在原核細胞中產生免疫原性多糖的生物合成系統的製作方法

2023-09-14 02:15:30

專利名稱：在原核細胞中產生免疫原性多糖的生物合成系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物合成系統和蛋白質在製備疫苗中的應用。另外，本發明涉及重組原核生物合成系統，該系統具有啟動在還原末端具有特定單糖的寡糖或多糖(oligo-or polysaccharide)的合成的差向異構酶。本發明還涉及在表達系統中用聚糖產生的N-糖基化蛋白及由包含免疫原性聚糖的所述N-糖基化蛋白製成的生物綴合物疫苗(bioconjugate vaccines),並且提供用於產生N-糖基化蛋白的方法。發明背景 糖蛋白是具有一個或多個共價連接的糖聚合體的蛋白質。N-聯蛋白質糖基化是在真核生物的內質網中發生的一種必需和保守的過程。它對於分泌蛋白和膜蛋白的蛋白質摺疊、寡聚化、穩定性、質量控制、分選(sorting)和轉運來說是十分重要的(Helenius，A.和Aebi, M. (2004). Roles of N-Iinked glycans in the endoplasmic reticulum (N_ 聯聚糖在內質網中的作用) Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049)。蛋白質糖基化對於蛋白質的免疫原性、穩定性和半壽期具有深遠的影響。另外，糖基化可有助於蛋白質的純化，即利用與固相結合併與蛋白質的糖基化部分相互作用的凝集素配體進行層析(例如親和層析)來純化蛋白質。因此，為了提供生物學和藥學上有用的糖基化模式，慣例是在真核細胞中重組產生許多糖基化蛋白。WO 2003/07467 (Aebi等人)證明了經食物傳播的病原體空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(它是一種細菌)可以使其蛋白質N-糖基化，除了古生菌(archaea)的某些種以外，在已知的原核生物中，這是一種獨特的特徵。糖基化所需要的機器由12個基因編碼，這12個基因在所謂的pgl基因座中是成簇的。N-糖基化的破壞會影響空腸彎曲桿菌(C. jejuni)的侵襲和致病機制但並不是致死的，正如在大多數真核生物中(Burda P.和 M. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-Iinked glycosylation(N-聯糖基化的多職醇途徑).Biochem Biophys Acta 1426 (2) : 239-57)。在大腸桿菌(E. coli)中通過同時重組表達Pgl基因座和受體糖蛋白來重建空腸彎曲桿菌蛋白的N-糖基化是可倉泛的(Wacker 等人(2002). N-Iinked glycosylation in Campylobacter jejuni and itsfunctional transfer into E. coli (空腸彎曲桿菌中的N-聯糖基化及其功能性轉移到大腸桿菌中) Science 298，1790-1793)。N-聚糖具有一種與蛋白質中的共有序列連接的聚糖。蛋白質中已知的N-糖基化共有序列允許原核生物中重組靶蛋白的N-糖基化。這類生物體包含寡糖基轉移酶(「0T」； 「OTase」)，例如空腸彎曲桿菌的寡糖基轉移酶，寡糖基轉移酶是一種將聚糖轉移到蛋白質的共有序列上的酶。WO 2003/07467 (Aebi等人)教導了一種被導入了編碼以下⑴、(ii)和(iii)的核酸的原核生物(i)在脂質載體上裝配寡糖的特定糖基轉移酶，(ii)包含共有序列「N-X-S/T」的重組靶蛋白，其中X可以為除脯氨酸以外的任何胺基酸，和(iii)寡糖基轉移酶，例如將所述寡糖與靶蛋白的共有序列共價連接的空腸彎曲桿菌寡糖基轉移酶。所述原核生物產生具有由特定糖基轉移酶類型限定的特定結構的N-聚糖。WO 2006/119987 (Aebi等人)描述了用於在原核生物體內(in vivo)高效N-糖基化的蛋白質，以及高效產生N-糖基化蛋白質的手段(means)和方法。它進一步描述了將N-聚糖有效引入到重組蛋白中以改變所述蛋白的免疫原性、穩定性、生物活性、預防和/或治療活性，並且提供了在其表面有效地展示本發明的重組N-糖基化蛋白的宿主細胞。另夕卜，它描述了一種重組N-糖基化蛋白，其包含以下N-糖基化最優化胺基酸序列中的一個或多個 D/E-X-N-Z-S/T (最優化共有序列)，其中X和Z可以為除Pro以外的任何天然胺基酸，並且其中所述N-糖基化部分胺基酸序列中的至少一個被引入。將特定部分胺基酸序列(最優化共有序列)引入到蛋白質 會導致產生在這些引入的位置中被寡糖基轉移酶有效地N-糖基化的蛋白質。不同多糖的生物合成在細菌細胞中是保守的。多糖在載體脂質(carrier lipid)上從細胞質膜上的共同前體(活化糖核苷酸)由具有確定特異性的不同糖基轉移酶進行裝配。脂多糖(「LPS」)僅在革蘭氏陰性菌例如志賀氏菌(Shigella spp.)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)和大腸桿菌(E. coli) (ExPEC, EHEC)中提供。