產量增加的植物及其製備方法

2024-01-21 22:57:15 1

專利名稱：產量增加的植物及其製備方法
技術領域：
本發明一般涉及分子生物學領域，並且涉及增加植物產量的方法。更加具體而言，本發明涉及通過向植物引入編碼D-型細胞周期蛋白依賴性激酶(D-type Cyclin-Dependent Kinase(CDKD))的核酸來增加植物產量尤其是種子產量的方法。本發明還涉及通過根據本發明的方法產生的植物，其中所述植物相比對應的野生型植物具有增加的產量。本發明也涉及在本發明方法中有用的構建體。
不斷增長的世界人口和可用於農業的可耕地的不斷減少的供給，激起農業研究向提高農業的效率發展。農作物和園藝改良的傳統手段利用選育技術來鑑定具有期望特性的植物。然而，這樣的選育技術具有若干缺點，即這些技術一般是勞動密集型的，而且產生通常含有異質遺傳組分的植物，這並非總是產生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學的發展已經允許人類修飾動物和植物的種質。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(一般是DNA或RNA的形式)，隨後需要把該遺傳物質導入到植物中。這種技術能夠提供具有多種改良的經濟學、農藝學或園藝性狀的作物或植物。一種具有特殊經濟利益的性狀是產率。產率通常定義為作物產生的可衡量經濟價值。這可以從數量和/或質量方面定義。產率直接取決於幾個因素，例如，器官的數量和大小，植物結構(例如，分枝的數量)，種子產量等等。根的發育、營養吸收和應激耐受性也是確定產率的重要因素。可以通過優化上述因素之一來提高作物產率，這可以通過修飾植物內在的生長機制來完成。
植物內在的生長機制存在於總稱為「細胞周期」的高度有序的事件序列中。通過細胞周期前進對多細胞生物的生長和發育是基本的，並且對細胞增殖是關鍵的。細胞周期的主要組分在酵母、哺乳動物和植物中高度保守。細胞周期一般分為下列連續的時期G0-G1-S-G2-M。DNA複製和合成一般發生在S期(「S」指DNA合成)，而染色體的有絲分裂分離發生在M期(「M」指有絲分裂)，其間插入間期G1(DNA複製之前的細胞生長期)和G2(DNA複製之後細胞準備分裂的時期)。M期的最後步驟一—胞質分裂之後，細胞分裂完成。離開細胞周期並變成休眠的細胞稱為處於G0期。這個時期的細胞可以受刺激而重新進入細胞周期的G1期。G1、G2和G0中的「G」代表「間隙」。細胞周期進程的完成使得處於細胞分裂的每個子細胞接受親本基因組的一個完整拷貝。
細胞分裂受控於兩個主要的細胞周期事件，即DNA合成的起始和有絲分裂的起始。每個這些主要事件的每個過渡都受控於特定蛋白質複合體(涉及DNA複製和分裂)代表的檢查點。在哺乳動物和植物細胞中，G1/S邊界時DNA合成必需的基因的表達受轉錄因子的E2F家族調節(LaThangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人，2002)。進入細胞周期由E2F/Rb複合體調節/觸發，該複合體整合信號並允許細胞周期基因的轉錄激活。細胞周期不同時期之間的轉換以及因此細胞周期的前進通過形成和激活不同異二聚體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(通常稱作細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK))來驅動。這些激酶活性的前提是與特定的細胞周期蛋白物理結合，激活的計時主要取決於細胞周期蛋白的表達。細胞周期蛋白的結合誘導相關聯的CDK的N末端裂片(lobe)構象變化，並且促進複合體的定位和底物特異性。當單體的CDK結合細胞周期蛋白時，它們被激活，並因此具有激酶活性。細胞周期蛋白的蛋白水平在細胞周期中起伏，並因此代表著決定CDK激活作用定時的主要因素。這些包含細胞周期蛋白和CDK的複合體在細胞周期中的周期性激活介導了細胞周期轉換(檢查點)的時序調節。其它調節CDK活性的因子包括CDK抑制劑(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK活化激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人，1999；Reed 1996)。
在植物中，迄今為止，已經研究了兩種主要類型的CDK，稱作A型和B型CDK。A型CDK調節G1向S和G2向M的轉換；而B型CDK似乎僅控制G2至M的檢查點(Hemerly等人，1995；Magyar等人，1997；Porceddu等人，2001)。此外，已經報導存在C型CDK和CDK活化激酶(CAK)(Magyar等人，1997；Umeda等人，1998；Joubès等人，2001)。Vandepoele等人2002年通過基於同源性的註解方法鑑定了4種CAK。這些CAK為三種D型CAK(Arath；CDKD；1，Arath；CDKD；2和Arath；CDKD；3)；和一種F型CAK(Arath；CDKF；1)。
Yamaguchi等人(PNAS Vol.100(13)8019-8023，2003)描述了在菸草葉外植體中過量表達稻R2cDNA(編碼CAK)。他們報導，R2在培養的第一個7天瞬時表達觸發在沒有細胞分裂素的情況下形成愈傷組織。Yamaguchi等人也檢查了CDK對體外器官發生的控制。
Fabian-Marwedel等人(The Plant Cell，Vol.14，197-210，2002)報導了稻CAK、R2在懸浮細胞中調節S期進程和總體生長速率。
影響植物細胞周期並因此修飾植物多種生長特徵的能力將應用於下列領域，例如作物增產、植物育種、觀賞植物生產、aboriculture、園藝學、林業、用於生物反應器(用於諸如藥物、抗體、或疫苗的生物技術生產、或有機廢物的生物轉化)的藻類的生產以及其它此類領域。
現在已經發現，向植物引入CDKD編碼核酸使植物具有相比對應的野生型植物增加的產量。因此，根據本發明的一個實施方案，提供了在植物中增加產量的方法，其包括向植物引入編碼CDKD的核酸。
如文中所定義的術語「增加的產率」分別用來指相對於對應的野生型植物，在如下的一個或多個方面的增加(i)植物一個或多個部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收穫)部分，增加的根生物量或增加的任何其它的可收穫部分的生物量，(ii)增加的種子產率，其可能源於增加的種子生物量(種子重量)，可能是每株植物種子重量的增加或個別種子基礎上的增加，並且所述種子重量的增加可能是因改變的種子大小所致，如種子長度和/或種子寬度和/或種子面積；(iii)增加的(飽滿)種子數量；(iv)增加的種子大小，這可能也影響種子的組成；(v)增加的種子體積，這也可能影響種子的組成；(vi)增加的收穫指數，其可以表達為可收穫部分如種子的產率佔總生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，是從計數的飽滿種子的數量和它們的總重量推斷的。增加的TKW可能源於增加的種子大小和/或種子密度。
根據本發明的一個優選實施方案，產率的增加涵蓋如上文(ii)至(vii)中任何一項或多項所定義的種子水平上的產量增加。
以穀物為例，產量增加可表現為下列一個或多個方面每公頃或每英畝植株數的增加，每株植物穗的增加，行數、每行種仁數、粒重、千籽粒重、穗長度/直徑的增加，等等。以稻為例，產量增加可表現為下列一個或多個方面的增加每公頃或每英畝植株數，每株植物的花序數，每個花序上的小穗數，每個花序上的花數，種子飽滿率的增加、千籽粒重的增加，等等。產量的增加可能還導致改變的結構，或可能作為改變的結構的結果發生。
根據優選特徵，使用本發明的方法導致植物具有增加的產量，其中所述增加的產量通過下列至少一種情況來證明增加的地上面積、增加的TKW、增加的飽滿種子數量、增加的種子重量和增加的收穫指數(每個都相對於對照或相應的野生型植物)。
使用本發明的方法方便地導致任何植物的產量增加。
如文中所用的術語「植物」包含整個植物，植物的祖先和後代，以及植物的部分，包括種子，枝條，莖，葉，根(包括塊莖)，以及組織和器官，其中上述的每一種都包含目的基因。術語「植物」還包含胚，分生組織區域，配子體，孢子體，花粉與小孢子，同樣其中上述的每一種也都含有目的基因。如本文所定義，術語植物不包括懸浮培養物和愈傷組織。
