從組織祖細胞和血管祖細胞從頭形成和再生血管化組織的製作方法

2023-06-13 12:38:16 1

專利名稱：：從組織祖細胞和血管祖細胞從頭形成和再生血管化組織的製作方法
技術領域：
：本發明整體上涉及從組織祖細胞和血管祖細胞從頭形成和再生血管化組織。
背景技術：
：對於用於創傷重建、慢性疾病、腫瘤移除和先天性異常的組織移植的臨床需求是大量的。目前的外科程序依賴於自體移植、同種異體移植、異種移植或合成材料。外科和科研團體已經廣泛認識到了與目前臨床程序相關的缺陷。大於100-200|um的組織裝配需要經灌注的血管床以供給營養物以及清除廢物、代謝中間產物和分泌物的事實限制了臨床上可移植的三維工程(engineered)組織或器官的發展。考慮到血管發育是複雜的事件，其涉及各種各樣的細胞類型以及許多不同的生長因素，成熟的功能性血管網絡已經難以建造。在胚胎發育的過程中，內皮細胞形成管並結合形成初級毛細血管叢，該過程被稱作血管生成。新血管是通過現有的血管分裂成兩半或者通過從現有血管中萌發而形成的。在被稱作血管成熟化的過程中，這種初級網絡被改型和修剪以形成不同的微循環單位包括毛細管、動脈以及靜脈。次優的血管生成仍然是組織工程的重要障礙，特別是對於重要尺寸組織缺陷。之前血管生成工程的途徑依賴血管生成生長因子的釋放或血管類似物的製造。然而，對於大組織移植物一直存在對生長因子遞送的成本、潛在毒性、次優吻合和內皮遷移緩慢的關心。可以從單一的骨髓樣品中分離兩種幹細胞的亞組間充質幹細胞(MSC)和造血幹細胞(HSC)。MSC能夠分化成幾乎全部的結締組織譜系細胞。HSC分化成內皮細胞，連同原本的血細胞一起對於血管化組織的形成是必要的。因此，存在對工程血管化組織構建體(contruct)的組合物，以及其生產方法的需求。發明概述本文公開了新的方法，其針對通過組織祖細胞和血管祖細胞的組合作用的血管化組織工程。使用所公開的組合物和方法生產的血管化組織組件(module)可以用於多種臨床應用中。在某些方面中，本發明涉及血管化組織組件。在多種配置中，組織組件包括生物相容性基質、組織祖細胞和血管祖細胞。祖細胞可以被引入(例如通過同時或依次注射、內鏡檢查術或輸注)到基質材料的生物相容性支架內或其上。本發明的另一方面提供了一種形成血管化組織組件的方法。這些方法包括提供生物相容性基質，並向該基質引入組織祖細胞和血管祖細胞。4吏用本領域中公知的方法例如通過注射、內鏡;險查術或輸注，祖細胞可以被遞送到生物相容性基質內或其上。在多種配置中，遞送可以是同時或者依次的。這些方法還進一步包括孵育含有組織和血管祖細胞的基質。在某些配置中，在孵育過程中，可以發生組織形態形成和/或細胞分化。這種孵育可以至少部分在體外，基本上在體外，至少部分在體內或者基本上在體內。在某些配置中，可以至少部分離體7(exvivo)形成組件，而在一些其他的配置中，生物相容性基質、組織祖細胞和血管祖細胞中的至少一種對於期待的受體例如需要治療進行組織修復或置換的人而言是異源的。在多個方面中，組織祖細胞可以是間充質幹細胞(MSC)、MSC衍生細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經元細胞、心肌細胞、神經膠質細胞、施旺細胞(Schwanncell)、上皮細胞、真皮成纖維細胞、間質成纖維細胞、齒齦成纖維細胞、牙周成纖維細胞、顱縫成纖維細胞、腱細胞(tenocyte)、韌帶成纖維細胞、尿道細胞、肝細胞、骨膜細胞、P-胰島細胞或其組合。在某些配置中，優選組織祖細胞可以是MSC、MSC衍生細胞或其組合。在多個方面中，血管祖細胞可以是造血幹細胞(HSC)、HSC衍生內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、內皮細胞譜系、原代培養內皮細胞、衍生自幹細胞的內皮細胞、骨髓衍生幹細胞、脊索血衍生細胞(cordbloodderivedcell)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、淋巴腺內皮細胞、內皮祖細胞、分化成內皮細胞的幹細胞、來自胚胎幹細胞的血管祖細胞、來自脂肪組織或牙周組織或牙髓的內皮細胞，優選HSC或HSC衍生的內皮細胞。在多個方面中，基質可以包含材料例如纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、瓊脂糖、藻酸鹽、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚已內酯、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白(marineadhesiveprotein)、氰基丙烯酸酯、高分子水凝月交、類似物或其組合。在某些優選的配置中，基質材料可以是高分子水凝膠。在多個方面中，基質可以包含至少一個大通道和/或微通道。在某些實施方式中，多個大通道可以具有至少大約O.lmm至最高達大約50mm的平均直徑。例如，大通道可以具有下列平均直徑大約0.2mm、大約0.3mm、大約0.4mm、大約0.5mm、大約0.6mm、大約0.7mm、大約0.8mm、大約0.9mm、大約l.Omm、大約l.lmm、大約1.2mm、大約1.3mm、大約1.4mm、大約1.5mm、大約1.6mm、大約1.7mm、大約1.8mm、大約1.9mm、大約2.0mm、大約2.5mm、大約3.0mm、大約3.5mm、大約4.0mm、大約4.5mm、大約5.0mm、大約5.5mm、大約6.0mm、大約6.5mm、大約7.0mm、大約7.5mm、大約8.0mm、大約8.5mm、大約9.0mm、大約9.5mm、大約10mm、大約15mm、大約20mm、大約25mm、大約30mm、大約35mm、大約40mm或者大約45mm。在多個方面中，基質可以包含至少一種生長因子，優選血管生成生長因子，更優選bFGF、VEGF、PDGF、IGF、TGFb或其組合。祖細胞，其密度為總共大約0.5x100萬個祖細胞(M)ml"大約100Mmr1。例如，在多種配置中，組織組件可以含有下列密度的祖細胞大約lMmr1、5Mml-1、10Mmr1、15Mml-1、20Mml-1、25Mml-1、30Mmr1、35Mml-1、40Mml-1、45Mml"1、50Mml-1、55Mmr1、60Mml-1、65Mml—1、70Mmr1、75Mmr1、80Mml-1、85Mml"、90Mmr1、95Mml"或100Mml人在某些配置中，組織組件可以含有密度為大約0.0001x100萬個細胞(M)ml^大約1000Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為大約1Mml"至最高達大約100Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約5Mml"至最高達大約95Mmr1的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約10Mml"至最高達大約90Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約15MmK1至最高達大約85Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約20Mml"至最高達大約80Mm1—1的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約25Mml"至最高達大約75Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約30Mml"至最高達大約70Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約35Mml"至最高達大約65Mmr1的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約40Mml"至最高達大約60Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約45Mmr1至最高達大約55Mmr1的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約45Mml"至最高達大約50Mml"的祖細胞。在某些配置中，組織組件可以含有密度為至少大約50Mml"至最高達大約55Mml"的^且細月包。在多個方面中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約100:1至最高達大約1:100。例如血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或者1:20。在某些配置中，血管祖細胞與組織-且細胞的比例可以為大約20:1至最高達大約1:20。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為19:1大約1:19。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約18:1大約1:18。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約17:1大約1:17。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約16:1大約1:16。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約15:1大約1:15。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約14:1大約1:14。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約13:1大約1:13。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約12:1大約1:12。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約11:1大約1:11。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約10:1大約1:10。在某些配置中，血管^L細胞與組織;f且細胞的比例可以為大約9:1~大約1:9。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細月包的比例可以為大約。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約8:1大約1:8。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約7:1大約1:7。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約6:1大約1:6。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約5:1大約1:5。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約4:1大約1:4。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約3:1大約1:3。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約。在某些配置中，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以為大約2:1大約1:2。本發明的另一個方面提供了治療組織或器官缺陷的方法。在多種配置中，這些方法包括將本發明的組織組件移植到有此需要的個體中。本發明進一步的一個方面提供了鑑定調控組織血管化的候選分子10的方法。這類方法包括形成本發明的組織組件；將基質、組織祖細胞、血管祖細胞、其組合或組織組件與候選分子接觸；測量工程組織組合物的血管化；以及測定相對於未與候選分子接觸的對照，是否候選分子調控工程組織組合物(engineeredtissuecomposition)中血管的形成。在某些配置中，可以在將基質與祖細胞組合之前，在將細胞接種在基質上之後但在發生血管形態形成之前，或者在開始血管化之後，將候選分子與基質、組織祖細胞或血管祖細胞接觸。正如本文所使用的，調控組織血管化可以包括與對照相比，提高血管化或者降低血管化。其他的目的和特徵將一部分清楚，一部分被指出。本領域技術人員能夠理解下面所描述的附圖僅僅是為了說明的目的。這些附圖不以任何方式限制本發明的範圍。圖l是一系列組織切片圖，其顯示了人間充質幹細胞(hMSC)分化成成骨細胞。圖1A代表從從多個人供體之一製備的骨髓樣品，其顯示了大量的細胞。圖1B代表hMSC從貼壁細胞群擴增培養成紡錘型細胞。圖1C代表在成骨分化培養基中處理的MSC,其顯示對鹼性磷酸酶的陽性染色。圖1D代表MSC衍生成骨細胞，根據馮庫薩(vonKossa)染色所顯示的，其產生了礦化結節。比例標尺(scalebar):100(im。在實施例1中提供了關於該方法的進一步細節。圖2是一系列圖，其顯示來自衍生於人間充質幹細胞(hMSC)的上皮細胞以及成骨細胞的工程骨構建體。圖2A代表衍生自hMSC的成骨細胞被接種到磷酸三鈣的孔內(TCP:淡紅色)。在4。C下，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)擴增並接種到基膜水凝膠中，在水相中的Matrigel,並被輸注到僅TCP的孔內，接著在37。C下Matrigel凝膠化。圖2B顯示在體內植入免疫缺陷小鼠背部中之後獲得的樣品中TCP區域內的類骨組織(B)的面積。圖2C代表使用H&E染色的切片，其顯示形成被圓形細胞所圍繞的腔。如果將HUVEC均勻地接種在含水的Matrigel中，則在該構建體內腔和原始血管樣(PV)結構的形成中存在明顯的所接種HUVEC的重建。圖2D代表使用更高放大倍數的馮庫薩染色，其顯示在TCP周圍礦化組織島。比例標尺100pm。在實施例1中提供了關於該方法的進一步細節。圖3是一系列圖和柱狀圖，其顯示造血幹細胞朝著工程血管化骨分化成內皮細胞。圖3A代表所分離的骨髓、CD34+、非貼壁細胞被鋪在塗覆纖連蛋白的細胞培養聚苯乙烯平板上。儘管這些細胞是與圖1所示的MSC分離自相同的骨髓，但HSC的形態是圓形的，而圖1B中的MSC是紡錘形的。圖3B代表在培養兩周後形成集落。圖3C顯示通過將形成集落的HSC接種在Matrigel內，在未結合的細胞之間所形成的管狀結構。圖3D顯示正如Ac-LDL螢光的細月包內定位所證明的，對乙醯化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的陽性標記。圖3E顯示HSC衍生內皮類細胞還表達一種天然內皮細胞的標記物-馮威勒布蘭特因子(vonWillebrandFactor)(vWF):圖3F證明HSC衍生內皮類細胞產生比對照細胞(成纖維細胞)(右柱)顯著多的vWF(左柱)。在實施例2中提供了關於該方法的進一步細節。圖4是一系列草圖，其顯示PEG水凝膠的結構。圖4A代表僅有PEG水凝膠，沒有bFGF或大通道。圖4B代表PEG水凝膠，具有在光聚合之後形成的3個大通道(直徑lmm),但沒有bFGF。圖4C代表PEG水凝膠，其在光聚合之後裝載溶液中的10ug/mlbFGF,但沒有大通道。圖4D代表PEG水凝膠，其具有10ug/mlbFGF加上大通道。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖5是一系列照片，其描繪收穫體內植入的樣品。圖5A顯示所收穫的PEG水凝膠、其沒有細胞、bFGF或通道，顯示了沒有宏觀宿主組織侵入。