LPS的合成始於在膜的細胞質一側將單糖添加到載體脂質i^一異戊二烯基磷酸(undecaprenyl phosphate, 「Und-P-P」)上。通過不同糖基轉移酶序貫添加來自活化糖核苷酸的單糖構建抗原，而脂質-連接的多糖通過翻轉酶(flippase)穿過膜轉向。抗原-重複單位通過酶反應進行聚合。然後多糖通過連接酶(Ligase) WaaL轉移到脂質A，形成LPS，再輸出到表面，而莢膜多糖在聚合後從載體脂質中釋放出來並輸出到表面。這些多糖的生物合成途徑使得LPS生物綴合物能夠在體內(in vivo)產生，俘獲周質中的多糖到蛋白載體。寡糖或多糖(即糖殘基)和蛋白(即蛋白載體)的這類合成複合物可以用作綴合物疫苗以抵抗多種細菌感染。綴合物疫苗已經成功地用於抵抗細菌感染。抗原性多糖與蛋白載體的綴合需要保護性記憶應答，因為多糖是不依賴T-細胞的免疫原。利用多糖以及蛋白載體中的活化反應基團，通過不同的化學方法已經使多糖與蛋白載體綴合。綴合物疫苗可以給予兒童以抵抗細菌感染並且也可以給成年人提供長時間持續的免疫應答。WO 2009/104074 (Fernandez等人)的構建體已經發現在動物中產生IgG應答。在人類中，已經發現針對志賀氏菌屬0-特異性多糖-蛋白綴合物疫苗的IgG應答與人體內的免疫保護有關(PasswelI, J. H.等人，「Safety and Immunogenicity of ImprovedShigella 0-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines in Adults inIsrael (改進的志賀氏菌屬0-特異性多糖-蛋白綴合物疫苗在以色列成年人中的安全性和免疫原性)』』Infection and Immunity, 69 (3) : 1351-1357 (2001 年 3 月))。據信多糖(即糖殘基)觸發糖特異性的短期免疫應答。事實上，人體的免疫系統對細菌的特定多糖表面結構例如0-抗原和莢膜多糖會產生強烈應答。然而，由於對多糖的免疫應答是依賴IgM的，因此免疫系統不產生記憶。攜帶多糖的蛋白載體能觸發IgG應答，IgG應答是依賴T-細胞的並提供長時間持續的保護作用，因為免疫系統產生了記憶。大腸桿菌0157是一種引起溶血性尿毒症候群所有當前病例三分之二左右的腸出血性菌株並造成嚴重的人類健康擔憂(Law, D. (2000) J. App.Microbiol. , 88, 729-745; Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Tmmun. 66, 3545-3551)。大腸桿菌菌株0157 (Escherichia coli strain 0157)產生含有重複四糖單兀(4-N-乙酸基 perosamine —巖藻糖—葡萄糖—GalNAc) ( a -D-PerNAc- a -L-Fuc- ^ -D-GIc-a-D-GalNAc)的 0_ 抗原(Perry, M. B. , MacLean, L.和 Griffith, D. W. (1986) Biochem.Cell. Biol. ,64，21-28)。該四糖在i^一異戊二烯基焦磷酸上預裝配。大腸桿菌細胞被膜含有內眾膜即帶有應力的(stress-bearing)肽聚糖層和由磷質 內單層和外單層組成的不對稱外膜，這構成了細菌LPS。LPS含有脂質A錨形體、含有3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸的核心和0-抗原區三個組分(參見:Raetz, C. R. H.和Whitfield, C. (2002)Annu. Rev.Biochem. , 71, 635-700 ; Whitfield, C. (2006) Ann. Rev. Biochem. 75, 39-68 ; Samuel, G.和Reeves, P. R. (2003) Carbohydrate Research, 338，2503-2519;及其中關於細菌LPS 的 0_抗原裝配綜述的參考文獻)。細菌LPS的0-抗原組分是大的、極度多變的多糖，可以是同聚的，由單一重複單糖組成，或者雜聚的，含有3-6個糖單元的10-30個重複(Reeves, P. R. , Hobbs, M. , Valvano, M.A.，Skurnik，M.，Whitfield, C.，Coplin，D.，Kidoj N.，Klena，J.，Maskell，D.，Raetz,C.R.H.和 Rick，P.D. (1996)Trends Microbiol.，4，495-503)。因此，0-抗原是細菌細胞表面的主要特徵並構成毒力和致病性的重要決定因子(Law，D. (2000) J. App.Microbiol. , 88, 729-745; Spears, K. J. , Roe, A. J.和 Gaily, D.L. (2006) FEMS Microbiol.Lett.，255，187-202; Liu, B.，Knirel，Y. A.，Feng, L.，Perepelov, A. V.，Senchenkova, S.N.，Wang, Q.，Reeves, P. R.和 Wang，L (2008) FEMS Microbiol. Rev. 32，627-653 ; StenutZjR^WeintraubjA.