本發明的方法可以用於任何植物，尤其屬於植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括飼料或飼料豆科植物，觀賞植物，糧食作物，選自如下物種的喬木或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、紐西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp.)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、樺木屬(Betula spp.)、芸苔屬(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱纓花屬物種(Calliandra spp.)、大葉茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、決明屬物種(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomelesspp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressusspp.)、Cyathea dealbata、(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(Davalliadivaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、粗糙蚌貝蕨(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartiaspp.、子(Eleusine coracana)、畫眉草屬物種(Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費約果(Feijoasellowiana)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺屬物種(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(Indigo incarnata)、鳶尾屬物種(Irisspp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、Lettucaspp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、羅頓豆(Lotonusbainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋果屬物種(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、菸草屬物種(Nicotianum spp.)、驢食豆屬物種(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物種(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄屬物種(Petunia spp.)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、檳榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠屬物種(Photinia spp.)、白雲杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、紐西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesiio)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、歐洲醋慄(Ribes grossularia)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp.)、懸鉤子屬物種(Rubusspp.)、柳屬物種(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬物種(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophvlla)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、莧屬植物、朝鮮薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍、捲心菜、canola、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍綠葉植物、亞麻、無頭甘藍、小扁豆、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶葉和藻類，等等。根據本發明的一個優選實施方案，植物是作物如大豆，向日葵，芸苔，紫花苜蓿，油菜籽，棉花，番茄，馬鈴薯或菸草。更進一步優選地，植物是單子葉植物，如甘蔗。更優選地，植物是穀類，如稻，玉米，小麥，大麥，粟，黑麥，高粱或燕麥。
術語「D型CDK」或「CDKD」在本文可互換使用，並且指當在CDK系統樹(如


圖1描繪的系統樹)的構建中使用時聚類在包括D型CDK(但無其它CDK類型，例如A、B、C、E或F型CDK)的組周圍或組中的任何胺基酸序列。本文編碼CDKD的核酸是指編碼如上文定義的CDKD胺基酸的核酸。
本領域技術人員使用已知技術和用來製作此類系統樹的軟體，例如GCG、EBI或CLUSTAL軟體包，使用默認參數可以容易確定任何所討論的胺基酸序列是否屬於上述定義。構建此類系統樹時，聚類在D型CDK組周圍或組中的序列將被認為屬於「D型CDK」的定義。編碼此類序列的核酸將用於進行本發明的方法。
D型CDK一般具有磷酸化並激活CDK的能力，並且也已經顯示為磷酸化並激活RNA聚合酶II。D型CDK也可以呈現一種或多種並且優選所有下列特徵(i)NXTALRE基序，其中X為任意胺基酸；(ii)催化性激酶結構域；以及(iii)結合細胞周期蛋白H的能力。
由於基序NXTALRE對CDKD是特異的(根據現有知識)，所以這種類型的CDK可以容易與任何其它CDK區別。相反，根據現有知識，A型CDK將具有PSTAIRE基序，B型CDK具有P(P/S)T(A/T)(L/M)RE基序，C型CDK具有PITAIRE基序，E型CDK將具有SPTARE基序，而F型CDK將具有XSAXRE基序。
本領域技術人員可以對例如純化的底物(例如人CAK2)或擬南芥(Arabidopsis thaliana)RNA聚合酶II羧基末端測定激酶活性。CDKD結合細胞周期蛋白H的能力可以通過從純化的CDKD和細胞周期蛋白H中共沉澱CDKD-細胞周期蛋白H複合體或者通過使用雙雜交測定容易地確定。
在擬南芥中，CDKD由3種不同基因CDKD；1、CDKD；2和CDKD；3編碼；每種基因編碼包含基序NXTALRE的蛋白質，其中X為任意胺基酸。
有利地，本發明的方法可以使用任何編碼上文定義的CDKD的核酸來執行。向植物引入CDKD編碼核酸使得此核酸在植物中的調節性表達(優選增加的表達)和/或植物中CDKD多肽的受調節的(優選增加的)活性和/或水平。CDKD的活性可以通過增加多肽水平來增加。備選地，當CDKD多肽的水平沒有改變或者甚至當CDKD多肽的水平減小時，活性增加。當多肽的內在性質改變(例如，通過製備比野生型多肽更具活性的突變形式)時，就會發生活性增加。
編碼CDKD的核酸優選與組成型啟動子有效連接以在植物中過量表達。組成型啟動子優選為GOS2啟動子，進一步優選來自稻的GOS2啟動子。應當清楚的是，本發明的應用既不局限於使用擬南芥CDKD，也不局限於SEQ ID NO1代表的CDKD，本發明的應用也不局限於CDKD編碼核酸在GOS2啟動子驅動下的表達。
根據本發明優選的方面，想像到CDKD核酸增強或增加的表達。獲得基因或基因產物增強或增加的表達的方法在本領域詳細記載，並且包括例如通過強啟動子驅動的過量表達、轉錄增強子或翻譯增強子的使用。
編碼CDKD的核酸可以來自任意來源。編碼CDKD的核酸/基因可以從微生物來源(例如細菌、酵母或真菌)或植物、藻類或動物(包括人類)來源分離。這個核酸可以在組合物和/或基因組環境中通過有意的人為操作來對其天然形式進行修飾。核酸優選為同源核酸，即從植物獲得的核酸(無論是從它將被引入的相同植物物種，或從不同植物物種)。核酸可以從雙子葉物種，優選十字花科(Brassicaceae)、更加優選擬南芥中分離。更加優選地，從擬南芥分離的編碼CDKD的核酸是CDKD；1、CDKD；2或CDKD；3。最優選地，CDKD是擬南芥的CDKD；1，具體而言是SEQ ID NO1代表的核酸序列和SEQ ID NO2代表的相應胺基酸序列。
有利地，本發明的進行不局限於使用SEQ ID NO1代表的擬南芥CDKD；1。根據本發明的方法也可以使用上文定義的CDKD的功能性變體或使用編碼CDKD的核酸的功能性變體來進行。優選的功能性變體為SEQID NO1代表的核酸序列的變體或SEQ ID NO2代表的胺基酸序列的功能性變體。
本文定義的術語「功能性變體」為落入上文定義的CDKD定義的變體。優選地，功能性變體也具有磷酸化和激活CDK以及磷酸化和激活RNA聚合酶II的能力。優選地，D型CDK的功能性變體也呈現一種或多種並優選地所有下列特徵(i)NXTALRE基序，其中X為任意胺基酸；(ii)催化性激酶結構域；以及(iii)結合細胞周期蛋白H的能力。本領域技術人員也可以通過簡單地將待檢驗功能的變體替換下文實施例部分描述的序列容易地確定特定變體是否為功能性的(根據它是否能夠增加植物產量)。
