具有乾燥的基因沉默組合物的儀器和系統的製作方法

2023-06-15 09:29:31 3

專利名稱：具有乾燥的基因沉默組合物的儀器和系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於RNA幹擾的儀器和系統。具體來說，本發明涉及一種包括多孔板的儀器和系統，該多孔板具有含有siRNA的乾燥的基因沉默組合物。
2.相關的技術 最近，發現了一種使用轉錄的微小RNA(「miRNA」)來控制蛋白質生產的天然細胞調控通路。該miRNA包括一個有義和反義RNA組成的雙鏈區域。這個調控通路使用miRNA來靶向互補的mRNA以抑制該編碼蛋白質的生產。相應地，一個複雜系列的蛋白質參與到這個RNA幹擾通路中以抑制或者阻止由mRNA編碼蛋白質的生產。因而，該過程被稱為RNA幹擾或者RNAi。
另外，已經發現該RNAi通路能夠使用合成的dsRNA(例如，siRNA)來沉默基因和抑制蛋白質的表達。這樣就可以製造具有特異序列的siRNA以靶向編碼特定蛋白質的互補DNA和/或mRNA。該siRNA可以與天然的RNAi通路相互作用以沉默靶基因並且抑制其編碼多肽的生產。該沉默特異基因並抑制其編碼蛋白質生產的能力已經被用於基礎研究，例如基因功能、基因定位、細胞通路的分析以及其它與基因相關的研究。
為了誘導基因沉默，需要將siRNA導入細胞。儘管將核酸導入細胞的最常用方法是正向轉染(forward transfection)，但新近開發出的反向轉染(「RTF」)已經用來代替正向轉染方法。在某些的RTF操作方案中，可以製備脂質-核酸的複合物(例如，lipoplex)並且引入到多孔板上的測試孔中。將細胞引入具有脂質-核酸複合物的測試孔中，溫育就可以使siRNA進入細胞。一些RTF操作方案的例子可以在下述文獻中找到Palsson的美國專利號5,811,274，Palsson的5,804,431以及Sabatini的6,544,790，Sabatini的已經公布的美國申請2002/0006664以及Caldwell等人的2003/070642。正如這些參考文獻所描述的，用於核酸的RTF方法通常可以具有比傳統的正向轉染更少的步驟並且有益於分離已被轉染的細胞至單一表面--例如載玻片--的特定區域。然而用於siRNA的RTF方法還沒有優化到實際應用的程度，並且仍需要對基因沉默功效進行改進，尤其在那些使用多鐘不同的siRNAs、不同的基因靶目標、或者不同的細胞系的情形更是如此。
因此，獲得一種用於將siRNA轉運入細胞並通過RNAi途徑產生基因沉默的改良RTF操作方案是有益的。另外，將RTF方式(包括RNAi)調配成提高基因沉默功效的方式是有益的。
發明概述 總的來說，本發明的具體實施方案中包括多孔板、試劑盒、系統以及相應的使用方法以在細胞中引起基因沉默。相應地，本發明提供多孔板、試劑盒以及系統，其構成了用於遞送siRNA進入細胞並通過RNAi途徑引起基因沉默的改進的RTF操作方案。另外，該多孔板、試劑盒以及系統可包括在RTF操作方案中應用的以在反向轉染期間提高穩定性的方式而配置的siRNA。此外，本發明包括使用所述的多孔板、試劑盒以及系統的方法。
在一個具體實施方案中，本發明包括一個被配置用於引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的反向轉染儀器。此儀器包括一個多孔板，該多孔板具有配置用於轉染細胞的孔。該孔包括一個基本上乾燥的基因沉默組合物，其具有至少一種用於沉默至少一種第一靶基因的第一siRNA。該基因沉默組合物是按照使siRNA能夠以足夠轉染孔中細胞的量溶解或者懸浮於含水培養基中配置的。可選擇地，基因沉默組合物中siRNA的總量足以用於在一個孔中進行反向轉染。另外，可選擇地該siRNA可具有帶有一個環的發卡結構、修飾或者結合物中的至少一種。並且，可以合理地(rationally)設計siRNA使之以不會誘導對非靶基因的顯著沉默的有效方式特異地沉默靶基因，而。此外，該基因沉默組合物可以包括一個siRNAs庫，其靶向同一靶基因的不同多核苷酸。
在一個具體實施方案中，本發明提供一試劑盒或者系統，其包括一個具有與上述任意特性一致的多孔板。另外，這樣的一個試劑盒或者系統可以包括多核苷酸載體。該多核苷酸載體可以是陽離子脂質體、多聚體、多肽、脂多聚體(lipopolymer)、脂質-多肽複合物等等。另外，該試劑盒或者系統包括多種增溶的溶液、試劑、細胞培養基等等，在此將更詳細地論述。
在一個具體實施方案中，本發明包括一種以用於將siRNA引入細胞而引起基因沉默的反向轉染方法。此方法包括提供一個具有上文表徵的多孔板。可向該孔中添加一種含水培養基以便懸浮或者溶解該基因沉默組合物和/或siRNA於該溶液。另外，細胞在允許siRNA進入細胞的條件下被添加至該孔中。例如，細胞可以每大約0.3平方釐米至大約0.35平方釐米細胞生長表面積大約1×103至大約3.5×104個細胞添加至96孔板的不同孔中，或更優選的是2×103至大約3×104個細胞。
在一個具體實施方案中，該方法包括向孔中添加一個多核苷酸載體以便形成siRNA-載體複合物。該siRNA-載體複合物可以是懸浮或者溶解在含水培養基中，並且可以與細胞接觸並可通過任意的內吞作用過程來誘導進入該細胞。因此，該多核苷酸載體可以作為含水培養基的一部分或者另外添加至該孔中。該多核苷酸載體可以是陽離子脂質，多聚體，脂多聚體，多肽，抗體-多肽結合物等等。另外，還可以使用其他多核苷酸轉運方法將siRNA轉運入細胞，包括電穿孔法，沉澱法，物理轟擊，光穿孔(optoporation)等等。
在孔中細胞與siRNA組合物結合之後，將多孔板在一定條件下溫育，使細胞生長、分裂和/或發生基因沉默。所述的一定條件即是本領域公知的常用的普通細胞培養條件。這樣，siRNA可以沉默靶基因並且抑制至少50％，更優選地至少70％，並且最優選地至少90％的靶多肽的生產。
這些及其它具體實施方案以及本發明的特徵將在下面的說明書和所附的權利要求中得到充分體現，或者可以通過下文所述的本發明的實例中獲悉。
附圖簡述 為了更進一步地闡明本發明的以上所述的及其它的優點和特徵，通過參考附圖所說明的特定具體實施方案可以提供一份更詳細的本發明的描述。值得注意的是這些附圖僅僅描述的是本發明的典型具體實施方案並不限定本發明的範圍。通過使用附圖，本發明可以用附加的特性和細節來描述和解釋，其中

圖1A是顯示一個將siRNA安裝在多孔板上的具體實施方案的示意圖，其中siRNA庫(「P1」)與組成該庫(例如，1A-1N，2A-2N，3A-3N)的單獨siRNA一起被置於多孔板上。
圖1B是顯示一個將siRNA安裝在多孔板上的具體實施方案示意圖，其中多於一個的庫(P1和P2)與組成該庫(例如，1A-1N，2A-2N，等等)的單獨siRNA和對照(例如，Tc1，Tc2，和Tc3)一起被置於多孔板上。
圖2A-2F是通過細胞生活力和基因沉默功效來比較DNA和RNA的RTF的具體實施例的圖示。圖2A是在正向轉染操作方案中的螢光素酶表達的具體實施方案，其中HeLa細胞以每孔10,000個的數量置於PLL板中並且用LIPOFECTAMINETM2000-pCMV-Luc複合物轉染以證明該pCMV-Luc表達載體的功能。圖2B是在圖2A描述的條件下來研究細胞生活力的一個具體實施方案，其中Y軸代表存活率的相對水平，1.0表示100％生活力。圖2C是用使用多種脂質(LIPOFECTAMINETM 2000，OLIGOFECTAMINETM，Transit TKO，和siRNA168(168))和質粒濃度的pCMV-Luc質粒反向轉染操作方案的具體實施方案，其中HeLa細胞是每孔10,000個細胞，並且螢光素酶表達水平是在利用STEADYGLOWTM試劑盒24小時後測定的。圖2D是是在圖2C描述的條件下研究細胞生活力的一個具體實施方案，其中1.0表示100％生活力。圖2E是利用LIPOFECTAMINETM 2000，OLIGOFECTAMINETM，TKO或siRNA168脂質進行基因沉默的環3siRNA(cyclo 3 siRNA)的反向轉染的具體實施方案，其中Y軸代表與對照相比的基因表達水平，1.0是100％表達。圖2F是由圖2E中所描述的條件下的細胞生活力結果的具體實施方案。
圖3A-3F是關於在siRNA RTF中siRNA功能的效果的具體實施方案的圖示。四種具有不同的沉默功能(例如，分別為95％，90％，75％，和＜50％的沉默)的不同siRNA(例如，cyclo 3，14，28，和37)以不同的濃度塗布用於RTF。加入不同量的DharmaFECTTM1脂質使得每100微升(「μL」)含有0-0.5微克(「μg」)的脂質。siRNA的溶解以及複合之後，每孔添加10,000個HeLa細胞並培養(例如，1、2或4天)。以RTF方式進行的siRNA的功能的效果是通過分析在圖3A、3C和3E中的親環素B沉默，以及在圖3B、3D和3F中細胞生活力來評價的。對於細胞存活率測量，Y軸代表存活率的相對水平，1.0是100％生活力。對於基因沉默，Y軸代表與對照相比的基因表達水平，1.0是100％表達。
圖4通過微陣列分析確定siRNA誘導的非靶向沉默的具體實施方案的熱圖(heatmap)。由括號區域突出顯示的頂部淺色線代表下調的基因，其被未修飾的IGFR1-73 siRNA非目標靶向。該底線表明當IGFR1-73 siRNA進行化學修飾後非靶向的數目顯著地減少。
圖5是化學修飾的siRNA對細胞生活力的影響的具體實施方案的圖示。
圖6是溴化乙錠染色凝膠顯示修飾的和未修飾的siRNA降解率的具體實施方案的圖像，其中包括用重疊線來更好地顯示非降解siRNA。
圖7提供了通過顯示四種不同的修飾的和未修飾的siRNA的降解動力學來評估血清中的RNA酶是否具有降解未修飾的和修飾的siRNA能力的具體實施方案的圖示。
圖8是未修飾的和穩定修飾的siRNA的沉默持久性的具體實施方案的圖示，其中DF1是DharmaFECTTM1。
圖9A是使用LIPOFECTAMNETM 2000以及穩定的和不穩定的siRNA的細胞生活力的具體實施方案的圖示。
圖9B是圖9A所示條件下基因沉默的具體實施方案的圖示。
圖10A是使用TKO以及穩定的和不穩定的siRNA的細胞生活力的具體實施方案的圖示。
圖10B是圖10A所示條件下基因沉默的具體實施方案的圖示。
圖11A是使用DharmaFECTTM1以及穩定和不穩定的siRNA的細胞生活力的具體實施方案的圖示。
