卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法

2023-12-01 01:53:46

專利名稱：卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別涉及一種卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法。
背景技術：
莖瘤芥(Brassicajuncea var.tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，該屬包含許多有重要經濟價值的油料、蔬菜、飼料作物，如油菜、白菜、甘藍等，莖瘤芥為榨菜的主要原料，口感鮮嫩、營養豐富，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報導，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。莖瘤芥轉基因方法目前主要採用的方法為:取外植體進行組織培養，再通過農桿菌浸染外植體使農桿菌中攜帶的外源基因轉化至外植體中從而獲得轉基因植株，農桿菌轉化方法如文獻《芥菜轉基因再生體系的建立》(楊朝輝等，作物學報)和《芥菜cry2基因RNAi載體的構建與遺傳轉化研究》(梁婷等，安徽農業科學)，其中農桿菌中的重組表達質粒除攜帶外源基因序列外，通常還有抗生素抗性標記基因以便篩選轉基因植株，當農桿菌侵染外植體後，通過添加相應抗生素以篩選獲得可能的轉基因植株。通過組培方法篩選獲得的存活下來的植株，由於添加抗生素的濃度和時間可能不適宜(濃度和時間不適宜會導致非轉化體逃離篩選)或者由於採用較低的抗生素濃度篩選(採用較低的抗生素濃度是增加再生苗甚至是轉基因苗數量的方法，因為濃度低則選擇壓小，則愈傷組織會更多地生長和分化，因此非轉化體數量會增多)，則再生苗中很可能多數是假轉化體，因此後續必須對這些植株進行進一步的分子生物學篩選，比如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交，甚至Western雜交以確保為轉基因植株。另外，農桿菌侵染獲得的第一代轉基因植株還是雜合子，若要進行功能分析和研究，必須獲得純合子，那麼，同樣地，需要進行大量的篩選，篩選放方法仍然為提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交,甚至Western雜交。然而,提取植株的DNA與RNA、Southern雜交、Northern雜交等這些分子生物學技術需要使用大量試劑和耗材，而且特異性越強的檢測技術所需的費用越昂貴，檢測周期長，並且操作複雜，當篩選的植株的量大時顯然成本高昂而且費時費力。為節省實驗成本，CN102696477A和CN102217472A分別公開了用卡那黴素溶液浸種篩選轉基因棉花和卡那黴素塗抹葉片篩選轉基因蘿蔔的方法，但兩者所採用的卡那黴素濃度高，分別為1000-1500mg/L和1000mg/L，後者篩選時間長，需12天；另外，棉花種子大適合浸種篩選，莖瘤芥種子相對棉花非常小，不適宜對種子進行抗生素處理；而且，不同物種、不同組織對同一濃度抗生素的承受能力均不同，因此，更不能將上述篩選棉花和蘿蔔的方法直接應用於莖瘤芥的轉基因篩選。
因此，需要一種快速簡單的篩選轉基因莖瘤芥的方法，尤其是當篩選植株量較大時，可以節約實驗成本和時間成本，以實現初步篩選，縮小後續分子生物學實驗的篩選範圍。

發明內容
鑑於此，為節約實驗成本，縮小分子生物學實驗(如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交,甚至Western雜交等)的篩選範圍，本發明提供一種簡單、低成本的轉基因莖瘤芥初步篩選的方法，採用的技術方案是:通過切取莖瘤芥植株的一小片葉片，並將切下的葉片於含有生長素和抗生素的水溶液中觀察葉片的黃化程度來判斷是否為轉基因植株，具體方法為:切取莖瘤芥植株的葉片，放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那黴素的水溶液的檢測液中，並觀察所述葉片是否黃化死亡，若是則判斷為非轉基因植株，若否則判斷為轉基因植株。無卡那黴素抗性的葉片在一定濃度的卡那黴素溶液中會黃化甚至死亡，即葉片顏色由綠色變為黃色或褐色，由此作為判斷轉基因植株的特徵；生長素6-苄氨基腺嘌呤可以幫助切下的葉片保持一定生存能力。進一步地,所述葉片為新生嫩葉，葉面積為2_4cm2，即新長出來的葉面積在2_4cm2的葉片；6_苄氨基腺嘌呤和卡那黴素的濃度分別為lmg/L和120mg/L，且觀察5-6天後所述葉片是否黃化死亡。由於不同種植物、甚至同種植物的不同組織器官對同一濃度的抗生素的承受能力均不同，因此必須通過梯度試驗獲得檢測液中卡那黴素的最佳濃度以用於檢測。另外，葉片面積過大會延長黃化死亡時間，不利於篩選；葉片過小又不能起到觀察黃化程度變化的過程，從而導致判斷失誤。進一步地，所述黃化死亡指所述葉片的黃化面積比例為80-100%。當黃化面積達80%,實驗證明葉片已經不能進行正常的生存代謝，時間再延長2-3天必定全部黃化即死亡。特別地，在判斷是否為轉基因植株時，我們以黃化死亡為判定準則，因為只有黃化死亡才能為我們提供更正確的判定結果，才能嚴格為後續的分子生物學實驗縮小篩選範圍。進一步地,所述葉面積為3cm2。進一步地，所述觀察的天數為5天。實驗證明5天後葉片均黃化死亡，為減少觀察的時間，5天即可。本發明中，通過切取莖瘤芥葉片並放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那黴素的檢測液中觀察是否黃化死亡來判斷轉基因與否的方法，實驗成本低，方法簡單，在lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那黴素的檢測液中，5-6天即可快速篩選，正確率高；當篩選的植株量大時，該篩選方法尤其適用，可以大大縮小進一步進行分子生物學實驗驗證轉基因植株的範圍，節約人力物力，節約試劑和時間。


