具有肽聚糖分解活性的蛋白質及編碼該蛋白質的DNA、微生物分解製劑以及微生物分解方法與流程

2024-04-15 15:46:05 3

具有肽聚糖分解活性的蛋白質及編碼該蛋白質的dna、微生物分解製劑以及微生物分解方法
技術領域：
：1.本發明涉及具有肽聚糖分解活性的蛋白質及編碼該蛋白質的dna、微生物分解製劑以及微生物分解方法。
背景技術：
：：2.利用活性汙泥法進行汙水淨化時，被除去的有機物成為包含微生物(細菌)的絮狀物，產生稱為剩餘汙泥的汙泥。從廢水處理設備排出的剩餘汙泥在產業廢棄物中佔多達20％以上的比例。通常而言，剩餘汙泥在脫水、乾燥之後被燃燒處理(非專利文獻1：平成30年度事業、產業廢棄物排出、處理情況調查報告書，平成28年度實績(概略版)，非專利文獻2：山本昌幸，「關於汙水的燃燒技術」，日本燃料學會志，一般社團法人日本燃燒學會，2011，第53卷，164號，p91-96)。3.現有技術文獻4.非專利文獻5.非專利文獻1：「平成30年度事業、產業廢棄物排出、處理情況調查報告書，平成28年度實績(概略版)」[在線]，平成31年3月，環境省環境再生、資源循環局廢棄物規制課[令和2年3月17日檢索]，網際網路《url：https：//www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download？statinfid＝000031887949filekind＝2》[0006]非專利文獻2：山本昌幸，「關於汙水的燃燒技術」，日本燃料學會志，一般社團法人日本燃燒學會，2011，第53卷，164號，p91-96技術實現要素：[0007]發明要解決的課題[0008]然而，燃燒處理剩餘汙泥時，會產生溫室效應氣體，因此，出於對環境的考慮，要求將剩餘汙泥減容。作為將剩餘汙泥減容的方法，提出了分解構成剩餘汙泥的微生物的方法。[0009]本發明的目的在於提供可分解肽聚糖的新蛋白質及編碼該蛋白質的dna、微生物分解製劑以及微生物分解方法。[0010]用於解決課題的手段[0011]本發明涉及以下例示的[1]～[11]。[0012][1]一種蛋白質，其來自膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779，且具有肽聚糖分解活性。[0013][2]根據[1]所述的蛋白質，其為分泌蛋白質。[0014][3]一種蛋白質，其為以下(a1)～(a3)中任一種蛋白質，[0015](a1)包含序列號2的1～164位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，[0016](a2)包含序列號2的1～164位胺基酸序列中1～10個胺基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，[0017](a3)包含相對於序列號2的1～164位胺基酸序列具有90％以上同一性的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0018][4]根據[1]～[3]中任一項所述的蛋白質，其中，[0019]上述肽聚糖分解活性為分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性。[0020][5]一種蛋白質，其為以下(a1)～(a4)中任一種蛋白質，[0021](a1)由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質，[0022](a2)由序列號2的1～164位胺基酸序列中1位的ala被met取代的胺基酸序列組成的蛋白質，[0023](a3)由序列號2的1～164位胺基酸序列中1位的ala被met取代，在該met的n末端添加序列號21記載的胺基酸序列的胺基酸序列組成的蛋白質，[0024](a4)由序列號2的1～164位胺基酸序列中在1位的ala的n末端添加met的胺基酸序列組成的蛋白質。[0025][6]一種蛋白質，其為以下(b1)～(b3)中任一種蛋白質，[0026](b1)包含序列號4(seqidno：4)的1～493位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，[0027](b2)包含序列號4的1～493位胺基酸序列中1～10個胺基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，[0028](b3)包含相對於序列號4的1～493位胺基酸序列具有90％以上同一性的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0029][7]根據[1]、[2]或[6]所述的蛋白質，其中，[0030]上述肽聚糖分解活性為n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶活性。[0031][8]一種蛋白質，其為以下(b1)～(b4)中任一種蛋白質，[0032](b1)由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質，[0033](b2)由序列號4的1～493位胺基酸序列中1位的glu被met取代的胺基酸序列組成的蛋白質，[0034](b3)由序列號4的1～493位胺基酸序列中1位的glu被met取代，在該met的n末端添加序列號21記載的胺基酸序列的胺基酸序列組成的蛋白質，[0035](b4)由序列號4的1～493位胺基酸序列中在1位的glu的n末端添加met的胺基酸序列組成的蛋白質。[0036][9]一種dna，其編碼[1]～[8]中任一項所述的蛋白質。[0037][10]一種載體，其包含[9]所述的dna。[0038][11]一種轉化體，其包含[9]所述的dna或[10]所述的載體。[0039][12]一種微生物分解製劑，其包含選自由[1]～[8]中任一項所述的蛋白質、以及[11]所述的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種。[0040][13]一種微生物分解方法，其包括使選自由[1]～[8]中任一項所述的蛋白質、以及[11]所述的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種作用於靶標微生物的工序。[0041]發明效果[0042]根據本發明，能夠提供可分解肽聚糖的新蛋白質及編碼該蛋白質的dna、微生物分解製劑以及微生物分解方法。[0043]附圖簡單說明[0044][圖1]為示出代表性的肽聚糖的結構及可被肽聚糖分解酶切割的部位的圖。[0045][圖2]為示出了在實驗4中添加膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779之後的剩餘汙泥的乾燥重量的圖。[0046][圖3]為在實驗6中將膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779的培養上清液利用柱層析法(columnchromatography)進行分級，並檢查了肽聚糖分解活性的圖。[0047][圖4]為在實驗6中將膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779的培養上清液利用柱層析法進行分級，並利用電泳檢測了洗脫級分中所含的蛋白質的圖。[0048]發明的具體實施方式[0049]以下，對用於實施本發明的方式進行詳細說明。需要說明的是，本發明並不限於以下實施方式。[0050][來自膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779的蛋白質][0051]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質是來自膨脹芽孢桿菌屬物種(tumebacillussp.)nitebp-02779(以下，有時記載為「nitebp-02779」)，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質。蛋白質可以是經合成的蛋白質，也可以是經純化或分離的蛋白質。對於某蛋白質是不是本發明涉及的蛋白質而言，可以基於後述的蛋白質的鑑定方法及肽聚糖分解活性的測定方法的結果進行判斷。來自nitebp-02779、且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，由於可分解靶標微生物，因此能夠將剩餘汙泥減容。[0052]nitebp-02779是於2018年9月11日國際保藏在國家技術評估學會，專利微生物保藏中心(292-0818日本國千葉縣木更津市上總鐮足2丁目5番地8122號室)，於2018年9月26日發出了關於原保藏的保藏證明及關於存活的證明書的細菌。認為nitebp-02779是膨脹芽孢桿菌(tumebacillus)屬細菌的新種。nitebp-02779可以分解桿菌(bacillus)、微球菌(micrococcus)、葡萄球菌(staphylococcus)等各種各樣的靶標微生物及剩餘汙泥，因此對處理剩餘汙泥有用。關於nitebp-02779的細菌學性質，示於後述實施例的表1～4中。nitebp-02779是具有包含序列號10記載的鹼基序列的16srrna基因的細菌。[0053]「來自nitebp-02779」可以是指由nitebp-02779合成或生成某物質，也可以是指以nitebp-02779的基因組序列為基礎，還可以是指例如以nitebp-02779的基因組序列為基礎，人工地或者在其它生物的細胞內合成或生成某物質。作為來自nitebp-02779的物質，可舉出例如蛋白質、核酸、糖等生物體分子及代謝產物等。這些產生後可以局部存在於細胞內，也可以分泌到細胞外。[0054]作為檢查某蛋白質是不是來自nitebp-02779的蛋白質的方法，可舉出例如以下方法。首先，利用下一代測序儀解讀nitebp-02779的基因組序列。