聚體或多聚體。
HCⅡ先用鹽濃度0.05～0.2M的緩衝溶液清洗後，再用不同濃度的緩衝溶液將HCⅡ從固相化肝素中洗脫出。其中鹽的濃度為0.05～1.0M，優選為0.1～0.5M，更優選為0.1～0.2M。另外，用緩衝溶液清洗HCⅡ時，較優選的是逐級提高鹽濃度，反覆清洗幾次。用於配製離子強度的鹽的成分有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、硫氰酸鈉、硫酸鈉等。優選的是氯化鈉。另外，該緩衝溶液的pH調整到6～9。
本發明更優選的實施方案是將含有HCⅡ的溶液進一步用陰離子交換層析分離進行處理。所用的陰離子交換體可舉例說明為DEAE系列[DEAE-Sephadex、DEAE-纖維素、DEAE-Sepharose、DEAE-聚乙烯(例如DEAE-Toyopearl)]，QAE系列[QAE-Sephades、QAE-纖維素、QAE-Sepharose、QAE-聚乙烯(例如QAE-Toyopearl)等]。
在用陰離子交換層析分離處理時，陰離子交換體的平衡及清洗用緩衝液進行。該緩衝液為0.005～0.1M的檸檬酸緩衝液(pH6-8)、0.005～0.1M的磷酸緩衝液(pH6-8)、0.005～0.1M的Tris鹽酸緩衝液(pH7-9)。另外，HCⅡ從陰離子交換物中的洗脫使用含0.05～0.5M。優選為0.2～0.25M的氯化鈉進行。其中該緩衝液也被用於陰離子交換物的平衡及清洗。
上述進行的HCⅡ與低分子化因子的分離處理，使用固化肝素處理及陰離子交換層析分離處理二種方法，無順序上的限制，可任意選擇。另外，在純化步驟中為防止HCⅡ的多聚化及低分子化，只要沒有特別的條件限制，上述各項處理均在pH6～9、4～20℃的條件下進行。另外為防止多聚物的生成，上述各步驟中使用的全部緩衝溶液中，最好都含有0.001％～1.0％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG4000等)。
在上述各純化處理中得到的HCⅡ活性部分有可能混入低分子化HCⅡ。在本發明中，低分子化HCⅡ指的是用高效液相層析法分離時出現一個有別於有效HCⅡ峰的片段化HCⅡ肩峰(HPLC的分離條件在後提到)。因此，為分離除去低分子化HCⅡ，上面得到的HCⅡ活性部分需進一步進行超微過濾及/或凝膠過濾層析分離等分離步驟。其中這種分離是基於分子量的大小進行的。
對於超濾的濾膜的孔徑大小不作特別限制，只要能使有效HCⅡ通不過，而只讓低分子化HCⅡ通過即可。例如常用的有乙醯纖維素、丙烯腈共聚物、芳香族尼龍、聚碸、聚氟化乙烯、聚亞胺、樹脂膜等。其形狀可選擇使用管狀膜、扁平膜、螺旋組件(module)、中空纖維組件等。由於超濾膜的孔徑不是某一固定的值，當被除去的低分子化HCⅡ與有效HCⅡ分子量相差不大時，最好先通過超濾將HCⅡ濃縮後，再進行凝膠層析分離。
用於凝膠層析分離的凝膠有交聯葡聚糖珠(例如，交聯葡聚糖)、交聯聚丙烯醯胺珠(如BioGel)、瓊脂糖膠(例Sepharose)、葡聚糖丙烯醯胺(例如Sephacryl)等。在進行凝膠過濾時，使用檸檬酸緩衝液或磷酸緩衝液(pH6～9)洗脫。其中緩衝液中含有0～0.5M最好為0.1～0.2M的氯化鈉。
為儘可能防止HCⅡ的多聚化及低分子化、上述超濾及凝膠過濾希望在pH6～9，4-20℃進行。另外，上述各步驟中使用的所有緩衝液最好都含有0.001％～1.0％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG 4000等)，以預防多聚體的生成。
在上述各項處理後得到的HCⅡ，其純化程度，以蛋白量及HCⅡ的比活性為指標進行監測。其中蛋白量是在波長280nm測得的吸光度(A280)。HCⅡ的活性是以抑制凝血酶的活性作用為指標進行測定的。其方法在下文的實施例中詳述。
