一種CLL1抗體及其應用的製作方法

2024-04-13 17:36:05

一種cll1抗體及其應用
技術領域
1.本技術涉及生物醫藥領域，具體涉及一種cll1抗體及其應用。


背景技術：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是髓系造血幹/祖細胞惡性疾病。以骨髓與外周血中的原始和幼稚髓系細胞異常增生為主要特徵，臨床表現為貧血、出血、感染和發熱、臟器浸潤、代謝異常等，多數病例病情危重，預後兇險，如不及時治療常可危及生命。嬰幼兒比成人易發生aml，本病佔小兒白血病的30％。目前的治療方法有：化療、支持治療、造血幹細胞移植。
3.嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，car)是car細胞治療藥物的核心部件，其可包括抗原識別結構域、鉸鏈區、跨膜區和細胞內結構域。到目前為止，抗原識別結構域從抗體的單鏈可變區(single chain variable fragment，縮寫為scfv)、或者從受體配體相互作用、tcr模擬物、可變的淋巴細胞受體(variable lymphocyte receptors，vlr)衍生而來；其中最為常見的來源就是scfv抗體。car-t細胞免疫療法，被認為是最有希望攻克腫瘤的手段之一。car-t細胞就是利用基因改造的方法使t細胞表達car蛋白，這種car蛋白有能力在不依賴於抗原提呈的情況下識別膜表面的完整蛋白，進而引起t細胞的活化和功能效應。目前，car-t細胞免疫療法在多種血液系統腫瘤的治療中取得了顯著的成效，如：用於治療b細胞淋巴瘤的cd19 car-t和用於治療多發性骨髓瘤的bcma car-t已有上市藥物。然而，由於aml的異質性，較難發現治療aml的理想car-t靶點，現有針對aml的靶點有cd33、cd123、ley、nkg2d等，但這些靶點均未有上市的car-t藥物。
4.研究發現，cll1(c-type lectin-like molecule 1，c-型凝集素樣分子-1)是有治療aml前景的理想靶標，因為cll1在正常造血幹細胞中不表達，在aml原始細胞和白血病幹細胞中高表達，因此尋找以cll1為靶點的適合藥物的抗體，尤其是以cll1為靶點的適合car-t細胞治療藥物的抗體具有現實意義。


技術實現要素：

5.本技術提供了一種cll1抗體及其應用，發明人開發了多個靶向cll1的抗體，並將其相應scfv抗體作為cll1 car結構的胞外抗原識別結構域，以此構建了嵌合抗原受體表達載體、製備了靶向cll1的car-t細胞，還在細胞水平驗證了cll1car以及cll1 car-t細胞的多項指標，並從中選擇了表現最好的3條抗體。
6.一種cll1抗體或其抗原結合部位，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:54所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:55所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
7.或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:56所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3
的胺基酸序列分別與seq id no:57所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
8.或，所述所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:58所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:59所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同。
9.一種cll1抗體或其抗原結合部位，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41所示的胺基酸序列；
10.或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47所示的胺基酸序列；
11.或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53所示的胺基酸序列。
12.上述cll1抗體或其抗原結合部位在某些實施方式中，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:54所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:55所示的胺基酸序列；
13.或，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:56所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:57所示的胺基酸序列；
14.或，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:58所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:59所示的胺基酸序列。
15.上述cll1抗體或其抗原結合部位在某些實施方式中，為cll1 scfv抗體、cll1sc(fv)2抗體、cll1[sc(fv)2]2抗體。
[0016]
上述cll1抗體或其抗原結合部位在某些實施方式中，所述cll1 scfv抗體包含選自以下序列的任意一種：如seq id no:54所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:55所示的胺基酸序列、如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:56所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:57所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:58所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:59所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；可選地，所述cll1 scfv抗體包含選自以下序列的任意一種：如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；進一步可選地，所述cll1 scfv抗體包含如seq id no:1或seq id no:2或seq id no:14所示的胺基酸序列。
[0017]
上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位在一些實施例中，連接序列選自以下序列的一種或多種：seq id no:66、seq id no:67和seq id no:68。
[0018]
本技術還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼上述cll1抗體或其抗原結合部位的核苷酸序列。
[0019]
上述分離的核酸分子在某些實施方式中，編碼上述cll1抗體或其抗原結合部位的核苷酸序列包含：
[0020]
1)編碼如seq id no:54所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:60所示；和編碼如seq id no:55所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:61所示；或
[0021]
2)編碼如seq id no:56所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:62所示；和編碼如seq id no:57所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:63所示；或
[0022]
3)編碼如seq id no:58所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:64所示；和編碼如seq id no:59所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:65所示。
[0023]
本技術還提供了一種載體，其包含上述分離的核酸分子。
[0024]
本技術還提供了一種細胞，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子或載體。
[0025]
本技術還提供了一種藥物組合物，其包括上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞，以及藥學上可接受的輔料。
[0026]
本技術還提供了一種抗體藥物，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位。
[0027]
上述抗體藥物在某些實施方式中，所述抗體藥物為單特異性抗體藥物、雙特異性抗體藥物、三特異性抗體藥物或四特異性抗體藥物。
[0028]
本技術還提供了一種抗體藥物偶聯物，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位。