圖11B是圖11A所示條件下基因沉默的具體實施方案的圖示。
圖12是使用單個和成庫的siRNA進行多基因沉默具體實施方案的圖示。
圖13A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第2天的每個孔中5,000個HeLa細胞產生基因沉默的具體實施方案的圖示。
圖13B是圖13A條件下細胞生活力的圖示。
圖14A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第4天的每孔中5,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。
圖14B是圖14A條件下細胞生活力的圖示。
圖15A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第8天的每孔中5,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。。
圖15B是圖15A條件下細胞生活力的圖示。
圖16A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第1天的每個孔中10,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。。
圖16B是圖16A條件下細胞生活力的圖示。
圖17A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第2天的每個孔中10,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。。
圖17B是圖17A條件下細胞生活力的圖示。
圖18A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第4天的每個孔中10,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。。
圖18B是圖18A條件下細胞生活力的圖示。
圖19A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第1天的每個孔中20,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。
圖19B是圖19A條件下細胞生活力的圖示。
圖20A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第2天的每個孔中20,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。
圖20B是圖20A條件下細胞生活力的圖示。
圖21A是多種DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度和對照siRNA濃度的siRNA RTF對實驗第1天的每個孔中40,000個HeLa細胞產生基因沉默的一個具體實施方式
的圖示。
圖21B是圖21A條件下細胞生活力的圖示。
圖22是具有不同LIPOFECTAMINETM2000濃度和對照siRNA濃度(例如修飾的siRNA和未修飾的)的細胞培養基和緩衝液的siRNA RTF對細胞生活力影響的具體實施方式
的圖示。
圖23A是使用多種LIPOFECTAMINETM2000和DharmaFECTTM1(「DF1」)濃度以及多種對照siRNA濃度(例如靶向SRD5al基因的修飾的siRNA和未修飾的siRNA)的siRNA RTF對細胞生活力的一個具體實施方式
的圖示。
圖23B是圖23A條件下基因沉默的具體實施方案的圖示。
圖24A-24C是在siRNA RTF操作方案中比較針對不同濃度的GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1的單個siRNA和siRNA庫的效力的具體實施方式
的圖示。
圖25A-25C是在siRNA RTF操作方案中比較針對不同濃度的接GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1的單個siRNA和siRNA庫的效力的具體實施方式
的圖示。圖25A顯示在有GAPDH雙鏈體1、MAP2K2雙鏈體1以及MAP2K1雙鏈體1(1，1&1)存在的情況下GAPDH的敲低(knockdown)；以及在有GAPDH雙鏈體2、MAP2K2雙鏈體2以及MAP2K1雙鏈體2(2，2&2)存在的情況下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH雙鏈體4、MAP2K2雙鏈體4以及MAP2K1雙鏈體3(4，4&3)存在的情況下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH雙鏈體5、MAP2K2雙鏈體7以及MAP2K1雙鏈體4(5，7&4)存在的情況下GAPDH的敲低；以及在有由之前提到所有的雙鏈體組成的GAPDH、MAP2K2以及MAP2K1庫存在的情況下GAPDH的敲低。圖25B顯示在所有圖25A中描述的雙鏈體組合存在條件下MAP2K2的敲低。圖25C顯示在所有圖25A中描述的雙鏈體組合存在條件下MAP2K1的敲低。
優選實施方案的詳述 總的來說，本發明涉及一種用於在細胞中實現基因沉默的儀器和系統。其儀器包括孔中具有包含有siRNA的乾燥基因沉默組合物的多孔板，此組合物在用於RTF操作方案中時可以是溶解或者是懸浮的。其系統，可以以試劑盒形式提供，包括多孔板和多核苷酸載體，該載體可以與siRNA結合從而形成能夠進入細胞的轉染複合物，從而轉運siRNA。另外，試劑盒包括siRNA的增溶用含水培養基或者懸浮用含水培養基、在相應載體溶液中的多核苷酸載體以及細胞培養基等等。
本發明的多孔板、系統、試劑盒以及方法可以配置而在使用或不使用實驗室自動化設備的高容量篩選(「HCS」)和高通量篩選(「HTS」)中使用。並且，該多孔板、系統、試劑盒和方法還可以和自動化系統一起使用，例如機器人系統。然而，該多孔板、系統、試劑盒和方法也可以在沒有自動化遞送系統或者機器人的輔助下用於RTF操作方案，這樣便為手工操作的實驗室提供了一種有效替代昂貴機器人遞送系統的方法。因而，該多孔板、系統、試劑盒以及方法提供多種選擇使得高通量篩選可通過更經濟的方式實現。
在本文定義的下列術語用辭是用於闡明描述本發明具體實施方案所使用的術語而不用來限制其範圍。因此提供的下列術語用辭是用於幫助相關領域技術人員對這些詞語的理解。
在本文使用的術語」2』修飾」是指發生在核苷酸第二位原子上的化學修飾。因此，2』修飾可以包括化學修飾基團與核苷酸的核糖環的2』碳的結合，或者與寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的2』碳相結合。因此，2』修飾發生在核苷酸的2』位原子上。
在本文使用的術語「脂肪族的」是指一種烴基部分，例如一種烷基，其可以是直鏈的或者支鏈的、飽和的或者非飽和的、和/或取代的或者未被取代的，其主鏈上具有二十個或更少的碳或者雜原子。脂肪族基團可以包括直鏈的、支鏈的、環狀的和/或雜環的基團，可以包括功能性基團例如醚、酮、醛、羧化物等等。在脂肪族基團內的取代可以包括任意脂肪族基團可容許原子或者基團，包括但不限於滷素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯、仲或者叔)、醯胺、醚、酯、醇、氧等等。而且，脂肪族基團也可以容納異種取代，其是通過例如氮、氧、磷或者硫等雜原子對於碳原子的取代。
在本文使用的術語「烷基」是指在一條鏈上兼備碳和氫的烴基部分。優選地，烷基部分僅僅由氫和碳組成。烷基部分可以是直鏈性的、分枝的和/或環狀的。優選地該烷基部分是非支鏈的和非環狀的，是完全地飽和的，並且是未被取代的。
示例性的烷基包括但是不局限於以下部分，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基和具有更多碳原子數的烷基，以及2-甲基丙基、2-甲基-4-乙基丁基、2，4-二乙基丙基、3-丙基丁基、2，8-二丁基癸基、6，6-二甲基辛基、6-丙基-6-丁基辛基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基己基、異丙基、異丁基、異戊基等等。術語烷基也包括烯基基團，例如乙烯基、烯丙基、芳烷基和炔基基團。可以用任意合適的原子置換烷基，只要這樣的置換不會與烷基被替換分子的功能發生實質上的牴觸。
在本文使用的術語「反義鏈」是指一個至少基本上(例如，大約80％以上)互補於或者100％互補於所感興趣的靶核酸的多核苷酸或者多核苷酸區域。並且，dsRNA的反義鏈和其有義鏈是互補的。反義鏈可以由一個多核苷酸區域組成，該多核苷酸是RNA、DNA或者嵌合的RNA/DNA。另外，在反義鏈之內的任意核苷酸可以通過包括與其偶聯的取代基(例如2』修飾)而被修飾。反義鏈可以被不同類的小分子和/或結合物來修飾。例如，反義鏈可以是完全或者部分地互補於信使RNA(「mRNA」)分子，非mRNA的RNA序列包括非編碼RNA(例如，tRNA和rRNA)，或者編碼或非編碼的DNA序列。術語「反義鏈」和「反義區域」是同等的並且可互換地使用。
在本文使用的術語「互補(的)」和「互補性」是指多核苷酸相互間形成鹼基對的能力。鹼基對一般地是由在反向平行多核苷酸鏈上的核苷酸單位之間形成氫鍵而形成的。互補的多核苷酸鏈可以按照Watson-Crick方式(例如，A對T，A對U，C對G)，或者其它任意允許二聚體形成的方式形成鹼基對。正如所屬技術領域的技術人員所熟知的，當使用RNA與DNA相對應時，尿嘧啶是與腺嘌呤核苷的互補鹼基，而不是胸腺嘧啶。
完全互補或者100％互補是指那種一個多核苷酸鏈的每個核苷酸單元都可以與反向平行的多核苷酸鏈的核苷酸單元形成氫鍵的情況。不夠理想的互補是指那種兩個鏈的一些而不是所有的核苷酸單元可以互相形成氫鍵的情況。例如，對於兩個20單體的多核苷酸鏈，如果只有每個鏈的兩個鹼基對可以互相形成氫鍵，該多核苷酸鏈展現出10％的互補性。在相同的例子中，如果每個鏈的18個鹼基可以互相形成氫鍵，該多核苷酸鏈展現出90％的互補性。「基本互補」是指多核苷酸鏈展現79％或者更高的互補性，其中排除多核苷酸鏈中的一些區域，例如突出端，該突出端是經過挑選以造成非互補性的。相應地，互補性並不考慮經挑選出來的且不與反向平行鏈的核苷酸相似或互補的突出端。