從得到的鹼基序列中修剪(trimming)接頭序列，進行從頭測序組裝(denovoassembly)。分析通過從頭測序組裝得到的支架(scaffold)序列，進行基因區域預測及注釋，製作用於質量分析的蛋白質資料庫。接著，對對象蛋白質進行質量分析，與上述蛋白質資料庫進行對照，由此可以判斷對象蛋白質是不是來自nitebp-02779的蛋白質。[0055]作為檢查某蛋白質是不是來自nitebp-02779的蛋白質的另一種方法，可以利用胺基酸測序儀解讀對象蛋白質的胺基酸序列，並與上述蛋白質資料庫進行對照。[0056]來自nitebp-02779、且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，優選為分泌蛋白質。分泌蛋白質能夠在細胞外起作用。為了將剩餘汙泥減容，具有肽聚糖分解活性的蛋白質在細胞外的環境中具有肽聚糖分解活性是有用的。具有肽聚糖分解活性的分泌蛋白質，可以從產生該蛋白質的細胞的培養上清液中回收，也可以破壞產生該蛋白質的細胞而回收。[0057]肽聚糖是指n-乙醯葡萄糖胺(glcnac)與n-乙醯胞壁酸(murnac)交替地β-1，4鍵合的多糖通過寡肽交聯的分子。在圖1中示出代表性的肽聚糖的結構。「肽聚糖分解活性」是指促進肽聚糖變成2種以上物質的反應的狀態，「具有肽聚糖分解活性的蛋白質」(以下，有時記作「肽聚糖分解酶」)是指促進上述反應的蛋白質。[0058]肽聚糖通過構成多糖的糖之間的糖苷鍵、寡肽內的肽鍵等被分解而有效地被分解。在圖1中用箭頭示出可被肽聚糖分解酶分解的部位。作為具有分解肽聚糖的活性的蛋白質，可舉出：(1)具有分解n-乙醯葡萄糖胺與n-乙醯胞壁酸之間的糖苷鍵的活性的蛋白質，(2)具有分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性的蛋白質，(3)具有分解n-乙醯胞壁酸與l-丙氨酸之間的醯胺鍵的活性的蛋白質，(4)具有分解各肽鍵的活性的蛋白質。[0059]具體而言，作為(1)，可舉出n-乙醯氨基葡萄糖苷酶，作為(2)，可舉出n-乙醯胞壁質酶、溶菌糖基轉移酶，作為(3)，可舉出n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶，作為(4)，可舉出l，d-內肽酶、d，l-內肽酶、羧肽酶、d，d-內肽酶。[0060]作為檢查是不是具有肽聚糖分解活性的蛋白質的方法，可舉出例如使對象蛋白質與肽聚糖在緩衝液中反應一定時間之後，測定肽聚糖的分解的方法。作為檢查分解的方法沒有特別限定，可舉出例如測定肽聚糖的濁度的方法，利用slp試劑檢測肽聚糖的方法，使用高效液相層析法(hplc)；質量分析法(ms)；薄層層析法(tlc)；核磁共振(nmr)；氣相層析法(gc)等檢測來自肽聚糖的分解物的方法等。[0061]作為檢查是不是具有肽聚糖分解活性中的(2)分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性的蛋白質的方法，可舉出以溶壁微球菌(micrococcuslysodeikticus)作為基質的方法。具體而言，可以將溶壁微球菌的培養菌體用作基質，也可以使用溶菌酶活性試劑盒(lysozymeactivitykit)(sigma-aldrich公司制)、enzchek溶菌酶檢測試劑盒(lysozymeassaykit)(thermofisherscientific公司制)等。[0062]作為檢查肽聚糖分解活性中的(3)水解n-乙醯胞壁酸與l-丙氨酸之間的醯胺鍵的醯胺酶活性的方法，可舉出使用如applmicrobiolbiotechnol.2015，oct，99(20)：8563—73中所記載的、作為n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶的基質的l-苯胺-對硝基苯胺鹽酸鹽(sigma-aldrich公司制)的方法。[0063][序列號2或4記載的蛋白質][0064]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，是以下任一種蛋白質。[0065](a1)包含序列號2的1～164位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0066](b1)包含序列號4的1～493位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0067]序列號2的1～164位胺基酸序列及序列號4的1～493位胺基酸序列，是由nitebp-02779的基因組序列預測出的蛋白質的成熟體的胺基酸序列。對於蛋白質是否具有肽聚糖分解活性而言，能夠通過例如上述方法進行判斷。具有肽聚糖分解活性的蛋白質，由於可分解靶標微生物，因此能夠將剩餘汙泥減容。[0068]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，只要維持肽聚糖分解活性即可，可以是具有序列號2的1～164位胺基酸序列或序列號4的1～493位胺基酸序列的蛋白質的變異株。有時將維持肽聚糖分解活性的變異株稱為「保守性變異株」。在本發明中，被判定為具有肽聚糖分解活性的蛋白質的蛋白質中，除了上述蛋白質以外，還包括其保守性變異株、及那些蛋白質與其它肽的融合蛋白質。[0069]以下，關於肽聚糖分解酶的保守性變異株進行例示。[0070]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，只要維持肽聚糖分解活性即可，可以是具有在序列號2的1～164位胺基酸序列或序列號4的1～493位胺基酸序列中1個或數個胺基酸被取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列的蛋白質。「1個或數個」是根據蛋白質的立體結構中的胺基酸殘基的位置及種類等而不同的，可以是例如1～10個、1～8個、1～5個或1～3個。[0071]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，只要維持肽聚糖分解活性即可，可以是具有如下胺基酸序列的蛋白質，上述胺基酸序列對於序列號2的1～164位胺基酸序列或序列號4的1～493位胺基酸序列具有高的同一性，例如90％以上、93％以上、95％以上、97％以上或99％以上的同一性。[0072]上述胺基酸殘基的變異是正常維持蛋白質的功能的保守性變異。代表性的保守性變異為保守性取代。保守性取代是指，取代部位為芳香族胺基酸時，在phe、trp、tyr之間；取代部位為疏水性胺基酸時，在leu、ile、val之間；為極性胺基酸時，在gln、asn之間；為鹼性胺基酸時，在lys、arg、his之間；為酸性胺基酸時，在asp、glu之間；為具有羥基的胺基酸時，在ser、thr之間，相互取代的變異。作為被視為保守性取代的取代，具體而言，可舉出從ala到ser或thr的取代，從arg到gln、his或lys的取代，從asn到glu、gln、lys、his或asp的取代，從asp到asn、glu或gln的取代，從cys到ser或ala的取代，從gln到asn、glu、lys、his、asp或arg的取代，從glu到gly、asn、gln、lys或asp的取代，從gly到pro的取代，從his到asn、lys、gln、arg或tyr的取代，從ile到leu、met、val或phe的取代，從leu到ile、met、val或phe的取代，從lys到asn、glu、gln、his或arg的取代，從met到ile、leu、val或phe的取代，從phe到trp、tyr、met、ile或leu的取代，從ser到thr或ala的取代，從thr到ser或ala的取代，從trp到phe或tyr的取代，從tyr到his、phe或trp的取代，及從val到met、ile或leu的取代。胺基酸殘基的變異中，還包括由基於蛋白質來源的生物的個體差、種的不同等而天然產生的變異(mutant或variant)所產生的變異。[0073]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，可以是與其它肽的融合蛋白質。作為其它肽，可舉出標記肽(標記蛋白質)、肽標籤、及pro序列或prepro序列、例如分泌信號肽等。連接於肽聚糖分解酶的肽可以是僅1種的肽，也可以是2或其以上的肽。肽聚糖分解酶為與信號肽的融合蛋白質時，在可分泌的宿主細胞中表達之後，信號肽被切割而只有肽聚糖分解酶部分(成熟蛋白質)可以分泌到細胞外。肽聚糖分解酶為融合蛋白質時，上述同一性是除了其它肽部分以外的成熟蛋白質部分中的同一性。[0074]作為標記肽，只要是可作為標記發揮功能的肽即可，沒有特別限制，可舉出例如鹼性磷酸酶、抗體的fc區域、hrp、gfp等。作為肽標籤，沒有特別限制，可舉出myc標籤、his標籤、flag標籤、gst標籤等以往公知的肽標籤。作為分泌信號肽，除了nitebp-02779所具有的肽聚糖分解酶自身的分泌信號肽以外，還能夠使用可在表達肽聚糖分解酶的宿主中發揮功能的分泌信號肽。融合蛋白質能夠通過常規方法進行製作。[0075]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，可以是以下(al)～(a4)中任一種蛋白質。[0076](a1)由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質，[0077](a2)由序列號2的1～164位胺基酸序列中1位的ala被met取代的胺基酸序列組成的蛋白質，[0078](a3)由序列號2的1～164位胺基酸序列中1位的ala被met取代，在該met的n末端添加metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalproargglyserhis(序列號21)記載的胺基酸序列的胺基酸序列組成的蛋白質，[0079](a4)由序列號2的1～164位胺基酸序列中在1位的ala的n末端添加met的胺基酸序列組成的蛋白質。