[0029]
本技術還提供一種上述cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞在製備用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症的藥物中的應用。
[0030]
上述應用在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0031]
上述應用在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0032]
本技術還提供了上述cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞在製備用於診斷與cll1的表達相關的疾病或病症的檢測試劑中的應用。
[0033]
上述應用在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0034]
上述應用在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0035]
本技術還提供了一種治療與cll1的表達相關的疾病或病症的方法，包括以下步驟：將有效量的包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞的藥物施用於具有治療與cll1的表達相關的疾病或病症的需求的受試者。
[0036]
上述方法在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0037]
上述方法在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0038]
本技術還提供了一種藥物，其包含上述cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞，用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症。
[0039]
上述藥物在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0040]
上述藥物在某些實施方式中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
附圖說明
[0041]
圖1表示了本技術實施例2中各種cll1 car的結構示意圖，在該示意圖中從上到下分別為：cd8a信號肽、抗cll1 scfv、cd8a鉸鏈區和跨膜區、4-1bb、cd3δ。
[0042]
圖2表示了本技術實施例5中抗原刺激之後各組car-t細胞中cd3
+
細胞的持續增殖情況。
[0043]
圖3a-圖3c表示了本技術實施例6中各種cll1 car-t細胞、陽性對照m26cll1 car-t細胞在不同效靶比對不同靶細胞的裂解殺傷效果；其中：圖3a中靶細胞是hl60；圖3b中靶細胞是k562-cll1；圖3c中靶細胞是k562。
[0044]
圖4表示了本技術實施例7中各種cll1 car-t細胞、陽性對照m26 cll1car-t細胞、utd細胞(未轉導car的t細胞)被陽性靶細胞激活後的細胞因子ifn-γ釋放情況。
具體實施方式
[0045]
以下由特定的具體實施例說明本技術發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地了解本技術發明的其他優點及效果。
[0046]
以下對本技術做進一步描述：在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0047]
在本技術中，術語「抗體」具有本領域常規的含義，是指由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，四條多肽鏈指通過二硫鍵互相連接的兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈。通過分析不同抗體重鏈和輕鏈的胺基酸序列發現，重鏈和輕鏈靠近n端的胺基酸序列變化很大，其他部分胺基酸序列相對恆定。因此，將抗體輕鏈和重鏈中靠近n端胺基酸序列變化較大的區域稱為可變區(variable region，v)，將靠近c端的胺基酸序列相對穩定的區域，稱為恆定區(constant region，c)，重鏈和輕鏈的v區分別簡稱為vh和vl，重鏈和輕鏈的c區分別簡稱為ch和cl。在抗體可變區內有一小部分胺基酸殘基變化特別強烈，這些胺基酸的殘基組成和排列順序更易發生變異區域稱高變區(hypervariable regions，hvr)；在l鏈、h鏈的v區中各有三個高變區，該部位因在空間結構上可與抗原決定簇形成精密的互補，故高變區又稱互補性決定區(complementarity determining region，cdr)。抗體中，常見的劃分cdr規則有kabat、abm、chothia、contact、imgt，這些規則為本領域技術人員熟知的，當應用執行這些規則的網站時，只要將vh和vl序列輸入並選擇相應規則，即可得到依據不同規則的cdr序列。本領域技術人員應當理解，本技術的保護範圍涵蓋了通過採用不同規則分析獲得的cdr序列的組合。抗體的6個cdr區共同決定了抗體對相應抗原的識別能力和特異性。本領域技
術人員應當理解，當本技術限定了6個cdr區的胺基酸序列時，抗體對相應抗原的識別能力和特異性是可預期的。
[0048]
在本技術中，術語「抗原結合部位」具有本領域常規的含義，是指抗體上可特異性識別並結合抗原的關鍵部位，包括vh和vl區。
[0049]
在本技術中，術語「單克隆抗體」具有本領域常規的含義，是指高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，其可以通過已知的例如雜交瘤技術、抗體庫技術、轉基因小鼠技術或單細胞pcr技術來製備。
[0050]
在本技術中，術語「scfv」具有本領域常規的含義，是指單鏈可變區(single chain variable fragment，縮寫為scfv)，其是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過短肽(linker，連接序列)連接而成的抗體。
[0051]
在本技術中，術語「sc(fv)2、[sc(fv)2]
2」等未具體解釋的名詞也都具有本領域常規的含義。
[0052]
在本技術中，術語「嵌合抗原受體」(chimeric antigen receptor，car)是car細胞治療藥物的核心部件，其可包括胞外抗原識別結構域(例如，結合腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，taa)的部分)、鉸鏈區、跨膜區和細胞內結構域。car-t(chimeric antigen receptor t)細胞免疫療法，被認為是最有希望攻克腫瘤的手段之一。car-t細胞就是利用基因改造的方法使t細胞表達car蛋白，這種car蛋白有能力在不依賴於抗原提呈的情況下識別膜表面的完整蛋白，進而引起t細胞的活化和功能效應。
[0053]
在本技術中，術語「胞外抗原識別結構域」是指抗原識別結構域(antigen recognition domain，ard)。car細胞治療產品(如car-t細胞)之所以能特異性識別和/或結合到腫瘤細胞表達的靶抗原，依賴於胞外抗原識別結構域，到目前為止，抗原識別結構域從抗體的單鏈可變區(single chain variable fragment，縮寫為scfv)、或者從受體配體相互作用、tcr模擬物、可變的淋巴細胞受體(variable lymphocyte receptors，vlr)衍生而來。到目前為止，最為常見的來源就是抗體的scfv段，scfv包括抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，二者之間由一段肽鏈連接，如：由18個胺基酸組成的連接序列gstsgsgkpgsgegstkg。
[0054]
本技術中，術語「特異性識別和/或結合」是指car和特異性靶標之間的識別和/或結合，是以比car結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標。
[0055]
在本技術中，術語「鉸鏈區」是指作用於胞外抗原識別結構域與跨膜結構域之間的連接段，這個區域通過給予抗原識別結構域一定的活動範圍，允許car識別抗原。目前使用的鉸鏈區主要來源於igg1、igg4、cd4、cd7、cd28、cd84、cd8α中的一種或多種。此外，典型的鉸鏈區還包含一些殘基，這些殘基參與car二聚化，有助於增強抗原的敏感性。
[0056]
在本技術中，「跨膜區」是指連接著car結構的細胞內和細胞外成分的跨膜結構域。不同的跨膜結構域可以一定程度上影響car的表達和穩定性，但是並不直接參與信號傳遞，通過相互作用可以提高下遊信號傳遞。所述跨膜區可以來源於cd3、cd4、cd7、cd8α、cd28、cd80、cd86、cd88、4-1bb、cd152、ox40、fc70中的一種或多種。
[0057]
在本技術內，術語「細胞內結構域」包括胞內信號傳導區，還可以包括共刺激信號傳導區。
[0058]
在本技術中，術語「胞內信號傳導區」是指負責表達car的免疫效應細胞的至少一
種正常效應子功能的活化。所述胞內信號傳導區可以來源於cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、fcrγ、fcrβ、cd66d、dap10、dap12、syk中的一種或多種。
