桄榔植物蛋白酶的製作方法

2023-09-15 02:56:35 1

專利名稱：桄榔植物蛋白酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物中提取的新蛋白酶種及其提取方法。
酶是生物催化劑。根據酶的來源，可分為動物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶三類。植物蛋白酶由於資源豐富，不需要採用象微生物發酵培養之類的複雜工藝，因而受到重視。植物蛋白酶是植物組織中含有的天然物質。可以應用到食品、製革、洗滌及醫藥工業之類的許多領域。植物蛋白酶常常按習慣以植物「屬」命名。已經提取形成生產的植物蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、劍麻蛋白酶等。
眾所周知，不同的植物蛋白酶，具有不同的性質。因而開發新的植物蛋白酶種，就可以擴大用途。如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和劍麻蛋白酶活性最適PH範圍在中性，三種酶室溫下在50%乙醇中失活。
本發明的目的在於採用非常規的植物蛋白酶提取方法，提取新的，具有耐乙醇和高PH值的植物蛋白酶。
本發明採用無機鹽沉澱法(提取粗酶)和高PH去雜離子交換法(提取精酶)從棕櫚科(Palmaceae)桄榔屬(Areaga)砂糖椰子(Areaga Pinnata、又名桄榔)植物中提取桄榔蛋白酶的工藝過程順序包括採用砂糖椰子做原料→榨取汁液→硫酸銨去除雜蛋白、沉澱→乾燥為粗酶 (透析)/ 用鹼調PH9.5左右沉降→DE52層析→冷凍乾燥為精酶製劑。
本發明工藝過程所採用的砂糖椰子植物包括其莖、果柄、果皮和果肉。但以果肉的含酶量最高。在成熟度不同的果實中，又以果實充分長大，但又未成熟變軟時的酶得率最多且活性最高。
本發明工藝過程用硫酸銨去除雜蛋白和沉澱時，先用25～35%飽和度硫酸銨加入榨取的桄榔汁液中去除雜蛋白，然後上清補足50%飽和硫酸銨取其沉澱。
本發明工藝過程採用鹼調節PH時。所用的鹼可是氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化銨、銨水。但最好是用氫氧化鈉將經透析的粗酶調PH至9.5左右。
本發明工藝過程所採用DE52層析。也可用CM52、22、QAE25、50等柱取代進行分離，但分離效果不如DE52。
本發明經DE52柱層析酶能分離9個在280nm處有吸收的蛋白峰，其中2、4、5峰有活性。第5蛋白峰為主要活性成份。經等電聚焦鑑定DE52柱層析成份5。證實DE52層析的酶製劑較純，等電點在PH3.99左右。將對應等電為PH3.99的位置上切下的膠體進入系統測活，顯示該蛋白帶有活性，證明該蛋白帶確是蛋白酶。用SPS電泳證明酶的分子量為4.4萬道爾頓。
採用本發明方法所得到的桄榔蛋白酶，除具有一般的巰基蛋白酶性質外，還表現出以下特性(1)桄榔蛋白酶比菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶的巰基試劑耐受力要高出兩個數量級。5×10-3mol的Na2S4O6和10-3mol的DFP、PMSF對它的活性無影響;(2)桄榔蛋白酶極耐鹼，在PH9.6-11之間有最高活性，PH13時酶活性還有PH7時的1/3;(3)桄榔蛋白酶在50～75%的乙醇(30分鐘)內都顯示出幾乎最高活性。桄榔蛋白酶的以上特性，顯示了它在生物工程中作為工具的前景。
實施例1剝取充分長大的桄榔果實的果肉100克壓榨得57ml汁液，邊攪拌邊加入60ml40%飽和度的硫酸銨溶液。靜置12小時後離心(4000轉/分)取出上清液，在攪拌下加放固體硫酸銨，使溶液達50%硫酸銨飽和度。靜置12小時，離心(10000轉/分)取沉澱。加PH9.3的NaOH溶液溶解沉澱，試液用透析膜透析除鹽。再用NaOH調已透析後的試液為PH9.3，離心(10000轉/分)，取上清液用DE52柱層析分離。取層析成分5冷凍乾燥成精酶0.37克、活力485萬紫外單位/克。
實施例2柱層析前的操作同實施例1。取上清液用CM52柱層析分離，取層析成分1，冰冷乾燥成精酶0.52克、活力為293萬紫外單位/克。
實施例3製備過程按實施例1。將冷凍乾燥改成50℃熱風乾燥，得精酶0.35克，活力為308萬紫外單位/克。
實施例4-7取砂糖椰子的莖、果實柄、果皮、果肉各1000克，分別榨取汁液，用酪蛋白法直接測汁液活性，結果見表1。
表1
實施例8-10將不同成熟度砂糖椰子果實採收後洗淨剝取果肉。各稱取1000克，分別榨取汁液後照實施例1提取粗酶方法，按所得汁液比例加入硫酸銨提取粗酶，並用酪蛋白法測定各自活性。結果見表2。
表2
實施例11-14桄榔酶與現有技術木瓜酶對乙醇耐受性的比較。
將本發明實施例1所得到的精酶用不同濃度的乙醇配製成酶液(1∶10000)。並以木瓜酶作對照40℃預熱15分鐘後進入測定系統(用酪蛋白法測定蛋白酶水解活性)。表3列出了桄榔酶對不同濃度乙醇在不同作用時間下的耐受性。
表權利要求
1.一種植物蛋白酶。其特徵在於從砂糖椰子(ArengaPinnata)提取的桄榔蛋白酶有耐鹼、耐乙醇、耐Na2S4S6以及二異丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺醯氟(PMSF)的特性。
2.按權利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特徵在於它在PH9.5-11之間有最高活性，PH13時活性還有PH7時的1/3。
3.按權利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特徵在於它在75%濃度以內的乙醇中保持原有的活性。
4.按權利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特徵在於5×10-3mol的Na2S4O6對它無影響。
5.按權利要求1所述的桄榔植物蛋白酶，其特徵在於10-3mol的DFP、PMSF對它無影響。
6.提取桄榔植物蛋白酶的方法，其特徵在於採用砂糖椰子植物作原料，按下列步驟進行砂糖椰子植物→榨汁→沉澱去雜→乾燥 (透析)/ 用鹼調PH沉降→層析→乾燥→成品。
7.按權利要求6所述的提取步驟，其特徵在於是採用砂糖椰子的莖、果柄、果皮和果肉作原料，最好是用果肉。
8.按權利要求6、7所述的提取步驟，其特徵在於所用的是已充分長大，但又未成熟變軟的果實的果肉。
9.按權利要求6所述的提取步驟，其特徵在於用25～35%飽和度硫酸銨加入汁液去雜，然後上清補足約50%飽和硫酸銨取沉澱。
10.按權利要求6所述的提取步驟，其特徵在於用氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氫氧化銨、銨水調PH至9.5左右沉降。
11.按權利要求6所述的提取步驟，其特徵在於用DE52柱層析分離效果最好。
全文摘要
本發明涉及一種從植物中提取的新蛋白酶種及其提取方法。採用砂糖椰子植物作原料，用無機鹽沉澱法提取粗酶。經離子交換法提取精酶。所提取的桄榔植物蛋白酶具有耐Na
文檔編號C12N9/50GK1066468SQ91103150
公開日1992年11月25日 申請日期1991年5月9日 優先權日1991年5月9日
發明者葉啟騰, 陳強, 李春香 申請人:廣西亞熱帶作物研究所