和 Widmalm，G. (2006)FEMS Microbiol. Rev. 30，382-403) 已經鑑定出具有超過180個獨立0-血清型(屬於獨特的0-抗原結構)的大腸桿菌菌株(Stenutz, R. , ffeintraub, A.和 Widmalm, G. (2006)FEMS Microbiol. Rev. 30, 382-403) 0-抗原重複單位在與i^一異戊二烯基焦磷酸連接的內膜細胞溶質面上進行預裝配。脂質-連接的重複單位橫向地擴散(翻轉(flip-flop))到內膜的周質表面並在轉運到外膜和連接到LPS之前聚合。大多數雜聚合0-抗原重複單位在還原末端或者具有N-乙醯基葡萄糖胺(「GlcNAc」)或者具有N-乙醯基半乳糖胺(「GalNAc」)。已假定通過被WecA催化的GIcNAc-P或GalNAc-P從其相應的糖核苷酸衍生物轉移到十一異戊二烯基單磷酸(「Und-P」)上，啟動脂質中間體的生物合成(Samuel, G.和 Reeves, P. R. (2003)Carbohydrate Research, 338, 2503-2519 ; Alexander, D. C.和 Valvano, M. A. (1994) J. Bacteriol. , 176, 7079-7084; Zhang, L. , Radziejewska-Lebrecht, J. , Krajewska-Pietrasik,D.,Tolvanen,P.和Skurkik1M. (1997)Mol. Microbiol. 23, 63-76;Amor, P. A.和 Whitfield, C. (1997)Mol.Microbiol. 26(145-161) ;ffang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66，3545-3551)。雖然已經表徵了 WecA的GlcNAc-磷酸轉移酶活性的性質和特異性(Rush，J. S.，Rick, P. D.和ffaechter, C. J. (1997) Glycobiology, 7，315-322)，但是 WecA 催化 GalNAc-P-P-Und 合成的結論是基於遺傳學研究(Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66, 3545-3551)。這樣的較早遺傳學研究表明通過被WecA催化的GalNAc-P從UDP-GalNAc酶促轉移到Und-P上啟動脂質-連接的四糖中間體的生物合成(Wang, L.和Reeves, P. R. (1998) Infect.Immun. 66，3545-3551)。然而，沒有直接的酶學證據證明WecA利用UDP-GalNAc作為GalNAc-P 供體。此外，先前已提出大腸桿菌055 gne和gnel基因編碼UDP-GlcNAc 4_差向異構酶(Wang, L. , Huskic, S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和 Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184，2620-2625; Guo, H. , Yi, ff. , Li, L.和 Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res.Commun. , 356, 604-609)。先前的報導鑑定了分別來自大腸桿菌055 (Wang, L. , Huskic,S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和 Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625)和大腸桿菌 086(Guo，H.，Yi，W.，Li，L.和 Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res.Commun. , 356, 604-609)的兩個基因，分別為大腸桿菌055 gne和大腸桿菌086 gnel,它們與同一基因家族內的Z3206基因有100%同一性。因此，將會一直導致技術人員相信Z3206基因也編碼UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向異構酶。 發明簡述現在令人驚奇地發現，由大腸桿菌0157中的Z3206基因編碼的差向異構酶能催化在十一異戊二烯基焦磷酸上合成N-乙醯基半乳糖胺(「GalNAc」)的反應，從而啟動寡糖或多糖的形成。在一個方面，本發明涉及一種重組原核生物合成系統，其產生多糖的全部或一部分，包含在i^一異戊二烯基焦磷酸上合成GalNAc的差向異構酶。本發明進一步包括合成在還原末端具有GalNAc的多糖的全部或一部分的糖基轉移酶，並且再進一步包括合成在還原末端具有GalNAc的抗原性多糖的全部或一部分的糖基轉移酶。在另一個方面，本發明涉及在i^一異戊二烯基焦磷酸上產生GalNAc的差向異構酶，和在一個進一步方面，該差向異構酶由Z3206基因編碼。