[0059]
在本技術中，術語「共刺激信號傳導區」之所以存在，是因為除了抗原特異性信號的刺激之外，很多免疫效應細胞還需要共刺激來促進細胞增殖、分化和存活，以及活化細胞的效應子功能。在一些實施例中，car還可以包括一個或多個共刺激信號傳導區，其中，共刺激信號傳導區可以來源於cd2、cd3、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cd244、4-1bb、ox40、lfa-1、icos、light、nkg2c、nkg2d、dap10、b7-h3、myd88中的一種、兩種或三種以上。
[0060]
在本技術中，術語「引導肽」，是指胞外抗原識別結構域(如scfv序列)前的短肽，其作用是引導細胞內合成的重組蛋白質輸出到細胞外。常用的引導肽有人cd8α信號肽，或者人gm-csf受體α信號肽。
[0061]
在本技術中，決定car-免疫細胞治療效果的關鍵因素之一是對腫瘤靶抗原的選擇。在本技術中，所選擇的腫瘤靶抗原「cll1」具有本領域常規的含義，其還被稱為klr1、clec12a，其是一種ii型跨膜糖蛋白，是與免疫調節相關的c型凝集素樣受體大家族的成員。研究發現，cll1(c-type lectin-like molecule 1)是有治療aml前景的理想靶標，因為cll1在正常造血幹細胞中不表達，在aml原始細胞和白血病幹細胞中高表達。
[0062]
在本技術中，術語「連接序列」通常是指長度為約1至100個胺基酸的寡肽或多肽區，其將本發明的嵌合抗原受體的任何結構/區域連接在一起。連接序列可由不同的胺基酸殘基(如甘氨酸和絲氨酸)組成，以便相鄰的蛋白質結構域相對於彼此自由移動。當期望確保兩個相鄰結構域在空間上不相互幹擾時，可使用較長的連接序列。
[0063]
在本技術中，術語「分離的」通常指從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種「分離」的物質或成分，那麼可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語「分離的」不排除從天然狀態下經人工手段獲得後，經過人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。
[0064]
在本技術中，術語「分離的核酸分子」通常指任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其可以是從其天然環境分離的或人工合成的類似物。
[0065]
在本技術中，car基因轉導/轉染和靶基因表達時，基因轉導/轉染方法主要包括病毒和非病毒的方法。如：通過γ反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒相關病毒載體、質粒dna依賴的載體、轉座子依賴的基因轉移、mrna介導的基因轉導。
[0066]
術語「載體」通常指可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可通過轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內得以表達。舉例來說，載體包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。術語「轉座
子」是指不連續的dna片段，具有在染色體位點之間遷移和攜帶基因信息的能力，如：睡美人sb系統和來源於鱗翅目昆蟲的pb系統。在一些實施例中，還可以使用電轉的方法將mrna轉導進t細胞。
[0067]
在本技術中，術語「免疫效應細胞」通常是指參與免疫應答，例如促進免疫效應應答的細胞。免疫效應細胞可以選自以下組：t淋巴細胞、自然殺傷細胞(nk細胞)、外周血單個核細胞(pbmc細胞)、多能幹細胞、多能幹細胞分化成的t淋巴細胞、多能幹細胞分化成的nk細胞和胚胎幹細胞中的一種或多種。
[0068]
在本技術中，術語「藥物組合物」通常指適合施用於患者的藥物組合物，其可以包含本技術所述的免疫效應細胞，還可以包含一種或多種藥學上可接受的輔料，如：載劑、保護劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑中的一種或多種。在一些實施例中，藥學上可接受的輔料包括保護劑，如：細胞凍存液。在一些實施例中，本技術的藥物組合物為細胞懸液或其凍存細胞。
[0069]
在本技術中，術語「受試者」通常指人類或非人類動物，包括但不限於小鼠、大鼠、貓、狗、兔、馬、豬、牛、羊或猴。
[0070]
在本技術中，術語「包含」通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
[0071]
在本技術中，術語「約」通常是指在指定數值以上或以下本領域技術人員可接受的波動範圍，如：在
±
0.5％-10％的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的範圍內變動。
[0072]
cll1抗體或其抗原結合部位、相應核酸分子、相應載體、相應細胞、相應藥物組合物
[0073]
一方面，本技術提供了一種cll1抗體或其抗原結合部位，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:54所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:55所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
[0074]
或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:56所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:57所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
[0075]
或，所述所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:58所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:59所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同。
[0076]
在抗體中，常見的劃分cdr規則有kabat、abm、chothia、contact、imgt，這些規則為本領域技術人員熟知的，當應用執行這些規則的網站時，只要將vh和vl序列輸入並選擇相應規則，即可得到依據不同規則的cdr序列。本領域技術應當理解，即使針對相同的重鏈可變區和輕鏈可變區，根據不同的cdr劃分規則可得到不同的cdr序列。本領域技術人員應當理解，本技術的保護範圍涵蓋了通過採用不同規則分析獲得的cdr序列的組合。
[0077]
另一方面，本技術還提供了一種cll1抗體或其抗原結合部位，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41所示的胺基酸序列；
[0078]
或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47所示的胺基酸序列；
[0079]
或，所述重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53所示的胺基酸序列。
[0080]
在本技術中，採用了kabat規則進行cdr的劃分。
[0081]
上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位在一些實施例中，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:54所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:55所示的胺基酸序列；
[0082]
或，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:56所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:57所示的胺基酸序列；
[0083]
或，所述重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:58所示的胺基酸序列，所述輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:59所示的胺基酸序列。
[0084]
本技術通過實驗篩選出3條性能最好的抗體，分別為1-3、1-28和3-67抗體。其中，1-3scfv抗體包含胺基酸序列如seq id no:54所示的重鏈可變區和胺基酸序列如seq id no:55所示的輕鏈可變區；1-28scfv抗體包含胺基酸序列如seq id no:56所示的重鏈可變區和胺基酸序列如seq id no:57所示的輕鏈可變區；3-67scfv抗體包含胺基酸序列如seq id no:58所示的重鏈可變區和胺基酸序列如seq id no:59所示的輕鏈可變區。
[0085]
上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位在一些實施例中，為cll1 scfv抗體、cll1 sc(fv)2抗體、cll1[sc(fv)2]2抗體。
[0086]