圖1為本發明野生型葉片在不同濃度卡那黴素檢測液中5天的黃化情況圖；圖2為本發明lmg/L6-BA和120mg/L Kana檢測液篩選轉基因葉片的葉片黃化情況圖；圖3為本發明葉片篩選轉基因後又進一步以基因組DNA為模板PCR擴增目的基因驗證的電泳圖。
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍。本發明不限於下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明範圍之內。1、通過葉片篩選莖瘤芥轉基因植株的卡那黴素濃度梯度實驗:由於不同種植物、甚至同種植物的不同組織器官對同一抗生素的承受能力均不同，因此要獲取切下的莖瘤芥葉片對卡那黴素的承受程度以選擇合適的抗生素濃度需要做梯度試驗，方法如下:十月中旬將莖瘤芥種子(品種為永安小葉，購買於重慶市涪陵農科所)野生型播種於地裡；同時將本實驗室獲得的超表達莖瘤芥光敏色素A的轉基因莖瘤芥種子和超表達莖瘤芥光敏色素B的轉基因莖瘤芥種子(二者均攜帶nptll基因，可以採用卡那黴素篩選)播種於地裡。播種一個半月後切取野生型和轉基因莖瘤芥的新生嫩葉，其葉面積為3-4cm2，在不同濃度的檢測液中檢測葉片的黃化情況以判斷是否為轉基因植株(沒有抗性的葉片，在抗生素環境下將逐步黃化死亡)。檢測液為含lmg/L的生長素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和不同濃度的卡那黴素(簡寫為Kana)，其中卡那黴素的濃度設有六個梯度，為:20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。上述播種的3個品種莖瘤芥均切取葉片於各個濃度中進行檢測，每個品種、每個濃度均檢測10片嫩葉，並重複3次，在10小時光照、14小時黑暗、20°C條件下培養並定期觀察葉片變色情況，葉片的黃化面積比例達80%認為葉片死亡，定期觀察為每24小時觀察I次。檢測統計結果見表I，可見，野生型葉片在120mg/L卡那黴素檢測液5天(即葉片放入檢測液中120小時)時黃化面積達80-100%，即葉片全部死亡；野生型葉片在160mg/L卡那黴素檢測液4天(96小時)時黃化面積達80_100%，即葉片全部死亡；野生型葉片在200mg/L卡那黴素檢測液2天(48小時)時黃化面積達80_100%，即葉片全部死亡。圖1所示為5天時不同濃度卡那黴素的檢測液中野生型葉片的黃化程度，從左至右依次為 20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L,黃化程度約為 0_5%、15-30%、40-60%、80_100%。根據表1，轉基因葉片在160mg/L卡那黴素檢測液2_3天就會出現黃化現象，200mg/L卡那黴素檢測液中黃化現象嚴重，說明轉基因植株不能承受較高濃度的卡那黴素選擇壓。從時間上、黃化程度上考慮，並參照野生型黃化數據(參照野生型黃化數據較好，因為不同的轉基因植株的抗性效率會有差異，有不確定性)，最終選擇最佳的卡那黴素濃度為120mg/L以篩選轉基因植株較合適，即如果葉片於含lmg/L6-BA和120mg/L Kana的檢測液中5天仍不死亡則初步判斷為轉基因植株。表I不同濃度卡那黴素檢測液中葉片黃化程度統計
權利要求
1.一種卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法，其特徵在於，切取莖瘤芥的葉面積為2-4cm2的新生葉片，放入含lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那黴素的水溶液的檢測液中5-6天，觀察所述葉片是否黃化死亡，若是則判斷為非轉基因植株，若否則判斷為轉基因植株。
2.如權利要求1所述的卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法，其特徵在於，所述黃化死亡指所述新生葉片的黃化面積比例為80-100%。
3.如權利要求1所述的卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法，其特徵在於，所述新生葉片的葉面積為3cm2。
4.如權利要求1所述的卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法，其特徵在於，將所述新生葉片放入含lmg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那黴素的水溶液的檢測液中5天。
全文摘要
本發明公開了一種卡那黴素抗性標記的轉基因莖瘤芥篩選方法，所述方法通過切取莖瘤芥葉片並放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那黴素的水溶液的檢測液中觀察葉片是否黃化死亡來判斷轉基因與否，實驗成本低，方法簡單；當篩選的植株量大時，該方法尤其適用，可以大大縮小進一步進行分子生物學實驗驗證轉基因植株的範圍，節約人力物力，節約試劑和時間。
文檔編號G01N21/25GK103149157SQ20121059231
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者向瀏欣, 蔡應繁, 付於銀, 劉吉軍, 冉燕子, 王秋娟, 王小豔 申請人:重慶郵電大學