在本文使用的術語「結合物」是指一個分子、大分子或者大分子結構，其與siRNA的有義鏈或者反義鏈偶聯。也就是說，與siRNA偶聯在一起的部分被認為是結合物。為了澄清的目的，siRNA可以包括通過共價鍵、離子相互作用等偶聯的結合物。通常，結合物結合至siRNA是為了賦予功能，而不是增加穩定性或者靶特異性。例如，結合物如膽固醇，可用於提高siRNA進入細胞的能力。其他的結合物可以是用於檢測轉染或者細胞中siRNA的標籤。通常，結合物是通過接頭基團與siRNA偶聯在一起。
在本文使用的術語「脫氧核苷酸」是指在其糖基部分2』位置上缺乏一個羥基(例如，OH基團)的核苷酸。作為替代，一個氫結合到2』碳。因此，包含一或多個脫氧核苷酸的RNA分子是指在糖基部分中2』的位置缺乏OH基團，並且有一個氫直接地結合至2』位碳。相似地，術語「脫氧核糖核苷酸」和「DNA」包括至少一個在2』位置具有一個氫的糖基部分的核糖核苷酸或者多核糖核苷酸。
在本文使用的用於表述基因沉默組合物相關的術語「乾燥的」或者「幹」是指一種非液體的並且非流動的組合物。然而，這並未排除少量的水或者其它的溶劑，並且包括保留在RNA製品中的水，該製品已在標準或環境條件下平衡，例如在一個大氣壓，室溫，並且環境溼度下，以使得該製品基本上不是一種液態，反而在孔中是「乾燥的」。例如，siRNA製品是「乾燥的」或者基本上「乾燥的」是指比如在大約一個大氣壓，在大約20到40攝氏度，以及大約50到95％溼度條件下，該製品是平衡的，並且當多孔板翻轉或者從水平位置傾斜例如90度時，該RNA製品在孔內不會移動或者流動。這是與傾斜時會流動或流出的液體製品相比較而言的。在不同的具體實施例中，使用該幹基因沉默組合物進行轉染的方法包括在合適的含水培養基中溶解或者懸浮該幹製品以形成混合物。另外，合適的含水培養基包含一種多核苷酸載體，其能夠促進引導該siRNA進入細胞並且將一或多個細胞暴露於該混合物中以實現轉染。
在本文使用的術語「雙鏈體區域」是指在兩個互補的或者基本上互補的多核苷酸中通過Watson-Crick鹼基配對或者其它任意可以在多核苷酸鏈之間形成穩定雙鏈的方式彼此形成鹼基對的區域。例如，一個具有21個核苷酸單元的多核苷酸鏈可以同另一個具有21個核苷酸單元的多核苷酸進行鹼基配對，而每個鏈上僅有19個鹼基是互補，所以其「雙鏈體區域」具有19個鹼基對。該剩餘的鹼基可以出現在例如5』和/或3』突出端。此外，在雙鏈體區域內，並不需要100％互補，雙鏈體區域基本互補便可。基本互補是指79％或者更高的互補，其原因可以是錯配和/或凸起。例如，在一個由19個鹼基對組成的雙鏈體區域中，單一錯配導致94.7％的互補，將該雙鏈體區域稱為基本上互補。
在本文使用的術語」功能性」是指siRNA誘導的基因特異性沉默的水平。通常，功能性是用基因沉默百分比來表示。這樣，一個基因的90％沉默(例如，F90)是指該基因的表達僅有正常水平的10％。相似地，一個基因的80％沉默(例如，F80)是指該基因的表達僅有正常水平的20％。
在本文使用的術語」基因沉默」是指一種通過減輕、減弱和/或終止來抑制特定基因產物表達的方法。基因沉默可以通過多種途徑產生。例如，基因沉默可以指由RNAi途徑導致的基因產物表達的減少，其中siRNA與宿主蛋白質(例如，RISC)以序列依賴的方式協力降解mRNA。另外，基因沉默可以指由siRNA介導的翻譯抑制所產生的基因產物表達減少。再另外一種情況，基因沉默可以指由siRNA介導的轉錄抑制所產生的基因產物表達減少。基因沉默的水平可以通過各種方法來測量，其中包括通過Northern印跡分析、B-DNA方法、轉錄-敏感的報告子構建體、表達譜(例如，DNA晶片)以及相關技術和分析來測量轉錄本水平。另外，基因沉默的水平可以通過估量特定基因所編碼並由相應mRNA翻譯的蛋白質的水平來測量。這可以通過許多方法來完成，其中包括Western分析、測量報告蛋白質的表達水平，例如其比色或者螢光性質(例如，GFP)，酶活性(例如，鹼性磷酸酯酶)或者其它公知的分析方法。
在本文使用的術語「核苷酸間連接」是指一個多核苷酸中的兩個核苷酸單元之間的一種鍵或者連結，其中該連結可以是修飾的或者未修飾的。短語「修飾核苷酸間連結」包括所有現在已知的或者以後開發的經修飾的核苷酸間連接。核苷酸間連接可以具有相關的平衡離子，並且該短語意味著包括這樣的平衡離子和任意的可以在核苷酸間形成連接的配位複合物。
在本文使用的術語「錯配」包括有義鏈的核苷酸與反義鏈的核苷酸之間並不產生Watson-Crick鹼基配對的情況，其中該未配對核苷酸的兩側是雙鏈體，其包含位於直接開始於該未配對核苷酸之後(例如，在5』方向)的錯配的5』方向上的鹼基對以及位於直接開始於該未配對核苷酸之後(例如，在3』方向)的錯配的3』方向上的鹼基對。錯配的例子是A和G相對應、C和A相對應、U和C相對應、A和A相對應、G和G相對應、C和C相對應等等。錯配也意味著包括非鹼基殘基和核苷酸或者修飾的核苷酸對應、非環形殘基和核苷酸或者修飾的核苷酸對應、缺口或者不成對的環。廣義而言，在此使用的錯配包括在給定位置的任意變更，其減少了該位置或其附近的熱力學穩定性，這樣使得該特定位置的的雙鏈體熱力學穩定性低於該位置形成Watson-Crick鹼基對時的熱力學穩定性。
在本文使用的術語「核苷酸」是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者它們的修飾形式，以及它們的類似物。核苷酸包括嘌呤，例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤以及它們的衍生物和類似物，而且還包括嘧啶，例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及它們的衍生物和類似物。核苷酸是本領公知的。核苷酸類似物包括具有對鹼基、糖和/或磷酸鹽的化學結構進行修飾的核苷酸，包括但不限於5』-位置的嘧啶修飾、8』-位置的嘌呤修飾、胞嘧啶環外的胺的修飾、5-溴尿嘧啶的取代，和2』-位置的糖基修飾(例如，2』修飾)。這樣的修飾包括糖基修飾的核糖核苷酸，其中2』-OH被下述基團所取代H，或者，R、滷素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或者CN，其中R是烷基或者脂肪族的部分。核苷酸類似物也包括具有例如次黃嘌呤核苷、Q核苷、黃嘌呤等的鹼基，如2』-甲基核糖等的糖基，如膦酸甲酯、硫逐磷酸酯等非天然的磷酸二酯鍵和多肽的核苷酸。並且，位於第一位置的核苷酸或者第一核苷酸是指核苷酸雙鏈體區域的5』-端位置的核苷酸，有鑑於此，第二核苷酸是第一核苷酸3』端的下一個核苷酸。在雙鏈體區域延伸至siRNA末尾的情況中，其5』末端核苷酸是第一核苷酸。
在本文使用的術語「修飾的鹼基」是指下述的核苷酸鹼基，例如已經通過置換或添加一個或多個的原子或者基團進行修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤核苷和Q核苷。鹼基部分修飾類型的一些例子包括但是不局限於單獨地或者組合式地烷基化、滷化、硫醇化、氨化、醯胺化或者乙醯化的鹼基。更具體的例子包括，例如，5-propynyluridine、5-propynylcytidine，6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿嘧啶核苷及其他具有5位置修飾核苷酸，如5-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷、5-滷代胞苷、5-滷代尿苷、4-乙醯胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿嘧啶核苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2，2-二甲基鳥嘌呤核苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脫氮核苷酸例如7-脫氮-腺嘌呤核苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿核苷，其它的含硫的鹼基例如2-硫尿核苷和4-硫尿核苷以及2-巰基胞苷、二氫尿嘧啶核苷、假尿嘧啶核苷、Q核苷、古嘌苷、萘基和取代萘基基團、O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶例如N6-甲基腺苷、5-methylcarbonylmethyluridine、尿嘧啶核苷5-氧乙酸(oxyacetic)、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修飾的苯基例如氨基苯酚或者2，4，6-三甲氧基苯，修飾的胞嘧啶其作為G-螺旋夾核苷酸，8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-取代的脲嘧啶和胸腺嘧啶、氮雜嘧啶、carboxyhydroxyalkyl核苷酸，carboxyalkylaminoalkyl核苷酸和alkylcarbonylalkylated核苷酸。修飾的核苷酸也包括糖基部分被修飾的核苷酸，以及其中具有糖基或者類似物如非核糖基的核苷酸。例如，糖部分可以是，或者基於，甘露糖、阿拉伯糖、吡喃(型)葡萄糖、吡喃(型)半乳糖、4』-硫代核糖和其他糖類、雜環、或者碳環。
另外，術語「核苷酸」包括本領域所公知的所有通用鹼基。例如，通用鹼基包括但是不局限於3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或者水粉蕈素。術語「核苷酸」也包括由胺基置換核糖基3』氧而產生的N3』-P5』是氨基磷酸酯。
在本文使用的術語「非靶向」和「非靶向效應」是指下任意述情形，即siRNA(例如合成的siRNA或shRNA)是針對於一個給定的靶mRNA的，但是其通過與其他mRNA、DNA、細胞蛋白質、或者其它部分直接地或者間接地相互作用而引起一種非靶蛋白表達減少的非期望效果。經常地，當siRNA與具有和其相同或者相似多核苷酸序列的非靶向mRNA相互作用時就會發生上述情況。例如，當由於其它非靶向mRNA和siRNA有義和/或反義鏈之間部分同源或者互補而導致非靶向mRNA同時降解的時候，「非靶向效應」也就發生了。