上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位在一些實施例中，所述cll1 scfv抗體包含選自以下序列的任意一種：如seq id no:54所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:55所示的胺基酸序列、如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:56所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:57所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:58所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:59所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；可選地，所述cll1 scfv抗體包含選自以下序列的任意一種：如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；進一步可選地，所述cll1 scfv抗體包含如seq id no:1或seq id no:2或seq id no:14所示的胺基酸序列。在上述描述中，
「‑」
表示相互連接，並且在上述描述中
「‑」
具有方向性，其表示從胺基酸的n端向c端的連接。
[0087]
上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位在一些實施例中，連接序列選自以下序列
的一種或多種：seq id no:66、seq id no:67和seq id no:68。
[0088]
再一方面，本技術還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位的核苷酸序列。
[0089]
上述分離的核酸分子在一些實施例中，編碼上述cll1抗體或其抗原結合部位的核苷酸序列包含：
[0090]
1)編碼如seq id no:54所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:60所示；和編碼如seq id no:55所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:61所示；或
[0091]
2)編碼如seq id no:56所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:62所示；和編碼如seq id no:57所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:63所示；或
[0092]
3)編碼如seq id no:58所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:64所示；和編碼如seq id no:59所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:65所示。
[0093]
再一方面，本技術還提供了一種載體，其包含上述分離的核酸分子。載體可以任意地選自以下載體地一種或幾種：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0094]
再一方面，本技術還提供了一種細胞，其包含上述cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子或載體。
[0095]
再一方面，本技術還提供了一種藥物組合物，其包括上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞，以及藥學上可接受的輔料。藥學上可接受的輔料包括但不限於：載劑、保護劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑中的一種或多種。
[0096]
包含cll1抗體或其抗原結合部位的抗體藥物、抗體藥物偶聯物
[0097]
一方面，本技術提供了一種抗體藥物，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位。
[0098]
上述抗體藥物在一些實施例中，所述抗體藥物為單特異性抗體藥物、雙特異性抗體藥物、三特異性抗體藥物或四特異性抗體藥物。
[0099]
另一方面，本技術還提供了一種抗體藥物偶聯物，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位。
[0100]
cll1抗體或其抗原結合部位的應用
[0101]
一方面，本技術提供一種上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞在製備用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症的藥物中的應用。
[0102]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0103]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0104]
另一方面，本技術還提供了上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸
分子、載體或細胞在製備用於診斷與cll1的表達相關的疾病或病症的檢測試劑中的應用。
[0105]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0106]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0107]
再一方面，本技術還提供了一種治療與cll1的表達相關的疾病或病症的方法，包括以下步驟：將有效量的包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞的藥物施用於具有治療與cll1的表達相關的疾病或病症的需求的受試者。
[0108]
上述方法在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0109]
上述方法在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0110]
上述方法在一些實施例中，所述施用可以通過不同的方式進行，例如口服、靜脈內、瘤內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。
[0111]
上述方法在一些實施例中，針對不同的適應症，給藥劑量可以不同；針對病情嚴重程度不同的患者，給藥劑量也可以不同。
[0112]
上述方法在一些實施例中，所述受試者可以包括人類和非人類動物。例如，所述受試者可以包括但不限於小鼠、大鼠、貓、狗、馬、豬、牛、羊、兔或猴。
[0113]
再一方面，本技術還提供了一種藥物，其包含上述任一種cll1抗體或其抗原結合部位、分離的核酸分子、載體或細胞，用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症。
[0114]
上述藥物在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0115]
上述藥物在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0116]
cll1嵌合抗原受體、相應核酸分子、相應載體、相應免疫效應細胞、藥物組合物
[0117]
一方面，本技術提供了一種靶向cll1的嵌合抗原受體，其包含cll1胞外抗原識別結構域、鉸鏈區、跨膜區和細胞內結構域，所述cll1胞外抗原識別結構域包括cll1重鏈可變區和cll1輕鏈可變區，其中：
[0118]
所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:54所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:55所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
[0119]
或，所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:56所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:57所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同；
[0120]
或，所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:58所示抗體重鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別與seq id no:59所示抗體輕鏈可變區中的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列相同。
[0121]
另一方面，本技術還提供了一種靶向cll1的嵌合抗原受體，其包含cll1胞外抗原識別結構域、鉸鏈區、跨膜區和細胞內結構域，所述cll1胞外抗原識別結構域包括cll1重鏈可變區和cll1輕鏈可變區，其中：
[0122]