經上述各處理得到的純化HCⅡ溶液，通過製劑，可以製備出高純度的HCⅡ製劑。製劑時，根據需要可添加藥學上可接受的載體、添加劑的及通過加熱、滅菌、除菌過濾、病毒滅活，分散、冷凍乾燥等進行製劑。這些製劑方法均為藥學上可接受的常規方法。
本發明的純化HCⅡ溶液為了達到基本上不合有感染力病毒的這一目的，希望進一步進行病毒滅活及/或除病毒的處理步驟。這裡的「基本上不含病毒」指的是滅活病毒使病毒感染效價(TC1 D50)控制在檢出界限以下或者是除去病毒使病毒基因量限制在1 PCR單位以下(按照Transfusion，32，824～828，1992報導的PCR測定法，檢出的最小核酸量)。
病毒滅活法，可使用眾所周知的任何一種方法。例如液體加熱處理、乾燥加熱處理、表面活性劑處理等。不過希望選擇一種方法儘可能對HCⅡ的生理活性無不利影響。其中不利影響物有HCⅡ的變性、低分子化、多聚化等。由於HCⅡ對熱不穩定、希望在有適當穩定劑(例如酸性胺基酸等)存在的條件下，進行液體加熱處理、乾燥加熱處理、表面活性劑處理。病毒除去方法，最好用病毒除去濾膜進行濾過處理。這種濾膜的孔徑大小能使HCⅡ分子通過，但病毒粒子通不過。該病毒除去膜的開頭有管狀膜、扁平膜、中空纖維等各種形狀。最好使用多孔性中空纖維的那種。
多孔性中空纖維是管狀絲、在其周壁自由向外有許多貫通的孔，該同壁可作為過濾膜。在本發明中使用的多孔性中空纖維的周壁孔徑是1nm～100nm。優選為10nm～50nm，最優選為15±2nm。在此範圍內，可以從HCⅡ溶液中將夾雜的病毒除去。另外，多孔性中空纖維的內徑，優選為330±30μm。周壁厚度優選為27±3μm。
多孔性中空纖維的製備原料沒有特別限制，但希望使用再生纖維素。由再生纖維素構成的多孔中空纖維希望在纖維素銅氨溶液中，用微相分離法(Am.Chem.Soc.，9，197-228，1985)進行製備。
多孔中空纖維優選以組件形式使用。例如，很多多孔中空纖維平行捆在一起，包在一個盒子中(cartridge)通過粘合劑形成載體。
過濾時，HCⅡ溶液的溫度是4℃～50℃。優選溫度為4℃～20℃。濾過壓力是0.1 kgf/cm2～1 kgf/cm2，優選0.4 kgf/cm2～0.9kgf/cm2。HCⅡ的濃度優選為0.01～10％(w/v)，更優選為0.1～4％(w/v)，在此濃度時HCⅡ溶液的過濾效率高。
過濾法有循環式過濾與非循環式過濾，均在加壓空氣下進行。前者是在給溶液一個傾斜速度下進行的過濾。後者則不給予傾斜速度。
上述病毒滅活處理和除病毒處理，分別單獨使用就可以達到除去有感染力病毒的目的，但最好還是將兩種方法組合使用。其應用順序無特別限制但優選病毒滅活處理後進行除病毒處理。
經上述步驟製備的循環式過濾製劑中，基本上至少不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HGⅡ及著色劑中的一種，這是該製劑的特徵。本發明所指的著色劑是指在410nm處顯示特異吸收的夾雜物，例如可舉出轉鐵蛋白、觸珠蛋白等物質。這裡所說的「基本上不含低分子因子」指的是在0.1M磷酸鈉緩衝溶液以pH8、25℃的條件下培養48～120小時後，用HPLC(G 3000 SWXL)檢測時也檢不出低分子化HCⅡ。「基本上不含低分子化(或多聚化)HCⅡ」指的是用HPLC(G 3000 WXL)檢不出低分子化(或多聚化)HGⅡ的峰(這裡的HPLC條件如下所示)。
分離柱G 3000 S WXL(中7.8mm×30cm；TOSOH公司製備)流動相0.1M醋酸鈉，0.3M氯化鈉，0.1％疊氮化鈉(pH 6.5)流速 1.0 mL/分檢出波長 280nm樣品進樣量50μl(A280=約為1(在最小0.2～最大2的範圍內))。
