使用具有過氧化水解活性的酶生產過酸的製作方法

2023-12-01 02:21:56

專利名稱:使用具有過氧化水解活性的酶生產過酸的製作方法
使用具有過氧化水解活性的酶生產過酸
本申請要求於2005年12月13日提交的美國臨時申請號60/750，092，和於2006 年10月20日提交的美國臨時申請號60/853，065的優先權。
發明領域
本發明涉及過酸生物合成和原位酶催化領域。具體而言，提供了使用鑑定為具有頭孢菌素C脫乙醯酶活性的某些酶的過氧化水解(perhydrolysis)活性產生過酸的方法。 酶促過程由羧酸酯底物產生過羧酸。
發明背景
過酸組合物已報導是有效的抗微生物劑。針對不希望有的微生物生長使硬表面、肉製品、活植物組織和醫療器材清潔、消毒和/或衛生處理的方法已得到描述(US 6, 545, 047 ；US 6, 183, 807 ；US 6, 518, 307 ；US 20030026846 ；和 US 5,683,724)。 過酸也已報導在製備用於衣物清潔劑應用的漂白組合物中是有用的(US 3, 974, 082 ；US 5，296，161 ；和 US 5，364，554)。
過酸可以通過羧酸和過氧化氫的化學反應進行製備(參見OrganicPeroxides, Daniel Swern，編輯，第 1 卷，第 313-516 頁；Wileyhterscience，New York)。該反應通常由強無機酸例如濃硫酸催化。過氧化氫與羧酸的反應是平衡反應，並且過酸的生產通過使用過量濃度的過氧化物和/或羧酸，或通過去除水得到促進。關於用於過酸生產的化學反應存在幾個缺點a)用於促進過酸生產的高濃度羧酸在使用含過酸溶液時可以導致不希望有的氣味，幻過酸隨著時間的過去在溶液中時常是不穩定的，並且溶液中的過酸濃度在使用前的貯存期間減少，和3)由於使用濃硫酸作為催化劑該製劑通常是強酸性的。
克服過酸化學生產的缺點的一種方法是使用酶催化劑代替強酸催化劑。酶催化劑的使用允許在使用和/或應用時快速生產過酸，避免了與過酸溶液貯存和隨著時間的過去過酸濃度中的變化相關的問題。一般用於經由與過氧化氫的直接化學反應生產過酸的高濃度的羧酸不是過酸的酶促生產所需的，其中酶催化的反應可以使用濃度比化學反應中一般使用的低得多的羧酸酯作為底物。酶反應可以跨越廣泛範圍的PH來進行，取決於在給定pH 下的酶活性和穩定性，並且取決於在給定PH下對於過氧化水解的底物特異性。
某些酯酶、蛋白酶和脂肪酶具有催化烷基酯水解以產生相應的羧酸的能力(式 1)。
式 1
脂肪酶、酯酶或
蛋白酶
R1COOR^H2O — R1COOMOIi2
某些酯酶、蛋白酶和脂肪酶還顯示出過氧化水解活性，催化來自烷基酯的過酸合成(式2)。
式2
脂肪酶、酯酶或
蛋白酶[0017]R1COOR^H2O2 — I^C000H+H( 2
0. Kirk 等人(Biocatalysis，ll :65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化醯基底物與過氧化氫的過氧化水解以形成過氧羧酸，並且報導過氧化水解在水系統中以非常低的效率進行。此外，他們發現脂肪酶和酯酶使過羧酸降解成相應的羧酸和過氧化氫。他們還發現蛋白酶在水中既不降解羧酸酯也不催化羧酸酯的過氧化水解。作者得出結論酯酶、脂肪酶和蛋白酶一般而言不適合於在水環境中催化簡單酯類，例如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯(trioctanoin)的過氧化水解。
US 3，974，082描述了通過使待漂白的材料與水溶液接觸生產用於衣物清潔劑應用的漂白組合物，所述水溶液包含釋放無機過氧化合物的氧、醯基烷基酯、和能夠使酯水解的酯酶或脂肪酶。
US 5，364，554描述了使用蛋白酶、過氧化氫來源、和優選地不能以化學方法過氧化水解的酯底物用於在水溶液中原位生產過酸的活化氧化劑系統。還公開了漂白方法和形成過酸的方法。
US 5，296, 161描述了在包含一種或多種特定酯酶和脂肪酶、過氧化氫來源、和適合於在漂白組合物中使用的官能化酯底物的水溶液中生產過酸。然而，產生的過酸濃度一般不足以用於在許多商業消毒應用中使用。