在進行根據本發明的方法中有用的適當變體核酸及胺基酸序列包括(i)CDKD編碼核酸的功能性部分；(ii)能夠與CDKD編碼核酸雜交的序列；(iii)CDKD編碼核酸的可變剪接變體；(iv)CDKD編碼核酸的等位變體；和(v)CDKD胺基酸的同源物、衍生物和活性片段。
每一種上述變體都是上文定義的功能性變體。
使用全長CDKD編碼DNA序列並非進行根據本發明方法的先決條件，這對本領域技術人員是顯而易見的。根據本發明的方法可以使用CDKD編碼DNA/核酸的功能性部分，優選SEQ ID NO1代表的核酸序列的功能性部分來有利地進行。功能性部分為落入上文定義的功能性變體定義的CDKD編碼核酸。部分可以使用本領域眾所周知的技術，例如通過在編碼CDKD的核酸(例如SEQ ID NO1的核酸序列)中產生一個或多個缺失來製備。
因此，根據本發明，提供了增加植物產量尤其是種子產量的方法，其包括向植物引入CDKD編碼核酸的一部分。
另一變體為能夠與CDKD編碼核酸雜交的序列。此類雜交序列為那些落入上文功能性變體定義的序列。特別優選的是能夠在嚴格條件下與CDKD編碼核酸，尤其是SEQ ID NO1代表的CDKD編碼核酸雜交的序列。
如本文所定義的術語「雜交」是其中基本上同源的互補核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可完全發生在溶液中，即兩互補的核酸都處於溶液中。依賴這種方法的分子生物學工具包括聚合酶鏈式反應(PCR；以及基於此的所有方法)、扣除雜交、隨機引物延伸、S1核酸酶作圖、引物延伸、反轉錄、cDNA合成、RNA差異顯示和DNA測序。雜交過程還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定於基質如磁珠、瓊脂糖凝膠珠子或任何其它樹脂上。依賴這種方法的分子生物學工具包括poly(A+)mRNA的分離。此外雜交過程可還可以如此進行，即其中互補核酸之一固定於固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術固定到例如矽酸玻璃支持物上(後者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸晶片)。依賴這種方法的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、集落雜交、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使得雜交發生，通常使核酸分子熱變性或化學變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去髮夾或其它二級結構。雜交的嚴格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩衝液組成等條件的影響。雜交優選在嚴格條件下進行。嚴格條件為(1)採用低離子強度和高溫度進行洗滌，例如，0.5M磷酸鈉緩衝液pH 7.2，溶於7％SDS的1mM EDTA pH 8.0，溫度為65℃或55℃，或者(2)在雜交期間使用變性劑如甲醯胺，例如，50％(體積/體積)甲醯胺加0.1％牛血清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.05M磷酸鈉緩衝液pH 6.5加0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉，溫度為42℃。具體的實例包括使用50％甲醯胺，5×SSC(0.75NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhard’s液，超聲處理的鮭精DNA(50nm/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，溫度為55℃，並於55℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。本領域的技術人員能夠很容易地確定並適當地改變嚴格條件，以獲得清楚和可檢測的雜交信號。
因此，根據本發明，提供了增加植物產量的方法，其包括向植物引入能夠優選地在嚴格條件下與CDKD編碼核酸雜交的序列。
另一在本發明方法中有用的變體是CDKD編碼核酸的可變剪接變體。適當的剪接變體為那些落入上文定義的功能性變體的定義的變體。本文所用術語「可變剪接變體」包含其中所選的內含子和/或外顯子已經被缺失、替代或加入的核酸變體。此類變體是其中蛋白質的生物活性保持不受影響的變體，這可以通過選擇性地保持蛋白質的功能性片段來實現。此類剪接變體可以在天然中找到或者是人造的。製備此類剪接變體的方法在本領域是眾所周知的。SEQ ID NO1的剪接變體特別優選由於根據本發明的方法。
因此，本發明也提供了增加植物產量的方法，其包括向植物引入CDKD編碼核酸的可變剪接變體。
用於本發明的方法的另一種變體為CDKD編碼核酸的等位變體。合適的等位變體為那些落入上文定義的功能性變體的定義的變體。等位變體天然存在，而且本發明方法中包含的等位變體就是使用這些天然的等位基因。等位變體包含單核苷酸多態性(SNP)以及小插入/缺失多態性(INDEL)。INDEL的大小通常小於100bp。SNP和INDEL形成了大多數生物天然發生的多態性株系中最大的序列變體集。在根據本發明的方法中尤其優選使用SEQ ID NO1的等位變體。
因此，本發明也提供了增加植物產量的方法，其包括向植物引入CDKD編碼核酸的等位變體。
更加有利地，根據本發明的方法也可以使用CDKD的同源物、衍生物或活性片段來進行。編碼胺基酸的同源物、衍生物或活性片段的核酸(例如SEQ ID NO2代表的核酸)可以容易地通過本領域技術人員眾所周知的常規技術來確定。此類適合在本發明的方法中使用的核酸可以容易地如上所述確定。
蛋白質的「同源物」包含相對所討論的未修飾蛋白質具有胺基酸置換、缺失和/或插入、但具有與它們從中衍生的未修飾蛋白質類似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。要產生此類同源物，蛋白質的胺基酸可以用其它具有相似性質(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或斷裂α-螺旋結構或β-摺疊結構的傾向性)的胺基酸代替。保守置換表是本領域眾所周知的(例如見Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany)。
用於根據本發明的方法中的同源物與SEQ ID NO2代表的胺基酸序列具有(按升序的優選性)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。CDKD彼此之間呈現大約65％的同一性，並且與其它CDK呈現小於40％的同一性。因此，具有與SEQ ID NO2代表的CDK至少50％同一性的同源物將不包含非D型CDK的任何其它CDK。
術語「同源物」還涵蓋兩種特殊形式的同源性，其包括直向同源(orthologous)序列和共生同源(paralogous)序列，它們涵蓋了用於描述基因遺傳關係的進化概念。術語「共生同源」涉及某物種基因組內的基因複製，產生共生同源基因。術語「直向同源」涉及不同生物體中因遺傳關系所致的同源基因。
例如，單子葉植物物種中的直向同源物可以通過實施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，包括在任何序列資料庫如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI資料庫中，對所討論的序列(例如，SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)進行blast。如果尋找的是稻的直向同源物，所討論的序列將與例如來自NCBI上可用的Oryza sativa Nipponbare稻的28,469的全長cDNA克隆進行blast。當從核苷酸開始時可使用BLASTn，或當從蛋白質開始時可使用TBLASTX，並使用標準預設值(期望值10，比對值50)。blast的結果可以進行過濾。然後再將過濾結果或未過濾結果的全長序列與所討論的序列(SEQ ID NO1或2)進行反向blast(第二次blast)。然後對第一次和第二次blast的結果進行比較。在大家族的情況下，使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察聚類(clustering)。
同源物可以是蛋白質「取代變體」的形式，即，其中胺基酸序列中的至少一個殘基已經被除去，而將一個不同的殘基插入到它的位置上。胺基酸取代一般是單殘基的，但是取決於對多肽構成的功能限制可以是成串的；插入通常是大約1到10個胺基酸殘基，缺失為大約1到20個殘基。優選地，胺基酸取代包括保守胺基酸取代。