進而，基本上不含著色物質「指的是著色度(C.I.)為50以下。著色度在後記的實例中加以定義。
本發明的HCⅡ製劑，優選為不合低分子化因子及低分子化HCⅡ，更優選為進一步不含多聚化HCⅡ及著色物質中的一種或兩種者不含的製劑。
特別優選的實施方案為，本發明的HCⅡ製劑含有純化到98％以上，最好99.9％，以上的有效HCⅡ。其中該純度百分率是HCⅡ對於總蛋白量的百分率。
通過以下實施例，詳述本發明。但本發明並不限定於實施例。並且，為防止HCⅡ的多聚化，在以下實施例中各純化步驟所用的全部緩衝液的含有0.01或0.1％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG 4000等)。
比較例1．從人血漿中純化HCⅡ(Ⅰ)(1)固相化肝素處理Cohn’s分級分離的上清液Ⅱ+Ⅲ加到使用了肝素凝膠親和性層析分離柱，再用含0.4M NaCl的緩衝液洗脫，得到純度約1％的HCⅡ部分(以下稱作粗製品)，將此部分在4℃條件下通過用20mM磷酸緩衝液(pH8.0)洗淨的肝素凝膠柱(φ5×2.5cm)，接著用含有0.1～0.15M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH8.0)洗脫吸附到柱上的部分，可以得到比粗製品的比活性高7.5～9.6倍的HCⅡ級分。HCⅡ的活性按下述方法測定。即，在被檢樣品烯釋液中加入50μL含有60mMEDTA、0.2％HSA及50μl 0.1mg/ml硫酸皮膚素的Tris緩衝液(pH8.56)、另外再加入100μL 0.93mg/ml二鹽酸H-D-苯丙氨醯基-L-甲基哌啶-L-精氨醯基-對硝基苯甲醯胺，在37℃培養5分鐘。加入1mL檸檬酸使反應停止，測定405nm處的吸光度(A405)、按照以往的方法，將製備的部分純化品作為標準品〔由吸收係數E1％=5.93(Arch.Biochem.Biophys.，259，331-340，1997)和吸光度A280求出的蛋白濃度0.1mg/ml，作為1 U作標準曲線，算出HCⅡ的活性。
(2)陰離子交換層析在(1)中得到的含HCⅡ的級分，在4℃通過(12[A280]/ml膠)QAE-聚乙烯柱(φ5×2.5cm)，其中該柱預先用40mM磷酸緩衝液(pH8.0)平衡，接著用含有0.15～0.4M NaCl的40mM磷酸緩衝液洗脫。其中NaCl的濃度的0.05M的速度逐級升高。最終，在含0.20～0.25MNaCl的緩衝液洗脫部分得到比活性為15.4 U/A280的HCⅡ，收率為92％。
按粗純化品計算，回收部分HCⅡ的比活性上升到69-91倍，收率為71％。將得到的含HCⅡ的部分，用10-20％梯度凝膠(第一化學制)以及SDS-PAGE(20mA/凝膠，約1.5小時)進行分析。凝膠的染色用快速染色盒(和光純藥制)進行。結果在相當於有效HCⅡ的72 KDa位置檢出了主帶，此外還檢出了66 KDa及未知的35 KDa的兩個帶。其中66 KDa相當於N末端缺少42個胺基酸的低分子化HCⅡ。將該含HCⅡ的級分置於冷室時，HCⅡ的低分子化會進一步進行，最終將檢不出72 KDa的分子。由此可知，依靠固相化肝素處理及陰離子交換層析分離處理不能夠除去HCⅡ低分子化因子，特別是蛋白酶。
(3)凝膠過濾層析將(2)得到的含HCⅡ的部分用10 KDa截斷超濾膜進行濃縮。濃縮後的蛋白濃度為20mg/ml，將該濃縮蛋白加到凝膠過濾層析柱Superdex 200 pg(φ1.6×60cm；Pharmacia製備)上。所加體積約為柱體積的1％(1.2ml)，按下述條件洗脫。