所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38所示的胺基酸序列，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3
的胺基酸序列分別包含如seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41所示的胺基酸序列；
[0123]
或，所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44所示的胺基酸序列，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47所示的胺基酸序列；
[0124]
或，所述cll1重鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50所示的胺基酸序列，所述cll1輕鏈可變區的cdr1、cdr2、cdr3的胺基酸序列分別包含如seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53所示的胺基酸序列。
[0125]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，所述cll1重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:54所示的胺基酸序列，所述cll輕鏈可變區序列包含如seq id no:55所示的胺基酸序列；
[0126]
或，所述cll1重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:56所示的胺基酸序列，所述cll輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:57所示的胺基酸序列；
[0127]
或，所述cll1重鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:58所示的胺基酸序列，所述cll輕鏈可變區的胺基酸序列包含如seq id no:59所示的胺基酸序列。
[0128]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，cll1胞外抗原識別結構域包括選自以下結構中的任意一種：如seq id no:54所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:55所示的胺基酸序列、如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:56所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:57所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:58所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:59所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；可選地，所述cll1 scfv抗體包含選自以下序列的任意一種：如seq id no:55所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:54所示的胺基酸序列、如seq id no:57所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:56所示的胺基酸序列、如seq id no:59所示的胺基酸序列-連接序列-如seq id no:58所示的胺基酸序列；進一步可選地，所述cll1 scfv抗體包含如seq id no:1或seq id no:2或seq id no:14所示的胺基酸序列。
[0129]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，連接序列選自以下序列的一種或多種：seq id no:66、seq id no:67和seq id no:68。
[0130]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，所述鉸鏈區來源於igg1、igg4、cd4、cd7、cd28、cd84、cd8α中的一種或多種；可選地，所述鉸鏈區的胺基酸來源於cd8α；進一步可選地，所述鉸鏈區的胺基酸序列包含如seq id no:17所示的胺基酸序列。
[0131]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，所述跨膜區來源於cd3、cd4、cd7、cd8α、cd28、cd80、cd86、cd88、4-1bb、cd152、ox40、fc70中的一種或多種；可選地，所述跨膜區的胺基酸序列來源於cd8α；進一步可選地，所述跨膜區的胺基酸序列包含如seq id no:18所示的胺基酸序列。
[0132]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，其中所述細胞內結構域包含胞內信號傳導區；可選地，還包括共刺激信號傳導區。
[0133]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，其中所述胞內信號傳導區來源於cd3δ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、fcrγ、fcrβ、cd66d、dap10、dap12、syk中的一種或多種；可選地，所述胞內信號傳導區來源於cd3δ；進一步可選地，所述胞內信號傳導區的胺基酸序列包含如seq id no:20所示的胺基酸序列。
[0134]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，其中所述共刺激信號傳導區來源於cd2、cd3、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cd244、4-1bb、ox40、lfa-1、icos、light、nkg2c、nkg2d、dap10、b7-h3、myd88中的一種、兩種或三種以上；可選地，所述共刺激信號傳導區來源於cd28或4-1bb；進一步可選地，所述共刺激信號傳導區的胺基酸序列包含如seq id no:19所示的胺基酸序列。
[0135]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，還包含位於所述嵌合抗原受體胺基酸序列n-末端的引導肽；可選地，其中所述引導肽來源於cd8α；進一步可選地，所述引導肽的胺基酸序列包含如seq id no:16所示的胺基酸序列。
[0136]
上述任一種嵌合抗原受體在一些實施例中，所述嵌合抗原受體包括如seq id no:21、seq id no:22或seq id no:34所示的胺基酸序列。
[0137]
再一方面，本技術還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼上述任一種嵌合抗原受體的核苷酸序列。
[0138]
上述分離的核酸分子在一些實施例中，編碼所述嵌合抗原受體的核苷酸序列包含：
[0139]
1)編碼如seq id no:54所示的cll1重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:60所示；和編碼如seq id no:55所示的cll1輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:61所示；或
[0140]
2)編碼如seq id no:56所示的cll1重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:62所示；和編碼如seq id no:57所示的cll1輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:63所示；
[0141]
3)編碼如seq id no:58所示的cll1重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:64所示；和編碼如seq id no:59所示的cll1輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列，可選地，其如seq id no:65所示。
[0142]
再一方面，本技術還提供了一種載體，其包含上述分離的核酸分子。載體可選子以下的任意一種或幾種：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0143]
上述載體在一些實施例中，為表達載體；在另一些實施例中，載體為病毒載體；在另一些實施例中，載體為慢病毒載體。
[0144]
再一方面，本技術還提供了一種經工程化的免疫效應細胞，其包含上述嵌合抗原受體、上述分離的核酸分子，或上述載體。
[0145]
上述經工程化的免疫效應細胞在一些實施例中，所述經工程化的免疫效應細胞選自t淋巴細胞、自然殺傷細胞(nk細胞)、外周血單個核細胞(pbmc細胞)、多能幹細胞、多能幹細胞分化成的t細胞、多能幹細胞分化成的nk細胞和胚胎幹細胞中的一種或多種。
[0146]
上述經工程化的免疫效應細胞在一些實施例中，所述經工程化的免疫效應細胞是t淋巴細胞；可選地，所述t淋巴細胞的來源為自體t淋巴細胞或同種異體t淋巴細胞。
[0147]
上述經工程化的免疫效應細胞在一些實施例中，t淋巴細胞的αβt淋巴細胞或γδt淋巴細胞。