圖5B顯示所收穫的具有3個大通道(均為直徑lmm)的PEG水凝膠，其顯示宿主組織在工程大通道的腔中向內生長。圖5C顯示所收穫的負載bFGF但沒有大通道的PEG水凝膠，其顯示整體為紅色。圖5D顯示所收穫的具有bFGF和大通道而這的PEG水凝膠，其顯示整體為紅色，並且宿主組織在3個工程大通道的腔中向內生長。比例標尺6mm。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖6是一系列圖，其顯示在體內植入3周後使用H&E染色的PEG水凝膠樣品。圖6A代表不具有bFGF和大通道PEG水凝膠(H),其顯示沒有宿主細胞侵入。圖6B代表宿主組織，其生長在具有3個大通道(C箭頭)的PEG水凝膠(H)中。注意在PEG中大通道以外的部分沒有宿主細胞滲透。圖6C描述了負載bFGF但沒有通道的PEG水凝膠(H),其顯示明顯隨機的宿主組織滲透。圖6D代表宿主組織滲透；這種滲透僅發生在bFGF-浸透的PEG水凝膠的大通道內。儘管圖6C和圖6D中bFGF的劑量相同，但具有大通道的負載bFGF的PEG(圖6D)誘導了大量的宿主細胞向內生長。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖7是柱狀圖，其顯示通過計算機組織形態計量向內生長的宿主組織的量。在負載bFGF的PEG水凝膠的大通道中向內生長的宿主組織的量比沒有bFGF的PEG水凝膠的大通道中宿主組織的量顯著地大。每組N二8。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖8是一系列圖片，其描繪在PEG水凝膠中向內生長的宿主組織的H&E染色。圖8A代表具有大通道，但沒有bFGG的PEG水凝膠，其顯示宿主組織僅在大通道內向內生長。箭頭表示血管。圖8B代表更高功率的圖8A,其顯示被內皮細胞類細胞排成的血管樣結構(白色箭頭)，並被成纖維細胞類細胞圍繞。圖8C代表PEG水凝膠(H),負載bFGF但沒有大通道，其顯示很少向內生長的宿主組織，被內皮細胞類細胞排成的血管樣結構(黑色箭頭)。圖8D代表更高功率的圖8C。圖8E代表具有bFGF和大通道的PEG水凝膠，其顯示以高密度血管樣結構向內生長的緊密宿主組織(黑色箭頭)。圖8F代表圖8E的更高功率圖片，其顯示具有類似血紅細胞的大血管樣結構(白色箭頭)，並由內皮細胞類細胞排成。成纖維細胞類細胞圍繞血管樣結構。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖9是一系列圖，其描繪使用抗-VEGF抗體染色的免疫定位組織切片。圖9A代表PEG水凝膠(H),其不具有bFGF和大通道，其顯示除了宿主纖維嚢(C)外缺少VEGF陽性組織。圖9B代表PEG水凝膠，具有3個大通道但不具有bFGF,其顯示大通道內宿主組織的強VEGF染色。圖9C代表PEG水凝膠(H)，負載bFGF但沒有大通道，其顯示以明顯隨機的方式的VEGF陽性組織。圖9D代表PEG水凝膠(H),具有bFGF和大通道，其顯示在大通道內宿主組織的強VEGF染色。來自Stosich等人(2006)。在實施例3中提供了關於該方法的進一步細節。圖10是一系列草圖，其描繪細胞密度實驗的實驗安排。人間充質幹細胞(MSC)、MSC-衍生成骨細胞(MSC-Ob)和MSC衍生軟骨細胞(MSC-Cy)。對於每種細胞譜系，在PEG水凝膠中封裝四種細胞密度每毫升細胞懸浮液0、500萬、4000萬和8000萬個細胞。OS培養基骨生成刺激培養基，其含有地塞米松(dexamethosone)、抗壞血酸和b-甘油磷酸。CS培養基軟骨生成培養基，其含有TGFb3。圖IOA代表人MSC,沒有分化成任何細胞譜系。圖10B代表人MSC衍生的成骨細胞。圖IOC代表人MSC衍生的軟骨細胞。在每種情況中，以3D培養的細胞被胰蛋白酶處理並加載到細胞懸浮液中。接著將懸浮的細胞加載到PEG水凝膠的水相中，接著進行光聚合併形成凝膠。對於每種條件(A、B和C)，獲得了封裝MSC、MSC-Ob和MSC-Cy的凝膠化構建體用於進一步的體外和體內研究。來自Troken和Mao(2006)。在實施例4中提供了關於該方法的進一步細節。圖ll是一系列圖，其描繪在體外培養4周後，各種細胞密度的組織觀察。上排在DMEM中培養的沒有分化的對照或MSC。中排在成骨培養基中培養的MSC-成骨細胞(MSC-Ob)。下排在成軟骨培養基中培養的MSC衍生的軟骨細胞(MSC-Cy)。5M細胞/mL-每毫升細胞懸浮液500萬個細胞。最左列代表無細胞PEG水凝膠。下一列代表每毫升500萬個細胞的起始細胞接種密度，接著是每毫升4000萬個細胞，最右列是每毫升8000萬個細胞。對於每種細胞諳系，在體外孵育中保持起始細胞接種密度4星期。來自Troken和Mao(2006)。在實施例4中提供了關於該方法的進一步細節。圖12是一系列圖，其描繪描繪在體外培養4星期後PEG水凝膠的番紅O染色，其中PEG水凝膠封裝人間充質幹細胞(MSC)(圖13A-13D)和MSC衍生軟骨細胞(MSC-Cy)(圖13A'-13D')。最左列代表無細胞PEG水凝膠。下一列代表每毫升500萬個細胞的起始細胞接種密度，接著是每毫升5000萬個細胞，最右列是每毫升8000萬個細胞。陽性的番紅O染色顯示了與起始細胞接種密度有關的標記面積。MSC是番紅O染色陰性。起始細胞接種密度連同PEG水凝膠中分化的成軟骨表型被維持。來自Troken和Mao(2006)。在實施例4中提供了關於該方法的進一步糹田節。圖13是一系列圖，其描繪在體外培養4星期後PEG水凝膠的馮庫薩染色，其中PEG水凝膠封裝人間充質幹細胞(MSC)(圖14A-14D)和MSC衍生成骨細胞(MSC-Ob)(圖14A'-14D')。最左列代表無細胞PEG水凝膠。下一列代表每毫升500萬個細胞的起始細胞接種密度，接著是每毫升4000萬個細胞，最右列是每毫升8000萬個細胞。馮庫薩染色是陽性，並且顯示了與起始細胞接種密度有關的標記面積。MSC是馮庫薩染色陰性的。這暗示在沒有加入下排的成骨刺激物時，MSC沒有分化成成骨細胞。起始細胞封裝密度連同PEG水凝膠中分化的成骨表型一皮維持。來自Troken和Mao(2006)。在實施例4中提供了關於該方法的進一步細節。圖14是一對柱狀圖，其顯示MSC衍生軟骨細胞和MSC衍生成骨細胞基質形成的定量。圖14A代表在4星期體內植入之後佔整個支架面積的Alcian藍色總面積。MSC衍生軟骨細胞(MSC-Cy)合成了比hMSC和HMSC衍生成骨細胞(hMSC-Ob)多的GAG。圖14B代表佔整個支架面積的馮庫薩染色總面積。MSC-Ob誘導比hMSC和HMSC-Cy顯著多的礦化。每組N二8。來自Troken和Mao(2006)。在實施例4中提供了關於該方法的進一步細節。圖15是一系列草圖，其描繪PEG水凝膠的結構和相應的4星期後所植入水凝膠的免疫組織化學圖。圖15A描繪PEG水凝膠，具有大通道但沒有bFGF。圖15B描繪PEG水凝膠，具有bFGF但沒有大通道。圖15C描繪PEG水凝膠，具有大通道和bFGF。圖15A'是所植入圖15A的PEG水凝膠的免疫組織化學組織圖片。圖15B'是所植入圖15B的PEG水凝膠的免疫組織化學組織圖片。圖15C'是所植入圖15C的PEG水凝膠的免疫組織化學組織圖片。在實施例20中提供了關於該方法的進一步細節。圖16是一系列圖，其描繪人間充質幹細胞在35天離體培養過程中在體外分化成生脂細胞。使用油紅O染色，hMSC衍生的生脂細胞與其反應陽性。圖16A-16E代表沒有生脂細胞分化的hMSC,而圖16F-16J代表hMSC衍生的生脂細胞。在實施例21-22中提供了關於該方法的進一步細節。圖17是一系列柱狀圖，其顯示經過35天在hMSC和hMSC衍生的生脂細胞之間培養物樣品的總DNA含量(圖17A),以及hMSC和hMSC衍生的生脂細胞樣品的甘油含量(圖17B)。在實施例22中提供了關於該方法的進一步細節。圖18是一系列草圖和圖片，其描繪封裝在PEG水凝膠內的hMSC和hMSC衍生的生脂細胞在植入4星期後血管化生成脂肪。圖18A描繪PEG水凝膠，不具有大通道，不具有bFGF,沒有細胞遞送。圖18B描繪PEG水凝膠，具有大通道，具有bFGF,但沒有細胞遞送。圖18C描繪PEG水凝膠，其具有大通道，具有bFGF,並遞送hMSC-脂肪細胞。圖19A，、19B，和19C，分別是圖19A、19B和19C的PEG水凝膠在植入小鼠12星期後的照片。在實施例23中提供了關於該方法的進一步細節。圖19是一系列圖，其描繪經染色的組織切片，其中封裝hMSC衍生的生脂細胞的具有大通道的PEG微通道水凝膠被植入12個星期。圖19A是免疫組織化學染色的組織。圖19B是被油紅0(Oil-red0)染色陽性的組織。圖19C是被抗VEGF抗體染色的組織。圖19D是被抗WGA植物凝血素抗體染色的組織。在實施例23中提供了關於該方法的進一步細節。圖20是一系列圖，其顯示血管祖細胞中血管內皮生長因子2或Flkl的表達。在實施例24中提供了關於該方法的進一步細節。圖21是柱狀圖，其顯示血管祖細胞中VEGF2的定量。在實施例24中提供了關於該方法的進一步細節。圖22是圖片，其顯示在(3TCP支架中被綠色螢光蛋白(GFP)標記的骨祖細胞和一皮紅色CM-DiI標記的血管祖細胞。在實施例25中提供了關於該方法的進一步細節。發明詳述本文所描述的途徑是至少部分基於通過應用造血幹細胞和間充質幹細胞的聯合作用形成血管化組織的發現以進行組織工程。本文所證明的是在與組織祖細胞和血管祖細胞組合時，高分子生物材料的血管化。還證明了當被引入到含有組織祖細胞的多孔支架內或其上時，血管祖細胞會在體內誘導血管樣結構。進一步證明了在基質材料中物理內置的大通道和/或血管生成生長因子在體內誘導宿主衍生的血管生成和血管化。因此，提供了一種通過血管祖細胞和組織祖細胞二者的協同作用彌補組織缺陷的新型再生途徑，以便總效果可以大於各自效果的和。這些途徑受益於本文所公開的關於在從頭形成血管化組織或器官中血管祖細胞(例如HSC)、組織祖細胞(例如MSC)以及它們的細胞譜系衍生物與調控血管生成生長因子之間的相互作用的新理解。作為例子，本文所公開的組合物和方法能夠提供生物上有活力的工程硬組織組件用於修復長骨缺陷例如節段性缺陷，在生物衍生全關節置換術中的軟骨下骨再生，以及骨髓置換。作為另一個例子，本文所描述的組合物和方法能夠提供生物上有活力的工程軟脂肪組織，用於修復由於外傷、腫瘤切除術和先天性異常所引起的軟組織缺陷。本發明的一個方面提供了工程血管化組織或器官的組合物。這些組合物通常包括被引入到生物相容性基質內或其上的組織祖細胞和血管祖細胞。本發明的另一個方面提供了用於形成這些工程血管化組織或器官的方法。根據這些用於組織工程和組織再生的方法，組織祖細胞和血管祖細胞被引入到生物相容性基質內或其上，以產生血管化組織或器官。進一步的方面提供了通過將本發明的組合物移植到有此需要的個體內來治療組織缺陷的方法。生物上有活力的組織或器官能夠從具有提高血管化的組織祖細胞通過使用血管祖細胞而被建造。根據本文所公開的方法能夠形成的血管化組織或器官類型包括但不限於膀胱，骨，腦，乳房，骨軟骨連接處，神經組織包括中樞神經系統、脊髓和外周神經、神經膠質，食道，輸卵管，心臟，胰腺，腸，膽嚢，腎，肝，肺，卵巢，前列腺，脊髓，脾，骨骼肌，皮膚，胃，睪丸，胸腺，曱狀腺，氣管，泌尿生殖道，輸尿管，尿道，間質軟組織，骨膜，牙周組織，顱縫，毛嚢，口腔黏膜和子宮。通過本發明的方法所形成的優選軟組織組合物是工程血管化脂肪組織。通過本發明的方法所形成的優選硬組織組合物是工程血管化骨組織。組織通常是具有相似形態和功能的細胞的集合體，並且通常得到具有多種細胞類型和血液供給的異源間質組織的支持。通常器官是發揮生物功能的組織的集合體。器官可以是但不限於膀胱、腦、神經組織、神經膠質組織、食道、輸卵管、骨、滑液關節(synovialjoint)、顱縫、心臟、胰腺、腸、膽嚢、腎、肝、肺、卵巢、前列腺、脊髓、脾、胃、睪丸、胸腺、曱狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、子宮、乳房、骨骼肌、皮膚、骨和軟骨。可以使用本領域技術人員已知的標準方法檢驗器官的生物功能。輸注和培養為了形成本發明的組合物，將組織祖細胞和血管祖細胞引入(例如植入、注射、輸注或接種)到能夠支持三維組織或器官形成的人工結構(例如包含基質材料的支架)內或其上。可以將組織祖細胞和血管祖細胞同時或依次引入。可以將組織祖細胞和血管祖細胞引入到相互之間相同的空間位置、類似的空間位置或者不同的空間位置。優選，組織祖細胞和血管祖細胞被引入到基質材料的不同區域內或其上。預期可以將多種類型的組織祖細胞引入到基質內。類似的，預期可以將多種類型的血管祖細胞引入到基質內。可以通過多種本領域已知的手段將組織祖細胞和/或血管祖細胞引入到基質材料中(參見例如實施例1;實施例4;實施例11;實施例12;實施例20,實施例23)。用於將祖細胞引入(例如輸注、接種、注射等)到基質材料內或其內的方法在例如Ma和Elisseeff,ed.(2005)ScaffoldingInTissueEngineering,CRCISBN1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866中被討論。例如，通過包括具有細胞懸浮液(例如，濃度為100個細胞/ml幾百萬個細胞/ml)的水合凍千支架的方法，祖細胞可以被引入到基質內或其上。加入額外試劑的方法會如下所討論而有變化。培養和分化支架(scaffold)內或支架上的祖細胞是本領域中公知的(參見例如Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X;Vunjak-Novakovic和Freshney,eds.(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss，ISBN0471629359;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。正如本領域技術人員能夠理解的，將一且細胞引入到基質內或其上與移植所得到的基質之間的時間可以根據特定的應用而變化。孵育(以及後續複製和/或分化)在基質材料中或其上含有組織祖細胞和血管祖細胞的工程組合物可以是例如至少部分在體外，基本上在體外，至少部分在體內，或者基本上在體內。確定最佳的培養時間屬於本領域的技能。可以使用適當的培養基用於體外祖細胞輸注、分化或細胞分化轉移(參見例如Vunjak-Novakovic和Freshney，eds.(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss，ISBN0471629359;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。培養時間可以在大約l小時、幾小時、一天、幾天、一星期、或幾星期內變化。可以通過例如利用ELISA的形態學、通過蛋白質檢驗、通過遺傳檢驗、通過機械分析、通過RT-PCR和/或通過免疫染色篩選細胞類型特異性標記物來對基質中存在的細胞的量和類型進行鑑定(參見例如Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。正如在本文所描述的，在某些實施方式中，通過將組織祖細胞和血管祖細胞引入到基質材料內或其上，形成工程血管化組織或器官，而不需要使用額外的生物活性劑，特別是生長因子等。不存在生長因子時形成工程血管化組織的能力提供了傳統工藝在組織工程中所不具有的優點。血管化在導致組合物血管化的條件下，發生將組織祖細胞和血管祖細胞引入到基質材料內或其上。優選，血管組織在整個工程組織或器官內生長。可以在體外(參見例如實施例2;實施例22)、體內(參見例如實施例1;實施例3)或其組合，在組織工程或器官中產生血管化。例如，可以通過培養支架基質細胞內的組織祖細胞和血管祖細胞來進行分化。作為另一個例子，祖細胞可以被輸注到基質內，並迅速將這種基質移植到個體內，使得在體內發生分化。何時將工程組織或器官引入個體的確定可以至少部分基於在組織或器官中所形成血管化的量。