[0080]本發明的一個實施方式涉及的蛋白質，可以是以下(b1)～(b4)中任一種蛋白質。[0081](b1)由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質，[0082](b2)由序列號4的1～493位胺基酸序列中1位的glu被met取代的胺基酸序列組成的蛋白質，[0083](b3)由序列號4的1～493位胺基酸序列中1位的glu被met取代，在該met的n末端添加序列號21記載的胺基酸序列的胺基酸序列組成的蛋白質，[0084](b4)由序列號4的1～493位胺基酸序列中在1位的glu的n末端添加met的胺基酸序列組成的蛋白質。[0085]對於由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質而言，認為其具有上述肽聚糖分解活性中(2)分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性。(a1)包含序列號2的1～164位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，(a2)包含序列號2的1～164位胺基酸序列中1～10個胺基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，(a3)包含相對於序列號2的1～164位胺基酸序列具有90％以上同一性的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，優選具有上述肽聚糖分解活性中(2)分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性。[0086]對於由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質而言，認為其具有上述肽聚糖分解活性中(3)n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶活性。(b1)包含序列號4的1～493位胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，(b2)包含序列號4的1～493位胺基酸序列中1～10個胺基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，(b3)包含相對於序列號4的1～493位胺基酸序列具有90％以上同一性的胺基酸序列，且具有肽聚糖分解活性的蛋白質，優選具有上述肽聚糖分解活性中(3)n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶活性。[0087](a1)～(a3)及(b1)～(b3)涉及的蛋白質，可以是經合成的蛋白質，也可以是經純化或分離的蛋白質。(a1)～(a3)及(b1)～(b3)涉及的蛋白質，可以是來自nitebp-02779的蛋白質，也可以是人工地或者在nitebp-02779或其它生物的細胞內合成或生成的蛋白質。[0088]「編碼肽聚糖分解酶的dna」[0089]本發明涉及的dna是編碼上述蛋白質的dna。具體而言，可舉出編碼序列號2的1～164位胺基酸序列的dna，編碼序列號4的1～493位胺基酸序列的dna，及編碼具有這些胺基酸序列的蛋白質的保守性變異株的dna。本發明的一個實施方式涉及的dna，可以是具有序列號1的205～696位鹼基序列或序列號3的85～1563位鹼基序列的dna。序列號1及3是基於nitebp-02779的基因組序列的鹼基序列，編碼具有肽聚糖分解活性的蛋白質的成熟體。本發明涉及的dna，可以在上述鹼基序列的5』末端側包含起始密碼子及/或編碼其它肽的鹼基序列，也可以在上述鹼基序列的3』末端包含終止密碼子。dna可以是重組dna。dna可以是經合成的dna，也可以是互補dna(cdna)。dna可以是經純化或分離的dna。[0090]本發明涉及的dna，並不限於由nitebp-02779所具有的序列組成的dna，可以是包含在編碼區域中將編碼各胺基酸的密碼子取代為編碼相同胺基酸的其它等價密碼子的鹼基序列的dna。本發明的一個實施方式涉及的dna，也可以是包含以提高具有肽聚糖分解活性的蛋白質的表達的方式變更了密碼子出現頻率(codonusage)的鹼基序列的dna。[0091]本發明的一個實施方式涉及的dna中，還包括在嚴格的條件下與具有與上述鹼基序列互補的鹼基序列的探針或可由上述互補的鹼基序列製備的探針進行雜交，且編碼具有肽聚糖分解活性的蛋白質的dna。嚴格的條件是指形成所謂的特異性雜交，不形成非特異性雜交的條件。如果示出一例，則能夠舉出同一性高的dna彼此例如具有50％以上、65％以上、80％以上、優選90％以上、更優選95％以上、進一步優選97％以上、特別優選99％以上的同一性的dna彼此進行雜交，與其相比同一性低的dna彼此不進行雜交的條件，或者在相當於為通常的southern雜交的洗滌條件的60℃、1×ssc、0.1％sds，優選60℃、0.1×ssc、0.1％sds，更優選68℃、0.1×ssc、0.1％sds的鹽濃度及溫度下，洗滌1次、優選2～3次的條件。另外，例如作為探針使用300bp左右的長度的dna片段時，作為雜交的洗滌條件，可舉出50℃、2×ssc、0.1％sds。[0092]2個序列之間的同一性的比例，可以使用例如數學算法來確定。作為數學算法的例子，可舉出myers及miller(1988)cabios、4：11—17中記載的算法，smithetal(1981)adv.appl.math.2：482中記載的局部同源算法，needleman及wunsch(1970)j.mol.biol.48：443453中記載的同源序列比對算法，pearson及lipman(1988)proc.natl.acad.sci.85：2444-2448中記載的檢索類似性的方法，karlin及altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa、90：587—5877中記載的經改良的karlin及altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa、872264的算法。[0093]利用基於這些數學算法的程序，能夠進行用於確定序列同一性的序列比對(alignment)。程序可以適當地由電腦來執行。作為這樣的程序，沒有特別限定，可舉出pc/gene程序的clustal(可從intelligenetics，mountainview，callif.獲得)、以及align程序(version2.0)、wisconsingeneticssoftwarepackage，version8(可從geneticscomputergroup(gcg)，575sciencedrive，madison，wis.，usa獲得)的gap、bestfit、blast、fasta及tfasta等。使用了這些程序的序列比對，可以使用例如初始參數來進行。關於clustal程序，其充分記載於higglnsetal.(1988)gene73：237-244、higglnsetal.(1989)cabios5：151-153、corpetetal.(1988)nucleicacidsres.16：1088190、huangetal.(1992)cabios8：155-65及pearsonetal.(1994)meth.mol.biol.24：307-331。[0094]為了得到與編碼對象蛋白質的鹼基序列具有同一性的鹼基序列，能夠將例如blast核苷酸檢索利用blastn程序以分數(score)＝100、字長＝12進行。為了得到與對象蛋白質具有同一性的胺基酸序列，能夠將例如blast蛋白質檢索利用blastx程序以分數(score)＝50、字長＝3進行。關於blast核苷酸檢索、blast蛋白質檢索，參考http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。為了得到以比較作為目的加了缺口(gap)的序列比對(alignment)，能夠利用gappedblast(blast2.0)。為了進行檢測序列之間的疏遠關係的重複檢索，能夠利用psi-blast(blast2.0)。關於gappedblast及psi-blast，參考altschuletal.(1997)nucleicacidsres.25：3389。利用blast、gappedblast或psi-blast時，可使用各程序(例如，對於鹼基序列的blastn，對於胺基酸序列的blastx)的初始參數。序列比對可以手動進行。[0095]2個序列之間的同一性是作為將2個序列以最大一致的方式排列時在2個序列之間一致的殘基的比率來算出的。[0096]本發明涉及的dna能夠通過化學合成得到或由nitebp-02779利用pcr等得到。[0097]「載體」[0098]本發明涉及的載體含有上述dna。載體為能夠擴增、維持dna的核酸分子，可以是表達載體或克隆載體。本發明涉及的載體通過基於通常的基因工程方法在基本載體整合上述dna而構建即可。基本載體可以在例如宿主細胞中自主複製，可以從宿主細胞中分離及純化，具有可檢測的標記。本發明涉及的dna被插入到例如可在導入基因的宿主細胞中利用的表達載體，載體通過被導入到宿主細胞，從而能夠在宿主細胞中表達具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0099]基本載體可以是例如來自細菌質粒的載體、來自酵母質粒的載體、病毒載體、粘粒載體、噬菌粒載體、人工染色體載體等。作為基本載體，可舉出pbr322、puc質粒載體、pet系質粒載體等。具體而言，以大腸菌作為宿主細胞時，能夠舉出例如載體puc19、puc18、puc119(寶酒造公司制)、噬菌粒pbluescriptii(stratagene公司制)、pet28a(+)載體及pet22b(+)載體(merckmillipore公司)等。