在本文使用的術語「靶向」(on-target)是指siRNA的一組修飾，其增加了siRNA優先地靶向並與靶mRNA或者DNA相互作用以抑制其所編碼多肽的生產的可能性。這些增加了siRNA沉默目標基因時的特異性。例如，一種靶向修飾包括一種siRNA，其中有義區域的第一和第二核苷酸各自具有一個2』-O-甲基部分，並且反義鏈在它的5』末端是磷酸化的，其中這樣一種導向修飾也是指一種專用的修飾，並被命名為On-TargetTM(D harmacon，Inc.)。無論如何，靶向修飾可用於幫助減少外非靶向效應。並且，siRNA可以具有一個與該siRNA的反義區域具有互補性有義區域，並且其中該反義區域是與靶mRNA具有互補性的區域。
在此使用的術語「多核苷酸」是指通過核酸間連結連接在一起的核苷酸多聚體。並且，多核苷酸包括DNA、RNA、DNA/RNA、雜合物(其包括具有規則地和/或不規則地替換的脫氧核糖部分以及核糖部分(例如，其中替換的核苷酸單元在糖基部分的2』位置具有一個-OH，然後-H，然後一個-OH，然後一個H等等)的多核苷酸鏈)、以及這些種類的多苷酸的修飾形式。此外，多核苷酸包括具有不同修飾的核苷酸或者在任何位置連接多種實體或部分的核苷酸。
在此使用的術語「多聚核糖核苷酸」是指包含兩個或更多修飾的或者未修飾的核糖核苷酸和/或它們的類似物的多核苷酸。術語「多聚核糖核苷酸」可以和術語「寡核糖核糖核苷酸」互換使用。
在此使用的術語「合理設計」以及「合理設計的」是指一個或更多用於基因沉默的siRNA的選擇和設計該設計或選擇是基於一個或多個獨立於靶序列的標準的。因此，選擇合理設計的siRNA進行特異地與所選mRNA相互作用並且抑制所選mRNA的多肽的翻譯。這樣，針對任何一個的靶mRNA可能有許許多多潛在的具有18到31個鹼基對的siRNA可以與靶mRNA 100％互補。部分原因是因為一個mRNA可能具有多個可以被siRNA特異地靶向的序列。然而，似乎並不是所有siRNA都具有同等的功能。通過實驗研究，一些其它的因素可以影響特定的siRNA的功能，其中包括在特定位置上某些特定的含氮鹼基的存在或者缺少、相對的GC含量等等。合理設計的siRNA相關的其他信息可以在下述文件中找到美國專利申請10/714,333,提交於2003年11月14日，相關的PCT申請PCT/US03/36787，作為WO2004/045543 A2公布於2004年6月3日，美國專利申請10/940,892，提交於2004年9月14日，作為美國專利申請公布2005/0255487，相關的PCT申請PCT/US04/14885，提交於2004年5月12日，以及美國專利申請公布2005/0246794，其中每個文獻以引用的方式併入本文。
在此使用的術語「反向轉染」以及縮寫「RTF」都是指一種用於介導核酸，例如siRNA，進入細胞的方法。這種引導siRNA進入細胞的方法可以通過在一個孔中混合核酸和細胞而進行，其中細胞沒有預先在生長面上粘附或者培養。該反向轉染通過核酸與細胞表面接觸的方式使核酸能夠進入細胞。通常，siRNA在與細胞接觸之前與脂質或者其它的多核苷酸載體複合在一起。反向轉染不同於正向轉染，因為在添加siRNA之前細胞沒有在孔或者其它貯存容器中的細胞生長表面上接種並培養。
在此使用的術語「核糖核苷酸」、「核糖核酸」和「RNA」是指修飾的或者未修飾的包含至少一個核糖核苷酸單元的核苷酸或者多核苷酸。一般地，所有的核苷酸單元都是核糖核苷酸。未修飾的核糖核苷酸單元包含連接於核糖基部分2』位置的羥基，該核糖基部分具有一個連接在核糖基部分1』位置的N-糖苷鍵連結的鹼基，以及一個可以或者阻止連接到另一個核苷酸的部分。核糖核苷酸、核糖核酸和RNA是本領域熟知的短語。
在此使用的術語「有義鏈」是指一個多核苷酸或者區域，其具有和靶核酸(例如信使RNA或者DNA序列)完全地或者部分地相同的核苷酸序列。術語「有義鏈」包括與另一個多核苷酸的反義區域形成了雙鏈體的多核苷酸的有義區域。此外，有義鏈可以是與同一個單分子多核苷酸上的第二多核苷酸序列形成雙鏈體的第一多核苷酸序列同，該單分子多核苷酸同時包括所述的第一以及第二多核苷酸序列。因此，有義鏈可以包括能夠形成髮夾結構的單分子siRNA的一部分，例如shRNA。按照慣例每次提到一段序列，除非另有指示，都是有義鏈或者有義區域，並且互補的反義鏈或者區域不再提及。「有義鏈」以及『有義區域「是同等的並且是可互換使用的。
在此使用的術語「siRNA」是指小的抑制性的RNA雙鏈體，其通過RNA幹擾(「RNAi」)途徑誘導基因沉默。這些siRNA是dsRNA，其可以在長度方面有差異，並且可以包括在反義和有義鏈之間以及在反義鏈和目標序列之間不同程度的互補性。每個siRNA包括17到31個鹼基對，更優選地是18到26個鹼基對，並且最優選地是19到21個鹼基對。對於一些siRNA(而不是所有的siRNA)，其在有義鏈和/或反義鏈的5』和/或3』末端上具有未配對的突出核苷酸。另外，術語「siRNA」包括具有兩個獨立鏈的雙鏈體，也包括可以形成含有雙鏈體區域的髮夾結構的單鏈，後者可以被稱為短的髮夾RNA(「shRNA」)。
在此使用的術語「siRNA文庫」或者「RTF siRNA文庫」是指一系列用於分析特定的生物學途徑或者靶基因的siRNAs。siRNA文庫包含多種的用於分析特定的途徑或者靶基因的siRNA庫試劑。庫一般地包含兩個或更多非同一的針對單一靶基因的siRNA。通常一個庫包括四個以上非同一的合理設計的siRNA。siRNA文庫的示例性的列表在下面的表1中提供。用於某些特定的siRNA文庫的序列，包括庫試劑，在併入本文的臨時申請的表1和表2中提供。
在此使用的術語「siRNA庫」、「庫」、「siRNAs的庫」以及「庫試劑」是指兩個或更多siRNA，一般地4個siRNA，其針對於單一靶基因、mRNA、和/或蛋白質的翻譯。庫試劑的siRNA可以通過根據非靶特異性的標準進行挑選而合理地設計。例如使用100nM的siRNA濃度，兩個納摩的各個庫試劑足夠轉染大約96-孔板上總共200個孔中的細胞。庫試劑可以以一組的形式塗布(例如，兩個或更多的Dharmacon’s SMARTpool@試劑在單個siRNA轉染孔中)。包括SMARTpool@試劑的單獨的siRNAs，有時在此是指SMARTselectionTMsiRNA(Dharmacon，Inc.)，還可以如同SMARTpool@試劑一樣單獨地被塗布到同一個板上。
在此使用的術語「靶」在本文件中以各種不同的形式使用，其使用是根據上下文來定義的。術語「靶基因」是指所編碼蛋白質被siRNA沉默的基因以及編碼生成靶mRNA的基因。術語「靶mRNA」是指一種給定的siRNA直接沉默其多肽產物轉錄的mRNA。術語「靶序列」以及「靶位置」是指在mRNA、miRNA或者DNA編碼或啟動子區域之內的一段序列，siRNA的有義鏈對其展現出不同程度的同源性並且反義鏈對其展現出不同程度的互補性。術語「靶多肽」或者「靶蛋白」是指該靶基因、靶mRNA、和/或靶序列編碼的基因產物。術語「siRNA靶」是指siRNA所要沉默的基因、mRNA、或者蛋白質。相似地，「靶沉默」是指基因或者相應mRNA或者蛋白質的沉默狀態。
在此使用的術語「轉染」是指一種將核酸引入細胞方法。可以轉染的核酸清單是巨大的，其包括但是不局限於siRNA、shRNA、有義和/或反義序列、DNA、RNA等等。有許多模式可用於轉染核酸進入細胞，包括但不限於電穿孔法、粒子轟擊、磷酸鈣轉運、二乙氨乙基葡聚糖轉運、脂質轉運、多聚體轉運、分子結合物轉運(例如，聚賴氨酸-DNA或-RNA結合物、抗體-多肽結合物、抗體-多聚體結合物、或肽結合物)、顯微注射、雷射-或光-輔助的顯微注射、具有可見的和/或不可見的電磁輻射波長的光穿孔或光穿孔等等。轉染可以是「正向轉染」，其中細胞首先塗布於孔中然後用核酸處理，或者可以是「反向轉染」(RTF)其中核酸在塗布之前或塗布期間與細胞結合和/或附著於孔的底部。任意如同上面描述的轉染細胞模式，能通過下述方式被本發明使用，即在siRNA溶解或懸浮於含水培養基中以誘導核酸進入細胞，從而實現反向轉染。關於反向轉染的一個模式的細節將在下面更詳細地描述。
在此使用的術語「多孔板『是指一種基質其被分成不同的區域以防止從一個特定區域到另一個特定區域的移動，其中的特定區域是孔。例如，一個多孔板的每個孔可以具有曲線的或平坦的水平底面，而且具有側壁。另外地，該側壁可以特定的角度或曲率聚集以使得離散的水平底面部分不出現。正如下面所述的，具有平坦的或基本上平坦的水平底面的多孔板在本發明的許多具體實施方案中是優選的，尤其在使用粘附細胞的時候。不管其形式如何，最重要的是多孔板上的每個孔是完全地與其它孔隔開的。孔一般在頂端開放以易於添加和除去原料。普通多孔板一般地包括48、96、384或1356個孔並且由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯玻璃或其等同的材料組成。板上的孔可以塗上多種化合物或者用物理方法處理以提高siRNA和/或細胞的附著。在板上的孔還可以用來容納大量液體體積並且提供大片的表面積，尤其沿著水平的底面。圖中的孔是用示意圖並僅僅為了簡化起見顯示為正方形，但是其可以是任意合適的形狀。另外，多孔板已經為本領域所熟知。
為了定義可測量的物質數量而使用的單位，例如濃度、重量以及體積，都是本領域技術人員通常地使用的。另外，單位優選地與國際公制一致。此外，「μ」正如在「μg」或「μL」中是指「百萬分之一」，例如正如微克以及微升。
另外地，上文的術語定義是用來補充本領域技術人員的知識，並沒有定義本文件中所有的術語。因此，未定義的術語可用本領域技術人員的知識和/或該術語的普通意思來解釋。另外，上文的術語不是用來通過提供實施例而進行限制的，然而只是為了有助於理解和使用本文描述的本發明。
I、反向轉染 通常，本發明提供用於實現siRNA反向轉染的多孔板、系統、試劑盒、和方法。本發明提供改良的以及更有效的siRNA反向轉染操作方案。這些改善是特別地有益於手工分析以及高通量篩選的。