用於測量組織工程或器官中血管生成的方法是本領域中標準的(參見例如Jain等人(2002)Nat.Rev.Cancer2:266-276;Ferrara,ed.(2006)Angiogenesis,CRC,ISBN0849328446)。在早期血管形成過程中，在發育過程中，不成熟的血管通過具有相對大的直徑和缺少血管形態分化而類似於血管叢。隨著時間的過去，不成熟的血管生成血管的網狀模式逐漸成熟為功能性微循環單位，其發育成具有分化的細動脈和小靜脈的密集毛細管網。可以通過例如測量無分支血管節段的19數目(每單位面積內節段的數目)、功能性血管密度(每單位面積灌注血管的總長度)、血管直徑或血管體積密度(根據每個節段的長度和直徑所計算的，每單位面積血管總體積)。官提高的血管化。例如，與不是通過本文所描述的引入血管祖細胞和組織祖細胞二者所形成的相應工程組織或器官相比，工程組織或器官中的血管形成(例如血管生成、血管發生、形成不成熟的血管網絡、血管改型、血管穩定化、血管成熟化、血管分化或功能性血管網絡的建立)可以被提高至少5%、10%、20%、25%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%甚至多達100%、150%或200%。優選，工程組織或器官組合物的血管化是穩定的血管網絡，其可以存在至少l天、2天、3天、4天、5天、6天、l星期、2星期、3星期、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或者甚至12個月或更長。優選地，工程組織或器官組合物的血管網絡被通過引入而整合到組織、器官或個體的循環系統。對於使用小支架(尺寸小於100立方毫米)的組織或器官再生，可以體外手動改變培養基，並定時(例如每3~4天)加入額外試劑。對於大支架，可以將培養保持在例如生物反應器系統中，所述生物反應器系統可以使用微型泵用於改變培養基。可以將微型泵設置在孵育器內，將新鮮的培養基泵向支架的基質材料。培養基循環回收，並通過如此，基質可以具有大約1%~大約100%的新鮮培養基。泵速可以被調節以達到培養基和/或培養基中所包含額外試劑的最佳分配。可以根據所製造的組織或器官的類型定製培養基遞送系統。優選，在無菌條件下進行所有培養。^且細月包本發明的組合物和方法採用組織祖細胞和血管祖細胞二者。這些細胞可以是通過本領域中已知的各種方法分離、純化和/或培養的(參見例如實施例9;實施例21)。用於分離和培養祖細胞的方法:f皮討論在例^口Vunjak-Novakovic禾口Freshney(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss,ISBN0471629359中。在某些方面中，祖細胞可以衍生自與意欲移植的受體相同或不同的物種。例如，祖細胞可以書f生自動物包括]旦不限於脊推動物例如哺乳動物、爬4亍動物或鳥。杜呆g曰。直甲，1凡迅P用孑L初物孰馬矢疋J^、亇、判、狗、千、諸或雞，最優選人。本發明的組織祖細胞包括能夠分化成目標組織或器官和/或經歷形態形成以形成目標組織或器官的細胞。組織祖細胞的非限制性例子包括間充質幹細胞(MSC),從MSC分化的細胞，成骨細胞，軟骨細胞，肌細胞，脂肪細胞，神經元細胞，神經元支持細胞例如神經膠質細胞(例如施旺細胞)，成纖維細胞細胞例如間質成纖維細胞、腱成纖維細胞(tendonfibroblasts真皮成纖維細胞、韌帶成纖維細胞、牙周成纖維細胞例如齒齦成纖維細胞、盧貞面成纖維細胞，心肌細胞，上皮細胞，肝細胞，尿道細胞，腎細胞，骨膜細胞，膀胱細胞，(3-胰島細胞，成牙質細胞，牙髓細胞，牙周細胞，肺細胞和心臟細胞。例如，在本發明的血管化骨組織中，引入到基質中的組織祖細胞可以是能夠產生骨組織的祖細胞例如間充質幹細胞(MSC)、MSC成骨細胞或MSC軟骨細胞。需要理解，MSC軟骨細胞是從MSC分化的軟骨細胞。類似的，MSC成骨細胞是成骨細胞MSC成骨細胞。在另一個例子中，本發明的血管化脂肪組織中，引入到基質中的組織祖細胞可以是能夠產生脂肪組織的祖細胞，例如MSC或MSC生脂細胞(即從MSC分化的生脂細胞)。引入到基質材料內或其上的血管祖細胞是能夠分化成或以其他方式形成血管組織的祖細胞。血管祖細胞可以是例如能夠分化成內皮細胞的幹細胞例如造血幹細胞(HSC)、HSC內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、內皮細胞譜系、原代培養內皮細胞、衍生自幹細胞的內皮細胞、骨髓衍生幹細胞、脊索血衍生細胞、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、淋巴腺內皮細胞、內皮祖細胞、內皮細胞譜系、體外從幹細胞產生的內皮細胞、從脂肪組織提取的內皮細胞、平滑肌細胞、間質成纖維細胞、肌成纖維細胞、牙周組織、牙髓或血管衍生細胞。需要理解，HSC內皮細胞是從HSC分化的內皮細胞。能夠從例如骨髓、軟組織、肌肉、血液和/或血管系統分離血管祖細胞。在某些配置中，血管祖細胞可以衍生自組織祖細月包。本發明包括優化組織祖細胞和血管祖細胞二者(以及它們的譜系衍生物)的密度以便使得血管化組織或器官的再生結果最大化的方法(參見例如實施例4;實施例5;實施例6)。在這些方法中，可以監控隨基質中經過一段時間以及在終點的細胞密度。可以確定組織的性質，例如使用本領域技術人員已知的標準技術，例如組織學、結構分析、免疫組織化學、生化分析和機械性能。正如本領域技術人員能夠認識到的，組織祖細胞和/或血管祖細胞的細胞密度會根據例如祖細胞類型、組織或器官類型、基質材料、基質體積、輸注方法、接種模式、培養基、生長因子、孵育時間、孵育條件等而變化。通常，對於組織祖細胞和血管祖細胞二者，基質中每種細胞的細胞密度可以獨立地為0.0001x1(^個細胞(M)ml"大約1000Mmr1。例如，組織祖細胞和血管祖細胞均可以以下列密度在基質中存在大約0.001Mmr1、0.01Mmr1、0.1Mml-1、1Mml"、5Mml—1、10Mml—1、15Mmr1、20Mml-1、25Mml"、30Mml1、35Mml"、40Mmr1、45Mmr1、50Mmr1、55Mmr1、60Mml-1、65Mmr1、70Mml-1、75Mmr1、80Mml-1、85Mmr1、90Mml-1、95Mml"、100Mml"、200Mml.1、300Mmr1、400Mml-1、500Mml"、600Mmr1、700Mmr1、800Mml"或900Mml.1。可以以各種比例將血管祖細胞和組織祖細胞引入到基質內或其上(參見實施例5)。正如本領域技術人員能夠理解的，血管祖細胞與組織祖細胞的細胞比例能夠根據例如祖細胞類型、目標組織或器官類型、基質材料、基質體積、輸注方法、接種模式、培養基、生長因子、孵育時間和/或孵育條件等而變化。通常，血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以是大約100:1大約1:100。例如血管祖細胞與組織祖細胞的比例可以是大約20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在某些實施方式中，帔引入基質的祖細胞可以包括異源核酸以便表達生物活性分子例如異源蛋白或用於過表達異源蛋白。在非限制性的例子中，被引入基質的祖細胞能夠表達螢光蛋白標記物，例如GFP,EGFP,BFP,CFP,YFP或RFP。在另一個例子中，被引入基質的祖細胞能夠表達血管生成相關因子例如激活素A、腎上腺髓質素、aFGF、ALK1、ALK5、ANF、血管生成素、血管形成素-1、血管形成素-2、血管形成素-3、血管形成素-4、血管生長抑制因子、血管趨向素、血管緊張素-2、AtT20-ECGF、(3細胞素、bFGF、B61、bFGF誘導活性、4丐粘素、CAM-RF、cGMP類似物、ChDI、CLAF、claudins、膠原、膠原受體a]Pi和ot2p!、連接蛋白、Cox-2、ECDGF(內皮細胞衍生生長因子)、ECG、ECI、EDM、EGF、EMAP、endoglin、內皮素、內皮抑制素、內皮細胞生長抑制劑、內皮細胞活力維持因子、內皮分化鞘糖G蛋白偶聯受體-l(EDGl)、ephrms、Epo、HGF、TNF-a、TGF-P、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8、生長激素、纖維蛋白片段E、FGF-5、纖維連接蛋白和纖維連接蛋白受體a5(3i、因子X、HB-EGF、HBNF、HGF、HUAF、血管細胞擴增的心臟衍生抑制劑、IFN-y、IL1、IGF-2IFN-y、整合素受體(例^口a亞基(例i口ai、a2、a3、ou、ot5、a6、0c7、as、0c9、oce、ay、ociib、aL、aM、ax)的各種組合、K-FGF、LIF、平滑肌瘤衍生生長因子、MCP-1、巨噬細胞衍生生長因子、單核細胞衍生生長因子、MD-ECI、MECIF、mmP2、mmP3、mmP9、尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑、神經氈蛋白(NRP1、NRP2)、neurothelin、一氧化氮供體、一氧化氮合成酶(NOS)、notch、閉合蛋白、帶狀閉合蛋白、制瘤素M、PDGF、PDGF-B、PDGF受體、PDGFR隱p、PD-ECGF、PAI-2、PD-ECGF、PF4、P1GF、PKR1、PKR2、PPAR-y、PPAR-y配體、磷酸二酯酶、催乳激素、環前列腺素、蛋白質S、平滑肌細胞衍生生長因子、平滑肌細胞衍生遷移因子、鞘氨醇-l-磷酸-l(SlPl)、Syk、SLP76、速激肽、TGF-(3、Tie1、Tie2、TGF-(3和TGF-(3受體、TIMP、TNF-a、TNF-(3、轉鐵蛋白、血小板反應素、尿激酶、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF、VEGF164、VEGI、EG-VEGF、VEGF受體、PF4、催乳激素的16kDa片段、前列腺素E1和E2、類固醇、肝素、l-丁醯甘油(單丁酸甘油酯)或尼克醯胺。作為另一個例子，被引入基質的祖細胞可以含有遺傳序列，其降低或消除宿主中的免疫應答(例如通過抑制細胞表面抗原例如I類和II類組織兼容性抗原的表達)。在某些實施方式中，除了第一組織祖細胞和第一血管祖細胞外，還可以將一種或者多種細胞類型引入到基質材料中或其上。這些額外的細胞類型可以選自上面所討論的，並且/或者可以包括(但不限於)皮膚細胞、肝細胞、心臟細胞、腎細胞、胰腺細胞、肺細胞、膀胱細胞、胃細胞、腸細胞、泌尿生殖道細胞、乳房細胞、骨骼肌細胞、皮膚細胞、骨細胞、軟骨細胞、角化細胞、肝細胞、胃腸細胞、上皮細胞、內皮細胞、乳腺細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、軟組織細胞、破骨細胞或軟骨細胞。可以在基質血管化之前，過程中，或之後引入這些細胞類型。這種引入可以發生在體外或者體內。如果在體內引入這些細胞，則引入可以在工程血管化組織或器官組合物的位點，或者與其無關的位點。施用這些細胞的示例性路線包括注射和手術植入。基質本發明的組合物和方法採用基質，向其中或其上引入祖細胞，以便形成組織或器官構建體。這些基質材料能夠允許細胞附著並遷移；遞送和保留細胞和生化因子；實現細胞營養物和所表達產物的擴散；和/或發揮某些機械和生物學影響以改變細胞期的行為。通常，基質是生物兼容材料的多孔微孔支架，其提供物理支持和粘附基材用於在體外培養和後續體內植入過程中引入血管祖細胞和組織祖細胞。優選，具有高多孔性和適當孔徑大小的基質，以促進引入細胞和在整個結構中擴散細胞和營養物。基質的生物可降解性也是優選的，因為周圍組織對基質的吸收能夠避免對手術除去的需要。降解發生的速度需要與組織或器官形成的速度儘可能一致。因此，當細胞在構建體圍繞它們的自身天然結構時，基質能夠提供結構的整體性，並最終分解而留下新生組織，新形成的組織或器官，其能夠呈現機械負載。可注射性在某些臨床應用中也是優選的。適當的基質材料被描述在例如Ma和Elisseeff,ed.(2005)ScaffoldinginTissueEngineering,CRC,ISBN1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X中。基質結構能夠以來待修復或產生的組織或器官，但優選基質是柔軟的、生物兼容的多孔模板，其允許血管和目標組織或器官生長。基質可以被製造成結構支持物，其中該結構的布局(例如形狀、大小、多孔性、微通道或大通道)被根據應用而定製。基質的多孔性是一種設計參數，其影響細胞引入和/或細胞滲透。基質能夠被設計成採用影響細胞粘附和在基質中遷移的細胞外基質蛋白質。基質可以由合成聚合物形成。這些合成聚合物包括但不限於聚氨酯、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白(marineadhesiveprotein)和氰基丙烯酸酯或類似物或上述的混合物、組合和衍生物。可替換的，成。這些聚合物包括但不限於瓊脂糖、藻酸鹽、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、膠原、凝膠、透明質酸和其他適當的聚合物和生物聚合物或上述的類似物、混合物、組合和衍生物。同樣，基質可以從天然存在的生物聚合物和合成聚合物的混合物形成。基質材料基質可以包括例如膠原凝膠、聚乙烯醇海綿、聚(D,L-丙交酯_共聚_乙交酯)纖維基質、聚乳糖(polyglactin)纖維、藻酸鈣凝膠、聚乙醇酸網、聚酯(例如聚(L-乳酸)或聚酐)、多糖(例如藻酸鹽)、聚磷腈或聚丙烯酸酯或聚環氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。基質可以從蛋白質(例如胞外基質蛋白例如纖維蛋白、膠原和纖維連接蛋白)、聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)或透明質酸形成。也可以使用合成的聚合物，其包括生物可侵蝕聚合物(例如聚(丙交酯)、聚(乙醇酸)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(己內酯)、聚碳酸酯、聚醯胺、聚酐、聚胺基酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯)、可降解聚氨酯、不可侵蝕的聚合物(例如聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯聚合物和其他醯基取代的醋酸纖維素和其衍生物)、不可侵蝕的聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯代磺化聚烯烴、聚環氧乙烷、聚乙烯醇、teflon和尼龍。基質還可以含有酶、離子、生長因子和/或生物試劑的一種或者多種。例如基質可以含有生長因子(例如血管生成生長因子或組織特異性生長因子)。可以以大約0~1000ng/mL的濃度提供這類生長因子。例如生長因子可以以大約100700ng/mL的濃度，以大約200-400ng/mL的濃度，或者以大約250ng/mL的濃度存在。基質可以含有一個或者多個物理通道。這些物理通道包括微通道和大通道。微通道通常具有大約O.l^m大約1,000]im的直徑。正如本文所顯示的，基質大通道可以促進血管生成和骨或脂肪組織形成，以及引導血管化和宿主細胞入侵的發生(參見例如實施例3;實施例20;實施例23)。微通道和/或大通道可以是某些基質材料天然存在的部件和/或基質材料中特異構建體的部件。微通道和/或大通道的形成可以是根據例如機械和/或化學手段。大通道可以在基質內延伸多種深度，或者完全穿過基質。大通道可以是多種直徑的。通常可以根據提高的灌注優化、組織生長和組織組件的血管化來選擇大通道的直徑。大通道可以具有例如大約0.1mm大約50mm的平均直徑。