以出芽酵母作為宿主細胞時，能夠舉出例如載體pgbt9、pgad424、pact2(clontech公司制)等。以哺乳動物細胞作為宿主細胞時，能夠舉出例如prc/rsv、prc/cmv(invitrogen公司制)等載體，牛乳頭瘤病毒載體pbpv(amershampharmaciabiotech公司制)，eb病毒載體pcep4(invitrogen公司制)，痘苗病毒載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等。以昆蟲細胞作為宿主細胞時，能夠舉出例如杆狀病毒載體。[0100]當使用具有自主複製起點(ori)的基本載體而構建本發明涉及的載體時，該載體在導入到宿主細胞時作為游離體保持在細胞內。當整合了sv40的ori的載體導入到例如由缺失ori的sv40基因組轉化了的cos細胞等中時，能夠在細胞內大幅增大載體的拷貝數。[0101]表達載體可以具有用於表達整合基因的啟動子序列及終止子序列。啟動子只要是在宿主細胞中發揮功能的啟動子即可，沒有特別限制。「在宿主中發揮功能的啟動子」是指，在宿主中具有啟動子活性，能夠控制整合基因的表達的啟動子。通常而言，整合於基本載體的dna序列在啟動子可發揮功能的狀態下被插入到啟動子的下遊。例如基本載體中，在啟動子序列的下遊設有克隆部位。基本載體可以具有選擇標記序列。[0102]啟動子可以是來自宿主的啟動子，也可以是來自異種的啟動子。啟動子可以是肽聚糖分解酶基因固有的啟動子，也可以是其它基因的啟動子。宿主細胞為大腸菌時，啟動子能夠舉出例如大腸菌的乳糖操縱子的啟動子(lacp)、色氨酸操縱子的啟動子(trpp)、精氨酸操縱子的啟動子(argp)、半乳糖操縱子的啟動子(galp)、tac啟動子、t7啟動子、t3啟動子、λ噬菌體的啟動子(λ-pl、λ-pr)等。宿主細胞為動物細胞或分裂酵母時，啟動子能夠舉出例如勞斯肉瘤病毒(rsv)啟動子、巨細胞病毒(cmv)啟動子、猴病毒(sv40)的初期或後期啟動子、小鼠乳頭瘤病毒(mmtv)啟動子等。宿主細胞為出芽酵母時，啟動子能夠舉出例如adh1啟動子等。adh1啟動子能夠從例如保持adh1啟動子及同一終止子的酵母表達載體paah5[可從washingtnresearchfundation獲得，ammerer等，methodinenzymology、101part(p.192-201)]利用通常的基因工程方法進行製備。具有adh1啟動子的載體pact2如果將目的基因插入到adh1啟動子的下遊，則能夠在cg1945(clontech公司制)等出芽酵母內大量表達目的基因。[0103][轉化體][0104]本發明涉及的轉化體包含上述的本發明涉及的dna或本發明涉及的載體。包含本發明涉及的dna或本發明涉及的載體的轉化體，能夠表達具有肽聚糖分解活性的蛋白質。[0105]作為導入本發明涉及的dna或本發明涉及的載體的宿主細胞，能夠使用真核生物或原核生物的細胞，可舉出細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆蟲細胞。宿主細胞優選為大腸菌。通過在宿主細胞導入dna或載體，能夠轉化宿主細胞並製作轉化體。[0106]本發明涉及的dna或本發明涉及的載體，可以在宿主細胞內保持在染色體外，也可以整合於染色體內。在轉化體內，本發明涉及的dna或本發明涉及的載體，優選在啟動子的控制下以可表達基因的狀態保持著，上述啟動子在宿主細胞內發揮功能。[0107]對於將本發明涉及的dna或本發明涉及的載體導入到宿主細胞的方法而言，適用符合宿主細胞的通常的導入方法即可。以大腸菌作為宿主細胞時，能夠舉出例如j.sambrook，e.f.frisch，t.maniatis「分子克隆第2版(molecularcloning2ndedition)」、冷泉港實驗室(coldspringharbrlaboratory)發行(1989年)等中記載的氯化鈣法、電穿孔法等的基因導入法。以哺乳動物細胞或昆蟲細胞作為宿主細胞時，能夠舉出例如磷酸鈣法、deae葡聚糖法、電穿孔法、脂質轉染法等的基因導入法。以酵母作為宿主細胞時，能夠舉出例如酵母轉化試劑盒(yeasttransformationkit，clontech公司制)等中所使用的鋰法等的基因導入法。將病毒用作載體時，除了利用上述基因導入法能夠將插入了本發明涉及的dna的病毒的基因組導入到宿主細胞以外，還能夠通過使含有該病毒的基因組的病毒粒子感染宿主細胞，將本發明涉及的dna導入到宿主細胞。[0108]要篩選導入了本發明涉及的dna或本發明涉及的載體的轉化體時，使用選擇標記即可。例如，將本發明涉及的dna或載體與選擇標記基因同時導入到宿主細胞，通過符合選擇標記的性質的方法進行培養。例如，選擇標記基因為賦予對示出對於宿主細胞的致死活性的篩選藥劑的藥劑耐性的基因時，使用添加了該篩選藥劑的培養基，培養導入了本發明涉及的dna或載體的宿主細胞即可。作為賦予藥劑耐性的基因與篩選藥劑的組合，能夠舉出例如新黴素耐性賦予基因與新黴素的組合、潮黴素耐性賦予基因與潮黴素的組合、殺稻瘟素s耐性賦予基因與殺稻瘟素s的組合等。另外，標記基因為補充宿主細胞的營養需求性的基因時，使用不包含符合該營養需求性的營養素的基礎培養基(minimummedium)，培養導入了本發明涉及的dna或載體的宿主細胞即可。基於由本發明涉及的dna或載體表達的酶的活性，也能夠篩選轉化體。[0109]要獲得本發明涉及的dna位於宿主細胞的染色體內的轉化體時，採用如下方式即可，即，首先，通過將本發明涉及的載體和具有標記基因的載體利用限制酶消化，使其變成直鏈狀，之後，利用上述基因導入法將其導入到宿主細胞。將經導入的細胞通常培養數周之後，基於標記基因的表達量獲得目的轉化體。作為標記基因使用賦予對篩選藥劑的耐性的基因時，將本發明涉及的載體和具有標記基因的載體利用上述基因導入法導入到宿主細胞，之後，將細胞在添加了篩選藥劑的培養基中傳代培養數周以上，純化培養以菌落狀存活的篩選藥劑耐性克隆，由此能夠獲得本發明涉及的dna導入到宿主細胞的染色體的轉化體。要確認本發明涉及的dna整合在宿主細胞的染色體時，基於通常的基因工程方法製備細胞的基因組dna，進行將經導入的具有本發明涉及的dna的部分鹼基序列的dna作為引物或探針的pcr、southern雜交等，由此檢測本發明涉及的dna的存在即可。本發明涉及的dna整合在宿主細胞的染色體內的轉化體，可冷凍保存，能夠根據需要解凍而使用，因此能夠節省每實驗的轉化體製作時間，另外，可以使用預先確認了性質、處理條件的轉化體而實施試驗。[0110][本發明涉及的蛋白質的製造][0111]本發明涉及的蛋白質能夠從例如nitebp-02779獲得。從nitebp-02779獲得是指，從nitebp-02779的菌體內或培養上清液獲得。例如從菌體內獲得本發明涉及的蛋白質時，適當地對菌體進行破碎、溶解或提取等而能夠回收本發明涉及的蛋白質。菌體利用離心分離等能夠從培養物回收。細胞的破碎、溶解或提取等能夠利用公知的方法進行。作為這樣的方法，可舉出例如超聲波破碎法、dyno研磨法、珠子破碎、弗氏壓碎破碎、溶菌酶處理。這些方法可以單獨使用1種，也可以適當地組合使用2種或其以上。本發明涉及的蛋白質蓄積在培養上清液中時，利用離心分離等獲得培養上清液，能夠從培養上清液回收本發明涉及的蛋白質。[0112]本發明涉及的蛋白質的純化能夠利用酶的純化中所使用的公知方法進行。作為那樣的方法，可舉出例如硫酸銨分級、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法、凝膠過濾層析法、等電沉澱。這些方法可以單獨使用1種，也可以適當地組合使用2種或其以上。本發明涉及的蛋白質的純化可以按所期望的程度進行。[0113]本發明涉及的蛋白質也能夠使用將編碼那些的dna導入到適當的宿主的轉化體製造。dna優選整合於載體而用於轉化。本發明涉及的蛋白質可以在無細胞系中被人工合成。[0114]使用轉化體而製造本發明涉及的蛋白質時，轉化體的培養利用培養宿主細胞的方法進行即可。轉化體為微生物時，能夠使用例如在微生物的培養中通常使用的，適當包含碳源、氮源、有機或無機鹽等的各種培養基進行培養。[0115]作為碳源，可舉出例如葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類；甘油等糖醇；富馬酸、檸檬酸、丙酮酸等有機酸；動物油、植物油及糖蜜。這些碳源在培養基中的添加量，對於培養液而言，通常為0.1～30％(w/v)左右。[0116]作為氮源，可舉出例如肉提取物、蛋白腖、酵母提取物、麥芽提取物、大豆粉、玉米漿(cornsteepliquor)、棉籽粉、乾酵母、酪蛋白胺基酸等天然有機氮源；胺基酸類；硝酸鈉等無機酸的銨鹽、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無機酸的銨鹽；富馬酸銨、檸檬酸銨等有機酸的銨鹽及尿素。這些中，有機酸的銨鹽、天然有機氮源、胺基酸類等在多種情況下也能夠作為碳源使用。這些氮源在培養基中的添加量，對於培養液而言，通常為0.1～30％(w/v)左右。[0117]作為有機鹽或無機鹽，能夠舉出例如鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅等的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽。具體而言，可舉出氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫一鉀及磷酸氫二鉀。這些有機鹽及/或無機鹽在培養基中的添加量，對於培養液而言，通常為0.0001～5％(w/v)左右。[0118]為tac啟動子、trc啟動子、lac啟動子等由異乳糖誘導的啟動子與本發明涉及的dna連接而表達基因的轉化體時，作為用於生產本發明涉及的蛋白質的誘導劑，也可以將例如異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)少量加入到培養基中。