同源物還可以是蛋白質的「插入變體」，即，其中一個或多個胺基酸殘基被引入到蛋白質中的預定位點。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸的序列內插入。通常，胺基酸序列內的插入將小於氨基或羧基末端融合，約為1到10個殘基的數量級。氨基或羧基末端融合蛋白質或肽的實例包括如用於酵母雙雜合系統的轉錄激活因子的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標籤、穀胱甘肽S-轉移酶-標籤、A蛋白、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白質「缺失變體」形式的同源物的特徵在於從蛋白質除去一個或多個胺基酸。
使用本領域熟知的肽合成技術，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易地製備蛋白質的胺基酸變體。對DNA序列進行操作以產生蛋白質的取代、插入或缺失變體的方法是本領域熟知的。例如，在DNA的預定位點產生取代突變的技術是本領域技術人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的位點定向誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導的位點定向誘變或其它位點定向誘變方案。
「衍生物」包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與S3a蛋白天然存在形式的胺基酸序列相比，例如，如SEQ ID NO2所示，其可以包括天然和非天然存在胺基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質的「衍生物」包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，與多肽天然存在形式的胺基酸序列相比，其可以包括改變的、糖基化的、醯化的天然存在的胺基酸殘基或非天然存在的胺基酸殘基。與其衍生自的胺基酸序列相比，衍生物還可包括一個或多個非胺基酸取代基，例如與胺基酸序列共價或非共價結合的報告分子或其它配體，如結合以便於其檢測的報導分子，以及相對於天然存在蛋白質的胺基酸序列而言的非天然存在的胺基酸殘基。
CDKD蛋白質的「活性片段」包含足夠的胺基酸殘基來聚類於構建的系統樹(如
圖1所示的一個系統樹)上D型CDK組的周圍或其中。當使用此系統樹中的片段時，相似片段應當與相似片段比較，這表示應當用其它CDK的相應片段來創建系統樹。
搜索和鑑定CDKD同源物的方法是本領域技術人員熟知的。對用於比較的序列進行比對的方法是本領域熟知的，這類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法來實現兩個全序列的比對，其最大化匹配的數目，並最小化空位數目。BLAST算法計算序列同一性百分比，並對兩個序列之間相似性進行統計學分析。執行BLAST分析的軟體通過國家生物技術信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)可公眾獲得。適合在本發明的方法中使用的同源物，即那些具有與SEQ ID NO2代表的胺基酸序列至少50％序列同一性的同源物，可以通過取得全長的CDK蛋白質序列並使用ClustalX1.81軟體(採用默認參數)將它們比對來鑑定。然後使用BOXSHADE軟體(同樣採用默認參數)從這個比對計算距離矩陣。兩種軟體程序都可以公開獲得。
因此，本發明也提供了增加植物產量的方法，其包括向植物引入編碼CDKD例如SEQ ID NO2代表的CDKD的同源物、衍生物或活性片段的核酸，其中所述同源物、衍生物或活性片段與SEQ ID NO2代表的胺基酸序列具有(按升序的優選性)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。
本發明還提供了遺傳構建體和載體，以便於引入和/或表達可用於本發明方法的核苷酸序列。
因此，提供的基因構建體包含(i)CDKD編碼核酸，優選SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性變體(如上文定義)；
(ii)能夠驅動(i)的核酸序列表達的一種或多種控制序列；和任選地(iii)轉錄終止序列。
在根據本發明的方法中使用的構建體可以使用本領域技術人員眾所周知的重組DNA技術構建。基因構建體可以插入適合轉化進入植物並且適合在轉化的細胞中表達目的基因的商品化載體中。
用包含目的序列(即SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性變體(如上文定義))的載體轉化植物。目的序列與一個或多個控制序列(至少與一個啟動子)有效地連接。術語「調控元件」、「控制序列」和「啟動子」在文中都可以互換使用，且應當取其廣義，是指能對與它們連接的序列的表達起作用的調控核酸序列。上述術語涵蓋來源於經典真核生物基因組基因(包括精確轉錄起始所需的TATA盒，帶或不帶CCAAT盒序列)以及根據發育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達的另外的調控元件(即，上遊激活序列、增強子和沉默子)的轉錄調控序列。該術語還包括經典原核生物基因的轉錄調控序列，在這種情況下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。術語「調控元件」也涵蓋合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠、在細胞、組織或器官中表達，激活或增強這種表達。如本文所用的術語「有效連接」指啟動子序列與目的基因之間的功能性連接，以便啟動子序列能啟動目的基因的轉錄。
優選地，編碼CDKD或其功能性變體的核酸有效地與組成型啟動子連接。如文中所定義的術語「組成型啟動子」指該啟動子在至少一種組織或器官中優勢表達，而且在植物生活周期的任何階段都優勢表達。優選地，組成型啟動子在整株植物中優勢表達。優選地，組成型啟動子是來自稻的GOS2啟動子。
適合用於本發明方法的其它組成型啟動子的例子列於下表A。
表A用於實施本發明的組成型啟動子的實例
任選地，一個或多個終止子序列也可用於被引入到植物中的構建體中。術語「終止子」涵蓋控制序列，其是位於轉錄單元末端的DNA序列，傳遞3』加工和初級轉錄物聚腺苷酸化以及轉錄終止的信號。另外的調控元件也可以包括轉錄增強子以及翻譯增強子。本領域技術人員知曉適合用於實施本發明的終止子與增強子。這樣的序列是已知的，或本領域技術人員可以很容易地獲得。
本發明的遺傳構建體還可以包括在特定細胞類型中維持和/或複製所需的複製原點序列。一個實例是需要遺傳構建體在細菌細胞中作為染色體外遺傳元件(例如，質粒或粘粒分子)維持的情況。優選的複製原點包括但不局限於f1-ori和colE1。
基因構建體可以任選地包含選擇性標記基因。如本文所用，術語「選擇性標記基因」包括任何賦予細胞表型的基因，其中它的表達促進已用本發明的核酸構建體轉染或轉化的細胞的鑑定和/或篩選。適當標記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標記。因此，包含重組DNA的細胞能夠在殺死未轉化細胞濃度的抗生素或除草劑存在下存活。選擇標記基因的實例包括提供除草劑Basta抗性的bar基因；賦予抗生素卡那黴素抗性的npt基因；賦予潮黴素抗性的hpt基因。可見標記例如綠色螢光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或螢光素酶也可以用作選擇標記。適當的選擇標記基因的其他實例包括氨苄青黴素抗性(Ampr)、四環素抗性基因(Tcr)、細菌卡那黴素抗性基因(Kanr)、膦絲菌素抗性基因、新黴素磷酸轉移酶基因(npt II)、潮黴素抗性基因、以及氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因等。
本發明也包括通根據本發明的方法可以獲得的植物。因此本發明提供了通過根據本發明的方法可以獲得的植物，其中所述植物相對於對應的野生型植物具有增加的產量並且所述植物具有改變的CDKD蛋白質活性和/或水平和/或編碼CDKD蛋白質的核酸改變的表達。
本發明也提供了產生具有增加產量的轉基因植物的方法，其包括在植物中引入和表達CDKD編碼核酸或其功能性變體(如上文定義)。
更加具體地，本發明提供了產生具有增加產量的轉基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物細胞引入CDKD編碼核酸或其功能性變體(如上文定義)；(ii)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養植物細胞。
)義於，其中核酸可以直接引入到植物細胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其它部分)之中。根據本發明的一個優選的特徵，核酸優選通過轉化被引入到植物中。