在一個另外的方面，本發明涉及用於產生N-糖基化蛋白的表達系統，包含編碼寡糖基轉移酶的核苷酸序列；編碼蛋白載體的核苷酸序列；來自至少一種細菌的至少一種寡糖或多糖基因簇；其中該多糖在還原末端含有GalNAc ;和編碼差向異構酶的核酸序列。在一個再進一步方面，本發明涉及一種包含Z3206基因的重組原核生物合成系統，該Z3206基因編碼將GlcNAc-P-P-Und轉變成GalNAc-P-P-Und的差向異構酶。在又一個另外的方面，本發明涉及一種包含大腸桿菌055 gne基因或大腸桿菌086 gnel基因的重組原核生物合成系統，該基因編碼將GlcNAc-P-P-Und轉變成GalNAc-P-P-Und的差向異構酶。在再一個方面，本發明涉及一種N-糖基化蛋白，其包含至少一種引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以為除脯氨酸以外的任何天然胺基酸，和在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的聚糖。在還另一個方面，本發明涉及一種生物綴合物疫苗，其包含具有至少一種引入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的N-糖基化蛋白，其中X和Z可以為除脯氨酸以外的任何天然胺基酸；在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的免疫原性聚糖；和佐劑。在一個另外的方面，本發明涉及在宿主細胞中產生N-聯糖基化蛋白的方法，該宿主細胞包含編碼由在還原末端含有GalNAc的至少一種細菌裝配至少一種寡糖或多糖的糖基轉移酶的核酸；編碼蛋白載體的核酸；編碼寡糖基轉移酶的核酸；和編碼差向異構酶的核酸。在一個進一步方面，本發明涉及生物合成系統和蛋白質在製備生物綴合物疫苗中的應用。在一個另外的方面，本發明涉及用於產生單糖、寡糖和多糖的方法，和在一個再進一步方面，本發明涉及用於產生抗原性聚糖和N-糖基化蛋白的方法。附圖簡述圖I顯示由來自大腸桿菌0157的膜部分合成[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P_Und的時程。將來自大腸桿菌菌株0157的膜部分與UDP-[3H]GlcNAc—起於37°C孵育指定時間。按實施例2中描述的方法提取[3H]脂質產物並測定[3H]G1cNAc摻入到[3H]GlcNAc-P-P-Und(O)和[3H]GalNAc-P-P-UncK )中。 圖2顯示由GlcNAc-P-P-Und形成GalNAc-P-P-Und的提出的生物合成途徑。圖3顯示由來自大腸桿菌菌株0157的膜部分合成[3H]GalNAc-P-P-Und的純化和表徵。將來自大腸桿菌0157的膜部分與UDP-[3H]GlcNAc —起孵育，並按實施例3中描述的方法純化[3H]GalNAc脂質。圖3A顯示在硼酸鹽浸潰的矽膠G (Quantum I)上經DEAE-纖維素純化後[3H]HexNAc脂質的製備型薄層層析圖。圖3B顯示從小圖A中製備板中回收後在硼酸鹽浸潰的矽膠G (Baker，Si250)上經純化的[3H]GalNAC-P-P_Und的薄層層析圖。圖3C顯示在圖3B中純化的[3H]GalNAc-P-P-Und經溫和的酸水解後回收的[3H]-氨基糖的下行紙層析圖(硼酸鹽浸潰的瓦特曼I號紙(Whatman No. Ipaper))。圖3D顯示用NaBH4還原來自圖3C的[3H]氨基糖產生的[3H] HexNAc-糖醇的下行紙層析圖(Whatman No. 3MM)。圖4顯示大腸桿菌21546細胞和大腸桿菌21546細胞在用pMLBAD:Z3206轉化後的代謝性標記。大腸桿菌21546(圖4A)和大腸桿菌21546:pMLBAD/Z3206(圖4B)用[3H]GlcNAc於37°C進行代謝性標記5分鐘。按實施例3中描述的方法提取[3H]G1cNAc/GalNAc-P-P-Und，使其不含水溶性汙染物後在硼酸鹽浸潰的矽膠板(Baker Si250)上通過薄層層析進行分離。使用Bioscan層析掃描儀檢測放射性脂質。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的層析位置用箭頭表示。圖5顯示由來自大腸桿菌菌株的膜部分與UDP-[3H]GlcNAc —起孵育形成的[3H]GlcNAc/GalNAc-P-P-Und的薄層層析圖。將來自大腸桿菌菌株K12 (圖5A)、0157 (圖5B)、21546(圖 5C)和 21546 :pMLBAD/Z3206(圖 5D)的膜部分與 UDP-[3H] GlcNAc 一起於 37。。孵育10分鐘，按實施例3中描述的方法提取[3H]脂質產物，通過分配使其不含水溶性汙染物，然後在硼酸鹽浸潰的矽膠板(Baker Si250)上通過薄層層析進行分離。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的層析位置用箭頭表示。圖6顯示GlcNAc-P與UMP孵育後的卸載(discharge)。將來自大腸桿菌21546:Z3206的膜部分與UDP_[3H]G1cNAc —起於37°C預孵育至將GlcNAc-P-P-Und酶標記10分鐘(圖6A)，然後與ImM UMP 一起進行第二個孵育期，包括或Imin (圖6B)或2min(圖6C)。在指定的孵育期後，按實施例3中描述的方法提取[3H]GlCNAC/GalNAC-P-P-Und，並在硼酸鹽浸潰的娃膠板(Baker Si250)上通過薄層層析進行解析。GalNAc-P-P-Und和GlcNAc-P-P-Und的層析位置用箭頭表示。