例如，大通道可以具有下列的平均直徑大約0.2mm、大約0.3mm、大約0.4mm、大約0.5mm、大約0.6mm、大約0.7mm、大約0.8mm、大約0.9mm、大約l.Omm、大約l.lmm、大約1.2mm、大約1.3mm、大約1.4mm、大約1.5mm、大約1.6mm、大約1.7mm、大約1.8mm、大約1.9mm、大約2.0mm、大約2.5mm、大約3.0mm、大約3.5mm、大約4.0mm、大約4.5mm、大約5.0mm、大約5.5mm、大約6.0mm、大約6.5mm、大約7.0mm、大約7.5mm、大約8.0mm、大約8.5mm、大約9.0mm、大約9.5mm、大約10mm、大約15mm、大約20rnm、大約25mm、大約30mm、大約35mm、大約40mm或者大約45mm。本領技術人員能夠理解，大通道直徑的分布可以是正態直徑分布，或者非正態直徑分布。力口入的藥物和/或診斷劑在某些實施方式中，本發明的方法和組合物還包括其他試劑，連同組織祖細胞和血管祖細胞被引入到基質內或其上。可以引入的各種實際包括但不限於生物活性分子、生物藥物、診斷試劑和增強劑。基質還可以含有生物活性分子。基質的細胞可以被遺傳改造以表達生物活性分子，或者可以將生物活性分子加入到基質中。也可以在存在生物活性分子時培養基質。可以在將祖細胞引入到基質之前，過程中，或之後加入生物活性分子。生物活性分子的非限制性離子包括激活素A、腎上腺髓質素、aFGF、ALK1、ALK5、ANF,血管生成素、血管形成素-1、血管形成素-2、血管形成素-3、血管形成素-4、血管生長抑制因子、血管趨向素、血管緊張素-2、AtT20-ECGF、p細胞素、bFGF、B61、bFGF誘導活性、《丐粘素、CAM-RF、cGMP類似物、ChDI、CLAF、claudins、膠原、膠原受體od(3！和ot2^、連接蛋白、Cox-2、ECDGF(內皮細胞書f生生長因子)、ECG、ECI、EDM、EGF、EMAP、endoglin、內皮素、內皮抑制素、內皮細胞生長抑制劑、內皮細胞活力維持因子、內皮分化鞘糖G蛋白偶聯受體-l(EDGl)、ephrins、Epo、HGF、TNF-a、TGF-P、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8、生長激素、纖維蛋白片段E、FGF-5、纖維連接蛋白、纖維連接蛋白受體a5^、因子X、HB-EGF、HBNF、HGF、HUAF、血管細胞擴增的心臟衍生抑制劑、IFN-y、IL1、IGF-2IFN-y、整合素受體(例如a亞基(例如a!、a2、a3、a4、a5、a6、otx)和(3亞基(例如&、(32、(33、p4、(35、(36、(37和(38)的各種組合)，K-FGF、LIF、平滑肌瘤衍生生長因子，MCP-1、巨噬細胞衍生生長因子、單核細胞衍生生長因子，MD-ECI、MECIF、mmP2、mmP3、mmP9、尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑、神經氈蛋白(NRP1、NRP2)、neurothelin、一氧化氮供體、一氧化氮合成酶(NOS)、notch、閉合蛋白、帶狀閉合蛋白、制瘤素M、PDGF、PDGF-B、PDGF受體、PDGFR-p、PD-ECGF、PAI陽2、PD-ECGF、PF4、P1GF、PKR1、PKR2、PPAR-y、PPAR-y配體、磷酸二酯酶、催乳激素、環前&1日盒去恭添c:尿；界日n.膾義:+AA向4亞《界Ein/t;茶^麼陽/j/jaj^/g、、_33nz"、i,。"〃ui'j_j--j_>、Hj，i,fg"'"少w"lji<(j~h子、鞘氨醇-l-磷酸-l(SlPl)、Syk、SLP76、速激肽、TGF-(3、Tiel、Tie2、TGF-p受體、TIMP、TNF-a、TNF-(3、轉鐵蛋白、血小板反應素、尿激酶、VEGF-A.VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF、VEGF164、VEGI、EG-VEGF、VEGF受體、PF4、催乳激素的16kDa片段、前列腺素E1和E2、類固醇、肝素、l-丁醯甘油(單丁酸甘油酯)和尼克醯胺。在其他優選的實施方式中，基質含有化學治療劑或免疫調節分子。這些製劑和分子是本領域技術人員已知的。優選，基質含有bFGF、VEGF或PDGF或者他們的某些組合(參見實施例3;實施例7)。可以根據生長因子的控制釋放調節工程組織移植物中的HSC-和MSC衍生血管生成。作為內皮細胞異常高滲透性的結果，工程血管組織可以是"漏的"。可以通過在植入體內的HSC-和MSC衍生血管化組織移植物的微嚢化遞送血管生成生長因子而增強HSC內皮細胞的成熟。可以加入到本發明組合物的生物藥物包括免疫調節劑和其他生物應答修飾劑。生物應答修飾劑通常包括參與修飾生物應答例如免疫應答或組織或器官生長和修復的生物分子(例如肽，肽片斷，多糖，脂質，抗體)，其以一種增強特定期望治療的方法，例如細菌細胞的細胞裂解，或組織或器官特異性細胞的生長，或者血管化。生物藥物也可以直接引入到基質組分中。本領域技術人員能夠理解或者能夠容易確定其他可以作為適當非生物藥物和生物藥物的物質。本發明的組合物也可以被修飾以引入診斷試劑，例如射線透不過的試劑。這些試劑的存在使得醫生能夠監控內部發生的傷口修復的進展。這些化合物包括硫酸鋇，以及各種含有碘的有機化合物。後者化合物的例子包括硤醋胺酸，硤膽胺，硤沙酸葡曱胺，碘番酸以及泛影葡胺鈉。可以在本發明的組合物中使用的其他造影劑可以被本領域技術人員容易確定，並且可以包括使用放射性標記的脂肪酸或其類似物。組合物中試劑的濃度將根據化合物的性質，生理作用和期望的治療或診斷效果而變化。治療有效量通常是顯示期望的效果而沒有不適當的毒性的充分的治療試劑濃度。診斷有效量通常是能夠有效監控組織移植物的整合而使潛在的毒性最小化的診斷試劑的濃度。無論如何，本領域技術人員都容易確定特定化合物在特定情況中的期望濃度。基質組合物可以通過使用補充物例如人血清白蛋白(HSA)、羥乙基澱粉、右旋糖苷或其組合而得到強化或增強。也可以通過加入非變性非離子去汙劑例如聚山梨醇酯80來增強基質組合物的溶解度。用於或者能夠不需要過多實驗而容易確定的。基質組合物也可以被通過使用可選擇的穩定劑或溶劑而被進一步增強。適當使用這些將是本領域技術人員已知的，或者能夠不需要過多實驗而容易確定的。植入本發明的工程組織或器官組合物具有顯著的臨床價值，因為與通過本領域已知的其他手段所產生的類似階段的工程組織或器官相比，他們具有提高的血管化水平。血管化的這種提高實現了更有效的組織項。通常通過與所涉及的組織或器官缺陷一致的歷史和身體檢查來評定對治療需要的確定。被鑑定為需要治療的個體包括具有被診斷的組織或器官缺陷的個體。優選個體是動物，包括但不限於哺乳動物，爬行動物和鳥類，更優選馬、牛、狗、貓、羊、豬或雞，最優選人。作為例子，有需要的個體可以缺少至少5%、10%、25%、50%、75%、90%或更多的特定細胞類型。作為另一個例子，有需要的個體可以具有組織或器官的損傷，並且該方法提供了組織或器官生物功能提高至少5%、10%、25%、50%、75%、90%、100%或者200%,甚至多達300%、400%或500%。作為另一個例子，有需要的個體可以患有疾病，紊亂或病症，該方法提供了工程組織或器官構建體，足以改善或穩、定疾病，紊亂或病症。例如，該個體可以患有疾病，紊亂或病症，這導致細胞的損失，萎縮，功能障礙或死亡。所治療的示範性病症包括神經，神經膠質，或肌肉退行性疾病，肌肉萎縮或營養失調，心臟疾病例如先天性心力衰竭，肝炎或肝硬化，自體免疫性疾病，癌症，導致需要除去組織或器官的先天性缺陷，或者需要切除組織或器官的疾病、紊亂或病症例如心絞痛，心肌梗塞和力支體缺血性疾病，意外組織缺失或損傷例如骨折或創傷。在進一步的例子中，有需要的個體可以具有發生疾病，紊亂或病症的高風險，本發明可以延遲或防止其發生。組織或器官可以選自膀胱，腦，神經組織，神經膠質，食道，輸卵管，心臟，胰腺，腸，膽嚢，腎，肝，肺，卯巢，前列腺，脊髓，脾，胃，睪丸，胸腺，曱狀腺，氣管，泌尿生殖道，輸尿管，尿道，子宮，乳房，骨骼肌，皮膚，骨和軟骨。血管祖細胞和/或組織祖細胞可以來自與工程組織組合物移植的個體相同的個體。可替換的，祖細胞可以來自相同的物種，或者甚至不同的物種。植入工程組織或器官構建體屬於本領域的技能。基質和細胞裝配物可以被完全或部分植入個體的組織或器官內以成為其功能部分。優選，植入物開始時通過細胞單層結合宿主或與宿主交流。經過一段時間，所引入的細胞能夠擴增並遷移出聚合物基質達到周圍組織。在植入後，工程血管化組織組合物周圍的細胞能夠通過細胞遷移進入。工程組織周圍的細胞可以被生物活性材料吸引，包括生物應答調節劑，例如多糖，蛋白質，肽，基因，抗原和能夠選擇性摻入基質的抗體，以提供所需要的選擇性，例如，將細胞受體限定到基質，或刺激細胞遷移進入基質，或者二者。通常，基質是多孔的，其具有相互連接的微通道和/或大通道，其能夠實現通過生物和物理化學梯度而放大的細胞遷移。例如，圍繞所植入基質的細胞可以被生物活性材料吸引，包括VEGF，成纖維細胞生長因子，轉化生長因子-P,內皮生長因子，P-選擇素，和細胞間粘附分子的一種或者多種。本領域技術人員能夠接受和知道如何使用其他適於將細胞吸引到基質上的生物活性材料。可以將生物分子引入基質，以使生物分子嵌入其內。可替換的，可以使用化學修飾方法以在基質的表面共價連接生物分子。通過使用本領域中已知的偶聯劑例如醛化合物，二醯亞胺等，基質組分的表面官能團可以與生物分子的官能團偶聯形成共價鍵。另外，可以使用間隔物分子用於中斷膠原中表面活性基團和生物分子的活性基團，以使基質表面上的這些分子更柔韌。生物分子結合到基質內部或外部的其他類似方法將是本領域技術人員已知的。本發明的方法、組合物和設備可以包括同時或依次使用酵、離子、生長因子和生物試劑中的一種或者多種例如凝血酶和釣或其組合進行處理。本發明的方法，組合物和設備可以包括使用非生物藥物和/或生物藥物同時或依次進4亍處理。篩選本發明的另一個方面提供了一種篩選調控血管形成的分子的方法。該方法包括下列步驟將組織祖細胞和血管祖細胞引入到基質材料；培養基質材料以形成工程組織；將基質材料或工程組織與候選分子接觸；測量工程組織的血管化；以及確定相對於未接觸候選分子的對照，候選分子是否調控基質/組織中血管的形成。任選地，該篩選方法也可以包括將基質材料或工程組織引入到個體中，並誘導內源性組織祖細胞和/或血管祖細胞遷移到所植入的構建體中。優選，候選分子是測試混合物的一部分，例如細胞裂解液、來自組織的裂解液或文庫。與相應的未接觸該分子的個體相比，調控血管形成的分子能夠在培養物、基質、組織或器官中提高或者降低血管形成(例如血管生成，血管形成，不成熟血管網絡的形成，血管改型，血管穩定化，血管成熟，血管分化，或建立功能型血管網絡)至少5%、10%、20%、25%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、卯％,或者甚至多達100%、150%或者200%。經過詳細描述了本發明，明顯的是，一些修飾，變化和等價的實施方式是可能的，而不離開在後面權利要求中所限定的本發明的範圍。而且，需要理解本文中的所有實施例都是作為非限制性實施例提供的。所引用的參考文獻通過參照將本申請中所引用的所有出版物，專利，專利申請和其他參考文獻整體併入本文，達到如同在這裡具體和單獨地描述每一篇通過參照整體併入本文的出版物，專利，專利申請和其他參考文獻一樣的成都。本文引用參考文獻不應該認為承認這些是本發明的現有技術。實施例提供了下面的非限制性實施例，以進一步說明本發明。本領域技的發明人已經發現在實施本發明時充分發揮功能的途徑，因此被認為是構成了其實施模式的例子。然而，本領域技術人員根據本發明的公開內容，能夠理解可以對所公開的具體實施方式進行許多改變，而仍能夠獲得相同或類似的結果，這並不離開本發明的主旨和範圍。應該理解，在實施例中所描述的任何方法可以是已經實際進行或者沒有進行的，或者在實施例中描述的任何組合物可以是已經實際形成或者沒有形成的，這所使用的動詞時態無關。實施例1:空間上與MSC成骨細胞共同接種的內皮細胞在體內工程骨構建體中產生了血管樣結構準備人骨髓樣品(AllCells,Berkeley,CA),根據之前建立的方法(Shi等人，1998;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Marion等人，2005;Moioli等人，2006;Troken和Mao,2006)分離間充質幹細胞(MSC)和造血幹細胞(HSC)。圖1A描繪了起始鋪平板的骨髓含量，其顯示濃密的已知是異源的細胞群。(參見Alhadlaq和Mao,2004;Marion和Mao,2006)。間充質幹細胞會分化成成骨細胞。兩種不同的細胞譜系人間充質幹細胞(MSC)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)被用於體內血管化骨工程中。根據上面所述的，從人骨髓樣品中分離MSC(參見例如圖1B)(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006)。擴增培養的/iMSCA分化成成骨細胞(Marion等人，2005;Moioli等人，2006)。hMSC衍生成骨細胞(hMSC-Ob)對鹼性磷酸酶(參見例如圖IC)和馮庫薩染色(參見例如圖ID)是陽性的。hMSC衍生成骨細胞(5xio6個細胞/mL)被接種在輕度減壓中的(3-磷酸三鈣盤的多孔表面((3TCP;平均孔徑300inm)(參見例如，圖2A，淡粉紅區域)。內皮細胞與MSC成骨細胞共同接種在體內工程骨構建體中。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)被擴增培養，接著以5x1(^個細胞/mL的密度同樣在輕度減壓4X:下封裝在Matrigel的液相中(參見例如圖2A,紅點)。Matrigel是底膜高分子水凝膠，其已經被廣泛用於內皮細胞粘附以及血管生成研究(Abilez等人；2006;Baker等人，2006;Bruno等人，2006;Mondrinos等人，2006;Rajashekhar等人，2006)。HUVEC-Matrigel構建體(參見例如圖2A,紅點)被輸注進已經被接種hMSC衍生成骨細胞的PTCP盤的孔內。隨後，通過在37。C孵育使Matrigel聚合。輸注具有HUVEC的複合構建體，並將接種hMSC-Ob的PTCP構建體(參見例如圖2A)植入到嚴格組合免疫缺陷(SCID)小鼠的背部4星期。對照構建體包括接種hMSC-Ob的PTCP盤和無細胞的PTCP盤。收穫體內植入後，回收的所輸注HUVEC、接種hMSC-Ob的(3TCP構建體顯示礦化面積以及馮庫薩染色切片中PTCP的支架材料(參見例如圖2B)。通過蘇木精和曙紅染色(參見例如圖2C),在礦化結節中發現內皮類細胞所形成的血管類內腔(參見例如，圖2C中的PV)。通過更高放大倍數的馮庫薩染色切片，|3TCP構建體的大量區域被礦化(參見例如圖2D)。如果HUVEC被均勻地接種在Matrigel中，則內皮類細胞所排成的內腔類結構的形成(參見例如圖2C)顯然在體內植入後參與HUVEC的重建。這些數據證明被共同接種在生物相容性材料不同空間區域內的人MSC成骨細胞和人內皮細胞可以在礦化組織內介導血管樣結構。因此，許多細胞譜系可以在工程血管化骨內被優化，例如HSC、MSC、和/或他們的譜系衍生物包括HSC衍生內皮細胞和MSC衍生成骨細胞。實施例2:骨髓衍生造血幹細胞在體外分化成內皮類細胞。對於臨床應用，可以從骨髓中連同MSC分離HSC,優選通過最低限度侵入性途徑。已經發現HSC經歷了緩慢擴增(Shih等人，2000;Li等人，2004)。FGF-2已經被證明會加速HSC擴增速度(Wilson和Trump,2006;Yeoh等人，2006)。本發明人的經-瞼是HSC的確以比MSC和HUVEC慢的速度擴增。可替代的，HSC可以分化成內皮細胞，接著擴增HSC衍生內皮細胞。製備骨髓樣品(同前)用於分離HSC。CD34和磁珠分離被用於分離非粘附性細胞(EasySep.AllCells，Berkeley,CA)。