在一個具體實施方案中，本發明包括一種引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的反向轉染方法。這一方法包括提供一個多孔板，其包括含有基本上乾燥的基因沉默組合物的孔。該基因沉默組合物包括一種沉默靶基因從而使相應基因產物的生產被抑制或停止的siRNA。該siRNA作為乾燥的基因沉默組合物的一部分置於孔中，使得多孔板可以在實施RTF操作方案前進行製備、密封的、儲藏、和/或運輸。部分地，這是因為該乾燥的基因沉默組合物可以穩定地保持siRNA在孔中處於具有功能的狀態，並且可以在RTF操作時再懸浮或再溶解在水溶液中。因此含有基因沉默組合物的多孔板可以在惰性的環境中製造並且密封，其中該板可以包括含有針對於特定基因靶而定製的siRNA的不同的孔。這樣的siRNA以及用於沉默的預定基因靶將在下面更詳細地描述。
可以添加含水培養基至每個包含基因沉默組合物的孔中以使siRNA懸浮或溶解於溶液中。該含水培養基可以使siRNA在一段足夠的持續時間處於溶解狀態。另外，該含水培養基或附加的培養基包含一種多核苷酸載體。因此，可以添加多核苷酸載體至每個含有基因沉默組合物的孔中，再將多孔板溫育足夠的時間以形成siRNA-載體複合物。然而，一些具體實施方案並不需要多核苷酸載體，可以使用其它的轉染模式將該siRNA轉染進入細胞。
在siRNA充分地溶解或懸浮之後，在siRNA可被引導進入細胞的條件下將細胞添加至該孔中。添加細胞的數量可以是每約0.35cm2到約0.35cm2的細胞生長表面面積上約1×103到約3.5×104個細胞。促進siRNA進入細胞的條件可以通過本領域公知的用於塗布細胞的典型細胞培養技術而描述。也就是說，該細胞可以類似於普通的塗布方式被添加至包含siRNA的孔中。將包含siRNA和細胞的孔溫育足夠的時間以發生基因沉默，其一般是不到72小時，更優選的是不到48小時，並且最優選的是大約24小時或更少。
在一個具體實施方案中，RTF操作方案包括向孔中增添一種多核苷酸載體以形成siRNA-載體複合物，其中該siRNA-載體複合物懸浮或溶解於溶液中。在添加細胞之後，siRNA-載體複合物可以與細胞接觸以誘導對該複合物的內吞作用。因此，該多核苷酸載體可以作為水溶液的一部分或另外的附加物而被添加。因此，該多核苷酸載體可以溶解或者懸浮狀態存在於該含水培養基中。該多核苷酸載體可以是一種脂質、陽離子聚合物、脂多聚體等等。
在細胞與siRNA結合之後，將多孔板置於可使細胞生長、細胞分裂、和/或發生基因沉默的條件下。通常，在測定基因沉默之前，細胞在siRNA存在的情況下培養大約6到大約72小時，更優選的是大約12到大約36小時，並且最優選的是大約24到大約48小時。然而，應該認識到細胞是與siRNA共同培養一段足以沉默基因的時間從而導致相應基因產物減少。因此，靶多肽的生產可以被沉默至少大約50％，更優選的是至少大約70％，更加優選的是至少大約80％，和最優選的是至少大約90％。
在懸浮生長的細胞就是靶細胞的情況下，這些細胞可以以適當的細胞密度添加至孔中，然後將多孔板在不會損害到細胞生活力的低重力下旋轉，從而使細胞以及脂質接近孔的底部。
在一個具體實施方案中，測定通過RTF方式被siRNA轉染的細胞的細胞生活力、基因沉默等等。細胞生活力研究可以依照公知的方法在多孔板中完成。另外，基因沉默還可以通過使用本領域公知的多種技術來分析孔中內含物，從而分析靶蛋白質的存在或缺少的存在與否。另外地，基因沉默的量度可以通過利用公知的方法將內含物從孔中移出而測定。在不同的具體實施方案中，孔是與光學檢測系統相適應的，例如，UV、冷光、螢光或光散射檢測系統。在與光學檢測系統相適應的具體實施方案中，孔的壁可以是不透明的，或者儘量減少或最小化能妨礙光學探測的光散射。
在一個具體實施方案中，RTF操作方案誘導基因沉默的結果可以通過用於高容量篩選(「HCS」)或高通量篩選(「HTS」)的系統來檢測或監測。HCS分析可用於測量特異性的易位以及形態學變化、受體運輸、細胞毒性、細胞運動性、細胞伸展等等。HCS研究可以在ArrayScan@HCS Reader上或KineticScan@HCSReader(Cellomics，Inc.)上完成。關於HCS的其他信息可在如下文獻中找到美國專利號6,902,883，6,875,578，6,759,206，6,716,588，6,671,624，6,620,591，6,573,039，6,416,959，5,989,835，其中每個文獻都在此通過引用的方式併入本文。HTS分析可以利用各種可用的閱讀器來完成，一般地對於每個孔的螢光都作為一個測量。
在一個具體實施方案中，本發明包括多孔板，其配置用於將一個孔中的內含物轉移到某一位置、裝置、或系統中，其中在所述位置、裝置或系統中檢測siRNARTF操作方案的結果。因此，可以使用溼式轉移檢測系統(wet transfer detectionsystem)，其包括將細胞從孔轉移到如硝化纖維這樣的基質上。在將孔中內含物轉移到該基質後，就可以進行檢測。這樣的多孔板轉移系統的一個實例包括硝化纖維，其中孔中內含物經過處理使得細胞膜被透化或者被破壞，從而使其與胞內物質接觸。可以通過包括重力或真空裝置(vacuum manifold)的使用在內的任意合適的方法而實現孔中內含物轉移到硝化纖維。該硝化纖維包含了孔中的內含物能因此更進一步地接受探測操作規程，該規程運用基於抗體的檢測系統等等，以檢測包含在一個特定孔中的一種或以上的細胞內含物。
II.優化siRNA RTF 由於RNAi通路獨特而且高度靈敏的性質，已經開發出對引導siRNAs庫進入細胞特別有用的方法。相應地，已開發了新的RTF方法來使用siRNAs庫(「siRNARTF」)。因此，近來開發的用於實現siRNA RTF的操作方案利用基於合理設計、siRNA穩定、siRNA目標特異性、以及siRNAs庫的近來開發出的siRNA技術進行改進，從而得到了增強。因此，在此描述了用於通過siRNA RTF操作方案而實現基因沉默的改進方法。
在一個具體實施方案中，本發明可以被用於來自植物和動物界中不同種的不同類型的細胞。優選地，該細胞來自於哺乳動物包括來自人的細胞、其他的靈長類、馬、豬、以及老鼠。例如，細胞可以是HT-29細胞、LNCaP-FGC細胞A549細胞、MDA-MB453細胞、HepG2細胞、THP-1細胞、miMCD-3細胞、HEK293細胞、3T3細胞、HeLaS3細胞、MCF7細胞、Cos-7細胞、CHO-K1細胞、BxPC-3細胞、DU-145細胞、Jurkat細胞、PC-3細胞、Capan-1細胞、HuVEC細胞、HuASMC細胞等等。另外，任意種的植物可以用來測定基因沉默效應。
每孔的細胞數目，其被稱為細胞密度，是成功的siRNA RTF的一個重要參數。已經發現，與使用DNA的RTF操作方案相比，具有較低的細胞密度的siRNA RTF操作方案可以具有更有好的結果。例如，96-孔板可以具有的細胞密度為大約每孔1,000-35,000個細胞，更優選地大約每孔2,000-30,000個細胞，更加優選的細胞密度是大約2,500-20,000個細胞每孔，更加優選地大約每孔3,000-15,000個細胞，以及最優越的細胞密度是大約每孔3,500-10,000個細胞。此外，每孔的細胞數目可以外推至具有不同的細胞培養面積的孔。一個可用於計算放入一個給定孔中的適當的細胞數目方程式是基於具有大約0.3cm2至大約0.35cm2細胞培養面積的96-孔板，其中孔#2是該96-孔板，方程式如下所示 孔#1中的細胞＝(孔#1的面積/孔#2的面積)×孔#2中的細胞 另外，siRNA RTF操作方案可以優化以便確定一個特定的轉染模式是否可以用於或提供最佳的結果。相應地，任何的轉染模式都可以用於在此描述的siRNARTF操作方案。通過使用強有力的並且已熟知的(well-characterized)siRNA(例如陽性對照siRNAs)轉染的細胞系(例如，HeLa)多核苷酸載體在很寬的濃度範圍內可以適用於超過通常使用的細胞密度以及總siRNA濃度的範圍。相應地，細胞生活力以及轉染功效可以用上述濃度梯度分析。因此，最優化研究可以通過特定的轉染模式或多核苷酸載體濃度梯度來完成，以便測定哪個轉染模式可以產生高效率的基因沉默並且不會誘導有害的細胞毒性。
在一個具體實施例中，本發明是要最優化用於通過RNAi途徑實現基因沉默的siRNA RTF方案。因此，siRNA RTF的最優化可以包括任何下列步驟(1)選擇多孔板的種類；(2)選擇適當的溶液以溶解或懸浮用於在孔中沉澱和乾燥的siRNA；(3)選擇特定的siRNA以沉默特異基因；(4)鑑別可以用於單獨siRNA的修飾或結合物，以便提高siRNA穩定性和/或特異性；(5)在固體表面上使用並乾燥siRNA以便它可以溶解或懸浮在適當的含水培養基中；(6)選擇適當的轉染模式；(7)為siRNA選擇多核苷酸載體，例如脂質；(8)溶解或懸浮siRNA；(9)絡合該siRNA和多核苷酸載體以形成siRNA-載體複合物；以及(10)將該siRNA-載體複合物與選擇出的細胞種類混合。因此，最優化siRNA RTF方案可以產生相對於早先的正向和反向轉染方法的顯著改善。
在一個具體實施方案中，本發明可以包括siRNA RTF操作方案與上述優化一起施行，其可以包括任何下列步驟(a)將至少一種siRNA點樣至一個多孔板上的兩個或更多孔中，其中該siRNA是靶向標準基因的對照siRNA；(b)在每個孔的底部乾燥該siRNA；(c)添加水溶液例如培養基或緩衝液至每個孔中的siRNA以便溶解或懸浮該siRNA，並且選擇性地該溶液包括一個多核苷酸載體以便可以形成siRNA-載體複合物；(d)添加適當數目的細胞至每個孔，其中siRNA是已經單獨地或作為一種siRNA-載體複合物而存在於溶液中；(e)在已經添加細胞之後，可以通過任意的轉染模式使得該siRNA進入該細胞；並且(f)在利用該siRNA的細胞轉染可以發生的條件下溫育該板。轉染之後，該細胞置於下述條件下，例如含水培養基、溫度、氣體分壓等等，其中細胞生長和/或細胞分裂可以發生並且基因沉默可能發生。這些條件可以是，而不是必要地，與發生轉染的條件相同，並且是本領域所公知的。
III.多孔板 在一個具體實施方案中，本發明包括對乾燥於多孔板孔底部的基因沉默溶液的利用。本發明使用的該孔板優選地是已格式化並且是離散的孔陣列(例如，48,96,384，或1536-孔板)，其可以購買自許多商業來源的細胞培養板及其他包含表面的細胞培養裝置，包括下述產品如NUNCTM，NUNCLONTM，MICROWELLTM以及FLUORONUNCTM板(例如，每個都可以是從Nalge Nunc International of Rochester，NY，以及Nunc A/S of Denmark獲得)，COSTAR THERMOWELLTM以及CORNINGTM板(例如，每個都可獲自Corning)，BD FALCONTM以及OPTILUXTM板(例如，可以從Becton，Dickinson and Company獲得)以及GREINERTM，CELL COATTM和CELLSTARTM板(例如，可以從Greiner Bio-Bio-One獲得)。