[0119]本發明涉及的轉化體的培養，只要基於在宿主細胞的培養中通常使用的方法進行即可，可舉出例如試管振蕩式培養、往復式振蕩培養、發酵缸(jarfermenter)培養、罐培養等的液體培養及固體培養。培養溫度能夠在轉化體可生長的範圍適當變更，通常為約15℃～約40℃。培養基的ph優選為約6.0～約8.0的範圍。培養時間根據培養條件而不同，可以為約1日～5日。[0120]通過培養本發明涉及的轉化體，可得到含有本發明涉及的蛋白質的培養物。本發明涉及的蛋白質可蓄積在例如轉化體的菌體內及/或培養上清液中。本發明涉及的蛋白質的生產，能夠通過對於例如培養上清液、菌體內提取物等適當的級分按上述方法測定肽聚糖分解活性進行確認。[0121]本發明涉及的蛋白質可以利用與上述的nitebp-02779相同的方法，對轉化體適當地進行破碎、溶解、提取及純化而得到。本發明涉及的蛋白質並不限於經純化的本發明涉及的蛋白質，可以將含有本發明涉及的蛋白質的任意級分作為「本發明涉及的蛋白質」利用於肽聚糖分解等的用途中。含有本發明涉及的蛋白質的級分只要將本發明涉及的蛋白質以能夠對肽聚糖起作用的方式含有即可，沒有特別限制。作為那樣的級分，可舉出例如轉化體、轉化體的培養上清液、破碎物、溶解物、提取物(無細胞提取液等)、它們的部分純化物(粗純化物)、及它們的組合。這些級分均可以在肽聚糖分解等用途中單獨被利用，也可以與經純化的本發明涉及的蛋白質一同被利用。在培養物中，還可以與本發明涉及的蛋白質一同，生成及蓄積與本發明涉及的蛋白質不同的其它酶。本發明涉及的蛋白質可以作為與那樣的其它酶的混合物被回收，也可以與那樣的其它酶分離而被回收。[0122][微生物分解製劑][0123]微生物分解製劑包含選自由本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種。轉化體的培養物中，包含經培養的轉化體、轉化體的培養上清液、破碎物、溶解物、細胞的提取物(無細胞提取液等)、它們的部分純化物(粗純化物)、及它們的組合。[0124]微生物分解製劑優選包含由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質及/或由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質。微生物分解製劑可以包含1種具有肽聚糖分解活性的酶，也可以包含2種以上的組合。只要不阻礙肽聚糖分解活性，也可以包含其以外的成分。可包含於微生物分解製劑中的轉化體可以是1種，也可以是2種以上。[0125]對微生物分解製劑中的本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物的含量沒有特別限定，根據靶標微生物的種類、濃度、微生物分解製劑的使用環境(反應系的容積、溫度等)適當地設定即可。[0126]微生物分解製劑由於包含具有肽聚糖分解活性的蛋白質或可表達具有肽聚糖分解活性的蛋白質的轉化體，因此能夠分解肽聚糖。微生物分解製劑能夠分解具有肽聚糖的靶標微生物。靶標微生物優選為構成剩餘汙泥的細菌。靶標微生物可以是死菌，也可以是活菌。微生物分解製劑能夠有助於剩餘汙泥的減容。[0127]對於微生物是否被分解而言，能夠利用本領域技術人員通常使用的方法進行確認。作為這樣的確認方法，可舉出例如使微生物分解製劑與靶標微生物在適當的培養基或緩衝液中反應一定時間之後，檢測培養基或緩衝液中的靶標微生物的分解的方法。對檢測靶標微生物的分解的方法沒有特別限定，可舉出例如測定靶標微生物的濁度的方法，利用slp試劑檢測靶標微生物的方法，利用pcr檢測靶標微生物的dna的方法，測定靶標微生物的乾燥菌體重量的方法，使用高效液相層析法(hplc)；質量分析法(ms)；薄層層析法(tlc)；核磁共振(nmr)；氣相層析法(gc)等檢測來自靶標微生物的分解物的方法等。利用上述的檢查肽聚糖分解活性的方法，還能夠檢查靶標微生物是否被分解。[0128]在利用濁度檢查靶標微生物的分解時，分解靶標微生物是指，反應後的濁度相比於反應前的濁度顯著降低，例如反應後的濁度為反應前的濁度的80％以下，優選為50％以下，更優選為30％以下。在利用乾燥菌體重量檢查靶標微生物的分解時，分解靶標微生物是指，例如反應後的乾燥菌體重量相比於反應前顯著降低，例如反應後的乾燥菌體重量為反應前的95％以下，優選為90％以下。[0129]微生物分解製劑的劑型只要不失去本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物的功能即可，沒有特別限定。作為劑型，可舉出例如液體、懸濁液、粉末、固形物、膠囊包封體或者這些的冷凍體或冷凍乾燥體等。在製劑化時，能夠使用例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、穩定化劑、稀釋劑、表面活性劑等添加劑。[0130]微生物分解製劑能夠投入到產生剩餘汙泥的汙泥處理裝置、排水處理裝置等中使用。微生物分解製劑還能夠投入到蓄積了剩餘汙泥或靶標微生物的罐等中使用。[0131]本發明的一個方式是微生物分解製劑的製造中的、選自由本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種的使用。[0132][微生物分解方法][0133]微生物分解方法包括使選自由本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種作用於靶標微生物的工序。轉化體的培養物中，包含經培養的轉化體、轉化體的培養上清液、破碎物、溶解物、細胞的提取物(無細胞提取液等)、它們的部分純化物(粗純化物)、它們的組合。使選自本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物中的至少1種作用於靶標微生物的工序，可以使用上述微生物分解製劑進行。[0134]使本發明涉及的蛋白質作用於靶標微生物是指，例如使本發明涉及的蛋白質與靶標微生物進行接觸。使本發明涉及的轉化體作用於靶標微生物是指，例如將本發明涉及的轉化體在靶標微生物的存在下進行培養。使本發明涉及的轉化體的培養物作用於靶標微生物是指，例如使轉化體的培養物、優選包含於培養物中且具有肽聚糖分解活性的蛋白質與靶標微生物進行接觸。[0135]根據本發明涉及的微生物分解方法，能夠分解具有肽聚糖的靶標微生物。靶標微生物優選為構成剩餘汙泥的細菌。靶標微生物可以是死菌，也可以是活菌。根據微生物分解方法，能夠有助於剩餘汙泥的減容。[0136]微生物分解方法優選包括使由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質及/或由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質作用於靶標微生物的工序。在該工序中，可以使用1種具有肽聚糖分解活性的蛋白質，也可以組合使用2種以上。在微生物分解方法中，作用於靶標微生物的轉化體可以是1種，也可以是2種以上。[0137]使本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物作用於靶標微生物的工序，只要是不失去本發明涉及的蛋白質或者不失去本發明涉及的蛋白質所具有的肽聚糖分解活性的條件、或不殺滅轉化體就能合成該蛋白質的條件即可，沒有特別限制。該工序可以在例如溫度為20～35℃的條件下，也可以在25～30℃的條件下。可以在ph為5.5～8.0的條件下，也可以在6.0～7.5的條件下。[0138]對微生物分解方法中使用的、本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物的量沒有特別限定，考慮靶標微生物的種類及濃度、反應系的容積、反應溫度等而能夠適當地設定。[0139]對於靶標微生物是否被分解而言，能夠利用微生物分解製劑的欄中記載的方法進行確認。[0140]本發明的一個方式是用於分解靶標微生物的、選自由本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種的用途。本發明的一個方式是用於分解靶標微生物的、包含選自由本發明涉及的蛋白質以及本發明涉及的轉化體及其培養物組成的組中的至少1種的微生物分解製劑的用途。實施例[0141]以下，舉出實施例對本發明進行更詳細說明，但本發明並不限於這些實施例。[0142][實驗1.微生物分解菌的分離][0143](方法)[0144]使用以微球菌(micrococcus)屬細菌作為碳源的培養基，培養環境(水)中存在的微生物群，由此富集培養了分解微球菌屬細菌的微生物。接著，從經富集培養的微生物群中分離增殖良好的數個菌株。[0145](結果)[0146]對分離的每個菌株檢查了微球菌屬細菌分解能力，結果在1個菌株中確認了微球菌屬細菌分解能力。以下，有時將確認到微球菌屬細菌分解能力的菌株記作「菌株a」。[0147][實驗2.菌株a的鑑定][0148](材料)[0149]·克隆用正向引物(27f：序列號5)[0150]·克隆用反向引物(1492r：序列號6)[0151]·測序分析用引物(339f：序列號7、536r：序列號8、907f：序列號9)[0152](方法)[0153]菌株a的鑑定通過16srrna基因分析、形態觀察及生理、生化的性狀試驗進行。[0154]16srrna基因分析按照以下步驟進行。從菌株a提取基因組dna，將得到的基因組dna作為模板，使用克隆用正向引物(27f)及克隆用反向引物(1492r)而進行了16srrna基因的pcr擴增。pcr擴增使用kodfx(東洋紡公司制)進行，對pcr後的擴增產物進行了純化。[0155]使用經純化的pcr後的擴增產物，進行了循環測序反應。循環測序反應使用bigdyeterminatorv3.1循環測序試劑盒進行。將得到的反應液純化，對純化液進行dna測序分析(3730xldna分析儀)，確定了從菌株a提取的模板dna的16srrna基因的鹼基序列。