所分離的CD34陽性細胞(CD34+)被認為是HSC。在塗覆纖連蛋白的平板中，HSC顯示為圓形細胞(參見例如圖3A),其形狀與在2D培養中呈現紡錘形的MSC明顯不同(參見例如圖1B)。在將HSC轉移到新培養板後，將內皮細胞分化補充物加入到DMEM,其含有VEGF(10ng/mL)、bFGF(lng/mL)和IGF-l(2ng/mL)(Shi等人1998;Shih等人，2000;Li等人，2004)。HSC在大約2星期內開始形成集落(參見例如圖3B)。進一步，在內皮分化補充物的刺激下，HSC分化成未連接的細胞，其形成互連細胞的管狀結構(參見例如圖3C)。正如Ac-LDL焚光的細胞內定位所證明的，HSC衍生細胞對乙醯化低密度脂蛋白(Ac-LDL)是陽性的，其中Ac-LDL是一種典型的內皮細胞標記物(參見例如圖3D)。正如抗體染色所證明的，HSC衍生內皮細胞還表達馮威勒布蘭特因子(vWF),—種天然內皮細胞的標記物(參見例如圖3E)。HSC衍生內皮細胞(HSC-EC)表達量比對照成纖維細胞(FB)(參見例如圖3F，右柱)顯著高的vWF(參見例如圖3F,左柱)。綜上所述，這些數據證明正如天然內皮細月包形態學和標記物所證明的，從人骨髓分離的HSC可以分化成內皮細胞類細胞。這些HSC衍生的內皮細胞形成細胞間管狀連接。因此，可以通過摻合HSC和MSC、和/或HSC衍生的內皮細胞與MSC衍生成骨細胞產生工程血管化骨。這模擬了在發育過程中如何通過血管侵入形成天然骨。長骨的中部骨幹區的骨生成帶有血管，這極好地證明了造血幹細胞和間充質幹細胞在天然(血管化)血管生成中的協同作用。實施例3:生長因子在體內誘導高分子水凝膠中的血管生成。本文已經證明HSC和MSC能夠分化成最終細胞語系例如內皮細胞和成骨細胞，其構成了某些血管和骨的構建體組件。還證明了血管樣結構能夠被在體內被建造在骨支架內。然而，現有的文獻已經顯示工程血管可能會由於異常高的內皮細胞滲透性而是漏的(Richardson等人，2001;Valeski和Baldwin,2003)。為了確定bFGF對宿主衍生的血管生成的影響，將血管生成因子bFGF遞送到密集的高分子水凝膠,聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)中，在以前的研究中已知其在體內對宿主衍生血管細胞是不能滲透的(Alhadlaq和Mao,20(B;Alhadlaq等人，2004;Alhadl叫和Mao,2005;Stosich和Mao,2006)。當組織工程骨被朝向臨床應用擴大以修復大的，嚴重尺寸的骨缺陷時，次優的血管化會是特別有問題的。下面所顯示的數據證明物理大通道和封裝在高分子水凝膠中的生物活性因子誘導寄主衍生的血管生成。在PEG水凝膠中設計了四種結構(參見例如圖4)(Stosich等人，2006)。組1由PEG水凝膠單獨構成。以6x4mm(直徑x厚度)的尺寸形成PEG圓柱體(參見例如圖4A)。組2由大通道單獨構成。在光聚合PEG圓柱體中總共形成3個大通道(直徑均為lmm)(參見例如圖4B)。組3由bFGF單獨構成。在PEG水凝膠的液相中裝載總共10pg/mLbFGF,接著進行光聚合。在該組中沒有形成大通道(參見例如圖4C)。組4由bFGF和大通道構成。在PEG水凝膠的液相中裝載總共10|ig/mLbFGF,接著進行光聚合併形成3個大通道(直徑均為lmm)(參見例如圖4D)。在任何四個組中都沒有遞送外源細胞。所有的PEG圓柱體都具有相同的6x4mm(直徑x厚度)尺寸，並淨皮皮下體內植入SCID小鼠的背部4個星期。在體內植入免疫缺陷小鼠內4周後，通過所提取的樣品分析注意到了下列。沒有設置bFGF或大通道的PEG水凝膠顯示出沒有血管滲透的宏觀證據(參見例如圖5A)。相反具有3個物理大通道的PEG水凝膠在體內收穫的時候顯示出3個紅點(參見例如圖5B)。下面的組織學和免疫組織化學證據暗示這些含有宿主衍生的血管組織。負載bFGF但沒有大通道的PEG水凝膠整體顏色上要更深(參見例如圖5C)。下面的組織學和免疫組織化學證據暗示宿主衍生血管組織滲透的隨機區域。具有大通道並負載bFGF的PEG水凝膠不僅整體顏色上更深，而且在體內收穫的時候還顯示出3個紅點(參見例如圖5D)。下面的組織學和免疫組織化學證據證明組織細胞僅滲透進大通道的內腔中，而不在PEG水凝膠的其他位置。組織學和免疫組織化學發現(Stosich等人(2006))如下。不具有bFGF或大通道的PEG水凝"交(組l)顯示沒有宿主細胞滲透或者任何血管生成的跡象(參見例如圖6A),這與之前的數據一致(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao，2005;Stosich34和Mao,2005)。具有大通道但沒有bFGF的PEG水凝膠(上面的組2)證明宿主細胞僅滲透進大通道內，而不在PEG的其他部分(參見例如圖6B)。相反，負載bFGF而沒有大通道的PEG水凝膠(組3)顯示出宿主細胞滲透明顯隨機的區域(參見例如圖6C)。負載bFGF並具有大通道的PEG水凝膠(上面的組4)證明宿主細胞僅滲透進大通道內，而不在PEG的其他部分(參見例如圖6D)。這些結果顯示下列。具有大通道和bFGF二者的PEG水凝膠具有0.47士0.18mm2的宿主組織向內生長量，這顯著地比具有大通道而沒有bFGF的PEG水凝膠的0.13士0.05mm2高(平均值士S.D.;P<0.01;N二每組8個)(參見例如圖7)。因此在PEG水凝膠中的物理和生物活性組合設計會促進宿主組織向內生長。更高功率圖像的分析顯示血管滲透進入PEG水凝膠，但會抵抗宿主組織向內生長(參見例如圖8)。在具有或不具有bFGF的宿主組織中發生向內生長(參見例如圖8A,9B和圖8E，9F)。然而如在圖7中所示，在負載bFGF的PEG水凝膠的大通道中所滲透的宿主組織的量(參見例如圖8E，9F)顯著地大於沒有bFGF的具有大通道PEG水凝膠(參見例如.圖8A,9B)。負載bFGF但沒有大通道的PEG水凝膠顯示出稀少的組織向內生長(參見例如圖8C,9D)。血管樣結構在由內皮類細胞排列成並被成纖維細胞類細胞所圍繞的血管樣結構中，含有類似血紅細胞的細胞(參見例如圖8E,9F)。使用抗血管內皮生長因子(VEGF)抗體染色的免疫定位顯示向內生長的宿主組織是血管組織。在具有或不具有bFGF的大通道中所滲透的宿主組織中出現強抗VEGF染色(參見例如圖9B,IOD)。VEGF抗體還標記組織嚢(參見例如圖9A)以及滲透到具有bFGF但沒有大通道的PEG水凝膠中的宿主組織。(參見例如圖9C)。這些數據證實血管樣結構(正如在例如圖8中所示)是由PEG水凝膠中的bFGF和/或大通道所誘導的宿主衍生血管生成。在沒有bFGF或大通道的PEG水凝膠中不存在血管生成(參見例如圖9A)。正如在先前工作中成脂細胞、成軟骨和成骨細胞的存活所證明的，PEG水凝膠的孔可能足夠大以允許生長因子和營養物擴散(Burdick等人，2003;Kim等人，2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli等人，2006;Stosich和Mao，2006)。然而，PEG水凝膠的孔徑的大小不足以允許宿主細胞向內生長，除非引入通道和生長因子例如bFGF。因此，在大通道中宿主組織向內生長可用於引導血管生成和宿主細胞沿著預定的路線入侵。此外，bFGF或其他血管生成因子的放大有助於進一步加速向內生長。這些發現支持宿主衍生血管生成的調節，和增強骨構建體中工程血管的成熟。實施例4:組織工程(engineering)中的細胞接種密度在工程(engineering)生物結構中^f艮實際的問題是將多少細胞引入支架中(Moioli和Mao,2006)。在發育中間充質幹細胞產生成骨祖細胞以及最後階段的成骨細胞時，細胞分裂的密度依賴性抑制(之前被稱作接觸抑制)是細胞存活的因素(Alberts等人，2002)。在工程組織支架中接種過多的細胞可能會造成局部可利用絲裂原、生長因子和存活因子的短缺，可能導致細胞凋亡以及造成體外細胞擴增時間的不必要浪費(Moioii和Mao，2006)。另一方面，在工程組織支架中接種太少的細胞，可能會導致再生結果差。因此，需要確定HSC、MSC和它們語系衍生物的最佳密度，以使得工程血管化骨的再生結果最大化(參見例如圖10)。這裡報導了MSC、MSC衍生成骨細胞和MSC衍生軟骨細胞的各種起始細胞密度的影響。從多個健康供體的多種骨髓細胞樣品的每一種中分離人MSC,在單層培養中擴增，並如上和根據現有方法分別分化為成軟骨細胞和成骨細胞(Alhadlaq等人，2004;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006)(參見例如.圖10)。對每種細胞譜系hMSC,hMSC-Ob和hMSC-Cy,採用四種細胞密度0xi6個細胞/mL、5x16個細胞/mL、40x16個細胞/mL和80x16個細胞/mL。以前研究了中間的細胞接種密度20x106個細胞/mL(Alhadlaq和Mao，2005)。0x1(^個細胞/mL-沒有細胞的構建體。將每種細胞密度和語系的細胞懸浮液封裝在PEG水凝膠的水相中，接著進行光聚合，以及連續培養3DPEG構建體4星期(參見例如圖10)。在分別在DMEM、成骨補充DMEM或成軟骨補充DMEM中，利用頻繁更換培養基連續培養3DPEG水凝膠構建體4星期之後，進行組織染色和生物化學檢驗。成骨培養基含有lOOnM地塞米松、50pg/ml抗壞血酸和lOOmMP-甘油磷酸，而成軟骨補充培養基含有10ng/mlTGFP^細節如下)。結果顯示在相應的DMEM、成骨補充DMEM或成軟骨補充DMEM培養基中孵育4星期後，在PEG水凝膠中維持起始的細胞接種密度(參見例如圖ll)(參見例如，Troken和Mao,2006)。圖11描述了H&E染色的示範性結果，並且顯示在PEG水凝膠中封裝並進行4星期3D構建體培養的各種密度的hMSC(上排)、hMSC衍生成骨細胞(中排)和hMSC衍生軟骨細胞(下排)的組織學觀察。通常，PEG水凝膠支架中終點細胞密度遵循了類似的起始細胞接種密度模式5M個細胞/ml、40M個細胞/ml和80M個細胞/ml(5M/ml=每毫升細胞懸浮液500萬個細胞)。在PEG水凝膠中孵育4星期後，hMSC衍生軟骨細胞(hMSC-Cy)不僅保持了他們的成軟骨表型，而且還保持了他們相應的起始細胞接種密度(參見例如.圖12,番紅O染色)(參見例如，Troken和Mao,2006)。番紅O是陽離子染料，其結合軟骨相關的粘多糖例如硫酸角蛋白和硫酸軟骨素，並且已經廣泛用於標記自然關節和生長平板軟骨(參見例如，Mao等人，1998;Wang和Mao,2002;Sundaramurthy和Mao，2006)。然而，在PEG水凝膠中孵育4星期後，儘管hMSC保持了他們的起始接種密度，但他們對番紅O染色是陰性的(參見例如圖12)。在PEG水凝膠中孵育4星期後，hMSC衍生成骨細胞(hMSC-Ob)不僅保持了他們的成骨表型，而且還保持了他們相應的起始細胞接種密度(參見例如圖13,馮庫薩染色)(Troken和Mao,2006)。馮庫薩染色通常被用於標記天然成骨和組織工程成骨中的礦化形成(參見例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Marion等人，2005;Moioli等人，2006)。然而，在PEG水凝膠中孵育4星期後，儘管hMSC保持了他們的起始接種密度，但他們對馮庫薩染色是陰性的(參見例如圖13)。在植入封裝相同密度hMSC、hMSC-Ob和hMSC-Cy的PEG水凝膠到棵鼠中後，體內數據顯示提高的細胞接種密度會導致提高的hMSC衍生成骨細胞和hMSC衍生軟骨細胞所形成基質的量(參見例如圖14),這延續了上面所提供的體外數據(參見例如，圖11-14)。該細胞密度實驗確認了之前通過比較兩種細胞密度5x106個細胞/mL和20x106個細胞/mL(Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005)在高細胞接種密度的再生結果中的發現例如20x1(^個細胞/mL優於5x1(^個細胞/mL的接種密度。然而，過高的細胞接種密度會引起組織例如營養物短缺，細胞間接觸異常以及體外細胞擴增時間不必要浪費(Moioli和Mao,2006)。通常優選最短的離體的擴增時間。這些細胞密度實驗證明了在組織工程支架中所封裝的細胞接種密度的優化能夠使再生結果最大化(參見Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Troken和Mao，2006)。實施例5:HSC和MSC之間的最佳比例下面的實驗研究血管化骨工程最佳的HSC和MSC之間的比例。表2在8X8X2設計中使用因子設計方法研究HSC和MSC對血管化骨工程的相對貢獻細胞比例(8)x樣品尺寸(8)x體內植入時間(2)。在體外支架中細胞的總數目(HSC和MSC結合)保持恆定在8x106個細胞/mL，而HSC和MSC的相對比例在1:11:15之間，因此能夠確定HSC和MSC對工程血管化骨的相對貢獻。tableseeoriginaldocumentpage38根據上面所述的究以及之前所建立的方法，從多種骨髓樣品的每一種中分離人HSC和MSC(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadl叫和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006;Stosich等人，2006)。來自單個供體的HSC和MSC被用於每種構建體tableseeoriginaldocumentpage39中以消除任何可能的免疫排斥問題。如同上述研究，HSC^:均勻接種中在Matrigd中，並輸注到已經被預先接種MSC的pTCP的孔中。細胞支架構建體被植入到不會排斥人細胞的棵鼠的背部。體內植入8星期和16星期的原理是根據先前的經驗，如果發生，則期望在該期限內發生(Stosich等人，2006)。收穫所植入的樣品，並進行下表3所列的分析。表3.工程血管化骨的結果檢驗和成功標準。後面討論這些技術的細節方法tableseeoriginaldocumentpage39H&E:蘇木精和曙紅，整體組織學顏色用於區分多種組織；Masson三色染色血管的組織學染色；OCN:骨鈣蛋白，成骨細胞的粘附蛋白，成骨分化的晚期標記物；OPN:骨橋蛋白，成骨細胞的粘附蛋白，成骨分化的晚期標記物；vWF:馮威勒布蘭特因子，在內皮細胞上發現的表面糖蛋白，內皮細胞分化的晚期標記物；VEGFR:血管內皮生長因子受體，內皮細胞分化的早晚期標記物；KDR/VEGFR-2/Flk-l:血管內皮生長因子受體2,內皮細胞分化的早晚期標記物。根據下面所描述的詳細方法數字X-射線和^CT對工程血管化骨進行定量。使用利用原子力顯微鏡(AFM)的微壓、以及使用傳統機械測試的壓縮和切力測試進行工程血管化骨的機械分析。工程血管化骨的微觀機械性能是感興趣的，並且容易被AFM所研究，但不能通過利用Instron或MTS的宏觀尺寸機械測試而獲得。然而，MTS能夠測試工程血管化骨的整體壓縮和切力性能，這不能夠通過AFM所測試。因此，AFM和MTS是工程血管化骨的互補機械測試途徑。所有的數字表示的數據都被進行統計分析。對於數據正態分布，使用利用Bonferroni檢驗的偏差分析(ANOVA)。如果數據分布是不對稱的，則使用非參數檢驗例如Kruskal-Wallis偏差分析。統計顯著性為0.05的a水平。自體細胞和同種異體細胞都已經被用於組織工程中。本文所提供的是組織工程中自體細胞的模型(植入棵鼠中的人細胞)。棵鼠作為模擬人的"孵育器"。與同種異體細胞相比，自體細胞具有許多重要的優點，例如缺少免疫排斥和病原體傳播。同種異體細胞能夠容易被製成適於受體，因此節省了與自體細胞相關的細胞操作所需的時間。然而，可能需要給藥免疫抑制藥物，以及可能會使得血管化骨的組織工程結果複雜。