如本文所提及的術語「轉化」涵蓋把外源多核苷酸向宿主細胞中的轉移，而不管轉移的方法如何。能夠隨後無性繁殖的植物組織，無論是通過器官發生還是胚胎發生，都可以用本發明的遺傳構建體進行轉化，並從其再生完整植物。選擇的特定組織將視可用於且最適於轉化的特定物種的無性繁殖體系而改變。例示性的靶組織包括葉圓盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時或穩定地被引入到宿主細胞中，並可保持非整合狀態，例如，作為質粒。可選擇地，它可以整合到宿主基因組中。所得的轉化植物細胞然後可用於以本領域技術人員所知的方法再生為轉化植物。
植物物種的轉化目前是一種相當常規的技術。有利地，任何轉化方法都可用於引入目的基因到合適的祖代細胞中。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進行轉化以及顯微注射。方法可選自用於原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA塗層顆粒轟擊(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。表達CDCK編碼核酸的轉基因稻植物優選使用任何用於稻轉化的熟知方法，通過土壤農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化產生，例如在任何以下文獻中描述的方法公開的歐洲專利申請EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣併入文中作為參考。至於穀物轉化，優選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等(PlantPhysiol.2002 May；129(1)13-22)中所述，其公開的內容如同其陳述的全部內容那樣併入文中作為參考。通常在轉化以後，選擇植物細胞或細胞群中與目的基因共轉移的植物可表達基因所編碼的一個或多個標記，接著將轉化的材料再生成完整植株。
DNA轉移和再生之後，可評價推斷轉化植物中目的基因的存在、拷貝數和/或基因組結構，例如使用Southern分析。可選擇地或另外地，新引入DNA的表達水平可使用Northern和/或Western分析進行監控，兩種技術都是本領域普通技術人員所熟知的。
產生的轉化植物可通過各種方法進行繁殖，如通過無性繁殖或經典育種技術。例如，第一代(或T1)轉化植物可以自花授精以產生純合的第二代(或T2)轉化株，而T2植物可進一步通過經典的育種技術進行繁殖。
產生的轉化生物體可以是各種形式的。例如，它們可以是轉化細胞與非轉化細胞的嵌合體；克隆轉化體(例如，所有的細胞都被轉化以含有表達盒)；轉化與未轉化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉化的根莖被嫁接到未轉化的接穗中)。
本發明顯然延及由文中描述的任何方法產生的任何植物細胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發明還延及囊括由任何上述的方法產生的原代轉化或轉染細胞、組織、器官或完整植物的後代，唯一的要求是該後代顯示與由本發明的方法在親代中產生的基因型和/或表型特徵相同的基因型和/或表型特徵。本發明還包括含有分離的編碼CDKD的核酸的宿主細胞。根據本發明優選的宿主細胞是植物細胞。本發明還延及植物的可收穫部分，如但不局限於種子、葉、果實、花、根莖、塊莖和鱗莖。
本發明也包含編碼CDKD的核酸的用途以及CDKD多肽的用途。
當然，該用途之一涉及CDKD在增加植物產量，尤其是增加種子產量中的用途。種子產量可以包括下列一種或多種情況增加的飽滿種子數量、增加的種子重量、增加的收穫指數和增加的TKW等等。CDKD可以是SEQID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的胺基酸或其如上文定義的功能性變體。
編碼CDKD的核酸和CDKD多肽也可以用於育種程序中。CDKD可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的胺基酸或其如上文定義的功能性變體。例如，CDKD編碼核酸或其功能性變體可以在染色體(或其部分)上，優選和一個或多個相關家族成員在一起。在此育種程序的實例中，鑑定DNA標記，其中所述的DNA標記可以與編碼CDKD蛋白質或其功能性變體的核酸遺傳性連接。然後這個DNA標記可以在育種程序中用來選擇具增加產量的植物。
CDKD的等位變體也可以用在常規育種程序，例如標記輔助育種中。此類育種程序有時需要通過誘變處理植物來向植物中引入等位基因變異。一種合適的誘變方法是EMS誘變。然後通過例如PCR進行等位變體的鑑定。緊接著是篩選步驟，選擇所討論序列的導致植物產量增加的優良等位變體。篩選一般通過監測包含所討論的序列的不同等位變體(例如SEQ IDNO1不同的等位變體)的植物產量來進行。監測產量可以在溫室或田間完成。其他的任選步驟包括將植物與另一植物雜交，其中鑑定出優良等位變體。這可以用來例如產生目的表型特徵的組合。
編碼CDKD的核酸和CDKD多肽也可以用作生長調節劑。CDKD可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定義的功能性變體；或者CDKD可以是SEQ ID NO2代表的胺基酸或其如上文定義的功能性變體。因為這些CDKD可用於增加植物產量，所以CDKD也是有用的生長調節劑，例如除草劑或生長刺激劑。因此，本發明提供了包含CDKD、以及適當載體、稀釋劑或賦形劑的組合物，其用作生長調節劑。
根據本發明的方法也可以不向植物引入編碼CDKD的核酸來進行。這可以通過引入基因修飾(優選在CDKD編碼基因的基因座中)來實現。本文定義的基因的基因座用來表示基因組區域，其包括目的基因和編碼區上遊或下遊的10KB。
可以例如通過任意一種(或多種)下列方法來引入遺傳修飾TDNA激活、tilling、位點定向誘變、同源重組或者如上文詳述，通過在植物(細胞)中引入和表達CDKD編碼核酸。
T-DNA激活標籤(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的插入，其通常在目的基因的基因組區域或基因編碼區的上遊或下遊10KB處中含有如此構造的啟動子(也可能是翻譯增強子或內含子)，從而該啟動子能指導靶基因的表達。一般地，破壞靶基因天然啟動子對其的表達調控，而使該基因處於新引入的啟動子的控制之下。啟動子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過土壤農桿菌感染隨機插入到植物基因組中，並導致靠近該插入的T-DNA的基因過量表達。由於接近引入的啟動子的基因過量表達，所得的轉基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動子可以是能指導基因在所需的生物體[在本案為植物]中表達的任何啟動子。例如，組成型、組織偏好的、細胞類型偏好的以及誘導型啟動子都適合用於T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(靶向誘導基因組局部突變技術，TargetedInduced Local Lesions IN Genomes)，把遺傳修飾引入到CDKD編碼核酸/基因的基因座中。這是一種誘變技術，可用於產生和/或鑑定、並最終分離能顯示CDKD生物學活性的CDKD編碼核酸的誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現出比該基因的天然形式所表現的更高的CDKD活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結合起來。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA製備和個體合併；(c)目的區域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈的存在檢測為色譜圖中額外的峰值；(f)鑑定突變個體；和(g)突變PCR產物的測序。TILLING的方法是本領域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple2004(TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics.NatRev Genet.2004年2月；5(2)145-50.)綜述)。
可利用位點定向誘變產生CDKD編碼核酸的變體。若干方法可用來實現位點定向誘變，最常見的是基於PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley編http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。TDNA激活、TILLING和位點定向誘變是能夠產生新的等位基因和CDKD變體的技術的實例。