在一個具體實施方案中，該多孔板的特徵可為經配置而適合於細胞生長和繁殖。多孔板可由玻璃、聚苯乙烯、其它的聚合材料或任意同類的原料製成，並且可以具有圓的和/或平坦的孔底。當然，當使用平底表面時某些分析設備可以具有增強功能。另外，具有基本上平坦的底面的孔可以提供統一的細胞空間和單層構造。因此優選的孔底面具有基本上平坦的底部表面。孔的底面可以進行物理的或化學的處理，例如輻照、電暈放電、等離子區放電、或對於聚苯乙烯的微波等離子區放電。在組織培養表面的這種處理可以是常規的，在這樣的表面上附著的真核細胞可以粘附並且生長。另外，孔可以不經過任意化學塗層的修飾，或它們可以包被上聚L-L-賴氨酸(「PLL」)、層粘連蛋白、膠原、或等效物，以改善細胞的粘附。
另外，每個板優選地具有6到2000個之間的孔，並且更優選地具有1536孔，384孔，或96孔。此外，孔優選地具有大約5至2000微升(「μL」)之間的容積，並且由孔底面或細胞底面所代表的總的培養面積，介於大約0.02cm2至大約4.2cm2之間，並且對於96-孔板而言大約0.3cm2至大約0.35cm2。
此外，在有些情況下，孔優選地沒有用例如MATRIGELTM(Beckinson Dickerson)等原料包被，或沒有用類似於慣常構建CELLBINDTM板(Corning)的方法製造。部分原因是這兩個技術是通常用於增強細胞附著，然而已經發現在RTF操作方案中其會減低或減少siRNA吸收和/或基因沉默。
此外，雖然由單一原料形成多孔板，例如處理過的聚苯乙烯形成的多孔板可用於本發明，但由兩個或更多種的原料形成的板也可以用於本發明。這樣的複合材料多孔板可在下述文獻中論述美國專利6,514,464，5,457,527，RE38，214以及5,487,872，其中每個文獻在此引作為參考用。相應地，該複合原料多孔板可以提供合乎需要的結構特性，其包括適於組織培養以及RNAi沉澱的孔底表面，其中孔壁是不適合於組織培養以及RNAi沉澱的。此外，該孔底面可以具有適於某些下遊分析的光學特性。例如，孔底面之下的塑料或玻璃是對可見光和/或紫外線而言是透光的，並且圍繞每個孔側壁的塑料阻擋光線通過鄰近的孔。
在一個具體實施方案中，該板包含一個可移動的底部。因此，該可移動的底部可利於轉移孔中內含物至另外的基質上。此外，具有可移動底部的板可和在此描述的任何具體實施方案同時使用。一個具有可移動底部的板的具體實施方案的例子是具有可移動的薄膜作為底部的板。可移動的薄膜可由任意合適的原料製成，例如聚烯烴。該可移動的薄膜可以和光學探測系統相適合(例如，可以透過一種或多種波長的電磁輻射，例如，可透過可見光或紫外光)。在包含可移動薄膜具體實施方案中，孔中的內含物可以縮減體積以使得在薄膜從該板移開之前該孔中的至少一些內含物能粘附在薄膜上。從板上移走之後，該薄膜包括粘附在薄膜特定位置上的原板中的內含物，該位置與孔的位置相對應。因此該薄膜能用於任意合適的檢測方法。在一個實施例中，該薄膜可用於轉移孔中的內含物至另一個基質，例如，硝化纖維。此外，可以破壞每個孔中的細胞以便在將薄膜從板移開之前暴露它們的胞內內含物。一旦轉移至另一個基質，該基質便包括該孔的內含物並且可以進行任意合適的檢測方法。一些檢測方法的實例包括Western印跡法、蛋白質-蛋白質印跡法、配體印跡法、以及核酸雜交。一個將板上內含物粘附至薄膜上的方法是蒸發該孔的內含物，或者減低該孔的水分含量。
在一個具體實施方案中，這樣的薄膜可由選擇性滲透原料製成，其中該選擇滲透性基於，例如分子大小。在這個具體實施方案中，該薄膜可以是一個分子篩。在一個實施例中，該薄膜可以由分子篩組成並且在施加正壓力(例如，從孔的上方)或者負壓力(例如，從孔的下方)時其允許小於大約10kDa的分子穿過該膜。其中，薄膜由分子篩組成，孔內含物可以通過分子篩而汲取可滲透的液體以降低含水量並且留下組成該孔內含物的大分子。
在一個實施例中，由分子篩組成的薄膜可以用在板的頂端。該板可以翻轉以使得孔中內含物接觸該分子篩。該板的底部可以是被刺穿的或，如果薄膜處於板的底部，則移除該薄膜。可以施加正壓力以強迫孔中內含物壓附在分子篩上。另外，也可以從分子篩下方施加負壓力。照這樣，將孔中內含物轉移至分子篩表面的同時孔中的水份將被移除。該分子篩於是將包含板上的孔中內含物，其位置與原來板上的相對的位置完全一致。如果需要，該分子篩能接著用於將該孔中內含物，以已知位置轉移到一個合適的基質例如硝化纖維上。
在一個具體實施方案中，薄膜可以用於與板同時使用以帶來某些光學特性。在這些具體實施方案中，一個板的頂端和/或底部的至少一部分可以施加到薄膜上，該薄膜對於特定波長的電磁輻射是有選擇地不透光或有選擇地透光。該薄膜被用作針對電磁輻射的一或多個波長或波長區域的薄膜濾波器。例如，該薄膜可以對紫外線是不透光的，而對可見光是透光的，或與此相反。該薄膜可以放置在該板的頂部，或可以放置於該板的底部。在電磁輻射從下面到達樣品的具體實施方案中，該薄膜濾波器可以位於板的底部。在電磁輻射從上面到達樣品的具體實施方案中，該薄膜濾波器可以位於板的頂部。該薄膜濾波器一般地接觸該板基質。兩個外加的薄膜可一起使用。使兩個或更多的薄膜彼此靠近以使用到板上(例如，先使用第一薄膜，然後在第一薄膜上使用第二薄膜)。
在此描述的用於任何具體實施方案中的薄膜可由任意合適的可用於特定應用的原料製造。該薄膜可以是薄的並且有彈性的，或薄的並且剛性的。該薄膜還可以與機器人系統相配合而製造。一般地，與機器人系統相配合的薄膜將是相對剛性的以便它們在從板上移開時不會打亂孔中內含物的格式或位置。
IV.基因沉默板 在本發明的一個具體實施方案中，依照上文的多孔板可以配置成為一個基因沉默板。相應地，該多孔板可以在一或多個孔中包括基因沉默組合物。該基因沉默組合物包括至少一種第一siRNA，其靶向至少一種第一基因以用於沉默。此外，該基因沉默組合物可以具有直接針對於相關基因家族的單一siRNA。另外，該多孔板可以在一個孔中含有靶向至單一基因的多種siRNAs，或靶向多個基因的多種siRNAs。通過將一種包含siRNA的溶液添加到至少一個孔中，然後移除溶液以留下乾燥基因沉默組合物的方式進行乾燥，使多孔板成為基因沉默板。
在有些情況下在施加、沉澱、和/或點樣siRNA溶液到孔的底面上以及在板上乾燥該材料之前，將該siRNA溶解在這些種類的溶液中的一個裡。通常，siRNA溶於蒸餾水來除去核糖核酸酶汙染，蒸餾水是利用本領域公知的任意方法處理的，例如超濾。另外地，siRNA可以是溶於幾種生理學相容的、沒有核糖核酸酶的緩衝液之一，包括但不限於磷酸鹽緩衝液、Hanks BSS、Earl’s BSS、或生理鹽水。這些溶液可以包含一或多種附加的試劑其增強siRNA的穩定性(例如，核糖核酸酶抑制劑)或改變該溶液的粘稠度以提高點樣或乾燥的效率(例如，蔗糖)，同時不會改變siRNA的性質或損害在RTF方法中的後續階段添加的細胞。
在又一個其它的案例中，siRNA可以溶解在溶液或培養基中，這將促進點樣、乾燥、或粘附到選擇出的板上。任選地，可使用與siRNA相容的揮發性的溶劑。一個實施例包括通過利用醇，例如乙醇，其與水混合便形成一種揮發性溶劑從而容易乾燥並將乾燥基因沉默組合物存留於孔底面上。在有些情況下siRNA溶液不包含脂質，在操作期間脂質很容易被氧化或可以毒害細胞。在其它情況中，siRNA在沉澱以及乾燥至孔底面之前，是與多核苷酸載體在溶液中預先複合的。
相應地，將預定量的siRNA加入到孔中以便當它被乾燥然後再懸浮的時候，就有已知數量或濃度的對照siRNA可用於基因沉默。沉澱在每個孔底部的siRNA溶液的體積，依賴於儲備溶液的濃度、siRNA的功能、以及有效基因沉默需要的siRNA的數量或濃度。通常，在轉染期間有效地沉默目標基因所需要的siRNA濃度是依賴於該siRNA的功能的。例如，在轉染期間siRNA的濃度可以從針對高度功能性的siRNA(例如，在50-100nM下沉默＞90％的目標表達)的皮摩(例如，300、900pM)，到針對中等功能性(例如，在50-100nM下沉默70-90％的目標表達)的納摩(例如100nM)，以及到針對低功能性的微摩(例如，1μM)。例如，針對一個96孔板，沉澱5-50μL的包含1μMsiRNA的溶液足夠產生RTF操作方案可接受的siRNA濃度。對於較小或較大的孔，可以調整siRNA的體積以及數量以補償每個孔中的最終濃度。
在一個具體實施方案中，基因沉默組合物的總量可以是轉染其所在孔中的細胞所需的量。因此，當在RTF期間溶解或懸浮在含水培養基中的時候siRNA的總濃度可以是小於大約100nM。更優選地，當在RTF期間溶解或懸浮在含水培養基中的時候siRNA的總濃度可以是小於大約50nM。更加優選地，當在RTF期間溶解或懸浮在含水培養基中的時候siRNA的總濃度可以是小於大約25nM。在更加優選的情況下，當在RTF期間溶解或懸浮在含水培養基中的時候siRNA的總濃度可以是小於大約10nM。最優選地，當在RTF期間溶解或懸浮在含水培養基中的時候siRNA的總濃度可以是小於大約1nM。例如，在一個96孔板中的siRNA數量可以從每孔0.1皮摩爾(「pm」)到大約100pm，更優選的是大約1pm到大約75pm，以及最優選的是大約10pm到大約62.5pm，其中siRNA的相應數量可以適合於具有其它數目孔的多孔板。
另外，加到每個孔中的siRNA的量足夠在該孔內進行一次RTF操作方案。也就是說，在基因沉默組合物中的siRNA可以是僅用於加到該孔中的細胞所需的量。因此，乾燥在孔中的siRNA的量可以是不夠在兩個不同的孔中完成兩個RTF操作方案的。這是因為該基因沉默組合物所提供的siRNA的量是配置用於單次RTF操作方案以產生最佳結果的。此外，這也取消了製造轉移進入多個孔所需的siRNA儲存溶液的需要，因此減低RTF操作方案的複雜性並且增加了其功效。