骨髓幹細胞的選擇是至少部分基於觀察到正如在上面所述研究中所證明的，骨髓衍生MSC和HSC已經被充分鑑定，並且具有建立血管化骨的能力。脂肪衍生幹細胞最近被報導，並且可以提供骨髓衍生細胞的替代品。實施例6:HSC、MSC和他們語系衍生物的最佳細胞密度使得工程血管化骨的產量最大化。儘管HSC和MSC在血管化骨發育中協同發揮功能，但還有一些其他的細胞系也參與血管骨生成包括內皮細胞和成骨細胞。成骨細月包是一種MSC衍生的最後階段的細胞之一。因此，需要研究是否血管化骨生成工程會被摻合HSC與MSC衍生成骨細胞以及MSC與HSC衍生內皮細胞而最大化。是否內皮細胞書f生自MSC、HSC或其他祖細胞，tableseeoriginaldocumentpage41根據上面所述的研究以及之前所建立的方法，從多種骨髓樣品的每一種中分離人HSC和MSC(Alhadlaq和Mao，2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006;Stosich等人，還未被完全了解(Yin和Li，2006)。內皮類細胞是從HSC分化的，因下面的實驗;爻計研究在血管化骨工程中的糹:^接種密度，不僅是HSC和MSC，還有他們的語系衍生物包括HSC衍生內皮細胞和MSC衍生成骨細胞。表4:實驗設計，實驗l-HSC和MSC衍生成骨細胞。在8x8x2設計中使用因子設計方法研究HSC和MSC衍生成骨細胞血管化骨工程中的相對貢獻。糹田胞比例(8)x樣品尺寸(s)x體內植入時間(2)。組HSC衍生.成骨細胞HS|^sc-樣品尺寸'(ft個細胞Zal)(s個細胞/m).)比例_('每繼S個裸鼠)體內植入時間(堪期)formulaseeoriginaldocumentpage412006)。來自單個供體的HSC和MSC被用於每種細胞接種構建體中以消除可能的免疫排斥問題。對於實驗1,根據之前建立的途徑，MSC分化成成骨細胞類細胞(Alhadlaq和Mao，2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Troken和Mao，2006;Marion和Mao,2006)。對於實驗2，根據在上面所述研究中的途徑，HSC分化成內皮細胞類細胞。如上面所述研究，HSC衍生內皮細胞被均勻接種在Matrigel中，並輸注到已經被預先接種MSC衍生成骨細胞的PTCP的孔中。對於實驗2，在將HSC衍生內皮細胞接種在Matrigel之前，首先將MSC接種在(3TCP的孔中。對於實驗1和2，細胞支架構建體被植入到不會排斥人細胞的棵鼠。體內植入8星期和16星期的原理是根據先前的經驗，如果發生，則期望在該期限內發生(Stosich等人，2006)。結果檢驗和數據分析和統計如上所述。同時接種HSC衍生內皮細胞與MSC衍生成骨細胞或軟骨細胞也能夠發生。實施例7:血管生成生長因子促進在HSC-和MSC衍生血管化骨中血管的成熟。工程血管系統必須正確地發揮功能例如在新形成的骨組織內提供適當的營養物供給，充氧，氣體交換和細胞供給。血管形成包括一系列事件級聯，其包括內皮細胞激活、遷移和增殖。工程血管可能由於異常高的滲透性而洩漏(Richardson等人,2001;Valeski和Baldwin,2003)。已知許多血管生成生長因子在天然發育中調節血管的形成(Thurston,2002;Ehrbar等人，2003;Valeski和Baldwin,2003;Fer腦，2005)。在骨中血管生成的開始幾天VEGF高度表達(Nissen等人，1996;Hu等人，2003;Bohnsack和Hirschi,2004;Ferrara,2005)。在VEGF作用之後，PDGF影響脈管系統，並增強血管內皮細胞的成熟(Darland和D，Amore，1999;Richardson等人，2001;Bohnsack和Hirschi，2004)。組織工程中"漏的"血管的原因是因為少量相關的壁細胞例如周邊細胞和平滑肌細胞。PDGF已經顯示誘導壁細胞的招募(Darland和D，Amore,1999;Ya腳poulos等人，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara，2005)。因此，遞送PDGF也^"對通過招募壁細月包而^f吏工程新生脈管系統成熟。為了鑑定VEGF和PDGF在誘導來自HSC和HSC衍生細胞的工程血管的成熟中的最佳劑量，探索比已知生理劑量高和低的劑量。在血管生成細胞的招募和增殖中，快速釋放VEGF是期望的(Nissen等人，1996;Hu等人，2003;Ferrara,2005)。因此，VEGF被吸入到(3TCP盤中以在體內植入的開始幾個小時或幾天快速釋放。PDGF的作用在VEGF之後，並且不僅促進內皮細胞的成熟，而且作為壁細胞的趨化因子(Darland和D，Amore,1999;Yancopoulos等人，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara,2005)。因此，PDGF被封裝在微球體中用於持續釋放而沒有起始脈沖期(Moioh等人，2006),以便能夠在更快速釋放的VEGF發揮功能之後，逐步持續釋放PDGF。根據上面所述研究中的經驗，在Matrigel中封裝PDGF微球體將進一步延緩其釋放速率。表6.用於增強工程骨中新生脈管系統成熟的實-險設計。HSC-EC:造血幹細胞衍生內皮細胞；MSC-Ob:間充質幹細胞衍生成骨細胞。在8x5x2設計中使用因子設計方法研究結果樣品尺寸(8)x生長因子劑量(5)x體內植入時間(2)。tableseeoriginaldocumentpage43VEGF被吸入到Matrigel中，接著輸注到卩TCP的孔中，進行快速釋放。通過技術細節在本文中描述的雙乳化技術以及根據現有的方法，PDGF被封裝在PLGA微球體中(Moioli等人，2006)。以緩慢的速度而沒有起始脈衝期釋放PDGF。在負載生長因子之前，細胞接種的程序與實施例1相同。結果檢驗和數據分析和統計如上所述。從上述和現有文獻中獲得VEGF和PDGF的劑量(參見例如，Darland和D,Amore,1999;Yancopoulos等人,2000;Richardson等人.,2001;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara，2005)。可替換的，可以使用bFGF替換VEGF,也是根據先前的經驗(Stosich等人，2006)。增加多種生長因子進行細胞遞送形成了複雜的系統，儘管這是天然血管生成和成骨如何發生的。將VEGF吸入Matigel的替換是凍幹pTCP。PLGA已知會在降解的過程中產生酸性副產物。然而，由於只有少量的PLGA用於製造微球體，因此酸性副產物問題不是重要的，並且在先前的工作中已經達到最小(Moioli等人，2006)。正如現有文獻所證明的，PDGF被認為招募血管平滑肌細胞(Darland和D，Amore,1999;Yancopoulos等人.，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara,2005)。考慮到最終臨床治療的經濟，通常採用最低的有效劑量。通過引入HSC和MSC到工程血管化骨，有可能所需血管生成生長因子的量不如沒有引入HSC和MSC(和/或語系衍生物)時的高。邏輯上，HSC和MSC和/或它們的譜系衍生物也可能介導必要的血管生成生長因子。實施例8:HSC、MSC和/或血管生成生長因子的優化遞送有效地修復嚴重尺寸的顱蓋缺陷。上面所描迷的實驗提供了優化的基於細胞和/或生長因子的途徑用於使用異位成骨途徑的工程血管化骨。顱蓋骨缺陷代表了重要的臨床需求，也代表了測試在工程血管化骨中優化的基於細胞和/或生長因子的途徑的同位位點。該實驗提供了同位骨缺陷環境以測試是否通過上面列出的方法確定的優化的條件能夠比任何單獨的成分和/或傳統骨組織工程途徑更有效地修復嚴重尺寸的顱蓋缺陷。顱蓋缺陷代表了與在上面所描述的實驗中所利用的同位移植位點不同的實驗^t型。表7.實驗設計用於利用優化的工程血管化骨的途徑修復嚴重尺寸的顱蓋缺陷；MSC-Ob:間充質幹細胞衍生成骨細胞。在8x7x2設計中使用因子設計方法研究結果細胞成分(7)x樣品尺寸(8)x體tableseeoriginaldocumentpage45大鼠總數112=8個4f品x7組x2個時間點如上檢驗結果。另外，在預定處死時間進行後續新形成顱骨的鑑定之前2星期和1星期，腹腔注射鈣黃綠素和茜素(Parfitt等人，1987;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。數據分析和統計如上所述。另外，通過螢光顯微鏡利用動態組織測量學定量骨形成速度(BFR)和礦化接合速度(MAR)進行定量(Parfitt等人，1987;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。中侵入的宿主細胞也有複合影響。例如，除了促進血管生成外，PDGF促進骨祖細胞的增殖(Park等人，2000)。這種複雜的系統對於提供不會修復重要尺寸的顱蓋缺陷的參與工具是必要的。雙生長因子的劑量(此處為VEGF和PDGF)，儘管在上面實施例3中進行了優化，但仍可能需要根據可能在顱蓋缺陷模型中存在的內源性生長因子進行修飾。實施例9:分離和擴增培養骨髓衍生造血幹細胞和間充質幹細胞。根據上面的研究中所描述的和我們先前所開發的方法，分離骨髓衍生造血幹細胞和間充質幹細胞(參見例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Stosich等人，2006)。如同在先前的工作一樣(Alhadlaq等人，2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005),通過商業渠道獲得匿名成年人所捐獻的骨髓樣品(AllCells,Berkeley,CA)將每種骨髓樣品的一部分用於使用RosetteSep試劑盒(AllCells,Berkeley,CA)的負選擇技術分離間充質幹細胞(hMSC)。使用Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium-LowGlucose(DMEM-LG;Sigma,St.Louis,MO)擴增培養所分離的MSC，其中所述DMEM-LG^皮補充10%的胎牛血清(FBS)(Biocell,RanchoDominguez,CA)和1%抗生素(1x抗生素-抗真菌劑，含有100單位/ml的青黴素G鈉，lOOpg/ml的硫酸鏈黴素和0.25jxg/ml的兩性黴素B(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)(Alhadlaq等人，2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005,Moioli等人2005;Stosich等人，2006)。每個骨髓樣品，hMSC擴增不超過3代用於每個實驗。根據先前的經驗，幾乎不必要擴增35代。培養是在95%空氣/5%C02中37。C下孵育。每個供體利用相同的骨髓樣品來分離造血幹細胞。使用連接到磁珠上的CD34抗體進行陽性選擇(RosetteSep)。使用流式細胞儀的純化細胞用於確定所分離CD34(CD34+)陽性細胞的百分比。還通過臺盼藍拒染法(TrypanBlueexclusion)評估細J包的活力。,人起始非貼壁細月包分離CD34+細胞。通過在37。C下孵育在96孔纖維連接蛋白塗覆的具有加入10%FBS的IMDM(HSC生長培養基)的塑料盤中3天接著收集非貼壁細胞，而分離CD34+細胞(Shi等人1998)。移出非貼壁細胞，並轉移到新孔中。重複該過程兩次，之後將仍存留的懸浮細胞鋪平板並使其粘附到纖維連接蛋白塗覆的平板上。實施例10:HSC分化成內皮類細胞，MSC分化成成骨細胞類細胞。匯合之後，將hHSC連續轉移到纖維連接蛋白塗覆的24孔、12孔和6孔組織盤，並最終轉移到Petri盤。HSC衍生內皮細胞類細胞將繼續擴增。初步數據顯示這些細胞顯示出內皮細胞形態，並表達一些內皮細胞標記物(參見例如，上面的圖3)。另外，hHSC衍生內皮細胞表達比對照細胞顯著多的一種內皮細胞標記物-馮威勒布蘭特因子(vWF)。使用具有內皮細胞分化補充物(ECS)的含有10%FBS的HSC生長培養基，使纖維連接蛋白的貼壁細胞分化，其中所述ECS包括VEGF(10ng/mL)、bFGF(lng/mL)和IGF-1(2ng/mL)。根據之前的方法，利用成骨刺激補充物，MSC分化成成骨細胞類細胞，其中所述成骨刺激補充物含有lOOnM地塞米松、50pg/ml抗壞血酸和100mMp誦甘油磷酸(參見例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006)。實施例11:製造PLGA微球和封裝PDGF。這些程序遵循上面所描述以及在Moioli等人(2006)中所描述的研究。PLGA是生物相容性和生物可降解的聚(L-乳酸)和聚(乙醇酸)合成共聚物，並已經被廣泛使用(參見例如，Lu等人，2000;Shea等人，2000;Burdick等人，2001;Hedberg等人，2003;Karp等人，2003a;Ochi等人，2003;Moioli等人，2006)。將總共250mg聚(L-乳酸)和聚(乙醇酸)(PLGA:50:50,PLA:PGA)(Sigma,StLouis,Mo)溶解在lmL二氯乙烷中。通過如在我們以前的工作中所描述的雙乳化技術使用PLGA微球體封裝PDGF(Moioli等人，2006)。將該混合物漩渦1分鐘。加入2ml1。/。PVA後，將混合物再旋渦1分鐘。將所得到的乳化物加入到100ml0.1%PVA溶液中。將PVA/微球體的混合物加入到100ml2%異丙醇中以除去二氯乙烷，並硬化微球體,並在化學通風櫃下連續攪拌2小時。通過過濾收集PDGF微球體，並接著冷凍乾燥，接著溶解到氯仿中4小時，接著劇烈搖晃2分鐘。在澄清4小時後，使用PDGFELISA試劑盒(R&DSystems,St.Louis，MO),根據產品規程對每單位微球體所封裝的PDGF的濃度進行定量。將封裝預定量的PDGF的微球體懸浮在lOjulPBS中。接種細胞後，在植入之前，將PLGA微球體封裝的PDGF通過microtip注射到Matrigel溶液中。實施例12:灌注接種細胞的構建體如果Matrigel輸注的(3TCP構建體中細胞存活差，則可以通過在先前工作中開發的灌注生物反應器增強物質傳遞(Vunjak-Novakovie等人，1999;2002)。簡言之，以線性速度建立灌注培養基通過10100pm範圍內的支架，這對應於天然骨的灌注速度。在每個通道中，在外部環形氣體交換器氧氣和pH方面，培養基保持平衡。以每天50%的速度更換培養基。根據上面表3所列出的工程血管化骨結果，對灌注時間沐A化Xk實施例13:形成完全厚度的顱蓋缺陷以及工程構建體的手術植入。將11周大的棵鼠通過腹腔注射(IP)含有90%克他命(100mg/ml;Aveco，FortDodge,IA)和10%曱苯p塞口秦(20mg/ml;Mobay,Shawnee,KS)的混合物麻醉。聚維酮碘(10。/。)用於對手術區域進行消毒。沿著頭骨的徑向中線切3cm長的線性切口。撥開皮下組織和骨膜，暴露出腦皮質骨表面。根據之前所使用的方法，使用磷酸緩沖鹽水衝洗的無菌牙科手機，在頂骨的中央形成全厚度的顱蓋缺陷(5ximm3:直徑5mm)(參見例如，Hong和Mao,2004;Moioli等人，2006)。根據先前的經驗，該5mm直徑全厚度的顱蓋缺陷構成了重要的缺陷，不通過骨移植無法將其修復(參見例如，Hong和Mao,2004;Moioli等人，2006)。硬腦膜和鄰近的頭蓋縫保持原樣(Kopher和Mao,2003;Hong和Mao，2004;Moioli等人，2006)。如在上述的研究中，在輕度減壓4。C下，HSC或HSC衍生內皮細胞被接種在Matrigel的水相中。