圖I顯示由來自表達Z3206的菌株21546的膜催化的外源[3H]GlcNAc-P-P_Und和[3H]GalNAc-P-P-Und轉變成直接有關的[3H=HexNAc-P-P-Und產物。將來自大腸桿菌菌株21546(圖7B和圖7E)和21546:pMLBAD/Z3206 (圖7C和圖7F)的膜部分與純化的[3H]GlcNAc-P-P-UncK 圖 7A,圖 7B 和圖 7C)或[3H] GalNAc-P-P-Und (圖 7D,圖 7E 和圖 7F 的分小圖)(在1%曲通X-100 (Triton X-100)中超聲處理進行分散)一起於37°C孵育I分鐘。按實施例3中描述的方法提取[3H]GlCNAC/GalNAC-P-P-Und，在硼酸鹽浸潰的矽膠板(BakerSi250)上通過薄層層析進行解析並用Bioscan AR2000放射性層析掃描儀進行檢測。圖8顯示未糖基化和糖基化AcrA蛋白的SDS-PAGE分析。由攜帶AcrA表達質粒和與pMLBAD: Z3206 (第I泳道)、pMLBAD: gne (第2泳道)或載體對照pMLBAD (第3泳道)互補的Pgl操縱子A gne的大腸桿菌DH5 a細胞製備的周質提取物用10%SDS_PAGE分離後轉移到硝化纖維素膜上。用抗AcrA抗血清檢測AcrA及其糖基化形式。顯示了對應於未糖基化(AcrA)和糖基化AcrA(gAcrA)的條帶位置。圖9顯示已經由Liu B等人鑑定的基因(Liu B等人，Structure and geneticsof Shigella 0 antigens (志賀氏菌0抗原的結構和遺傳學)FEMS MicrobiologyReview, 2008. 32:p. 27)。

圖10是顯示含有合成弗氏志賀氏菌6(S. flexneri 6) 0抗原所需基因的DNA區的方案。圖11顯示弗氏志賀氏菌6 0抗原在大腸桿菌中的表達。LPS通過銀染色或者通過轉移到硝化纖維素膜和通過抗弗氏志賀氏菌6的抗體檢測予以顯現。圖12顯示0抗原的HPLC。含有弗氏志賀氏菌-Z3206的大腸桿菌細胞(SCM3)、含有弗氏志賀氏菌+Z3206的大腸桿菌細胞(SCM3)或空大腸桿菌(SCM3)細胞的LLO分析。圖13顯示來自表達EPA、pglB和弗氏志賀氏菌60-抗原+/-Z3206的大腸桿菌細胞的經鎳純化的蛋白的蛋白質印跡圖。發明詳述本發明包括一種重組原核生物合成系統，其包含編碼差向異構酶的核酸，該差向異構酶合成在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的寡糖或多糖和在聚糖的還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的N-糖基化蛋白。術語「部分胺基酸序列」也稱為「最優化共有序列」或「共有序列」。最優化共有序列被寡糖基轉移酶(「0ST，」 「OTase」)進行N-糖基化，其效率比常規共有序列「N_X_S/T」
高得多。一般而言，術語「重組N-糖基化蛋白」是指在天然不包含所述蛋白編碼核酸的宿主細胞中產生的任何多肽或寡肽。在本發明的正文中，該術語是指在原核宿主細胞例如埃希氏菌(Escherichia spp.)、彎曲桿菌(Campylobacter spp.)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、志賀氏菌(Shigella spp.)、螺桿菌(Helicobacter spp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)中，和在進一步實施方案大腸桿菌(Escherichia coli)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等中重組產生的蛋白質，其中將所述蛋白編碼核酸導入到所述宿主細胞中並且其中所編碼的蛋白被OTase進行N-糖基化，所述轉移酶天然存在於或者被重組地導入到所述宿主細胞中。 根據胺基酸的國際上接受的單字母代碼，縮寫詞D、E、N、S和T分別表示天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、絲氨酸和蘇氨酸。根據本發明所述的蛋白質包含被引入到蛋白質並被N-糖基化的最優化共有序列D/E-X-N-Z-S/T中的一個或多個。因此，本發明的蛋白質不同於也含有該最優化共有序列但不包含任何額外的(引入的)最優化共有序列的天然存在的空腸彎曲桿菌N-糖蛋白。最優化共有序列的引入可以通過一個或多個胺基酸的添加、缺失和/或取代來完成。可通過化學合成策略(例如固相輔助的化學肽合成)完成一個或多個胺基酸的添加、缺失和/或取代以引入最優化共有序列，根據本發明，這項技術對於本領域技術人員來說是眾所周知的。對於較大的多肽來說可選和優選的是，根據本發明，可通過作為本領域標準技術的重組技術來製備本發明的蛋白質。本發明的蛋白質具有它們可以以高效和在任何宿主中產生的優點。