緩衝液含0.15M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH8.0)流速 10小時/柱溫度 4℃其結果，HCⅡ活性峰出現在相當於72 KDa分子的主要級分(有效HCⅡ級分)，並且與低分子級分(低分子化HCⅡ級分)得到分離。有效HCⅡ純化部分的比活性是11.1 U/A280。SDS-PAGE分析的結果，在72 KDa位置給出了一個單一的帶，進而用HPLC(G 3000 SWXL)進行分離，也檢出一個單一的峰。由此可知，該純化級分基本上不含低分子化及多聚化HCⅡ分子。另外，該純化級分的著色度〔定義為C.I.=A410/A280×1000〕是12.3。並且基本上不含觸珠蛋白與轉鐵蛋白。然而，當該有效HCⅡ純化級分在冷室或室溫放置時，與上述(2)的情況相同會發生低分子化。由此可知，低分子化因子(蛋白酶)用凝膠過濾也不能除去。
比較例2．從人血漿純化HCⅡ(Ⅱ)(1)固相化肝素處理按比較例1-(Ⅰ)同樣的方法，進行固相化肝素處理。只需將該法中的緩衝液變為20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)，加到柱上的粗純化品量變為30〔A280〕/mL凝膠，將洗脫液改為含0.1M NaCl的20mM Tris-鹽酸緩衝液(pH8.5)即可。結果，與粗純化品相比，經過上述處理，HCⅡ級分的比活性升高了13.6～19.3倍。
(2)陰離子交換層析層析用含有0.1 5～0.45M NaCl的40mM磷酸緩衝液(pH8.0)洗脫吸附在載體上的部分，其中，NaCl的濃度以每次0.05M的速度逐級升高。其他操作均與比較例1-(2)相同。其結果，在含有0.20～0.25MNaCl的緩衝液洗脫部分，得到了比活性為17.4 U/A280的HCII，回收率為95％。
由粗純化品計算，含HCⅡ級分的比活性上升了76～102倍，回收率為66％。將此含有HCⅡ的級分按比較例1-(2)的方法進行SDS-PAGE分析，在相當於有效HCⅡ的72 KDa的位置檢出了主帶，但除此之外，在66 KDa及未知的35 KDa處還檢出兩個帶。其中66 KDa相當於N末端缺少42個胺基酸殘基的低分子化HCⅡ。當把該含有HCⅡ的級分放置於冷室時，也發生HCⅡ的低分子化最終將檢不出72KDa的分子。
(3)凝膠過濾層析在(2)中得到的含有HCⅡ的部分，進一步用截斷量為10 KDa超濾膜使蛋白質濃縮至20mg/ml，將濃縮部分加至凝膠過濾層析Superdex 200 pg(φ1.6×60cm)上，按下述條件洗脫。其中加樣量約為柱體積的1％(1.2 mL)。
緩衝液含0.15M NaCl的20mM磷酸緩衝液(pH8.0)流速10小時/柱溫度4℃結果，HCⅡ活性峰出現在相當於72 KDa分子的主要分離部分(有效HCⅡ純化級分)，與低分子分離部分(低分子化HCⅡ級分)得以分離。有效HCⅡ純化級分與A280的最大峰一致(圖1)。有效HCⅡ純化級分的比活性是17.1 U/A280、在SDS-PAGE的分析結果中，72 KDa處給出了單一的帶。由此表明，該純化級分基本上不含低分子化及多聚化HCⅡ分子。另外，該純化級分的著色度〔定義為C.I.=A410/A280×1000〕是4.2，基本上不含觸珠蛋白與轉鐵蛋白。另外在獲得的HCII純化級分中，HCⅡ佔總蛋白量的99.9％以上。與比較例1一樣，會發生低分子化。
實施例1以疏水性層析法除去低分子化因子取一部分在比較例2-(2)得到的含HCⅡ的級分，在4℃條件下，通過Butyl Toyopearl(Tosoh公司制)後，在25℃培養48小時以上。其中Butyl Toyopearl預先用含1.5M以上NaCl的40mM磷酸緩衝液(pH7.1)平衡。用HPLC測定該溶液，未發現低分子化HCⅡ的含有率增高。因此，證明了用上述疏水性層析分離處理，可除去低分子化因子。