[0148]
上述經工程化的免疫效應細胞在一些實施例中，所述經工程化的免疫效應細胞的表面可以表達或表達有本技術所述的嵌合抗原受體。
[0149]
再一方面，本技術還提供了一種藥物組合物，其包括上述經工程化的免疫效應細胞和藥學上可接受的輔料。藥學上可接受的輔料包括但不限於：載劑、保護劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑中的一種或多種。
[0150]
上述藥物組合物在一些實施例中，藥學上可接受的輔料包括保護劑。
[0151]
上述藥物組合物在一些實施例中，藥學上可接受的輔料包括細胞凍存液。
[0152]
上述藥物組合物在一些實施例中，藥物組合物為細胞懸液或其凍存細胞。
[0153]
上述藥物組合物在一些實施例中，藥物組合物為靜脈注射劑。
[0154]
製備方法和用途
[0155]
一方面，本技術還提供了製備經工程化的免疫效應細胞的方法，其包括以下的步驟：向免疫效應細胞中轉導本技術所述的載體。
[0156]
上述方法在一些實施例中，所述經工程化的免疫效應細胞選自t淋巴細胞、自然殺傷細胞(nk細胞)、外周血單個核細胞(pbmc細胞)、多能幹細胞、多能幹細胞分化成的t細胞、多能幹細胞分化成的nk細胞和胚胎幹細胞中的一種或多種。
[0157]
上述方法在一些實施例中，所述經工程化的免疫效應細胞是t淋巴細胞；可選地，所述t淋巴細胞的來源為自體t淋巴細胞或同種異體t淋巴細胞。
[0158]
上述方法在一些實施例中，t淋巴細胞為αβt淋巴細胞或γδt淋巴細胞。
[0159]
另一方面，本技術還提供上述嵌合抗原受體、分離的核酸分子、載體或經工程化的免疫效應細胞在製備藥物中的應用，所述藥物用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症。
[0160]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0161]
上述應用在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0162]
再一方面，本技術還提供了一種治療與cll1的表達相關的疾病或病症的方法，包括以下步驟：將有效量的上述經工程化的免疫效應細胞或藥物組合物施用於具有治療與cll1的表達相關的疾病或病症的需求的受試者。
[0163]
上述方法在一些實施例中，所述施用可以通過不同的方式進行，例如靜脈內、瘤內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。例如，施用的方式可以通過靜脈注射的方式施用於受試者。在一些實施例中，有效劑量的經工程化的免疫效應細胞或藥物組合物可以單次施用於受試者，也可以在一定期間內分次施用於受試者，如：每周施用一次、兩周一次、三周一次、四周一次、一個月一次、3個月一次、或3-6個月一次。
[0164]
上述方法在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0165]
上述方法在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0166]
上述方法在一些實施例中，所述施用的方式為靜脈注射。
[0167]
上述方法在一些實施例中，所述施用的方式為將有效量的經工程化的免疫效應細胞或藥物組合物以單次注射的方式施用於受試者。
[0168]
上述方法在一些實施例中，有效量的經工程化的免疫效應細胞或藥物組合物為1
×
105至1
×
107個細胞/kg的劑量。在一些實施例中，針對不同的適應症，給藥劑量可以不同；針對病情嚴重程度不同的患者，給藥劑量也可以不同。施用劑量範圍可以是1
×
105個car陽性t細胞/kg至1
×
107個car陽性t細胞/kg，例如，1
×
105個car陽性t細胞/kg至1
×
106個car陽性t細胞/kg、1
×
106個car陽性t細胞/kg至1
×
107個car陽性t細胞/kg、0.5
×
106個car陽性t細胞/kg、0.6
×
106個car陽性t細胞/kg、0.7
×
106個car陽性t細胞/kg、0.8
×
106個car陽性t細胞/kg、0.9
×
106個car陽性t細胞/kg、1.0
×
106個car陽性t細胞/kg、1.1
×
106個car陽性t細胞/kg、1.2
×
106個car陽性t細胞/kg、1.3
×
106個car陽性t細胞/kg、1.4
×
106個car陽性t細胞/kg、1.5
×
106個car陽性t細胞/kg、1.6
×
106個car陽性t細胞/kg、1.7
×
106個car陽性t細胞/kg、1.8
×
106個car陽性t細胞/kg、1.9
×
106個car陽性t細胞/kg、2.0
×
106個car陽性t細胞/kg。
[0169]
上述方法在一些實施例中，所述受試者可以包括人類和非人類動物。例如，所述受試者可以包括但不限於小鼠、大鼠、貓、狗、馬、豬、牛、羊、兔或猴。
[0170]
再一方面，本技術還提供了一種藥物，其包含上述經工程化的免疫效應細胞或藥物組合物，用於治療與cll1的表達相關的疾病或病症。
[0171]
上述藥物在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為血液瘤。
[0172]
上述藥物在一些實施例中，與cll1的表達相關的疾病或病症為急性髓系白血病。
[0173]
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本技術的cll1抗體、嵌合抗原受體、經工程化的免疫效應細胞、製備方法和用途等，而不用於限制本技術發明的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括sambrook,j.,fritsch,e.f.and maniais,t.(1989)molecular cloning:a laboratory manual,2nd edition,cold spring harbor laboratory press。
[0174]
實施例1、cll1抗體開發
[0175]
cll1抗體開發過程：採用balb/c和c57bl/6小鼠作為免疫動物，以人cll1作為抗原按照表1中的程序進行免疫。取免疫後各只小鼠血清進行facs(流式細胞螢光分選技術)和elisa檢測，綜合elisa檢測和facs檢測的結果，取免疫效果最好的小鼠，將其漿細胞經cd138抗體富集後鋪種到beacon篩選晶片上，進行抗體陽性b細胞株的分析和篩選，共獲得單克隆細胞8561株、多克隆細胞1511株，其中抗體為igg的690株。根據與抗原結合的情況，將陽性b細胞克隆導出、進行v區測序，共獲得64條單克隆抗體的v區序列，根據序列相似性分類，選擇14條代表序列用於合成car中的scfv。
[0176]
表1、動物免疫程序
[0177][0178]
實施例2、cll1 car-t細胞的獲得
[0179]
我們獲得14條靶向cll1的候選scfv，候選scfv序號和其序列分別如表2所示。我們還獲得1條cll1陽性對照抗體m26(其來源於treatmen of acute myeloid leukemia with t cells expressing chimeric antigen receptors directed to c-type lection-like molecule 1,molecular therapy vol.25no.9september 2017)
[0180]
表2、14條靶向cll1的候選scfv序號及其序列
[0181]
scfv序號scfv序列scfv序號scfv序列1-3seq id no:13-11seq id no:81-28seq id no:23-13seq id no:91-16seq id no:33-16seq id no:102-8seq id no:43-35seq id no:112-25seq id no:53-37seq id no:122-31seq id no:63-64seq id no:132-40seq id no:73-67seq id no:14m26(陽性對照抗體)seq id no:15
ꢀꢀ
[0182]
我們選擇在二代car結構上對14條候選scfv進行篩選。在各個car結構中，均採用了cd8α引導鏈為信號肽(如seq id no:16所示)，鉸鏈區(如seq id no:17所示)和跨膜區(如seq id no:18所示)採用cd8α的結構，以4-1bb為胞內共刺激信號(如seq id no:19所示)，cd3δ為t細胞激活信號(如seq id no:20所示)，結構示意圖如圖1所示。
[0183]
1、慢病毒載體的構建
[0184]
根據表1中各候選scfv的序列以及car結構組件的序列，分別人工合成14條cll1 car結構以及1條m26 cll1 car結構，其胺基酸序列如表3所示。
[0185]
表3、14條cll1 car序號及其序列
[0186][0187]
[0188]
將上述15種cll1 car結構分別構建到經過改造的空慢病毒載體(廠家：sbi公司，貨號：cd500-cd800，如wo2021/121227實施例1中記載的改造抗性)中獲得car表達載體，隨後將car表達載體和三種包裝質粒一起轉染293t細胞，經過收集純化之後得到有功能性的慢病毒載體。三種包裝質粒分別是pmd2.g(購自biovector公司，產品號biovector012259)，pmdlg/prre(購自biovector公司，產品號biovector012251)，prsv-rev(購自biovector公司，產品號biovector012253)。