在本發明的一個實施方案中，宿主包含來自彎曲桿菌、例如來自空腸彎曲桿菌的功能性Pgl操縱 子。在進一步實施方案中，來自彎曲桿菌並用於實施本發明的寡糖基轉移酶是來自大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)或海歐彎曲桿菌(Campylobacter lari)。根據本發明，寡糖基轉移酶對於本領域技術人員來說是顯而易見的。例如，寡糖基轉移酶公開於諸如以下的參考文獻中Szymanski, C. M.和 Wren, B. W. (2005) Protein glycosylationin bacterial mucosal pathogens (細菌黏膜病原體中的蛋白質糖基化)，Nat. Rev.Microbiol. 3:225-237。當所述原核宿主是彎曲桿菌，或者例如空腸彎曲桿菌時，功能性pgl操縱子可天然存在。然而，根據本領域之前所證明的及以上提及的，Pgl操縱子可以被轉移到細胞中並在所述新的細胞環境中仍保留有功能。術語「來自彎曲桿菌、優選空腸彎曲桿菌的功能性pgl操縱子」意指編碼彎曲桿菌、例如空腸彎曲桿菌的功能性寡糖基轉移酶(OTase)和能夠在脂質載體上裝配寡糖的一個或多個特異性糖基轉移酶的核酸簇，並且其中所述寡糖可以通過OTase從脂質載體轉移到具有一個或多個最優化胺基酸序列D/E-X N-Z-S/T的靶蛋白上。應當理解，術語「來自彎曲桿菌、優選空腸彎曲桿菌的功能性Pgl操縱子」在本發明的正文中不一定就是指作為一個轉錄單位的操縱子。該術語只是要求在一個宿主細胞中重組蛋白N-糖基化的功能性組分存在。這些組分可以轉錄成為一個或多個獨立的mRNA並且可以被一起或單獨地調節。例如，該術語也包括位於一個宿主細胞中基因組DNA和質粒上的功能性組分。為了效率，在一個實施方案中，功能性Pgl操縱子的所有組分都可以被同時調節和表達。寡糖基轉移酶，在有些實施方案中可來源於彎曲桿菌，而在其它實施方案中可來源於空腸彎曲桿菌。在另外的實施方案中，寡糖基轉移酶可來源於本領域技術人員已知的具有寡糖基轉移酶的其它生物體，例如沃林氏菌(Wolinella spp.)和真核生物。能夠在脂質載體上裝配寡糖的一個或多個特異性糖基轉移酶可來源於宿主細胞或被重組地引入到所述宿主細胞中，唯一的功能性限制是由所述糖基轉移酶裝配的寡糖可以通過OTase從脂質載體轉移到具有一個或多個最優化共有序列的靶蛋白上。因此，天然包含特異性糖基轉移酶的宿主細胞的選擇和/或替代所述宿主中天然存在的特異性糖基轉移酶以及異源特異性糖基轉移酶的引入都將能夠使本領域技術人員去改變與本發明蛋白質中的最優化N-糖基化共有位點結合的N-聚糖。根據以上結果，本發明提供本發明蛋白質上N-聚糖模式的個體設計。因此，所述蛋白在它們的N-聚糖模式上可以是個性化的以滿足生物學、藥學和純化的要求。
在本發明的實施方案中，所述蛋白可包含所述N-糖基化最優化胺基酸序列中的一個但也可不止一個，例如至少兩個、至少3個或至少5個。本發明蛋白質中一個或多個N-糖基化最優化胺基酸序列的存在可具有增加其免疫原性、增加其穩定性、影響其生物活性、延長其生物半壽期和/或使其純化簡化的優點。最優化共有序列在位置X和Z上可包括除脯氨酸以外的任何胺基酸。術語「任何胺基酸」意指包括常用和稀有天然胺基酸以及合成胺基酸衍生物和類似物，它們都將仍然允許最優化共有序列被OTase進行N-糖基化。天然存在的常用和稀有胺基酸對於X和Z是優選的。X和Z可以相同或不同。需要注意的是，對於根據本發明所述的蛋白質中的每個最優化共有序列，X和Z可以是不同的。可以通過特異性糖基轉移酶及其當在脂質載體上通過OTase進行轉移來裝配寡 糖時相互作用來決定與最優化共有序列結合的N-聚糖。根據本發明，本領域技術人員通過改變所需宿主細胞中存在的特異性糖基轉移酶的類型和數量將能夠設計出N-聚糖。本文所用的「單糖」是指一個糖殘基。「寡糖和多糖」是指兩個或更多個糖殘基。本文所用的術語「聚糖」是指單糖、寡糖或多糖。「N-聚糖」在本文中定義為蛋白質中通過N-糖苷鍵與天冬醯胺殘基的e-醯胺氮連接的可變組成的單糖、寡糖或多糖。在一個實施方案中，通過OTase轉移的N-聚糖在革蘭氏陰性或陽性細菌的細胞質膜中存在的十一異戊烯醇焦磷酸(「Und-P-P」)脂質-錨形體上進行裝配。它們參與0抗原、0多糖和肽聚糖的合成(Bugg,T.D.和 Brandish, P. E. (1994). From peptidoglycan to glycoproteins: commonfeatures of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis (從妝聚糖到糖蛋白月旨質連接的寡糖生物合成的共同特徵).FEMS Microbiol Lett 119, 255-262;Valvano, M.A. (2003). Export of 0-specific lipopolysaccharide (0_ 特異性脂多糖的輸出) FrontBiosci 8，s452-471)。進行了多項研究以決定脂質連接的重複四糖(4-N-乙醯基perosamine —巖藻糖一葡萄糖一GalNAc)的生物合成是否是通過WecA形成GalNAc-P-P-Und啟動的。