實施例2以疏水性層析除去低分子化因子(Ⅱ)疏水性層析載體使用苯基瓊脂糖(Pharmacia公司制)，載體的平衡使用含0.1M以上NaCl的磷酸緩衝液(pH8)。其他均按實施例1進行操作。未吸附部分也按實施例1的方法處理，測定有無HCII的低分子化。結果顯示沒有發生低分子化。接著進行凝膠過濾層析。結果顯示在SDS-PAGE上的72 KDa位置。有一個單一的帶，用HPLC分析時，也只出現一個單一的峰(圖3)。因此表明在該純化部分不僅不含低分子化因子，基本上也不含低分子化及多聚化HCⅡ。
實施例3使用以賴氨酸為配體的親和性層析除去低分子化因子將一部分在比較例2-(2)得到的含HCⅡ的級分，4℃下通過以賴氨酸為配體的交聯瓊脂糖載體、所得到的未吸附部分按實施例1相同的方法處理，檢測有無HCⅡ的低分子化。同樣未觀察到低分子化發生。由此可知，上述親和性層析處理能除去低分子化因子。
實施例4用水溶性多聚物除去低分子化因子取一部分比較例2-(2)的含HCⅡ的級分，再加入PEG 4000或聚氧乙烯(160)聚丙(30)二醇(商品名Pluronic F68)，放置一定時間後，離心回收上清液。該上清液按比較例2-(3)的步驟處理後，再按實施例1的方法處理，檢測有無低分子化HCⅡ，同樣未觀察到HCⅡ的低分子化。由此可知，用上述水溶性多聚物或非離子性表面活性劑進行分級分離，能除去低分子化因子。
實施例5通過鹽析除去低分子化因子在一部分來自於比較例2-(2)的含HCⅡ的級分中，加入1M氯化鋇溶液，使其濃度為5～20％(v/v)，放置一定時間後，離心分離，回收上清液。將該上清液按比較例2-(3)步驟處理後，再以實施例1同樣的方法進行處理，檢測有無HCⅡ的低分子化，同樣未觀察到HCⅡ的低分子化。由此可知，通過上述鹽析處理能除去低分子化因子。
實施例6通過用多孔性中空纖維的過濾處理除去病毒多孔性中空纖維使用BMM(Bemberg Microporous Membrane(微孔膜)、旭化成株式會社)的組件。BMM是多孔性中空纖維，其製備原料為再生纖維素，並以銅氨法製成。BMM組合使用Planova15(旭化成株式會社制)。其中，Planova15是由150層以上的多層構造形成的膜壁。組合內的多孔性中空纖維的尺寸如下。
平均孔徑 15nm±2nm中空纖維內徑 330±30μm膜厚 27±3μm該組合是由上述多孔性中空纖維和耐高壓溼熱滅菌的聚碳酸酯製成的塑料容器以及使之粘合在一起的聚氨酯類粘合劑構成。該組合經高壓滅菌。其中注滿注射用蒸餾水。對於各種Planova構成材料的安全性，均按日本藥局方規定的方法進行了確認(摘自BMM商品說明書)。
在實施例1獲得的基本上不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HCⅡ及著色物的純化HCⅡ級分中，加入HCV陽性血漿，以0.22μm的濾膜(Millpore制)過濾後，再根據交叉流過液法用BMM組件過濾。過濾條件HCⅡ溶液溫度4～10℃、過濾壓力0.8Kgf/cm2。在該過濾步驟中，HCⅡ在濾液中的回收率為97％。過濾處理結束後，調整HCⅡ溶液的效價並進行除菌過濾。得到的HCⅡ溶液分裝後製成液體製劑。
實驗例1確認除病毒效果在實施例6得到的製劑中，C型肝炎病毒基因組量用PCR法測定。
(1)提取樣品中的RNA在該製劑中加入胍、硫氰酸胍及十二烷苯肌氨酸鈉、進一步加入酚。氯仿，除蛋白。其次，以異戊醇沉澱RNA。各反應均在室溫進行。
(2)用反轉錄酶製備cDNA從(1)得到的RNA與隨機六聚體退火，用逆轉錄酶在42℃反應1小時，得到cDNA。