[0156]形態觀察及生理、生化的性狀試驗通過利用光學顯微鏡的形態觀察、barrow等的方法(cowanandsteel’smanualfortheidentificationofmedicalbacteria3rdedition1993，cambridgeuniversitypress.)及api50chb(biomerieux公司制、lyon、france)進行。[0157](結果)[0158]將得到的16srrna基因的鹼基序列(序列號10)對照於國際鹼基序列資料庫(ddbj/ena(embl)/genbank)進行了同源性分析。在基準株中，對比永久冰凍膨脹芽孢桿菌(tumebacilluspermanentifrigoris)eurl_9.5的16srrna基因的鹼基序列，示出了同一性為98.1％。但是，並沒有存在具有與得到的鹼基序列完全一致的16srrna基因的微生物。另外，菌株a在10℃時不生長，但在16srrna基因的同一性最高的永久冰凍膨脹芽孢桿菌eurl_9.5中沒有觀察到這樣的特徵。因此，啟示菌株a是與以往的膨脹芽孢桿菌不同的新種。將菌株a作為膨脹芽孢桿菌屬物種nitebp-02779國際保藏。[0159]將nitebp-02779的形態觀察及生理、生化的性狀試驗結果示於表1～表4。[0160][表1][0161][0162]+：陽性，-：陰性，+w：反應較弱[0163][表2][0164][0165]+：陽性，-：陰性[0166][表3][0167][0168]+：陽性，-：陰性[0169][表4][0170]試驗項目試驗結果10℃下的生長-ph9.0下的生長+澱粉的水解+[0171]+：陽性，-：陰性[0172][實驗3.nitebp-02779對於剩餘汙泥(死菌)的分解能力評價-1][0173](材料)[0174]·r2a培養基：相對於1000ml的超純水，以3.2g的比例溶解r2a肉湯培養基daigo(日本製藥株式會社制)，並進行了高壓蒸汽滅菌的培養基[0175]·含有剩餘汙泥(死菌)的無機培養基：將986ml基質溶液、3.0mla液、3.0mlb液、3.0mlc液、3.0mld液及1.8ml1％磷酸進行混合的培養基[0176]作為基質溶液及a液～d液使用了以下這些。[0177]基質溶液：將剩餘汙泥洗滌之後，相對於超純水986ml混合而使得濁度(od660)為0.2，並進行了高壓蒸汽滅菌的溶液[0178]a液：將4.35g磷酸氫二鉀、1.70g磷酸二氫鉀、8.92g磷酸氫二鈉12水合物、0.34g氯化銨溶解於超純水之後，製備成200ml並進行了高壓蒸汽滅菌的溶液[0179]b液：將4.50g硫酸鎂7水合物溶解於超純水之後，製備成200ml並進行了高壓蒸汽滅菌的溶液[0180]c液：將5.50g無水氯化鈣溶解於超純水之後，製備成200ml並進行了高壓蒸汽滅菌的溶液[0181]d液：將0.05g氯化鐵6水合物溶解於超純水之後，製備成200ml並利用0.2μm的針頭式過濾器(syringefilter)進行了過濾滅菌的溶液[0182](方法)[0183]將nitebp-02779接種於r2a培養基，在25℃培養24小時～48小時。培養結束後，將nitebp-02779培養液50μl和含有剩餘汙泥(死菌)的無機培養基5.0ml添加到試管中，在25℃、200rpm條件下進行反應，利用簡易濁度計(簡易odmonitorminiphoto518r，taitec公司制)經時地測定了試管的濁度(od660)。算出含有剩餘汙泥(死菌)的無機培養基的濁度(od660)顯示陰性對照的濁度(od660)的50％時的經過天數。陰性對照使用了不添加nitebp-02779的含有靶標細菌(死菌)的無機培養基的濁度(od660)。[0184](結果)[0185]確認了通過添加nitebp-02779，剩餘汙泥(死菌)的濁度發生降低，3.2天時為陰性對照的濁度的50％。因此，nitebp-02779能夠分解剩餘汙泥(死菌)。[0186][實驗4.nitebp-02779對於剩餘汙泥(死菌)的分解能力評價-2][0187](材料)[0188]使用了與實驗3相同的材料。[0189](方法)[0190]以與實驗3相同的方法進行了反應。反應以5個重複連續進行，在反應開始之後第4天，總量回收試管中殘留的剩餘汙泥。將回收的剩餘汙泥乾燥之後，測定重量，利用陰性對照組和nitebp-02779添加組進行了顯著性檢驗(t檢驗，單側)。[0191](結果)[0192]將結果示於圖2。確認了與陰性對照組相比，nitebp-02779添加組中剩餘汙泥的乾燥重量發生顯著的降低(p＜0.01)。因此，通過添加nitebp-02779，能夠縮減剩餘汙泥。[0193][實驗5.nitebp-02779的基因組序列的確定][0194](方法)[0195]按照以下步驟，利用下一代測序儀，對nitebp-02779的基因組序列進行了分析。將nitebp-02779接種於50ml的r2a培養基，在25℃、130rpm條件下振蕩培養了2天。通過對得到的菌體進行離心分離，收集菌，使用基因組dna提取試劑盒(qiaampdnaminikit(250)、qiagen公司制)，進行了基因組dna的提取。將提取的dna作為模板，使用下一代測序儀hiseq2500(illumina公司制)，並利用雙端測序(paired-end)法進行了測序。接著，從得到的鹼基序列中修剪(trimming)接頭序列，使用velvet進行了從頭測序組裝(denovoassembly)。分析通過從頭測序組裝得到的支架(scaffold)序列，進行了基因區域預測及注釋。基因區域預測及注釋中，使用了rast(利用子系統技術的快速注釋工具，rapidannotationsusingsubsystemstechnology)。[0196](結果)[0197]從頭測序組裝的結果得到了149的支架，支架序列的合計長度為4.44mbp，預測到4446基因的存在。[0198][實驗6.具有肽聚糖分解活性的蛋白質(id2839)的鑑定][0199](1)nitebp-02779培養上清液的製備[0200](方法)[0201]將nitebp-02779接種於5ml的r2a培養基，在25℃進行了前培養。將得到的前培養液5ml接種於1.5l的r2a培養基，在25℃、130rpm條件下進行了振蕩培養。48小時之後，將培養液離心分離(4℃、8000×g、10分鐘)，對得到的培養上清液進行了過濾器過濾(0.20μm)。利用離心式過濾器單元(merckmillipore公司制)，對上述經過過濾器過濾的培養上清液進行濃縮，用作酶純化的起始材料。[0202](2)利用柱層析法的分級[0203]酶的分級及純化利用示於以下(a)～(c)的柱層析法進行。經分級的各級分的肽聚糖分解活性利用溶菌酶活性試劑盒(sigma-aldrich公司制)進行測定。對於得到的級分中所含的蛋白質而言，使用4～20％mini-proteantgx預製凝膠(biorad公司制)進行電泳，之後進行cbb染色而確認。[0204](a)陽離子交換層析法[0205](材料)[0206]·試樣：nitebp-02779培養上清液濃縮液[0207](方法)[0208]利用離心式過濾器單元(merckmillipore公司制)，將試樣中的緩衝液交換成50mm磷酸緩衝液(ph5.8)。將該試樣應用(apply)於使用相同緩衝液平衡了的hitrapqhp，5ml柱(gehealthcare公司制)中，將柱用相同緩衝液洗滌之後，利用0～1.0m的氯化鈉直線濃度梯度，洗脫吸附蛋白質。[0209](結果)[0210]對肽聚糖分解活性進行了檢查，結果在未吸附級分中確認了活性，因此將未吸附級分提供給疏水性相互作用層析法中。[0211](b)疏水性相互作用層析法[0212]·試樣：陽離子交換層析法的未吸附級分[0213](方法)[0214]利用離心式過濾器單元(merckmillipore公司制)，將(a)陽離子交換層析法的未吸附級分中的緩衝液交換成包含1m硫酸銨的50mm磷酸緩衝液(ph5.8)。將該試樣應用(apply)於使用相同緩衝液平衡了的hitraphic，5ml柱(gehealthcare公司制)中。將柱用相同緩衝液洗滌之後，利用1.0～0m的硫酸銨直線濃度梯度，洗脫吸附蛋白質。[0215](結果)[0216]對肽聚糖分解活性進行了檢查，結果在吸附級分中確認了活性，因此將確認到活性的級分提供給凝膠過濾層析法中。[0217](c)凝膠過濾層析法[0218]·試樣：疏水性相互作用層析法的吸附級分[0219](方法)[0220]利用離心式過濾器單元(merckmillipore公司制)，將(b)疏水性相互作用層析法的吸附級分中的緩衝液交換成66mm磷酸鉀(ph6.24)。將該試樣應用於使用相同緩衝液平衡了的superdextm7510/300gl(gehealthcare公司制)中，並利用相同緩衝液進行了洗脫。[0221](結果)[0222]對肽聚糖分解活性進行了檢查，結果如圖3所示在洗脫級分中確認了活性。[0223](3)利用質量分析的具有肽聚糖分解活性的蛋白質的鑑定[0224](材料)[0225]·試樣：凝膠過濾層析法的洗脫級分[0226](方法)[0227]利用離心式過濾器單元(merckmillipore公司制)，對確認到活性的洗脫級分進行濃縮，使用4～20％mini-proteantgx預製凝膠(biorad公司制)進行了電泳。其結果是，如圖4所示，確認了來自洗脫級分所含的蛋白質的帶為單一條帶。對於(c)凝膠過濾層析法的純化級分及利用電泳分離的帶，分別使用胰蛋白酶進行液相消化或膠內(ingel)消化，對消化液進行了脫鹽處理。利用納米lc-ms(thermoscientific公司制、qexactivehf，納米柱：acclaimpepmaprslcc18(thermoscientific公司制))，對經脫鹽處理的試樣實施了數據依賴型掃描(datadependentms/msacquisition(dda))。測定之後，以由nitebp-02779的基因組信息作成的蛋白質序列資料庫為對象，實施了利用proteomediscoverer2.1的masco搜索(ms/ms離子搜索)。