當來自大腸桿菌菌株K12、0157和PR4019 ( 一種WecA-過量表達菌株)的膜部分與UDP_[3H]GalNAc 一起孵育時，既未檢測到[3H]GlcNAc-P-P-Und也未檢測到[3H]GalNAc-P-P-Und的酶促合成。然而，當來自菌株0157的膜部分與UDP-[3H]GlcNAc—起孵育時，觀察到兩種酶標記的產物具有[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und的化學和層析特性，證實菌株0157含有能夠使GlcNAc-P-P-Und和GalNAc-P-P-Und相互轉變的差向異構酶。當外源[3H]GlcNAc-P-P-Und與來自菌株0157的膜一起孵育時，外源[3H]GlcNAc-P-P-Und被轉變成[3H]GalNAc-P-P-Und也證實了差向異構酶的存在。當菌株0157用[3H]G1cNAc進行代謝性標記時，[3H]GlcNAc-P-P-Und和[3H]GalNAc-P-P-Und兩者都被檢出。用Z3206基因轉化大腸桿菌菌株21546能夠使這些細胞在體內(in vivo)和體外(in vitro)合成GalNAc-P-P-Und。當來自菌株0157的膜與外源[3H]GalNAc-P-P-Und —起孵育時重新形成[3H]GlcNAc-P-P-Und，證明了差向異構酶反應的可逆性。在空腸彎曲桿菌N-糖基化系統在大腸桿菌中的表達中，Z3206不能代償gne基因的損失，表明它沒有作為UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc差向異構酶起作用。基於這些結果，證實了在大腸桿菌0157中，GalNAc-P-P-Und通過GlcNAc-P-P-Und差向異構酶可逆地合成後通過WecA形成GlcNAc-P-P-Und0對大腸桿菌0157 0-抗原亞基裝配的起始反應進行研究證實GalNAc-P-P-Und合成是被有些先前未知的機制而不是被WecA催化的。本文給出的證據說明在大腸桿菌0157中，GalNAc-P-P-Und不是由WecA催化的GalNAc-P從UDP-GalNAc轉移合成的，而是由Z3206基因編碼的差向異構酶催化的GlcNAc-P-P-Und的4-0H可逆差向異構化合成的。因此，本發明包括用於裝配重要的細菌細胞表面組分的一種新的生物合成途徑以及用於合成GalNAc-P-P-Und的一種新的生物合成途徑。本發明的一個進一步實施方案包括作為抗微生物劑新靶標的細菌差向異構酶。大腸桿菌0157合成具有重複四糖結構(4-N-乙醯基perosamine —巖藻糖一葡萄糖一GalNAc)的0-抗原。本文說明了脂質連接的四糖中間體的生物合成不是通過由WecA催化的GalNAc-P從UDP-GalNAc酶促轉移到Und-P而啟動的，這與較早的遺傳學研究正好相反(Wang, L.和 Reeves, P. R. (1998) Infect. Immun. 66, 3545-3551)。本文描述的發明是通過同源性檢索獲得後再通過遺傳學、酶學和代謝性標記實驗的結果來驗證的，證明WecA沒 有利用UDP-GalNAc作為底物，而是需要WecA來合成GlcNAc-P-P-Und，然後通過菌株0157中Z3206基因編碼的差向異構酶將其可逆地轉變成GalNAc-P-P-Und。本發明的Z3206基因屬於產生在其還原末端含有GalNAc殘基的表面0_抗原重複單位的幾個菌株中存在的基因家族(表I)。Z3206基因序列示於SEQ ID N0:1。先前的報導鑑定了分別來自大腸桿菌 055 (Wang, L. , Huskic, S. , Cisterne, A. , Rothemund, D.和Reeves, P. R. (2002) J. Bacteriol. 184，2620-2625)和大腸桿菌 086 (Guo, H.，Yi, ff.，Li, L.和 Wang, P. G. (2007)Biochem. Biophys. Res. Comm. , 356, 604-609)的兩個基因即大腸桿菌055gne和大腸桿菌086 gnel，這兩個基因與Z3206基因有100%同一性(表I)。大腸桿菌055gne基因序列顯示為SEQ ID NO:3，而大腸桿菌086 gnel基因序列顯示為SEQ ID N0:5。表IZ3206基因在表達在還原末端具有GalNAc的0_抗原鏈的細菌菌株中的相關性
權利要求
1.一種重組N-糖基化蛋白，其包含 引入的共有序列D/E - X - N - Z - S/T中的一個或多個，其中X和Z可以為除脯氨酸以外的任何天然胺基酸；和 在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的聚糖，其與至少所述一個或多個引入的共有序列通過N-糖苷鍵連接。
2.權利要求I的重組N-糖基化蛋白，其中所述蛋白是銅綠假單胞菌胞外蛋白。
3.權利要求I的重組N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含來自革蘭氏陰性菌的寡糖或多糖。
4.權利要求3的重組N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌。