同源重組能夠在基因組的規定選擇位置處引入選定的核酸。同源重組是生物學中通常使用的標準技術，用於較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用於在植物中進行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)3077-84)，而且在禾穀類作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Effcient genetargeting by homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgenetargeting by homologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)132-8)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定義的CDKD編碼核酸或其變體)不需靶向到CDKD編碼基因的基因座中，但是可以被引入到高表達的區域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用於替換內源基因，或附加地引入到內源基因中。
如上文所述，根據本發明的方法產生具有增加的產量的植物。這些有利的產量效應也可以與其它經濟上有利的性狀(例如進一步的產量增強性狀、多種壓力的耐受性、修飾多種結構特徵和/或生物和/或生理特徵的性狀)組合。
附圖描述現在本發明將參考下列附圖進行描述，其中
圖1為顯示多種植物CDK的樹。全長的CDK蛋白質序列使用「ClustalX1.81」軟體採用其默認參數進行比對。使用「ClustalX1.81」採用其默認參數從這個比對中計算鄰接樹。使用「Phylip3.5」軟體包的「drawgram」程序用其默認參數繪製樹。
圖2顯示在稻(Oryza sativa)中表達GOS2啟動子調控下的擬南芥CDKD；1基因的雙元載體。
圖3詳述了用於進行根據本發明的方法的序列的實例。
實施例本發明現在將參考以下實施例進行描述，其僅僅是為了例證說明。
進行ng DNA操作除非另有說明，重組DNA技術根據(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，3rd Edition Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等第1卷和第2卷(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols中描述的標準方案進行。用於植物分子工作的標準材料和方法描述於R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1基因克隆使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增擬南芥的CDKD1；1。在從幼苗提取的RNA進行反轉錄之後，將cDNA克隆進入pCMV Sport 6.0。文庫的平均插入片段大小為1.5kb，而最初克隆數為1.59×107集落生成單位(cfu)。在第一次6×1011cfu/ml擴增之後，最初效價測定為9.6×105cfu/ml。提取質粒之後，使用200ng在50μl PCR混合物中用作模板。使用引物prm2676(有義，起始密碼子帶下劃線，AttB1位點為斜體5』GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAACAGCCGAAGAAAG 3』)和prm3677(反義、互補的，終止密碼子帶下劃線，AttB2位點為斜體5』GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATAGGAACTCGAGATCAAGTT 3』)(其中包括進行Gateway重組的AttB位點)進行PCR擴增。用Hifi Taq DNA聚合酶在標準條件下進行PCR。擴增得到1256bp的PCR片段，同樣使用標準方法純化。然後進行Gateway方法的第一個步驟BP反應，在此期間PCR片段在體內與pDONR201質粒重組，產生根據Gateway命名法的「進入克隆」p2777。質粒pDONR201作為Gateway技術的部分從Invitrogen購買得到。
實施例2載體構建隨後進入克隆p2777用來與用於稻轉化的目的載體p0640進行LR反應。這個載體包含在T-DNA邊界中植物選擇性標記、可篩選標記以及旨在與已經克隆入進入克隆的目的序列進行LR體內重組的Gateway盒。組成型表達的稻GOS2啟動子定位於Gateway盒的上遊。
LR重組步驟之後，將所得到的表達載體(如圖2所示)(CDKD1；1::GOS2-上調)轉化進入農桿菌，隨後轉化進入稻植物。讓轉化的稻植物生長，並檢測實施例3中描述的參數。
實施例3評估和結果產生了大約15到20個獨立的T0稻轉化株。一代轉化株從組織培養室轉移到溫室中生長，並收穫T1種子。6個事件得以保留，其中T1後代發生轉基因存在/缺乏的3∶1分離。對於這些事件中的每一個，通過監控視覺標記的表達，選擇了大約10個包含轉基因的T1幼苗(異型和同型接合子)，和大約10個缺乏轉基因的T1幼苗(無效接合子)。
統計分析t-檢驗和F-檢驗兩因子的ANOVA(方差分析)用作統計模型，用於植物表型特徵的綜合評價。對用本發明的基因轉化的所有事件的所有植株的所有測量參數進行F測驗。進行F測驗以檢查基因對所有轉化事件的作用，並檢驗基因的總效應，亦稱之為整體基因效應。真實整體基因效應的顯著性閾值設置為F測驗的5％概率水平。顯著的F測驗值顯示基因效應，意味著不僅僅是基因的存在或位置引起表型的差異。
為了檢驗事件中的基因效應即株系特異效應，在每個事件中用從轉基因植物和相應無效植物採集的數據進行t-檢驗。「無效植物」或「無效分離子」為以與轉基因植物相同的方式處理但轉基因已經從中分離的植物。無效植物也可以描述為純合的陰性轉化體。t-檢驗的顯著性閾值設置為10％的概率平準。在一個5種轉化事件的總體中，一些事件可以低於或者高於這個t-檢驗閾值。這基於如下假設，即基因只在基因組的某些位置才具有效應，而且這種位置依賴性效應的發生是普遍的。這種類型的基因效應也已知為基因的株系效應(line effect)。通過比較t-值和t-分布或者備選地通過比較F-值和F-分布可以獲得p-值。這時，p值代表無效假說(無效假說即「沒有轉基因效應」)正確的概率。
4.1營養生長測量將經選擇的T1代植物(大約10株含轉基因，大約10株不含轉基因)轉移至溫室。每棵植物接受唯一的條形碼標籤來將表型數據與相應植物明確地關聯。經選擇的T1代植物在10cm直徑的盆中在下列環境條件下在土上生長光周期＝11.5h，目光強度＝30,000勒克斯(lux)或以上，白天溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對溼度＝60-70％。轉基因植物和相應的失效合子在隨機位置彼此相鄰地生長。從播種階段到成熟階段，每棵植物數次穿過數字成像箱(digital imaging cabinet)並照相。在每個時間點每棵植物至少從6個不同角度採集數字圖像(2048×1536像素，1千6百萬色彩(colours))。使用圖像分析軟體以自動方式從所有植物的所有數字圖像得到下文所述參數。
4.1.1地上植物面積植物的地上面積通過計數地上植物部分排除背景後的像素總數測定。將這個值對在同一時間點從不同角度拍攝的圖像平均，並通過校準將其轉化為以平方毫米表示的物理表面值。實驗表明，這種方式測定的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關。然後，T1代評估最好的3個株系在T2輪中進行評估。T2代評估的結果如下文表1所示。如表所示，其中一個株系與相應失效合子相比顯示地上面積的統計學上顯著增加(t-檢驗的p-值為0.0107)。
表1
每行對應一種事件，其中測定了轉基因(TR)和無效株系(null)的地上面積，以單位形式表示。給出了陽性植物和陰性植物之間的數字差異(dif)以及這些植物之間的差異百分數(％dif)。P-值代表通過每種植物株系的t-檢驗產生的概率。最後一行給出所有事件的平均數。其中，p-值表示從F-檢驗得到的p-值。
4.2種子相關參數測量收穫成熟的初級穗，裝袋，進行條形碼標記，然後在烘箱於37℃乾燥3天。然後對穗脫粒，收集所有的種子並計數。使用鼓氣裝置，把飽滿的穀殼從空穀殼中分離開。丟棄空穀殼，並對保留的部份再次計數。飽滿的穀殼在分析天平上稱重。該方法產生如下所述的種子相關參數組。
4.2.0飽滿種子數飽滿種子數通過在分離步驟後計數依然存在的飽滿外殼數來測定。同樣，T1代評估最好的3棵植物進行T2輪。T2代評估的結果如下文表2所示。如其所示，2個株系顯示與相應的非轉基因植物的飽滿種子數相比轉基因植物顯著增加的飽滿種子數。也存在總體基因效應，其通過F檢驗的顯著性p值為0推斷。
表2