[0228](結果)[0229]對利用質量分析檢測到的胰蛋白酶切割肽進行了檢索，結果檢測到為id2839的部分序列的序列號11～17的胺基酸序列。這些部分序列相當於序列號2的15～164位胺基酸序列的一部分。根據以上，啟示nitebp-02779表達的蛋白質id2839具有肽聚糖分解活性。[0230](4)id2839的n末端切割部位的鑑定[0231](方法)[0232]進一步，以鑑定了id2839的dda測定數據文件為對象，檢索了n末端側是否包含在序列號2的-11～14位的任意部位被切割的肽。[0233](結果)[0234]作為具有最高強度的信號值的肽，得到了序列號18的部分序列。序列號18的部分序列相當於序列號2的1～10位。因此，認為序列號2的胺基酸序列總體是id2839的前體(pro序列)的胺基酸序列。認為id2839的成熟體的胺基酸序列是序列號2的1～164位，由序列號1的205～696位鹼基序列編碼。認為序列號2的-68～-1位是信號肽。以下，有時將由序列號2的1～164位胺基酸序列組成的蛋白質記作「id2939成熟體」，將由序列號2的胺基酸序列總體(-68～164位)構成的蛋白質記作「id2839前體」。認為從id2839前體切割信號肽時，成為id2839成熟體，id2839成熟體在菌體外分泌而可分解肽聚糖。id2839前體的分子量為約25kda，id2839成熟體的分子量為約18kda。[0235][實驗7.id2839成熟體的比活性測定][0236](材料)[0237]·id2839成熟體(凝膠過濾層析法的洗脫級分)[0238](方法)[0239]進行id2839成熟體的活性測定(單位/ml)和蛋白質定量(mg/ml)，算出比活性(單位/mg)。作為對照，使用了市售的溶菌酶2種類(sigma-aldrich公司制)。肽聚糖分解活性使用溶菌酶活性試劑盒(sigma-aldrich公司制)，根據分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性進行評價。[0240](結果)[0241]將結果示於表5。示出了id2839成熟體具有分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性，比活性比市售的變溶菌素、溶葡球菌酶高。[0242][表5][0243][0244][實驗8.id2839成熟體在e.coli中的製備][0245](1)id2839成熟體表達株的構建[0246](材料)[0247]·id2839克隆用引物f及r(序列號19及20)[0248]·lb瓊脂培養基：相對於500ml的超純水，以10個的比例溶解lbager(sigma-aldrich公司制)，經過高壓蒸汽滅菌之後，注入到皿中的瓊脂培養基[0249](方法)[0250]將nitebp-02779的基因組dna作為模板，使用id2839克隆用引物f及r進行了包含編碼id2839成熟體(序列號2中的1位的ala被met取代)的鹼基序列的區域的pcr擴增。pcr擴增使用kodfx(東洋紡公司制)進行。反應溶液按照附於試劑盒的組成進行製備，以(1)94℃、2分鐘，(2)98℃、10秒，(3)50℃、30秒，(4)68℃、1.5分鐘進行，並將(2)～(4)的工序反覆進行25個循環。將得到的pcr片段和pet-28a(+)載體(merckmillipore公司制)分別利用ndei、xhoi消化，使用高效率連接試劑(ligationhighver.2，東洋紡公司制)進行了連接。在該連接反應液中，將e.colidh5α轉化，從卡那黴素耐性株中提取了目的質粒。使用該質粒，將e.colibl21(de3)轉化，得到了id2839成熟體的表達株(有時記作「bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體」)。bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體中，在成熟蛋白質(序列號2中的1位的ala被met取代)的n末端附有包含his標籤及凝血酶切割部位的胺基酸序列(metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalproargglyserhis：序列號21)的蛋白質被表達。作為對照株，得到了不表達id2839成熟體的株(有時記作「bl21(de3)/pet28a」)。[0251](2)id2839成熟體的表達誘導及可溶性級分的製備[0252](材料)[0253]·lb液體培養基：相對於500ml的超純水，以10個的比例溶解lb肉湯培養基1.1gpertablet(sigma-aldrich公司制)，並進行了高壓蒸汽滅菌的培養基[0254]·轉化體：bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體[0255]·轉化體(對照)：bl21(de3)/pet28a[0256](方法)[0257]將各轉化株接種於包含卡那黴素50mg/l的lb培養基5ml，在37℃進行了前培養。將得到的前培養液1.0ml接種於包含卡那黴素50mg/l的lb培養基100ml，使用折流燒瓶進行了振蕩培養。在od660到達0.6的時刻，添加iptg(終濃度0.1mm)，進一步在18℃培養了16小時。培養結束之後，利用離心分離從得到的培養液收集菌體，加入對應每溼菌體量為一定量的bugbuster(novagen公司制)，對菌體進行了破碎。利用離心分離，從破碎液除去菌體殘渣，將得到的上清液作為可溶性級分。從bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體得到了包含id2839成熟體的可溶性級分。從bl21(de3)/pet28a得到了不包含id2839的可溶性級分。[0258](3)可溶性級分的活性評價[0259](材料)[0260]·來自bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體的可溶性級分[0261]·來自bl21(de3)/pet28a的可溶性級分[0262](方法)[0263]使用溶菌酶活性試劑盒(sigma-aldrich公司制)，算出分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性(單位/ml)。活性(單位/ml)使用下式而算出。[0264]分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性(單位/ml)＝{δabs450nm/分(添加了可溶性級分的含有靶標細菌的磷酸緩衝液)-δabs450nm/分(沒有添加可溶性級分的含有靶標細菌的磷酸緩衝液)}/(0.001×0.1)[0265](結果)[0266]將結果示於表6。來自bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體的可溶性級分中，確認到分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性，而來自對照的bl21(de3)/pet28a的可溶性級分中，幾乎沒有確認到分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性。可知id2839成熟體具有肽聚糖分解活性，具有分解n-乙醯胞壁酸與n-乙醯葡萄糖胺之間的糖苷鍵的活性。[0267][表6][0268]試樣活性(單位/ml)bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體264bl21(de3)/pet28a0[0269][實驗9.具有肽聚糖分解活性的蛋白質(id1644)的鑑定][0270](1)由基因組信息的鑑定[0271]從nitebp-02779的基因組序列的解讀結果，發現了與n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶同一性高的酶的基因。將該酶命名為id1644。id1644分泌在nitebp-02779的培養上清液中。認為序列號4的胺基酸序列總體是前體(pro序列)的胺基酸序列。認為成熟蛋白質的胺基酸序列是序列號4的1～493位，由序列號3的85～1563位鹼基序列編碼。認為序列號4的-28～-1位是信號肽。以下，有時將由序列號4的1～493位胺基酸序列組成的蛋白質記作「id1644成熟體」，將由序列號4的胺基酸序列總體(-28～493位)構成的蛋白質記作「id1644前體」。認為從id1644前體切割信號肽時，成為id1644成熟體，id1644成熟體在菌體外分泌而可分解肽聚糖。id1644前體的分子量為約56kda，id1644成熟體的分子量為約53kda。[0272][實驗10.id1644成熟體在e.coli中的製備][0273](1)id1644成熟體表達株的構建[0274](材料)[0275]·id1644克隆用引物f及r(序列號22及23)[0276]·lb瓊脂培養基[0277](方法)[0278]將nitebp-02779的基因組dna作為模板，使用idl644克隆用引物f及r進行了包含編碼id1644成熟體的鹼基序列的區域的pcr擴增。pcr擴增使用kodfx(東洋紡公司制)進行。反應溶液按照附於試劑盒的組成進行製備，以(1)94℃、2分鐘，(2)98℃、10秒，(3)50℃、30秒，(4)68℃、1.5分鐘進行，並將(2)～(4)的工序反覆進行25個循環。將得到的pcr片段和pet-22b(+)載體(merckmillipore公司制)分別利用ndei、xhoi消化，使用高效率連接試劑(ligationhighver.2，東洋紡公司制)進行了連接。在該連接反應液中，將e.colidh5α轉化，從氨苄西林耐性株中提取了目的質粒。使用該質粒，將e.colibl21(de3)轉化，得到了id1644成熟體的表達株(有時記作「bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體」)。bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體中，在成熟蛋白質(序列號4的1～493位)的n末端附有甲硫氨酸的蛋白質被表達。作為對照株，得到了不表達id1644成熟體的株(有時記作「bl21(de3)/pet22b」)。[0279](2)id1644成熟體的表達誘導及可溶性級分的製備[0280](材料)[0281]·lb液體培養基[0282]·轉化體：bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體[0283]·轉化體(對照)：bl21(de3)/pet22b[0284](方法)[0285]將各轉化株接種於包含氨苄西林100mg/l的lb培養基5ml，在37℃進行了前培養。將得到的前培養液1.0ml接種於包含氨苄西林100mg/l的lb培養基100ml，使用折流燒瓶進行了振蕩培養。在od660到達0.6的時刻，添加iptg(終濃度0.1mm)，進一步在18℃培養了16小時。培養結束之後，利用離心分離從得到的培養液收集菌體，加入對應每溼菌體量為一定量的bugbuster(novagen公司制)，對菌體進行了破碎。利用離心分離，從破碎液除去菌體殘渣，將得到的上清液作為可溶性級分。從bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體得到了包含id1644成熟體的可溶性級分。從bl21(de3)/pet22b得到了不包含id1644成熟體的可溶性級分。[0286](3)可溶性級分的活性評價-1[0287](材料)[0288]·來自bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體的可溶性級分[0289]·來自bl21(de3)/pet22b的可溶性級分[0290]·肽聚糖溶液：相對於50ml的磷酸緩衝液(ph7.0)，以10mg的比例溶解肽聚糖(sigma-aldrich公司制)的溶液[0291](方法)[0292]將肽聚糖溶液5ml和可溶性級分50μl混合，經時地測定od450，算出肽聚糖分解活性(單位/ml)。肽聚糖分解活性(單位/ml)使用下式而算出。[0293]肽聚糖分解活性(單位/ml)＝{δabs450nm/分(添加了可溶性級分的含有肽聚糖的磷酸緩衝液)-δabs450nm/分(沒有添加可溶性級分的含有肽聚糖的磷酸緩衝液)}/(0.001×0.05)[0294](結果)[0295]將結果示於表7。來自bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體的可溶性級分中，確認到肽聚糖分解活性，而來自對照的bl21(de3)/pet22b的可溶性級分中，幾乎沒有確認到肽聚糖分解活性。可知id1644成熟體具有肽聚糖分解活性。[0296][表7][0297]試樣活性(單位/ml)bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體100bl21(de3)/pet22b2[0298](4)可溶性級分的活性評價-2[0299](材料)[0300]·來自bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體的可溶性級分[0301]·來自bl21(de3)/pet22b的可溶性級分[0302]·n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶的基質：l-苯胺-對硝基苯胺鹽酸鹽(sigma-aldrich公司制)[0303](方法)[0304]將可溶性級分10μl、1mg/ml基質溶液10μl、100mm三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(tris-hcl、ph7.6)80μl在37℃靜置10分鐘，使用酶標儀(moleculardevice公司制)測定了吸光度(405nm)。[0305](結果)[0306]將結果示於表8。來自bl21(de3)/pet22b-id1644成熟體的可溶性級分示出了比來自bl21(de3)/pet22b的可溶性級分高的abs405nm值。可知id1644成熟體具有n-乙醯胞壁醯-l-丙氨酸醯胺酶的活性。[0307][表8][0308]試樣abs405nmbl21(de3)/pet22b-id1644成熟體0.536bl21(de3)/pet22b0.142[0309][實驗11.id2839成熟體-2在e.coli中的製備][0310](1)id2839成熟體-2表達株的構建[0311](材料)[0312]·id2839克隆用引物f及r(序列號24及25)[0313]·lb瓊脂培養基[0314](方法)[0315]將nitebp-02779的基因組dna作為模板，使用id2839克隆用引物(序列號24及25)進行了包含編碼id2839成熟體-2(由序列號2的1～164位胺基酸序列中在1位的ala的n末端添加了met的胺基酸序列組成的蛋白質)的鹼基序列的區域的pcr擴增。pcr擴增使用kodplusneo(東洋紡公司制)進行。反應溶液按照附於試劑盒的組成進行製備，以(1)94℃、2分鐘，(2)98℃、10秒，(3)68℃、30秒進行，並將(2)～(3)的工序反覆進行30個循環。使用融合hd克隆試劑盒(in-fusionhdcloningkit，takarabio公司制)，將得到的pcr片段與用ncoi、xhoi消化pet-28a(+)載體(merckmillipore公司制)而成的片段進行了連接。在該連接反應液中，將e.colidh5α轉化，從卡那黴素耐性株中提取了目的質粒。使用該質粒，將e.colibl21(de3)轉化，得到了id2839成熟體-2的表達株(有時記作「bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-2」)。bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-2中，成熟蛋白質(由序列號2的1～164位胺基酸序列中在1位的ala的n末端添加met的胺基酸序列組成的蛋白質)被表達。[0316](2)id2839成熟體-2的表達誘導及可溶性級分的製備[0317](材料)[0318]·lb液體培養基[0319]·轉化體：bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-2[0320]·轉化體(對照)：bl21(de3)/pet28a[0321](方法)[0322]將各轉化株接種於包含卡那黴素50mg/l的lb培養基5ml，在37℃進行了前培養。將得到的前培養液1.0ml接種於包含卡那黴素50mg/l的lb培養基100ml，使用折流燒瓶進行了振蕩培養。在od660到達0.6的時刻，添加iptg(終濃度1mm)，進一步在24℃培養了20小時。培養結束之後，通過與實驗8同樣的方法得到了菌體的可溶性級分。[0323](3)可溶性級分的活性評價[0324](材料)[0325]·bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-2[0326]·來自bl21(de3)/pet28a的可溶性級分[0327](方法)[0328]以與實驗8同樣的方法進行。[0329](結果)[0330]將結果示於表9。bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-2的可溶性級分中，確認了肽聚糖分解活性。[0331][表9][0332]試樣活性(單位/ml)bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-265.1bl21(de3)/pet28a0[0333][實驗12.id2839成熟體-3在e.coli中的製備][0334](1)id2839成熟體-3表達株的構建[0335](材料)[0336]·id2839克隆用引物f及r(序列號26及25)[0337]·lb瓊脂培養基[0338](方法)[0339]除了使用序列號26及25記載的克隆用引物以外，通過與實驗11同樣的方法得到了id2839成熟體-3的表達株(有時記作「bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-3」)。bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-3中，成熟蛋白質(由序列號2的1～164位胺基酸序列中1位的ala被met取代的胺基酸序列組成的蛋白質)被表達。[0340](2)id2839成熟體的表達誘導及可溶性級分的製備[0341](材料)[0342]·lb液體培養基[0343]·轉化體：bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-3[0344]·轉化體(對照)：bl21(de3)/pet28a[0345](方法)[0346]通過與實驗11同樣的方法得到了菌體的可溶性級分。[0347](3)可溶性級分的活性評價[0348](材料)[0349]·來自bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-3的可溶性級分[0350]·來自bl21(de3)/pet28a的可溶性級分[0351](方法)[0352]以與實驗8同樣的方法進行。[0353](結果)[0354]將結果示於表10。來自bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-3的可溶性級分中，確認了肽聚糖分解活性。[0355][表10][0356]試樣活性(單位/ml)bl21(de3)/pet28a-id2839成熟體-379.0bl21(de3)/pet28a0[0357]當前第1頁12當前第1頁12