(3)用巢式PCR法增幅cDNA用HCV引物〔自HCV基因組的5』末端非編碼區，5』-GTGAGTACACCGGAATTGCC-3』(序列號1)和5』-CACGGTCTACGAGACCTCCC-3』(序列號2)用作正義引物鏈，5』-ACGACCGGGTCCTTTCTTGG-3』(序列號3)和5』-GCACTCGCAAGCACCCTATC-3』(序列號4)用作反義引物〕和Taq聚合酶、擴增HCV cDNA。在94℃，30秒熱變性、在55℃ 2分鐘退火。cDNA的擴增，在72℃進行2分鐘。該項操作循環20次以上，得到反應產物。
(4)PCR反應產物的分析對於在(3)得到的反應產物，進行聚丙醯胺電泳(PAGE)6％(w/v)。其中使用了溴化乙錠。
實驗結果，過濾處理前HCⅡ溶液中HCV基因組量是103 PCR單位/ml，而過濾處理後降低到檢出限度(1PCR單位/ml)以下。
工業上使用的可能性因為按本發明的HCⅡ製劑製備法能除去低分子化因子，所以在HCⅡ保存過程中不會發生分解(低分子化)。因而，可以提供更高純度的安全有效的HCⅡ製劑。
序列表的單獨文字說明序列號1
一種被設計好的寡核苷酸，將其作為擴增HCV基因組5』末端非編碼區的正義引物。
序列號2設計的一種寡核苷酸，使其作為擴增HCV基因組5』末端非編碼區的正義引物。
序列號3設計的一種寡核苷酸，使其作為擴增HCV基因組5』末端側非編碼區的反義引物。
序列號4設計的一種寡核苷酸，使其作為擴增HCV基因組5』末端側非編碼區的反義引物。
本專利申請是以在日本提出的平成9年專利申請第320349號為基礎作成的，在上述專利申請中的內容全部包含在本說明書中。
另外，在本文述及的專利及專利申請說明書的所有公開物，通過引用的形式，將其全部內容編入到本說明書中。
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權利要求
1．含肝素輔助因子Ⅱ的製劑，它基本上不含至少一種選自低分子化因子、低分子化肝素輔助因子Ⅱ、多聚化肝素輔助因子Ⅱ以及著色物的夾雜物。
2．基本上不含低分子化因子及低分子化肝素輔助因子Ⅱ的含肝素輔助因子Ⅱ的製劑。
3．權利要求2的肝素輔助因子Ⅱ製劑，它還基本上不含多聚化肝素輔助因子Ⅱ及/或著色物。
4．含肝素輔助因子Ⅱ的製劑，其中在製劑中所含有的肝素輔助因子的純度在98％以上。
5．權利要求1-4任一項的含有肝素輔助因子Ⅱ的製劑，它基本上不含有有感染能力的病毒。
6．含肝素輔助因子Ⅱ的製劑的製備方法，其中該製法包含從含有肝素輔助因子Ⅱ及低分子化因子的溶液中分離兩者的步驟。
7．權利要求6的製備方法，該步驟包括選自疏水性層析法，水溶性多聚物分級分離法、鹽析以及以鹼性胺基酸為配體的親和性層析法的一或多種處理。
8．權利要求6或7的方法，它包括能進一步除去低分子化肝素輔助因子Ⅱ及/或著色物的步驟。
9．權利要求8的方法，其中該步驟為凝膠過濾層析。
10．權利要求6～9中的任一項的方法，它包括選自過濾處理，加熱處理及表面活性劑處理中至少一種除病毒或滅活病毒的步驟。
11．權利要求10的方法，其中該步驟以多孔性中空纖維進行過濾處理。
全文摘要
含有肝素輔助因子Ⅱ(HCⅡ)的製劑,其中基本上不含有選自低分子化因子、低分子化杆素輔助因子Ⅱ(HCⅡ)、多聚化HCⅡ及著色物中的至少一種雜質,特別是一種基本上不含低分子化因子及低分子化HCⅡ的製劑。基本上不含有感染力病毒的上述任一製劑。以及上述製劑的製備方法。該方法包括選自如下步驟:疏水性分析法、用水溶性多聚物進行的分級分離、鹽析及用鹼的胺基酸作酸體的親和性層析法,優選還有用多孔性中空纖維進行的過濾的步驟。
文檔編號A61K38/00GK1284881SQ98812944
公開日2001年2月21日 申請日期1998年10月30日 優先權日1997年11月5日
發明者後藤節, 淺原尚美, 大水章正, 上村八尋 申請人:吉富製藥株式會社