Matrigel是基膜高分子水凝膠，其已經被廣泛用於內皮細胞粘附和血管生成實驗(參見例如，Abilez等人，2006;Baker等人，2006;Bruno等人，2006;Mondrinos等人，2006;Rajashekhar等人，2006)。將細胞-Matrigel溶液輸注到已經被接種hMSC衍生成骨細胞的PTCP盤的孔中，接著在37。C下形成凝膠。(3TCP是通過商業渠道獲得的，其孔徑在200400|im之間(BDBioscience,SanDiego,CA)。具有(3TCP支架的工程組織構建體將適合5mm直徑全厚度的顱蓋缺陷，隨後使用4-0普通內臟可吸收手術縫合線(plaingutabsorbablesurgicalsuture)縫合手術組織，該手術組織由骨膜、皮下軟組織和皮膚構成。實施例14:組織收穫、組織學和免疫組織化學。將所收穫的含有工程骨的顱蓋樣品用於進行去礦化製備物，以用於石蠟包埋，以及不去礦化包埋在塑料中，對新形成骨的進行使用雙螢光標記的定量骨組織形態學(釣黃綠素和茜素)。對於去礦化製備物，將樣品固定在10%多聚曱醛中，在等體積的20%梓檬酸鈉和50%曱酸中去礦化，包埋在石蠟中，使用如上述研究中的標準組織學程序以lOpm的厚度橫平面進行切片(參見Mao等人，1998;Wang和Mao，2002;Kopher等人，2003)。將連續的切片使用蘇木精和曙紅、馮庫薩染色以及Masson三染色以進行工程骨中各種區域的顯形。未去礦化的製備物是下面所描述的。成骨和血管生成標記物的免疫組織化學遵循之前所開發的方法(參見例如，Alhadlaq和Mao,2005;Stosich等人，2006;Simdaramurthy和Mao，2006)。實施例15:通過計算機組織形態計量定量骨幾何學。通過計算機組織形態計量分離對工程骨進行定量檢驗(ImageProandNikonEclipseE800,NikonCorp.，Melvie,NY)。構建標準的才各柵(1175x880pm"並在4倍物鏡下置於組織樣品之上，以便能夠對工程骨進行定量。將數字數據進行如在每個實施例中所描述的統計分析。實施例16:通過雙螢光標記以及計算機輔助動態骨組織形態計量對新形成顱蓋骨進行定量。在處死前2星期和1星期，將鈣黃綠素綠(15mg/kg)和茜素紅(20mg/kg)腹腔注射，並通過計算機輔助動態骨組織形態計量進行顯形(Parfitt等人，1997;Mao,2002;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。在梯度乙醇和丙酮中將顱蓋樣品進行修整(trim)和脫水，進一步使用850/。曱基丙烯酸曱酉旨(MMA)和15%鄰苯二曱酸二丁酯製備用於未除鈣包埋。使用帶鋸(bandsaw)對聚合的MMA-樣品塊進行修整。使用能夠切未去礦化的4丐化組織樣品的Leica多切超薄切片機，連續切割未去礦化的15-)im切片。在螢光顯微鏡下對未去礦化切片中被4丐黃綠素標記的新礦化骨進行成像(Mao,2002;Kopher和Mao，2003;Clark等人，2005)。通過測量後續4丐黃綠素和茜素標記之間的平均距離除以注射標記的時間間隔(7天)來計算礦化接合速度(MAR)(Clark等人，2005)。骨形成速度(BFR)被定義為骨形成速度(BFR/BS)被定義為MARXBSf/BS(Clark等人，2005)。將數字數據進行如在每個實施例中所描述的統計分析。實施例17:使用原子力顯微鏡顯微鑑定工程骨通過使用原子力顯微鏡(AFM)建立的方法測試工程骨的機械性能(參見例如，Hu等人，2001;Patel和Mao,2003;Radhakrishnan等人？nm-Allen《a1/Tcin.nri4-Tnml^nr;ci容人？nnd-廣lQrL禁人2005)。使用AFM的機械測試比宏觀機械測試有利，因為後者不能區分工程骨的單獨的機械性能。使用快速乾燥氰基丙烯酸鹽在載玻片上快速乾燥樣品。使用雙面膠帶，將載玻片固定到AFM的不鏽鋼底盤上，接著磁力安裝到AFM的壓電掃描器上。在AFM微壓的過程中將樣品持續灌注磷酸緩沖液。將額定力常數k=0.12N/m的懸臂和氧化物削尖的Si3N4尖端用於對新收穫的構建體表面施加微壓。通過在Z平面中推動懸臂尖端獲得力譜數據。記錄力分布圖譜包括在懸臂尖端的伸長和收回過程中微壓負載以及在Z平面中相應的位移的數據採集。接著從力譜數據通過下面的Hertz模型計算楊氏模量(E)，其定義了接觸半徑、微壓負載和中心位移之間的關係E=3F(1-v》/4々R53"其中，E是楊氏模量(Young'smodulus),F是所施加的納米機械負載(nanomechanicalload),v是給定區域的泊松比率(Poisson，sratio),R是AFM尖端的曲率半徑，5是壓痕(indentation)的量。確定所有組構建體的楊氏模量值，並與之前所獲得的天然松質骨的類似值進行比較。對不同位置的平均楊氏模量進行統計分析以分別顯示他們的機械'性臺匕fi匕。實施例18:使用雙軸MTS機械測試設備對工程骨進行壓縮和切力性質進4於^l4成測試。收集全部工程骨。使用PBS溶液對所收集的樣品進行清洗，完全吸水以出去過多的水，並使用牙科石膏進行包裹(potted)(LabBuff,MilesDentalProducts,SouthBend,IN)以在測試設備中保護樣品(MTS858MiniBionixIIMachine,MTSCorp.,Minneapolis,MN)。以O.lmm/s的起始負載速度壓縮負載樣品。測量力(N)比位移(mm),並計算每個樣品的彈性模量，E(KPa)。對於切力測試，將側面包裹的骨的末端之一連接到負載軸上，同時使其它側面部分連接到固定臺架(fixedstage)上。對移動軸施加起始低位移(0.01mm/s),相對於固定端移動活動側。使用StationManager軟體測量所得到的剪切模量。對於壓縮和切力負載測試，均研究不同的負載速度以確定對機械測試結果對負棄\還/丈日'、J7-卞J，W且，口水W孰迷乂支7-叮M水,義''"^L乂卞J14rtZ日"3"-王JM載範圍內的負載速度(Collins等人，2004)。實施例19:使用數字X軸和pCT對工程骨進行成像。使用數字X-射線(Faxitron,Wheeling,IL)根據我們公開的途徑(Collins等人2005)對工程骨進行成像。將工程骨固定在10%福馬林中，並使用微型計算機X射線斷層掃描OCT)系統(ViVaCT40,Scanco,Switzerland)以21的解析度利用多層進行成像。將圖像重構成5x5xlmm3體積，並根據從圖像柱狀圖中骨像素和軟組織像素峰之間的谷確定臨界值。對工程骨的幾何寬度進行定量。所有的數值都進行利用Bonferroni檢驗的ANOVA。還通過^CT對鄰接的天然人字形骨(lamboidalbone)進行成像作為工程骨的對照。對天然人字形骨的pCT數據的分析與工程骨相同。實施例20:大通道和bFGF促進宿主組織的新生血管化。進行與在實施例3中所描述相似的實驗，但使用較低的bFGF濃度。將聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)中(MW3400;Nektar,Huntsville,AL,USA)溶解在PBS(6.6%w/v)中，補充133單位/mL青黴素和133mg/mL鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。以50mg/mL的濃度加入光引發劑2-羥基-l-[4-(羥基乙氧基)苯基]-2-曱基-l-丙酮(Ciba,Tarrytown,NY,USA)。使用365nm的UV光對所得到的PEG圓柱體進行光聚合5分鐘(Glo-Mark,UpperSaddleRiver,NJ,USA)。製造總共3種PEG水凝膠結構l)在光聚合PEG水凝膠中穿孔總共3個大通道(直徑lmm)(參見例如圖15A);2)0.5貼批bFGF裝載到PEG水凝膠中，而沒有大通道(參見例如圖15B);以及3)0.5pg/^LbFGF和大通道的組合(參見例如圖15C)。將嚴格組合免疫缺陷(SCID)雄性小鼠(C.B17林；鼠齡4-5星期)通過腹腔注射克他命(100mg/kg)和曱苯噻。秦(4mg/kg)麻醉。修建小鼠背部的毛髮，並置於臥姿，接著使用10%聚維酮碘和70%乙醇進行消毒。沿著背部上中切線(uppermidsagittalline)切除1cm的長線型切口，接著進行鈍器解剖以形成皮下陷凹。每隻SCID小鼠接受三種PEG水凝膠植入物具有大通道但沒有bFGF的PEG,負載bFGF但沒有大通道的PEG,氛者具有bFCiF和大逋道二者的PEG。1更用晉適內/1ii可吸收4-0縫合線縫合切口。在體內植入所有PEG水凝膠圓柱體4星期。在SCID小鼠背部皮下植入4星期之後，收穫PEG水凝膠樣品。。在C02窒息後，在SCID小鼠的背部無菌地切口。在小心地移出周圍纖維嚢後，從宿主分離PEG水凝膠圓柱體，使用PBS清洗，並在10%福馬林中固定24小時。接著將PEG樣品包埋在石蠟中，並以5pm厚度的橫平面進行切片(橫斷大通道，參見圖15A)。使用蘇木精和曙紅對石蠟切片進行染色。製備連續的鄰接切片用於免疫組織化學。將切片進行去石蠟，在PBS中清洗，在室溫下使用牛睪丸透明質酸酶(1600U/ml)在具有150mM氯化鈉的pH5.5醋酸鈉緩沖液中消化30分鐘。所有的免疫組織化學程序遵循我們之前的方法(Mao等人，1998;Alhadlaq和Mao,2005;Sundaramurthy和Mao,2006)。簡言之，在室溫下使用5%的牛血清白蛋白(BSA)對切片處理20分鐘，以阻斷非特異性反應。使用下列抗體抗血管內皮生長因子因子(抗-VEGF)(ABcam,Cambridge,MAUSA)和生物素標記的來自甜菜U〃"wmvw/gar&)(麥芽凝集素)的植物凝血素(WGA)，具有或者不具有其抑制劑乙醯脲酸(actyleuraminicadd)(Sigma,St.Loms，MI,USA)。WGA結合富含a-D-GlcNAc和NeuAc的血管內皮細胞的糖基(Jinga等人，2000;Izumi等人，2003)。在潮溼箱中與初級抗體孵育過夜後，使用PBS清洗切片，並與抗小鼠IgG的二級抗體(1:500;AntibodiesInc.,Davis，CA)孵育30分鐘。接著，將切片與鏈黴素-HRP偶聯物在潮溼箱中孵育30分鐘。在PBS中清洗後，重複使用二級抗體的雙連接程序。使用diaminobenzadine(DAB)溶液產生玻片，並使用Mayer's蘇木精復染色35分鐘。復染色的玻片在梯度乙醇中脫水，並在二甲苯中清洗。除省去一級抗體以外，對陰性對照進行相同的程序。結果顯示，在SCID小鼠背部體內植入4星期後，具有大通道但沒有bFGF的無細胞PEG水凝膠顯示了宿主組織滲透，其僅在大通道的內腔中，而不在PEG的其他位置(參見例如圖15A')。相反，負載bFGF但沒有大通道的無細胞PEG水凝膠明顯具有隨機和獨立的宿主組織滲透的區域(參見例如圖15B')。而具有大通道和bFGF二者的PEG水凝膠則顯示宿主組織向內生長在大通道中而不在PEG的其他位置(參見例如圖15C')。大通道和bFGF二者均缺少的PEG水凝膠顯示沒有宿主/一》—、/j*、-i>,丄一.b,，一、、i_L-、一cTP一'—f.I-、A—/■I>_>_rt厶.、《fe、1、"LI"l_f、--^^-A、,w"JKA""TQ—i—、'J—，_-r"'匕T)T—Il,'V~r~~1*/■卜,*/■U11甲/~~1WITHITrt,',"7T^一A、XtL》、。.J^、個直'J、J，々一yfg'J義'J、—山尺乂1日工-旦"、,八1日/J。/^_0^X4UPEG水凝膠的數據一致(Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;2006)。實施例21:分離和擴增培養人骨髓衍生間充質幹細胞(hMSC)與在實施例9中所列出的程序一致，進行分離和擴增培養人骨髓衍生間充質幹細胞(hMSC)。才艮據之前的方法(參見例如，Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006)，從兩名匿名成年供體的新鮮骨髓樣品分離人MSC(AllCells,Berkeley,CA)。將骨髓樣品轉移到50mL管後，加入總共750RosetteSep(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada),並在室溫下孵育30分鐘。接著加入15mL在20/)FBS和lmMEDTA溶液中的PBS到骨髓樣品中，達到總體積為大約30ml。接著將骨髓樣品在15mLFicoll-Paque(StemCellTechnologies)上分層，並在室溫下3000g離心25分鐘。將整個富集的細胞層從Ficoll-Paque界面取出。將混合物以lOOOrpm離心10分鐘。將溶液抽吸到500^LDulbecco'sModifiedEagle'sMedium(Sigma-AldrichInc.StLouis,MO),其中Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium^卜充了10%月臺牛血清(FBS)(AtlantaBiologicals,Lawrenceville,GA)和1%抗生物-抗真菌劑(Gibco，Carlsbad,CA),在後面將其稱作基礎培養基。對所分離的單核細胞計數，按照大約每lOOmmPetri盤0.51x106個細胞鋪平板，並在基礎培養基總37。C下5%。02中聘育。24小時候，除去非貼壁細胞，並使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次，通過每隔一天更換新鮮培養基孵育12天(25)。90%匯合之後，使用0.25%胰蛋白酶和lmMEDTA在37。C下5分鐘從平板取出細胞，並重新鋪在100mmPetri盤中，#皮稱作1代細胞。實施例22:人間充質幹細胞分化成生脂細胞。根據之前的方法(參見例如，Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005,2006;Marion和Mao,2006),通過暴露到成脂培養基，二代和三代hMSC被誘導分化成生脂細胞，其中所述成脂培養基由被補充0.5地塞米松、0.5juM異丁基甲基黃噪呤(IBMX)和50jiM茚甲新的基礎培養基構成。在基礎培養基中連續培養hMSC的亞群，也是在95%空氣和5%C02中37。C下，每隔一天更換培養基。使用油紅O染色(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)確認脂肪生成(脂肪形成)。為了體夕卜檢驗脂肪生成分化，使用成脂培養基處理hMSC最高達到5星期。將使用或不使用脂肪生成分化的單層培養hMSC固定在10%福馬林中，並進行油紅O染色。在反相顯微鏡下以IOX放大倍數檢測平板脂肪泡的存在或缺少。結果顯示經過離體培養的35天，人間充質幹細胞在體外分化成生脂細胞(參見例如圖16)。與沒有脂肪生成分化的hMSC相比(參見例如圖16A-17E),hMSC衍生生脂細胞與油紅O染色陽性反應，並且經過35天日益增多(參見例如圖16F-17J)。這與之前的數據一致，之前的數據顯示在成脂培養基中處理低於2星期後，hMSC衍生生脂細胞表達PPAR-i^(參見例如，Alhadlaq等人，200》。經過所觀察的35天，在hMSC和hMSC衍生生脂細胞之間，培養樣品的總DNA含量缺乏統計顯著差異。然而在培養的第28天和35天，hMSC衍生生脂細胞的甘油含量顯著地比hMSC高，這暗示hMSC衍生生脂細胞在體外逐步聚集細胞內脂肪泡。實施例23:在PEG水凝膠中封裝hMSC衍生生脂細胞並體內植入。在利用上述在PEG水凝膠中具有大通道和生物活性因子的模型系統的平行實驗中(參見實施例3),hMSC和hMSC衍生生脂細胞被封裝以確定是否工程大通道和bFGF促進血管化脂肪形成。將PEG水凝膠溶解在無菌PBS中，補充100U/ml青黴素和100pg/ml鏈黴素(Gibco，Carlsbad,CA)達到10％的最終溶液。