[0189]
2、通過慢病毒轉導的方式製備相應15種cll1特異性car-t細胞。
[0190]
轉導實驗按照本領域技術人員已知的常規方法進行，簡述轉導步驟如下：
[0191]
1)分選t細胞
[0192]
從人單採血細胞中分離獲得外周血單個核細胞(pbmc)，然後從pbmc細胞中分選獲得t細胞。
[0193]
2)對t細胞進行激活處理
[0194]
將分離的t細胞用t細胞完全培養基(x-vivo15培養基+5％fbs+300iu/ml il-2或x-vivo15培養基+5％fbs+5ng/ml il-15+10ng/ml il-7)進行重懸，使終濃度為(1～3)
×
106個細胞/ml，按1ul beads/1
×
106cells加入cd3/cd28磁珠刺激，混勻後置於培養箱培養，培養條件為37℃+5％co2，培養時間至少24小時。
[0195]
3)慢病毒轉導t細胞
[0196]
取出激活培養的t細胞，用含終濃度為8μg/ml的聚凝胺(polybrene)的單純x-vivo15培養基重懸，混勻獲得細胞懸液，並按每800ul細胞懸液(含2
×
106細胞)緩慢加入200ul的慢病毒載體，混勻後放入孔板，並於培養箱培養，培養條件為37℃+5％co2，培養時間至少4-6小時。
[0197]
4)轉導後t細胞的擴增培養
[0198]
取出轉導後的細胞，用t細胞完全培養基擴增培養，隔天傳代，使細胞密度維持在(0.8～2)
×
106個細胞/ml，以備後續實施例使用。
[0199]
分別使用包含有表3中car結構的慢病毒感染t細胞後，獲得的t細胞分別按其car序號進行命名，比如使用1-3car獲得的t細胞即命名為1-3car-t細胞、使用2-8car獲得的t細胞即命名為2-8car-t細胞。接下來，我們在細胞水平對14條cll1car結構進行篩選，以確定各個scfv的優劣。
[0200]
實施例3、cll1 car-t細胞表面表達的car分子的檢測及其抗原識別能力檢測
[0201]
1、car分子的檢測：對實施例2中獲得的轉導後培養7天的14種cll1 car-t細胞表面表達的car蛋白分子進行檢測，我們用pe螢光標記的cll1抗原(廠家：acrobiosystems，貨號：cla-ph2q3)和fitc螢光標記的cll1抗原(廠家：acrobiosystems，貨號：cla-hf247 25ug)對實施例2中獲得的14種cll1 car-t細胞、m26 cll1 car-t細胞和utd細胞(未轉導car的t細胞)進行染色，並通過流式細胞術進行car分子陽性比例檢測分析，檢測結果如表4所示。
[0202]
2、car分子抗原識別能力的檢測：對實施例2中獲得的14種cll1 car-t細胞表面表達的car蛋白分子進行抗原識別能力檢測，我們用fitc螢光標記的igg(廠家：abcam，貨號：ab98658)對實施例2中獲得的14種cll1 car-t細胞、m26 cll1 car-t細胞和utd細胞(未轉導car的t細胞)進行染色，並通過流式細胞術進行抗原識別能力的檢測，檢測結果如表4所
示。
[0203]
如表4所示：灰色底紋的細胞中，因car分子表達差和/或抗原識別能力差在篩選中被捨棄，其中：2-25、2-40、3-35的car不表達；3-11、3-13、3-16的car表達，但對抗原識別能力差，這些細胞在之後的實驗中全部被捨棄。
[0204]
表4、細胞表面表達的car分子的檢測結果及其抗原識別能力檢測結果
[0205][0206]
備註：car表達率低於10％認為不表達或者表達極差，低於篩選標準；抗原結合識別率低於10％認為抗原識別能力差，低於篩選標準。
[0207]
實施例4、cll1 car的特異性檢測
[0208]
在蛋白水平和細胞水平分別進行了cll1 car的特異性檢測。
[0209]
1)蛋白水平的特異性檢測
[0210]
以螢光標記的cd19蛋白(購自acrobiosystems，貨號cd9-hp2h3)、cs1蛋白(購自acrobiosystems，貨號sl7-hp2h3)、bcma蛋白(購自acrobiosystems，貨號bca-hf254)、gpc3蛋白(購自acrobiosystems，貨號gp3-hf2h1)、egfrviii蛋白(購自acrobiosystems，貨號egi-hp2e3)5種抗原蛋白按照如下方法對實施例3篩選得到的8種cll1 car-t細胞(1-3、1-28、1-16、2-8、2-31、3-37、3-64和3-67car-t細胞)以及m26 car-t細胞進行蛋白水平的特異性檢測：取每種car-t細胞0.5
×
106，用pbs洗滌細胞一次，200g離心5min，棄上清，細胞重懸到200ul pbs中，加入0.1ug上述螢光標記的抗原蛋白，4℃避光孵育20min，用pbs洗滌細胞一次，200g離心5min，棄上清，細胞重懸到200ul pbs中，以流式細胞術檢測結合能力；結果顯示：各個car-t細胞均不能與cd19蛋白、cs1蛋白、bcma蛋白、gpc3蛋白、egfrviii蛋白結合，顯示出好的特異性，檢測結果如表5所示。
[0211]
2)細胞水平的特異性
[0212]
以細胞系k562(人慢性骨髓性白血病細胞)、k562-cll1(外源表達cll1蛋白的k562細胞)、hl60(人早幼粒急性白血病細胞)、thp1(人單核細胞白血病細胞)、ovcar3(人卵巢腺癌細胞)、raji(人淋巴瘤細胞)、mm.1s(人多發性骨髓瘤細胞)、nalm6(人急性淋巴細胞白血病細胞)、sk-mel1(人皮膚黑色素瘤細胞)、a549(人肺癌細胞)、huh7(人肝癌細胞)這11種不同組織來源的細胞系按照如下方法對實施例3篩選得到的8種cll1 car-t細胞(1-3、1-28、
1-16、2-8、2-31、3-37、3-64和3-67car-t細胞)以及m26 car-t細胞進行細胞水平的特異性檢測，其中：k562-cll1、hl60、thp1、nalm6細胞系是cll1陽性靶細胞，其餘細胞系是陰性靶細胞。該研究中檢測t細胞激活的方法為cd107a分析。cd107a在膜上的表達被認為是活化細胞毒性淋巴細胞(cd8+t細胞和nk細胞)的標誌物，當細胞毒性淋巴細胞給予特定抗原刺激即發生免疫激活，表達cd107a，因此可做為檢測car-t細胞特異性的手段。具體步驟為：腫瘤細胞和轉染及未轉染的t細胞進行計數，用x-vivo培養基將腫瘤細胞調整至2
×
106/ml，t細胞調整至1
×
106/ml。對於殺傷板每孔加20ul的cd107a抗體，然後每孔加100ul的t細胞和100ul的腫瘤細胞，加完後400r/min離心3分鐘。37℃5％co2培養箱培養60分鐘。60分鐘後每孔加入20ul的golgi stop工作液(3mlx-vivo培養基加2ul golgi stop(bd golgistop
tm protein transport inhibitor，cat：554724))培養箱培養2.5小時。取cd3和cd8抗體等體積混合，混勻後每孔加10ul，培養箱培養30分鐘。30分鐘後1500r/min離心5分鐘，甩去上清，加250ul facs buffer(pbs+0.5％bsa)，混勻。1500r/min離心5分鐘，甩去上清。每孔加200ul facs buffer(pbs+0.5％bsa)混勻，轉移到已標記好的流式管中，再補200-300ul的含facs buffer(pbs+0.5％bsa)上機檢測。分析cd3+cd8+陽性細胞群裡cd107a的螢光信號。具體檢測結果如表6所示。
[0213]
表5、蛋白水平檢測car-t細胞特異性結果
[0214][0215]
備註：
「‑」
表示car-t細胞不與該蛋白結合，「+」表示car-t細胞與該蛋白結合。
[0216]
表6、細胞水平檢測car-t細胞特異性結果
[0217][0218][0219]
備註：
「‑」
表示未檢測到cd107a信號，「+」表示檢測到cd107a信號。
[0220]
如表6所示：2-31car能被陰性靶細胞激活，表現出cd107a信號，因此在細胞水平沒有達到篩選標準，因此在後續的實驗中也將其排除。
[0221]
實施例5、cll1 car-t細胞的持續增殖性
[0222]
抗原刺激可以激活car-t細胞使car-t細胞增殖，而t細胞的持續激活會導致細胞耗竭，耗竭的t細胞的增殖能力和效應功能都會有所下降，我們通過檢測cll1 car-t細胞在多輪抗原刺激實驗後cd3+細胞的增殖情況(即t細胞的增殖情況)，確定其持續增殖性。
[0223]
抗原刺激(以hl60細胞作為抗原)之前，將經過實施例3、實施例4中篩選獲得的7種cll1 car-t細胞(即1-3、1-16、1-28、2-8、3-37、3-64、3-67)、m26 car-t細胞的car陽性比例都利用utd調整到了與car陽性比例最低的一組car-t細胞一致的水平，在抗原刺激實驗中，將各組car-t細胞分別與陽性靶細胞hl60按照效靶比1:2在24孔板中進行共培養，每孔2ml x-vivo15培養基，每組細胞重複3孔。用螢光標記的cd3抗體(廠家：biolegend，貨號：300312)進行cd3，通過流式細胞術進行檢測分析，顯示t細胞的增殖情況(cd3是區分是否為t細胞的標記物)，根據體積倍數的換算計算cd3陽性細胞的細胞數，然後根據計算結果各組再取出一定量car-t細胞按照效靶比1:2加入對應的陽性靶細胞進行新一輪刺激，每隔2天一次，如此重複進行3-4輪刺激。經過多次重複實驗，排除掉增殖最差的2-8和3-37car。其餘5種cll1 car-t細胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、m26 car-t細胞再用上述方法進行多輪刺激和增殖統計後，發現1-3和1-28具有更強的持續增殖能力，顯著高於陽性對照m26 car-t細胞。1-16和3-67的持續增殖能力也不錯，3-64的持續增殖性相對較差，結果如圖2所示。在本技術中，經過多輪刺激後的細胞幾乎全為car+細胞，因此car+表達率不再作為重要指標。