用於使用酶催化劑由相應的羧酸酯製備過酸的最已知的方法不產生且積聚足夠高濃度的過酸，以用於在各種應用中有效消毒。幾種蛋白酶和脂肪酶組合近期已報導原位生產濃度適合於用作消毒劑和/或商業漂白劑的過酸(例如，過乙酸)(參見共同擁有的美國專利申請號11/413，246和11/588，523 ；引入本文作為參考)。然而，仍需要鑑定能夠原位生產過酸的另外的過氧化氫酶(perhydrolase)催化劑。
US 4，444，886描述了具有酯水解酶活性(描述為「甘油二乙酸酯酶 (acetinase) 」)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株(ATCC31卯4 )，其具有用於水解具有含2-8個碳原子的醯基的甘油酯的高特異性。US 4，444，886沒有描述、討論或預言這種菌株的酯水解酶活性具有對於羧酸酯包括甘油酯的過氧化氫酶活性。
待解決的問題是提供原位酶促生產濃度適合於在各種消毒應用和/或漂白應用中使用的過酸的方法。優選地，用於生產過酸組合物的底物應是相對無毒和價廉的，例如羧酸酯，特別是單醯甘油、二醯甘油和三醯甘油，其中醯基具有1-8個碳原子。
發明概述
所述問題已通過下述發現得到解決具有頭孢菌素C脫乙醯酶活性的某些酶顯示出在無機來源的過氧(peroxygen)(例如過氧化氫)的存在下，用於將羧酸酯轉化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過酸的過氧化水解活性。
具體地，發現來自枯草芽孢桿菌(ATCC 31954 )，即一種I. M. A. G. E.協會[LLNL] cDNA克隆(Lennon等人，Genomics, 33 :151-152(1996))和枯草芽孢桿菌BE1010，鑑定為具有頭孢菌素C脫乙醯酶活性的酶具有用於將羧酸酯(在過氧來源的存在下)原位轉化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過酸的過氧化水解活性。
分離了來自枯草芽孢桿菌ATCC 31%4 提供過氧化水解活性的酶。氨基末端序列分析鑑定該酶為來自枯草芽孢桿菌的頭孢菌素C脫乙醯酶(「CAH」，碳水化合物酯酶家族 7的成員；也稱為CE-7酯酶)。分離來自枯草芽孢桿菌ATCC 31954 的CAH的相應基因，測序且在微生物細胞中異源表達。對於這種酶推導的胺基酸序列(SEQ ID N0J)測定與來自枯草芽孢桿菌 HS 0133 的 CAH(Mitsushima 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,61(6) 2224-2229 (1995) ；U. S. 5，528，152 ；U. S. 5，338，676 ；和 Vincent 等人，J. Mol. Biol. 330 593-606(2003))具有100%的胺基酸同一性。
分離編碼來自枯草芽孢桿菌BE1010的CAH的第二種基因，異源表達，且顯示具有顯著的過氧化水解活性。對於這種酶推導的胺基酸序列測定與來自枯草芽孢桿菌枯草亞種 (Bacillus subtilissubsp. subtilis)菌株 168 的 CAH(SEQ ID NO :6 ;Kunst 等人，同上)具有100%的胺基酸同一性。SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :6的胺基酸序列相差4個胺基酸。本領域技術人員因此將預期具有基本上相似結構的其他酶，(例如具有CAH活性的其他酶)， 同樣將顯示出過氧化水解活性。
具有在本方法中使用的過氧化水解活性的酶催化劑可以是表達CAH的完整細胞， 表達CAH的滲透化處理的完整細胞，包含CAH的微生物細胞的一種或多種細胞成分，部分純化的CAH酶，和純化的CAH酶的形式。酶催化劑可以是未固定或固定的，包括但不限於固定在不溶性固體載體中或其上，與可溶性聚合物(例如，低分子量的聚乙二醇(PEG))共價附著，和在空心纖維藥筒中作為可溶性酶固定。
在本發明的一個方面，提供了用於原位生產過酸的水性酶促方法。所述方法包括
a)提供一組反應成分，所述成分包含