光引發劑2-羥基-l-[4-(羥基乙氧基)苯基]-2-曱基-l-丙酮(Ciba,Tarrytown,NY,USA)加入到PEGDA溶液中。在基礎培養基中成脂肪分化或培養1星期後，使用0.25%胰蛋白酶和ImMEDTA在37。C下5分鐘從培養平板取出hMSC或hMSC衍生生脂細胞，並以3x1(^個細胞/mL的密度分別重懸浮在PEG聚合物/光引發劑溶液中。將一份75^1細胞/聚合物/光引發劑懸浮液加載到0.075mL微離心管(6x4mm:直徑x高.度)的無菌塑料帽中(FisherScientific,Hampton,NH),接著使用長波365nm紫外燈(Glo-Mark,UpperSaddleRiver,NJ)大約4mW/cm2的強度進行光聚合5分鐘。從塑料帽取出光聚合的細胞-PEG構建體，並轉移到相應成脂肪培養基的12孔平板中。在光聚合之前，將總共0.5pg/|LiLbFGF負載到PEG水凝膠中。根據上面所述的途徑形成3個大通道(參見實施例20)。在無胸腺棵鼠的背部皮下植入12星期後，收穫PEG水凝膠圓柱體。所有的組織處理、組織學和免疫組織化學程序與上述相同(參見實施例20)。結果顯示PEG水凝膠不允許細胞滲透(參見例如圖18A')。這些發現與之前的研究一致(參見例如，Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;2006)。然而負載所工程化大通道和bFGF的PEG水凝膠不僅顯示較深的顏色，而且在橫平面具有3個紅圏(參見例如圖18B')。進一步，具有大通道和bFGF二者並被接種hMSC衍生生脂細胞的PEG水凝膠顯示不僅有較深的顏色，而且還有紅圈(參見例如圖18C)。在組織學和免疫組織化學檢驗之後，封裝hMSC衍生生脂細胞以及構建的大通道和bFGF的PEG水凝膠顯示了形成組織島(參見例如圖19A)。如在圖19B中所顯示的，許多工程組織島是油紅陽性的，這暗示存在脂肪生成。抗VEGF抗體在明顯間質組織中顯示陽性染色(參見例如圖19C),而抗WGA凝集素抗體定位在工程脂肪組織的附近(參見例如圖19D),這暗示工程新生血管會促進脂肪生成。實施例24:血管內皮細胞的分子標記血管祖細胞被分析血管內皮生長因子2或Flk1的表達，二者均為血管內皮細胞的分子標記物。與在實施例2中所描述的一致，進行造血幹細胞分離、培養、分化和標記。結果顯示與緩沖溶液(buffersulocation)不表達VEGF/Flkl相比，血管祖細胞(第一列中的1代細胞，和第2列中的2代細胞^皮發現表達血管內皮細胞生長因子2或Flk1二者(參見例如圖20)。VEGF2含量的定量顯示PI和P2細胞均表達比緩衝基質顯著多的VEGF2(參見例如圖21)。這些數據證明正如通過兩種內皮細胞標記物VEGF和Flkl的表達所證明的，從人骨髓分離的HSC能夠分化成內皮細胞類細胞。實施例25:細胞標記實驗。對被接種骨祖細胞和血管祖細胞的多孔(3TCP支架進行分析，兩種細胞類型的同時佔據。支架輸注祖細胞的方法與實施例1所描述的方法一致。結果顯示綠色螢光蛋白(GFP)標記的骨祖細胞與紅色CM-Dil標記的血管祖細胞同時佔據在多孔(3TCP支架內(參見例如圖22)。如上所述，體內植入接種骨祖細胞和血管祖細胞的PTCP支架產生了形成血管化骨，(參見例如，實施例1;圖2)。這些數據證明被共同接種在生物兼容材料不同空間區域中的人骨祖細胞和血管祖細胞在共同佔據支架的同時，能夠成功地分別分化成骨和血管組織。附件所引用的文獻AWtezO,BenharashP，MehrotraM,MiyamotoE,GaleA,PicquetJ,XuC,ZarinsC(2006》Anovelculturesystemshowsthatstemcellscanbegrownin3Dandunderphysiologicpulsatileconditionsfortissueengineeringofvasculargrafts.JSurgRes132:170-178，AlbertsB，JohnsonB,LewisJ，RaffM,RobertsK,WalterP(2002)MolecularBiologyoftheCell.4thEd，NewYork,GarlandPublishing,pp.1183-1184.AlhadlaqA,ElisseeffJH,HongL，WilliamsCG,CaplanAl,SharmaB'KopherRA,TomkoriaS,LennonDP,LopezA，MaoJJ(2004)Adultstemcelldrivengenesisofhuman-shapedarticularcondyle.AnnBtomedEng32:911-923.AlhadlaqA,MaoJJ(2003)Engineeredneogenesisofhuman-shapedmandibularcondylefromratmesenchymalstemcel,s，JDentRes82:951-956,AlhadlaqA,MaoJJ(2004)Mesenchymalstemcells:Isolationandtherapeutics.StemCellsDev13:436>448.AlhadlaqA,Mao(2005)OsteochondralTissueEngineering-RegenerationofArticularCondylefromMesenchymalStemCells.InMaPX,曰isseeffJH(Ed)ScaffoldingforTissueEngineering,Taylor&Francis,BocaRaton,FL，pp.545-564.AlhadlaqA,MaoJJ(2005)Tissue-engineeredosteochondralconstructsintheshapeofanarticularcondyle,JBoneJointSurgAm87:936-944.Alhadlaq,A,and丄丄M曰o,Tissue-engineeredneogenesisofhuman-shapedmandibularcondylefromratmesenchymalstemcells,JDentRes82:951-956,2003.Alhadlaq,A.,and丄丄Mao，Mesenchymalstemcells:Isolationandtherapeutics.StemCellsDev.13:436~448,2004.Alhadlaq,A,，丄H.Elisseeff,LHong,C.G.Williams,A丄Captan，B.Sharma,R.A.Kopher，S.Tomkorla,D.P.Lennon,A>Lopez,丄丄Mao,Adultstemcelldrivengenesisofhuman-shapedarticularcondyle.AnnBiomedEng32:911-923,2004.Alhadlaq,A.，M,H.Tang，丄丄Mao.Engineeredadiposetissuefromhumanmesenchymalstemcellsmaintainspredefinedshapeanddimension:implicationsinsofttissueaugmentationandreconstruction.TissueEng.11:556-66,2005.AllenDM,MaoJJ(2004)Heterogeneousnanostructuralandnanoelasticpropertiesofpericellularandinterterritorialmatricesofchondrocytesbyatomicforcemicroscopy.JStructBiol145:196-204.AlmubarakR,DasHveiraA,MaoJJ(2005)Expressionandmechanicalmodulationofmatrixmetalloproteinase1and2genesinfacialandcranialsutures-Cell&TissRes321:465-471.AlsbergE，AndersonKW,AlbeirutiA,RowleyJA，MooneyDJ(2002>Engineeringgrowingtissues,ProcNatlAcadSciUSA17鄰:12025-12030.Anusaksathien,O.'andW.V.Giannobile.Growthfactordeliverytor的ngineeringperiodontaltissues.CurrPharmBiochnol3:129-139，2002.AraiF,HiraoA，SudaT(2005)Regulationofhematopoiesisanditsinteractionwithstemcellniches.IntJHemato，82:371-376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管祖細胞的組合。4.權利要求2-3任一項的方法，其中所述組合是在離體進行。5.權利要求3-4任一項的方法，其中所述孵育包括離體孵育。6.權利要求3-5任一項的方法，其中所述孵育包括體內孵育。7.權利要求l-6任一項的組件或方法，其中所述組織祖細胞選自下列間充質幹細胞(MSC)、MSC衍生細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、神經元細胞、神經"交質細胞、成纖維細胞、心肌細胞、肝細胞、腎細胞、膀胱細胞、P-胰島細胞、成牙質細胞、牙髓細胞、牙周細胞、腱細胞、肺細胞、心臟細胞及其組合。8.權利要求7的組件或方法，其中所述成纖維細胞選自下列間質成纖維細胞、腱成纖維細胞、韌帶成纖維細胞、牙周成纖維細胞和顱面成纖維細^^。9.權利要求1-8任一項的組件或方法，其中所述組織祖細胞是MSC軟骨細胞。10.權利要求1-9任一項的組件或方法，其中所述組織祖細胞是MSC。11.權利要求1-10任一項的組件或方法，其中所述血管3且細胞選自下列造血幹細胞(HSC)、HSC內皮細胞、血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、培養內皮細胞、原代培養內皮細胞、骨髓幹細胞、脊索細胞、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、淋巴腺內皮細胞、內皮祖細胞、分化成內皮細胞的幹細胞、平滑肌細胞、間質成纖維細胞和肌成纖維細胞。12.權利要求1-11任一項的組件或方法，其中所述血管祖細胞是HSC。13.權利要求1-11任一項的組件或方法，其中所述血管祖細胞是HSC內皮細胞。14.權利要求1-13任一項的組件或方法，其中所述基質包括選自下列的材料纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白、氰基丙烯酸酯、高分子水凝膠和其組合。15.權利要求1-14任一項的組件或方法，其中所述基質包括高分子水凝膠。16.權利要求1-15任一項的組件或方法，其中所述基質包括至少一個物理通道。17.權利要求16的組織組件或方法，其中所述基質包括多個平均直徑為至少大約O.lmm至最高達大約50mm的物理通道。18.權利要求17的組織組件或方法，其中所述多個物理通道具有下列平均直徑大約0.2mm、大約0.3mm、大約0.4mm、大約0.5mm、大約0.6mm、大約0.7mm、大約0.8mm、大約0.9mm、大約l.Omm、大約l.lmm、大約1.2mm、大約1.3mm、大約1.4mm、大約1.5mm、大約1.6mm、大約1.7mm、大約1.8mm、大約1.9mm、大約2.0mm、大約2.5mm、大約3.0mm、大約3.5mm、大約4.0mm、大約4.5mm、大約5.0mm、大約5.5mm、大約6.0mm、大約6.5mm、大約7.0mm、大約7.5mm、大約8.0mm、大約8.5mm、大約9.0mm、大約9.5mm、大約10mm、大約15mm、大約20mm、大約25mm、大約30mm、大約35mm、大約40mm或者大約45mm。19.權利要求1-18任一項的組件或方法，其中所述基質還包含生長因子或將生長因子引入到所述基質材料的步驟。20.權利要求18的組件或方法，其中所述生長因子是血管生成生長因子。21.權利要求19-20任一項的組件或方法，其中所述生長因子選自bFGF、VEGF、PDGF、TGFb和其組合。22.權利要求1-21任一項的組件或方法，其中所述組件包括祖細胞，所述祖細胞的密度為至少大約0.0001x100萬個細胞(M)ml"至最高達大約1000Mmr1。23.權利要求22的組件或方法，其中所述祖細胞以下列密度出現在基質中大約1Mml"、大約5Mml"、大約10Mml"、大約15Mmr、大約20Mml—1、大約25Mmr1、大約30Mmr1、大約35Mmr1、大約40Mmr1、大約45Mmr1、大約50Mmr1、大約55Mml—1、大約60Mmr1、大約65Mmr1、大約70Mmr1、大約75Mmr1、大約80Mml"、大約85Mmr1、大約90Mml"、大約95Mml"或大約100Mml:24.權利要求1-23任一項的組件或方法，其中血管祖細胞與組織祖細胞的比例為大約100:l至最高達l:100。25.權利要求24的組件或方法，其中血管祖細胞與組織祖細胞的比例為大約20:1、大約19:1、大約18:1、大約17:1、大約16:1、大約15:1、大約14:1、大約13:1、大約12:1、大約11:1、大約10:1、大約9:1、大約8:1、大約7:1、大約6:1、大約5:1、大約4:1、大約3:1、大約2:1、大約1:1、大約1:2、大約1:3、大約1:4、大約1:5、大約1:6、大約1:7、大約1:8、大約1:9、大約1:10、大約1:11、大約1:12、大約1:13、大約1:14、大約1:15、大約1:16、大約1:17、大約1:18、大約1:19或者大約1:20。26.治療組織或器官缺陷的方法，其包括將權利要求1或6-15任一項的組件移植到有此需要的個體內。27.鑑定提高組織血管化的候選分子的方法，其包括將基質、組織祖細胞、血管祖細胞、其組合或權利要求1或7-26任一項的組織組件與候選分子接觸；孵育所述組織組件；以及測量所述組織組件的血管化。28.權利要求27的方法，其還包括測定相對於未與候選分子接觸的對照組織組件，在所述組織組件中，血管化是否提高。29.鑑定降低組織血管化的候選分子的方法，其包括將基質、組織祖細胞、血管祖細胞、其組合或權利要求1或7-26任一項的組織組件與候選分子接觸；孵育所述組織組件；以及領'J量所述組織組件的血管化。30.根據權利要求29的方法，其還包括測定相對於未與候選分子接觸的對照組織組件，在所述組織組件中，血管化是否降低。31.權利要求l-30任一項的組件或方法，其中所述組織組件是骨、脂肪、膀胱、腦、乳房、骨軟骨連接處、中樞神經系統、脊髓、外周神經、神經膠質、食道、輸卯管、心臟、胰腺、腸、膽嚢、腎、肝、肺、卵巢、前列腺、脾、骨骼肌、皮膚、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、間質軟組織、骨膜、牙周組織、顱縫、毛嚢、口腔黏膜或子宮組織組件。32.權利要求1-31任一項的組件或方法，其中所述組織組件是骨組織組件。33.權利要求1-31任一項的組件或方法，其中所述組織組件是脂肪組織組件。全文摘要發現通過組織祖細胞和血管祖細胞的聯合作用，血管化組織或器官能夠被建造。本發明提供了針對工程血管化組織或器官的組合物和方法，所述工程血管化組織或器官是通過將組織祖細胞和血管祖細胞引入到基質材料的生物相容性支架內或其上所形成的。還提供了用於治療組織缺陷的方法，其通過將這些組合物移植到有此需要的個體中。文檔編號A61F2/01GK101534747SQ200780026277公開日2009年9月16日申請日期2007年7月10日優先權日2006年7月10日發明者J·J·毛申請人:哥倫比亞大學