5.權利要求4的重組N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌6。
6.權利要求I的重組N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含以下結構
7.權利要求3的重組N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌。
8.權利要求7的重組N-糖基化蛋白，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌0157。
9.權利要求I的重組N-糖基化蛋白，其中所述聚糖包含寡糖或多糖，其包含結構a-D-PerNAc- a -L-Fuc-β -D-Glc- a -D-GalNAc0
10.一種生物綴合物疫苗，其包含權利要求I的重組N-糖基化蛋白和佐劑。
11.一種重組原核生物合成系統，其包含編碼以下酶和蛋白的核酸 在i^一異戊二烯基焦磷酸上合成N-乙醯基半乳糖胺的差向異構酶； 在脂質載體上裝配寡糖或多糖的糖基轉移酶； 寡糖基轉移酶；和 包含引入的共有序列D/E -X-N-Z- S/T中的一個或多個的蛋白，其中X和Z可以為除脯氨酸以外的任何天然胺基酸。
12.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中編碼差向異構酶的所述核酸包含SEQID NO. I。
13.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖基轉移酶是來自空腸彎曲桿菌。
14.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中所述蛋白是銅綠假單胞菌胞外蛋白。
15.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖是來自革蘭氏陰性菌。
16.權利要求15的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌。
17.權利要求16的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌6。
18.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖包含以下結構
19.權利要求15的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌。
20.權利要求19的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌 0157。
21.權利要求11的重組原核生物合成系統，其中所述寡糖或多糖包含結構a-D-PerNAC-a -L-Fuc-β -D-Glc- a -D-GalNAc0
22.—種產生N-聯糖基化蛋白的方法，包括 a.)將編碼i.) iv.)的核酸導入宿主生物中 i.)在i^一異戊二烯基焦磷酸上合成N-乙醯基半乳糖胺的差向異構酶； ii.)在脂質載體上裝配寡糖或多糖的糖基轉移酶； iii.)寡糖基轉移酶；和 iv.)包含引入的共有序列D/E-X-N-Z- S/T中的一個或多個的蛋白質，其中X和Z可以為除脯氨酸以外的任何天然胺基酸；和 b.)培養所述宿主生物直到至少一種N-糖基化蛋白產生。
23.權利要求22的方法，其中編碼差向異構酶的所述核酸包含SEQID NO. I。
24.權利要求22的方法，其中所述寡糖基轉移酶是來自空腸彎曲桿菌。
25.權利要求22的方法，其中所述蛋白是銅綠假單胞菌胞外蛋白。
26.權利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖是來自革蘭氏陰性菌。
27.權利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌。
28.權利要求27的方法，其中所述寡糖或多糖是來自弗氏志賀氏菌6。
29.權利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含以下結構
30.權利要求26的方法，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌。
31.權利要求30的方法，其中所述寡糖或多糖是來自大腸桿菌0157。
32.權利要求22的方法，其中所述寡糖或多糖包含結構a-D-PerNAc- a -L-Fuc- β -D-Glc-a -D-GalNAc。
全文摘要
本發明涉及包含N-糖基化蛋白的生物綴合物疫苗。此外，本發明涉及一種重組原核生物合成系統，包含編碼差向異構酶的核酸，該差向異構酶合成在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的寡糖或多糖。本發明還涉及含有在還原末端具有N-乙醯基半乳糖胺的寡糖或多糖的N-糖基化蛋白及用於產生這類N-糖基化蛋白的表達系統和方法。
文檔編號C07K1/00GK102724997SQ201080061239
公開日2012年10月10日 申請日期2010年11月16日 優先權日2009年11月19日
發明者M·瓦克, 查爾斯·韋克特 申請人:格林考瓦因有限公司