包含siRNA的溶液可以利用多種的本領域公知的沉澱含水進入多孔板孔中的方法來沉澱進入孔中，其可以包括手工的以及自動化的工序。多種方法可用於乾燥該包含siRNA的溶液以形成基因沉默組合物。在一個具體實施方案中，多孔板可以在室溫下無菌的環境中乾燥，該環境允許蒸發該沉澱溶液以保存下siRNA以及其他的內含化合物，例如鹽，糖類等等。乾燥的板優選地進行真空-密封或在無菌容器內存在惰性氣體的條件下進行密封，並且在從-80℃到37℃的溫度範圍內儲藏一段延續較長的時間而不損失沉默功能。因此，在至少一個孔中具有基本上乾燥的基因沉默組合物的多孔板可以在室溫下儲藏以及通過傳統的方式運輸並且仍然維持該siRNA的完整性以及功能性。
在一個具體實施方案中，多孔板可以具有多種的其它的孔用於對照和校準作用。因此，多孔板可以具有至少一個缺少或基本上缺少siRNA的孔。此外，多孔板可以具有至少一個包括至少一個第一對照siRNA的孔，其可以是轉染對照、陽性對照或陰性對照。例如，對照siRNA可以包括至少一個如下的成分(a)能夠沉默一個已知基因的一種siRNA；(b)轉染對照siRNA；(c)具有螢光標記的一種siRNA；(d)具有至少一個有毒基序的siRNA；(e)一種無功能的siRNA；或(f)一種siRNA，其抑制RISC通路。
V.siRNA 在一個具體實施方案中，上述乾燥的基因沉默組合物包括至少一個第一siRNA，其沉默至少一種第一靶基因。配置該基因沉默組合物以使得該siRNA能夠以足以轉染孔中細胞的量溶解或懸浮在含水培養基中。選擇性地，該孔中siRNA的總量足夠完成僅用於該孔的反向轉染。另外，該siRNA可選擇地具有帶有環的發卡結構、修飾或結合物中的至少一個。此外，該siRNA可以合理地用來靶向至該基因。此外，該基因沉默組合物可以包括一個siRNAs庫。
在一個具體實施方案中，篩選siRNA以優化沉默靶基因的功能。優選地，siRNA具有50％到100％之間的基因沉默功能。更優選地，siRNA具有70％到100％之間的基因沉默功能。更優選地，siRNA具有80％到100％之間的基因沉默功能。最優選地，siRNA具有90％到100％之間的基因沉默功能。功能性基因的設計可以基於以下的修飾，包括增加靶向性、減少非靶向性、增加穩定性、合理地設計用於特定的mRNA目標，以及它們的組合。
另外，siRNA反義鏈可以具有與其靶序列(例如，mRNA)不同水平的互補性。也就是說，反義鏈是具備誘導靶序列基因沉默功能的。因此，有義鏈可以是基本上與靶序列一致的。優選地，反義鏈可以與其靶序列具有50-100％的互補性。更優選地，反義鏈可以與其靶序列具有70-100％的互補性。更加優選地，反義鏈可以與其靶序列具有80-100％的互補性。更進一步優選地，反義鏈可以與其靶序列具有90-100％的互補性。最優選地，反義鏈可以與其靶序列具有100％的互補性。
具有小於100％互補性的序列可以有一個或多個核苷酸的凸起、突出端、或包含一個或多個錯配。另外，siRNA可以在其有義或反義鏈的3』和/或5』末端具有一到六個核苷酸的突出端。另外，應該認識到計算互補性時是排除突出端的，然而突出端可以與靶序列具有同源性或互補性。化學修飾、凸起、或錯配可以指引RNase-III Dicer在特定的位置切開siRNA或shRNA。兩個核苷酸的3』突出端可以模擬天然的siRNAs並且經常被使用，然而不是必要的。優選地，該突出端可以包括兩個核苷酸，最優選地是dTdT或UU。此外，該突出端可以包括位於有義和/或反義鏈3』末端的兩個核苷酸，該有義和/或反義鏈具有與目標序列的同源性或互補性。siRNA可以具有兩個核苷酸的突出端，其中對於內部位置具有C＞U＞G＞A的次序，並且對於末端位置具有A＞G＞U＞C的次序是優選的。對於siRNA結構以及Dicer酶的特異性的其他信息可以在Vermeulen A，et.al；The contributions of dsRNAstructure to Dicer specificity and efficiency；和RNA(2005)，11674-682中獲得。
在一個具體實施方案中，優選地從已經識別自合理地設計的列表中選擇siRNA。因此，該siRNA可以是從表I中選出來，該表引自美國臨時的申請系列號60/678,165。表I題為「用於人siRNA的siGENOME序列」並且由「基因名稱」、「登錄號」、「序列」以及「SEQ.ID NO.」欄組成。表I列舉了大約92,448個19-mer siRNA有義鏈序列，其中為了清楚將反義鏈序列省略。列在表I中的siRNA序列包括SEQ.ID NOs.1到大約92,448，其中每個優選地還可以在該有義鏈和/或反義鏈上包括一個3』UU突出物。表I中大約92,448個序列的每一個還可以包含一個在反義鏈上的5』磷酸酯。在表I中列舉的引自臨時申請的大約92,448個序列中，大約19,559個具有一系列靶向的修飾。具有靶向修飾的通過SEQ.ID NO識別的序列名單列於題為「通過SEQ.ID NO識別的具有靶向修飾的表I序列的清單」的表II中。靶向修飾在SEQ.ID NOs.1-22,300上。基因沉默組合物中的siRNA可以是單獨地使用(例如，每孔中一種siRNA序列)或作為庫的一部分使用。
在一個具體實施方案中，siRNA可以配置為短的髮夾siRNA(「shRNA」)。這是因為shRNA是一種包括一個環狀結構的siRNA，其環狀結構連接有義區域與反義區域並形成一個髮夾結構。此外，shRNA可以具有與其它的類型的siRNA基本上相似的功能。另外，shRNA不被認為是修飾的siRNA，除非其核苷酸包括如下詳述的修飾。siRNA作為髮夾shRNA存在的例子中，該鏈的大小和方向可以變化。優選地，存在於基因沉默組合物中的shRNA具有一個有義鏈或有義區域以及一個反義鏈或反義區域。shRNA的有義區域以及反義區域是一個較長的單分子結構的一部分，該結構具有一個大約18-31個鹼基對的主幹。該有義區域以及反義區域通過一個環狀結構連接，該結構可以由多核苷酸或其它的連接基團組成，也可以是由其組合組成。優選地該多核苷酸環包含4到10個核苷酸。更優選地，主幹在26到31個鹼基對之間並且所述環源自於人miRNA hsa-mir-17(序列5』-＞3』AUAUGUG，SEQ ID No1)。shRNA還可以包含與其它類型的siRNA相似的3』和/或5』突出端。該突出端如果存在，可以是dTdT、UU、或可以具有針對目標序列的同源性或互補性。
shRNA可以包括右旋性的或者左旋性的髮夾結構，以及斷裂的發卡結構。一個右旋性的shRNA是指一個在它的5』-＞3』方向具有一個有義區域，一個環狀區域，然後一個反義有義區域的單分子的序列。相似地一個左旋性的shRNA是指一個在它的5』-＞3』方向具有一個反義區域，一個環狀區域，然後一個有義區域的單分子的序列。最優選地，shRNA是(1)以反義-環-有義模式組織；(2)具有一個長度為26-31個核苷酸的主幹；並且(3)具有一個來源於人類miRNA hsa-mir-17的環狀結構。具有髮夾結構的siRNA的描述以及更進一步的例子參見美國臨時的專利申請號60/666,474，題為「髮夾構造」提交於2005年3月29日，以及美國申請2004/0058886，其以引用的方式併入本文。
A.化學修飾 在一個具體實施方案中，該基因沉默組合物中的s iRNA可以通過本領域已知的多種方法之一而產生，這些方法包括化學合成(例如，美國專利號5,889,136的2』-ACE化學處理，其以引用的方式併入本文)，利用酶促過程的合成(例如，長dsRNA的體外Dicer消化)，或來自質粒或載體構建物的表達。在使用ACE化學處理製備siRNA的情況中，優選的用於溶解siRNA的溶液具有適合於保存2』-ACE保護基團的pH。因此優選的該溶液具有高於6.0的pH，更優選地，在大約7.0和大約8.0之間，以及最優選地在大約7.5以及大約8.0之間。在缺少ACE基團，然而有另一個化學修飾存在的情況下，該pH可以在大約7.0以及大約7.3之間。
正如所簡要描述地，基因沉默組合物中的siRNA可以被修飾以增加特異性和/或穩定性。相應地，特異性修飾可以被引入任意siRNA，以便減少非靶向。這樣的特異性修飾可以是靶向的一個方面。另外，siRNA可以兼備特異性和穩定性修飾。對於提高特異性的修飾的更進一步描述包括在PCT專利申請號PCT/US04/10343，提交於2004年4月1日、PCT申請與公布號WO2005/097992以及美國臨時的專利申請系列號60/542,668和60/543,661之中，其內容以引用的方式併入本文。
可以減少非靶效應的化學修飾的例子包括多種的在siRNA核糖基團上的2』修飾，並且還包括5』磷醯基修飾，其包括一個磷酸基。這樣的化學修飾的例子包括對有義鏈第一位置和第二位置核苷酸的2』修飾，它們分別是雙鏈體區域的第一個5』有義核苷酸以及第二個5』有義核苷酸。另外，該化學修飾可以包括對反義鏈第一位置和第二位置上核苷酸的2』修飾，它們分別是雙鏈體區域的第一個5』反義核苷酸以及第二個5』反義核苷酸。該化學修飾還可以包括一個磷醯基部分，例如一個磷酸基，在該反義鏈5』末端核苷酸的5』碳上。此外，該修飾可以用氫替換5』-OH基團以抑制激酶磷酸化作用。
提高特異性的化學修飾的一個例子包括在第一和第二有義核苷酸上的2』修飾以及可包括在反義5』末端核苷酸的5』碳上的磷醯基部分。第二個例子可包括在第一和第二有義核苷酸以及在第一和第二反義核苷酸上的2』修飾，並且可包括在反義5』末端核苷酸的5』碳上的磷醯基部分。第三個例子可包括在第一和第二有義核苷酸以及在第二反義核苷酸上的2』修飾，並且可以包括在反義5』末端核苷酸的5』碳上的磷醯基部分。第四個例子可以包括在有義5』末端核苷酸上的5』脫氧基團修飾，以及在第一和/或第二反義核苷酸上的2』修飾同時有或者沒有在第一和第二有義核苷酸上的2』修飾，以及在反義5』末端核苷酸的5』碳上的磷醯基部分。此外，在沒有任何2』修飾的情況下包括對於在第一個反義核苷酸的5』上的磷酸基團的修飾可以有益於減少非靶向。在有些情況下優選地在有義5』末端核苷酸的5』碳上不具有磷酸基團。
例如，靶向修飾可以包括在有義鏈第一位置和第二位置核苷酸(例如，5』末端的第一位置和第二核苷酸)上的2』-O-甲基以及在反義鏈上的5』磷酸。另外，靶向修飾可包括在反義鏈第一位置和/或第二位置的核苷酸(例如，來自反義鏈5』末端的第二個核苷酸))))))上的2』修飾，以及在該反義鏈5』末端核苷酸的5』位置上磷酸部分。優選的修飾包括在第一個和第二個有義核苷酸以及在第二個反義核苷酸上2』修飾，以及在反義5』末端核苷酸上的磷酸。