每行對應一種事件，其中測定了轉基因(TR)和無效株系(null)的飽滿種子數，以單位形式表示。給出了陽性植物和陰性植物之間的數字差異(dif)以及這些植物之間的差異百分數(％dif)。P-值代表通過每種植物株系的t-檢驗產生的概率。最後一行給出所有事件的平均數。其中，p-值表示從F-檢驗得到的p-值。
4.2.1每棵植物的種子總產量種子總產量通過對植物收穫的所有飽滿外殼稱重來測定。同樣，T1代評估的3棵最好植物進行T2輪。T2評估的結果如下文表3所示。如其所示，2個株系顯示與相應的非轉基因植物相比轉基因植物顯著增加的種子重量。也存在總體基因效應，其通過F檢驗的顯著性p值為0來推斷。
表3
每行對應一種事件，其中測定了轉基因(TR)和無效株系(null)的種子總重量，以單位形式表示。給出了陽性植物和陰性植物之間的數字差異(dif)以及這些植物之間的差異百分數(％dif)。P-值代表通過每種植物株系的t-檢驗產生的概率。最後一行給出所有事件的平均數。其中，p-值表示從F-檢驗得到的p-值。
4.2.3植物的收穫指數本發明的收穫指數定義為種子總產量和地上面積(mm2)的比率乘以因子106。T1代評估中最好的3棵植物進行T2輪，T2評估的結果如下文表4所示。如其所示，1個株系顯示與對應的非轉基因植物相比轉基因植物增加的收穫指數，t檢驗的p值為0。總體基因效應也很明顯，F檢驗的p值為0。
表4
每行對應一種事件，其中測定了轉基因(TR)和無效株系(null)的收穫指數，以單位形式表示。給出了陽性植物和陰性植物之間的數字差異(dif)以及這些植物之間的差異百分數(％dif)。P-值代表通過每種植物株系的t-檢驗產生的概率。最後一行給出所有事件的平均數。其中，p-值表示從F-檢驗得到的p-值。
4.2.4千籽粒重(TKW)這個參數從已計數的飽滿種子數和它們的總重量外推得到。T1代評估中最好的3棵植物進行T2輪，T2評估的結果如下文表5所示。如其所示，1個株系顯示與對應的非轉基因植物相比轉基因植物增加的TKW，t-檢驗的p值為0.0455。
表5
每行對應一種事件，其中測定了轉基因(TR)和無效株系(null)的TKW，以單位形式表示。給出了陽性植物和陰性植物之間的數字差異(dif)以及這些植物之間的差異百分數(％dif)。P-值代表通過每個植物株系的t-檢驗產生的概率。最後一行給出所有事件的平均數。其中，p-值表示從F-檢驗得到的p-值。
序列表序列表110克羅普迪塞恩股份有限公司120產量增加的植物及其製備方法130CD-109-PCT150EP 04100841.51512004-03-01150US 60/550,9181512004-03-051605170PatentIn版本3.321012111256212DNA213擬南芥4001atggaacagc cgaagaaagt tgctgatagg tatctaaagc gagaggttct tggtcaaggt 60acttatggag tcgtcttcaa agctactgat acaaagaatg gagaaactgt agcgatcaag 120aaaataagac ttggtaaaga gaaagaaggt gtgaatgtaa cagctcttag agaaatcaaa 180ttacttaaag agcttaagca tccacatata attgagttga ttgatgcgtt tcctcacaag 240gagaatttgc acatcgtgtt tgagttcatg gagactgatc tcgaagcagt tatccgagat 300cgtaatctct atctttcgcc tggtgatgtc aaatcttacc tccaaatgat attgaaaggt 360cttgaatatt gccatggcaa atgggttctg cacagagata tgaagccaaa caacttgttg 420ataggaccca atggacagct gaaacttgca gattttgggt tagcacgtat atttggtagc 480ccaggtcgta agtttaccca ccaggtgttt gctagatggt atagagcacc tgaacttttg 540tttggtgcaa aacaatatga tggtgcagtt gatgtttggg ctgctggctg catttttgct 600
gaacttctat tacgcagacc atttcttcag ggaaacagtg atattgatca attaagcaaa 660atctttgctg cctttgggac tccaaaagca gatcagtggc ctgacatgat ctgccttcct 720gattatgtag agtatcaatt tgtccctgct ccttctttac gttctttact cccaacggtt 780agtgaggatg ctttagattt gttgtcaaag atgttcacct atgaccccaa gtctagaata 840tcgattcagc aggctctaaa acacaggtac ttcacatctg caccttcacc tactgaccct 900ttaaagctcc caagaccagt ttccaagcaa gatgctaagt catctgatag taaacttgaa 960gccattaaag tgctgtcacc agcacataag tttagaagag tgatgcctga ccgaggaaag 1020tctggtaatg gtttcaagga ccagagtgtt gatgtcatga gacaagctag ccatgatgga 1080caagcaccaa tgtctttaga tttcaccatc ttagctgagc ggccaccaaa ccgaccaacc 1140atcaccagtg cagatagatc tcatctgaag aggaaacttg atctcgagtt cctataggat 1200atcgcgtaac aggcttcttc ttgacgtcgt tcttcaggtt cctatagcct atagga 12562102211398212PRT213擬南芥4002Met Glu Gln Pro Lys Lys Val Ala Asp Arg Tyr Leu Lys Arg Glu Val1 5 10 15Leu Gly Gln Gly Thr Tyr Gly Val Val Phe Lys Ala Thr Asp Thr Lys20 25 30Asn Gly Glu Thr Val Ala Ile Lys Lys Ile Arg Leu Gly Lys Glu Lys35 40 45Glu Gly Val Asn Val Thr Ala Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Lys Glu
50 55 60Leu Lys His Pro His Ile Ile Glu Leu Ile Asp Ala Phe Pro His Lys65 70 75 80Glu Asn Leu His Ile Val Phe Glu Phe Met Glu Thr Asp Leu Glu Ala85 90 95Val Ile Arg Asp Arg Asn Leu Tyr Leu Ser Pro Gly Asp Val Lys Ser100 105 110Tyr Leu Gln Met Ile Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Cys His Gly Lys Trp115 120 125Val Leu His Arg Asp Met Lys Pro Asn Asn Leu Leu Ile Gly Pro Asn130 135 140Gly Gln Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Phe Gly Ser145 150 155 160Pro Gly Arg Lys Phe Thr His Gln Val Phe Ala Arg Trp Tyr Arg Ala165 170 175Pro Glu Leu Leu Phe Gly Ala Lys Gln Tyr Asp Gly Ala Val Asp Val180 185 190Trp Ala Ala Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu Leu Leu Arg Arg Pro Phe195 200 205Leu Gln Gly Asn Ser Asp Ile Asp Gln Leu Ser Lys Ile Phe Ala Ala210 215 220Phe Gly Thr Pro Lys Ala Asp Gln Trp Pro Asp Met Ile Cys Leu Pro