1)選自下述的羧酸酯
i)具有下述結構的酯
權利要求
1. 一種用於由羧酸酯生產過氧羧酸的方法，其包括 a)提供一組反應成分，所述成分包含 1)選自下述的羧酸酯 i)具有下述結構的酯
2. 一種用於由羧酸酯生產過氧羧酸的方法，其包括 a)提供一組反應成分，所述成分包含 1)選自下述的羧酸酯 i)具有下述結構的酯
3.權利要求
1的方法，其中所述過氧羧酸在組合所述反應成分的5分鐘-2小時內以至少200ppm的濃度產生。
4.權利要求
1或2的方法，其中所述酯選自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧乙酸甲酯、甲氧乙酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯、及其混合物。
5.權利要求
1或2的方法，其中所述甘油酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、 甘油三丁酸酯、及其混合物。
6.權利要求
1或2的方法，其中生產的所述過酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、 過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過β-羥丁酸、及其混合物。
7.權利要求
6的方法，其中生產的所述過酸是過乙酸。
8.一種使用酶促生產的過酸組合物減少硬表面或無生命物體上的微生物群體濃度的方法，所述方法包括a)提供一組反應成分，所述成分包含-1.選自下述的底物i)具有下述結構的酯
9.權利要求
8的方法，其中在步驟b)中形成的所述過酸產物包含在組合所述反應成分的5分鐘-2小時內至少200ppm的過酸濃度。
10.權利要求
8的方法，其中所述硬表面或無生命物體在組合所述反應成分的5分鐘-168小時內與步驟b)或步驟c)中生產的所述過酸接觸。
11.權利要求
8的方法，其中所述硬表面或無生命物體在組合所述反應成分的5分鐘-48小時內與步驟b)或步驟c)中生產的所述過酸接觸。
12.權利要求
8的方法，其中所述硬表面或無生命物體在組合所述反應成分的5分鐘-2小時內與步驟b)或步驟c)中生產的所述過酸接觸。
13.根據權利要求
8-12的方法，其中微生物汙染物的所述濃度減少至少5-log。
14.權利要求
8的方法，其中所述酯底物選自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧乙酸甲酯、甲氧乙酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯、及其混合物。
15.權利要求
14的方法，其中所述酯底物選自乳酸乙酯、乙酸乙酯、及其混合物。
16.權利要求
8的方法，其中所述甘油酯底物選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、及其混合物。
17.權利要求
1或8的方法，其中所述過酸在5分鐘內以至少200ppm的濃度產生。
18.權利要求
17的方法，其中所述過酸在5分鐘內以至少IOOOppm的濃度產生。
19.權利要求
18的方法，其中所述過酸在5分鐘內以至少2000ppm的濃度產生。
20.權利要求
8的方法，其中生產的所述過酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過β-羥丁酸、及其混合物。
21.根據權利要求
20的方法，其中生產的所述過酸是過乙酸。
專利摘要
提供了用於由羧酸酯產生過氧羧酸的方法。更具體而言，在來源於芽孢桿菌種、具有過氧化水解活性的酶催化劑的存在下，使羧酸酯與無機過氧化物例如過氧化氫反應，以生產過氧羧酸。
文檔編號C12P7/00GKCN101326288 B發布類型授權 專利申請號CN 200680046637
公開日2012年5月2日 申請日期2006年12月13日
發明者F·B·庫林三世, J·E·加瓦根, M·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),