[0224]
實施例6、cll1 car-t細胞進行細胞殺傷實驗
[0225]
細胞殺傷實驗：將經過實施例3、實施例4、實施例5中篩選獲得的5種cll1 car-t細胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、m26 car-t細胞分別與靶細胞按照效應細胞與靶細胞不同效靶比(1:1、3:1或9:1)的條件在x-vivo15培養基中共培養16～24小時後，通過檢測靶細
胞中穩定表達的螢光素酶活性檢測car-t細胞對靶細胞的殺傷比例，靶細胞分別採用hl60細胞、k562-cll1細胞、k562細胞，其中：hl60細胞是內源表達cll1的陽性靶細胞、k562-cll1是外源表達cll1的陽性靶細胞、k562是不表達cll1的陰性靶細胞。細胞殺傷結果如圖3a-圖3c所示：在hl60腫瘤細胞系中各car-t殺傷效果都很顯著；在k562-cll1腫瘤細胞系中1-16car-t細胞的殺傷效果差，其餘car-t效果非常顯著；在k562細胞系中，如預期的，各組均沒有殺傷效果。根據細胞殺傷實驗，可以進一步排除1-16。
[0226]
實施例7、cll1 car-t細胞進行細胞因子釋放實驗
[0227]
細胞因子釋放實驗：將經過實施例3、實施例4、實施例5中篩選獲得的5種cll1car-t細胞(即1-3、1-16、1-28、3-64、3-67)、m26 car-t細胞以及utd細胞分別與靶細胞按照效靶比1:1的條件在x-vivo15培養基中共培養24h後，通過elisa方法檢測細胞上清中ifn-γ的濃度；靶細胞分別採用hl60細胞、k562-cll1細胞、k562細胞，其中：hl60細胞是內源表達cll1的陽性靶細胞、k562-cll1是外源表達cll1的陽性靶細胞、k562是不表達cll1的陰性靶細胞。細胞因子釋放實驗結果如圖4所示：1-3和1-28car-t細胞因子釋放量顯著高於陽性對照m26 car-t，3-67car-t細胞因子釋放量也高於陽性對照m26和3-64。
[0228]
綜上，在體外藥效學檢測表明，以1-3scfv、1-28scfv作為胞外抗原識別結構域的car，在t細胞表面的表達率高、抗原識別能力強、在蛋白水平和細胞水平的特異性好、持續增殖性好、體外細胞殺傷能力強、細胞因子釋放水平高；尤其是其持續增殖性和細胞因子釋放水平都顯著優於陽性對照m26 scfv。以3-67scfv作為胞外抗原識別結構域的car，抗原識別能力強、在蛋白水平和細胞水平的特異性好、持續增殖性好、體外細胞殺傷能力強、細胞因子釋放水平高。
[0229]
序列描述
[0230]
seq id no:1：1-3 scfv胺基酸序列；
[0231]
seq id no:2：1-28 scfv胺基酸序列；
[0232]
seq id no:3：1-16 scfv胺基酸序列；
[0233]
seq id no:4：2-8 scfv胺基酸序列；
[0234]
seq id no:5：2-25 scfv胺基酸序列；
[0235]
seq id no:6：2-31 scfv胺基酸序列；
[0236]
seq id no:7：2-40 scfv胺基酸序列；
[0237]
seq id no:8：3-11 scfv胺基酸序列；
[0238]
seq id no:9：3-13 scfv胺基酸序列；
[0239]
seq id no:10：3-16 scfv胺基酸序列；
[0240]
seq id no:11：3-35 scfv胺基酸序列；
[0241]
seq id no:12：3-37 scfv胺基酸序列；
[0242]
seq id no:13：3-64 scfv胺基酸序列；
[0243]
seq id no:14：3-67 scfv胺基酸序列；
[0244]
seq id no:15：m26 scfv胺基酸序列；
[0245]
seq id no:16：cd8α引導鏈作為信號肽的胺基酸序列；
[0246]
seq id no:17：cd8α鉸鏈區的胺基酸序列；
[0247]
seq id no:18：cd8α跨膜區的胺基酸序列；
[0248]
seq id no:19：4-1bb胞內共刺激信號的胺基酸序列；
[0249]
seq id no:20：cd3ζt細胞激活信號的胺基酸序列；
[0250]
seq id no:21：1-3 car胺基酸序列；
[0251]
seq id no:22：1-28 car胺基酸序列；
[0252]
seq id no:23：1-16 car胺基酸序列；
[0253]
seq id no:24：2-8 car胺基酸序列；
[0254]
seq id no:25：2-25 car胺基酸序列；
[0255]
seq id no:26：2-31 car胺基酸序列；
[0256]
seq id no:27：2-40 car胺基酸序列；
[0257]
seq id no:28：3-11 car胺基酸序列；
[0258]
seq id no:29：3-13 car胺基酸序列；
[0259]
seq id no:30：3-16 car胺基酸序列；
[0260]
seq id no:31：3-35 car胺基酸序列；
[0261]
seq id no:32：3-37 car胺基酸序列；
[0262]
seq id no:33：3-64 car胺基酸序列；
[0263]
seq id no:34：3-67 car胺基酸序列；
[0264]
seq id no:35：m26 car胺基酸序列；
[0265]
seq id no:36:1-3 scfv vh cdr1胺基酸序列；
[0266]
seq id no:37:1-3 scfv vh cdr2胺基酸序列；
[0267]
seq id no:38:1-3 scfv vh cdr3胺基酸序列；
[0268]
seq id no:39:1-3 scfv vl cdr1胺基酸序列；
[0269]
seq id no:40:1-3 scfv vl cdr2胺基酸序列；
[0270]
seq id no:41:1-3 scfv vl cdr3胺基酸序列；
[0271]
seq id no:42:1-28 scfv vh cdr1胺基酸序列；
[0272]
seq id no:43:1-28 scfv vh cdr2胺基酸序列；
[0273]
seq id no:44:1-28 scfv vh cdr3胺基酸序列；
[0274]
seq id no:45:1-28 scfv vl cdr1胺基酸序列；
[0275]
seq id no:46:1-28 scfv vl cdr2胺基酸序列；
[0276]
seq id no:47:1-28 scfv vl cdr3胺基酸序列；
[0277]
seq id no:48:3-67 scfv vh cdr1胺基酸序列；
[0278]
seq id no:49:3-67 scfv vh cdr2胺基酸序列；
[0279]
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[0280]
seq id no:51:3-67 scfv vl cdr1胺基酸序列；
[0281]
seq id no:52:3-67 scfv vl cdr2胺基酸序列；
[0282]
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[0283]
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[0284]
seq id no:55：1-3 scfv vl胺基酸序列；
[0285]
seq id no:56：1-28 scfv vh胺基酸序列；
[0286]
seq id no:57：1-28 scfv vl胺基酸序列；
[0287]
seq id no:58：3-67 scfv vh胺基酸序列；
[0288]
seq id no:59：3-67 scfv vl胺基酸序列；
[0289]
seq id no:60：編碼如seq id no:54所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0290]
seq id no:61：編碼如seq id no:55所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0291]
seq id no:62：編碼如seq id no:56所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0292]
seq id no:63：編碼如seq id no:57所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0293]
seq id no:64：編碼如seq id no:58所示的重鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0294]
seq id no:65：編碼如seq id no:59所示的輕鏈可變區的胺基酸序列的核苷酸序列；
[0295]
seq id no:66：連接序列；
[0296]
seq id no:67：連接序列；
[0297]
seq id no:68：連接序列。