225 230 235 240Asp Tyr Val Glu Tyr Gln Phe Val Pro Ala Pro Ser Leu Arg Ser Leu245 250 255Leu Pro Thr Val Ser Glu Asp Ala Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Phe260 265 270Thr Tyr Asp Pro Lys Ser Arg Ile Ser Ile Gln Gln Ala Leu Lys His275 280 285Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Pro Ser Pro Thr Asp Pro Leu Lys Leu Pro290 295 300Arg Pro Val Ser Lys Gln Asp Ala Lys Ser Ser Asp Ser Lys Leu Glu305 310 315 320Ala Ile Lys Val Leu Ser Pro Ala His Lys Phe Arg Arg Val Met Pro325 330 335Asp Arg Gly Lys Ser Gly Asn Gly Phe Lys Asp Gln Ser Val Asp Val340 345 350Met Arg Gln Ala Ser His Asp Gly Gln Ala Pro Met Ser Leu Asp Phe355 360 365Thr Ile Leu Ala Glu Arg Pro Pro Asn Arg Pro Thr Ile Thr Ser Ala370 375 380Asp Arg Ser His Leu Lys Arg Lys Leu Asp Leu Glu Phe Leu385 390 3952103
2112193212DNA213稻4003aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aggaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200
tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc 1380gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt 1440aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag 1500ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg 1560atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat 1620acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc 1680cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca 1740ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta 1800gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga 1860tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg 1920attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac 1980tgtcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta 2040cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga 2100agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct 2160tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttc2193210421153212DNA213人工序列220
223引物prm2676
4004ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggaa cagccgaaga aag 53210521153212DNA213人工序列220
223引物prm26774005ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctataggaac tcgagatcaa gtt 5權利要求
1.相對於對應的野生型植物增加植物產量的方法，其包括向植物引入編碼D-型細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKD)的核酸。
2.根據權利要求1的方法，其中所述增加的產量為增加的種子產量。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述增加的產量選自(i)植物的一個或多個部分的增加的生物量；(ii)增加的種子生物量；(iii)增加的(飽滿)種子數；(iv)增加的種子大小；(v)增加的種子體積；(vi)增加的收穫指數；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)。
4.根據權利要求1-3任意一項的方法，其中所述核酸編碼CDKD或其功能性變體，並且其中所述核酸從植物獲得。
5.根據權利要求1-4任意一項的方法，其中所述編碼CDKD的核酸由SEQ ID NO1代表或者為其功能性變體，並且其中CDKD多肽由SEQID NO2代表或者為其功能性變體，所述功能性變體選自(i)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的部分；(ii)能夠與SEQ ID NO1的序列代表的核酸雜交的序列；(iii)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的可變剪接變體；(iv)SEQ ID NO1的序列代表的核酸的等位變體；和(v)SEQ ID NO2的序列代表的胺基酸的同源物、衍生物和活性片段。
6.根據權利要求1-5任意一項的方法，其中所述編碼CDKD的核酸序列在植物中過量表達。
7.根據權利要求1-6任意一項的方法，其中所述編碼CDKD的核酸的表達受組成型啟動子驅動。
8.產生具有增加的產量的轉基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物或植物細胞引入CDKD編碼核酸或其功能性變體；(ii)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養植物細胞。
9.根據權利要求8的方法，其中所述增加的產量是增加的種子產量。
10.增加植物產量、尤其是增加種子產量的方法，其包括向植物中編碼CDKD多肽或其功能性變體的基因的基因座中引入遺傳修飾。
11.根據權利要求10的方法，其中所述遺傳修飾通過下列方法之一實現位點定向誘變、同源重組、靶向誘導基因組局部突變技術(tilling)和T-DNA激活。
12.植物，其可以通過根據權利要求1-11任意一項的方法獲得。
13.構建體，其包含(i)CDKD編碼核酸或其功能性變體；(ii)能夠驅動(i)的核酸序列表達的一種或多種控制序列；和任選地(iii)轉錄終止序列。
14.根據權利要求13的構建體，其中所述控制序列為組成型啟動子。
15.植物，其用根據權利要求13或14的構建體轉化。
16.具有增加產量的轉基因植物，其特徵為所述植物包含分離的編碼CDKD的核酸或其功能性變體。
17.根據權利要求12、15或16的轉基因植物，其中所述植物為單子葉植物，例如甘蔗，或者其中所述植物為穀類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱或燕麥。
18.根據權利要求12或15到17的任意一項的植物的可收穫部分。
19.分離的編碼CDKD的核酸或其功能性變體在增加產量、尤其是種子產量中的應用。
20.根據權利要求19的用途，其中所述種子產量包括一種或多種下列情況增加的飽滿種子數、增加的種子重量、增加的收穫指數和增加的TKW。
21.根據權利要求19或20的用途，其中所述CDKD是SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性變體，或者其中所述CDKD為SEQ ID NO2代表的胺基酸或其功能性變體。
全文摘要
本發明涉及增加植物產量尤其是種子產量的方法，其包括向植物引入編碼CDKD或其功能性變體的核酸。本發明也提供了通過本發明的方法產生的轉基因植物，並且提供了用於本發明方法中的構建體。
文檔編號A01H5/00GK1946848SQ200580012292
公開日2007年4月11日 申請日期2005年3月1日 優先權日2004年3月1日
發明者V·弗蘭考爾德 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司