在一個具體實施方案中，本發明包括具有提高穩定性修飾的siRNA。因此，穩定性修飾可以通過附加於或者替換特異性修飾的方式而使用。另外，具有穩定性修飾的siRNA的優勢是它們可以防止核酸酶的降解。相應地，該穩定性修飾可以增加siRNA可能的儲存期限，並且增加製造以及在較長時間內儲藏具有乾燥基因沉默組合物的多孔板的能力。此外，穩定性修飾可用於在較長時間內誘導靶沉默。這樣的穩定性修飾描述於美國專利申請系列號60/542,646，60/543,640，以及60/572,270，美國申請號2004/0266707以及2004/0198640，以及國際的公布號WO2005/097992，以及WO2004/090105之中，每個文獻以引用的方式併入本文。在細胞中，延長的基因沉默具有多個優點。在有些情況下，靶基因的蛋白質具有長半衰期(例如大於24-48小時)，其需要延長基因沉默以使得蛋白質的量減少。
在一個具體實施方案中，本發明所包括的siRNA中包含了用來提高有義鏈、反義鏈、和/或siRNA雙鏈體穩定性的化學修飾模式。例如，穩定的siRNA可以包含在第一和第二有義核苷酸上的2』修飾，在所有的嘧啶型有義核苷酸中至少一個上的2』修飾，在第一和/或第二反義核苷酸上的2』修飾，在所有嘧啶型反義核苷酸中至少一個上的2』修飾，和/或在該有義或反義5』末端核苷酸的5』碳上具有的磷酸鹽修飾。該2』修飾可以是2』-O-脂肪族的修飾或2』滷素修飾。穩定性修飾還可以包括核苷酸間的磷硫醯或甲基膦酸酯修飾。
在第一個例子中，穩定的siRNA可包括在第一有義和第二有義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，在所有的有義嘧啶核苷酸中都沒有2』-O-脂肪族的修飾或至少一個上有2』-O-脂肪族修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸中至少一個上的2』滷素修飾，以及在反義5』末端核苷酸上的5』碳磷醯基修飾。第二個例子可包括在第一有義和第二有義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，在所有的有義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸中至少一個上的2』-滷素修飾，在反義5』末端核苷酸上的5』碳磷醯基修飾，以及在第一有義核苷酸5』碳上的膽固醇結合物。第三個例子可以包括在第一有義和第二有義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，在所有的有義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸中至少一個上的2』-滷素修飾，在反義5』末端核苷酸上的5』碳磷醯基修飾，以及在第一有義核苷酸5』碳上的螢光標籤結合物，其中該螢光標籤可以使用任何公知的螢光基團例如cy3。第四個例子可包括在第一有義和第二有義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，在所有的有義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在第一和/或反義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，以及在第一有義核苷酸5』碳上的螢光標籤結合物。第五個例子可包括在第一有義和第二有義核苷酸上的2』-O-脂肪族的修飾，在所有的有義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸上都沒有2』-O-脂肪族的修飾或在至少一個上有2』-O-脂肪族的修飾，在所有的反義嘧啶核苷酸上都沒有2』滷素修飾或在至少一個上有2』滷素修飾，以及在該反義5』末端核苷酸上的5』碳磷醯基修飾。另外，在2』或3』原子上的任何2』-滷素可以替換為磷硫醯基團。此外，任何siRNA可以包括在該反義鏈3』末端的突出端。選擇性地，第二反義核苷酸可以包含一個2』-O-烷基基團例如2』-O-甲基，並且第一反義核苷酸可以包含一個2』-OH或2』-O-甲基。另一個選擇是，突出端核苷酸可以包括2』修飾。
依照上文，2』修飾可以是2』-O-脂肪族修飾。此外，2』-O-脂肪族修飾可以存在於有義鏈和/或反義鏈的任意核苷酸上。該脂肪族基團可以包括飽和的或非飽和的、取代的或未被取代的、以及支鏈的或直鏈的鏈，其具有從1到20個碳或異種原子。更優選地，該脂肪族基團具有小於10個碳或雜原子，最優選地小於5個碳或雜原子，或是一個烷基。在一種選擇中，該2』-O-脂肪族的修飾可以替換為2』-O-芳香族取代基，或包括一個芳族基團。在另一個選擇中，該脂肪族基團可以是環狀的。例如，該2』-O-烷基可以選自以下基團2』-O-甲基、2』-O-乙基、2』-O-丙基、2』-O-異丙基、2』-O-丁基、2』-O-異丁基、2』-O-乙基-O-甲基(例如，-CH2CH2OCH3)、2』-O-乙基-OH(例如，OCH2CH2OH)、2』-原酸酯、2』-ACE基團原酸酯，以及由此的組合。最優選地，該2』-O-烷基修飾是2』O-甲基部分。另外，當該siRNA包括具有修飾的許多核苷酸時，在每一修飾的核苷酸上的修飾沒有必要是相同的。然而，對於就合成本發明分子的實用性而論，始終使用相同的修飾可能是可取的。
在一個具體實施方案中，優選地該2』修飾是一個原酸酯。因此，該2』修飾可以是一個2』-ACE基團。該2』ACE基團修飾參考於美國專利號6,590,093，6,008,400，以及5,889,136中，其中每個以引用的方式併入本文。
另外，該2』-滷素修飾可以選自以下的組氟、氯、溴、或碘；然而，氟是優選的。與特異性修飾相似，每個鏈始終使用相同修飾可能是可取的。例如，2』-O-甲基能被使用在有義鏈上，並且2』-氟能被使用在反義鏈上。然而，不同的2』修飾能被使用在相同鏈內的不同核苷酸上。
B.結合物 在本發明的一個具體實施方案中，siRNA包括與有義和/或反義鏈偶聯在一起的結合物。該結合物可以實現多種功能或為siRNA提供附加的功能。例如，結合物可以增加siRNA與或者沒有與載體複合時對細胞膜的穿透性。另外，該結合物可以是標籤從而可以被監測或識別以便確定標記的siRNA是否進入了細胞。
例如，結合物包括胺基酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、抗原、毒素、激素、脂質、核苷酸、核苷、多核苷酸、糖類、激素、碳水化合物、聚糖、聚二醇例如聚乙二醇以及聚丙二醇、膽固醇、磷脂、二和三醯甘油酯、脂肪酸、脂族化合物、酶作用物、生物素、異羥基洋地黃毒甙元、硫醚例如己基-S-tritylthiol、硫膽固醇(thiocholesterol)，醯基鏈例如十二基或十一基基團、雙-十六烷基-rac-甘油、三乙基銨基、1，2-雙-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺例如聚賴氨酸以及聚乙烯亞胺、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八烷基胺部分、己基氨基羰基-羥膽甾醇、法呢基、geranyl geranylgeranyl部分、螢光標記部分例如若丹明以及發螢光的、放射性的標記，酶的標記等等。優選的結合物包括膽固醇以及螢光的標記。
結合物，例如膽固醇、聚乙二醇、或多肽可以促進轉運siRNA進入細胞。優選地，當該結合物是脂質時，該脂質與siRNA的聯合不會誘導細胞毒性。另外，多肽或脂質結合物例如脂肪酸或膽固醇有可能消除對形成siRNA-載體複合物(例如，lipoplex)的需要。部分原因是該多肽或脂質可以用來運輸siRNA穿過細胞膜。
例如，可以使用膽固醇結合物以改善siRNA作為沉默劑的潛力。這種改善可以由修飾的和未修飾的siRNA以及shRNA得到。將膽固醇偶聯至有義鏈可以減輕對於有義鏈進行2』修飾而造成的負效應。有時候，膽固醇可以不利用多核苷酸載體而將siRNA被動地遞送進入細胞；然而，多核苷酸載體，例如脂質，能與膽固醇結合物一起使用。相應地，該siRNA-膽固醇可以通過形成一個可通過siRNA的孔而遞送，或通過結合到質膜隨後通過內吞作用途徑或質膜再生而被送到細胞中。
另外，標記物，例如螢光結合物，可用於監測siRNA進入細胞的轉運。該螢光標記可用於光度測定監測對照siRNA進入細胞的轉運。優選地，該螢光標記是若丹明或螢光素；然而，其它可以結合siRNA的螢光分子也能被使用。螢光標記的具體例子包括Cy3TM，Cy5TM(Amersham)，其他的藍色素衍生物，FITC，ALEXATMor BODIPYTM染料(分子探針，Eμgene，OR)中的一個，二甲氨基偶氮苯甲醯部分(dabsyl moiety)等等。也可能使用螢光微粒，例如無機的螢光粒子只要該粒子具有不影響轉染效率的大小。該標記可用來實現對在轉染細胞內的標記siRNA的顯像。另外，該標記可用於從非轉染的細胞中區分出轉染的細胞。因此，可以使用該標記的siRNA轉染一群細胞並且通過FACS(流式細胞儀)進行分選。此外，該螢光標記特別適合於HCS以及HTC分析方法。例如，已經轉染的細胞可以被識別，然後利用HCS分析進行更進一步的檢驗。
對標記的核苷酸的使用是本領域普通技術人員所公知的，並且除了螢光標記之外，例如，酶促的、質量、或放射性的標記可以在應用中使用，而且這些標記將是有益的。可應用到siRNA反向轉染上的對於標記分子更進一步的描述參見美國臨時的專利申請號60/542,646，60/543,640，以及60/572,270和PCT申請系列號PCT/US04/10343，其中每個以引用的方式併入本文。
結合物可以直接地或通過接頭連接至siRNA。結合物可以連接至siRNA內部的任意有義或反義核苷酸，然而，優選地偶聯至3』末端核苷酸和/或5』末端核苷酸。一個內部的結合物可以是直接地或間接地通過接頭連接至核苷酸核糖基團的2』位置，或者其他合適的位置。例如，該結合物可以偶聯至5』-氨基丙稀尿嘧啶核苷。優選地，該結合物可以連接至有義3』末端核苷酸，反義3』末端核苷酸，和反義5』末端核苷酸。
例如，接頭可以包含修飾的或未修飾的核苷酸、核苷、多聚體、糖類、碳水化合物、聚烯烴基例如聚乙二醇和聚丙二醇、多元醇、聚丙烯、乙烯和丙二醇的混合物、聚烷基胺、聚胺例如聚賴氨酸和亞精胺、聚酯例如聚(丙烯酸乙酯)、聚磷酸二酯、脂族化合物和烯烴基。結合物和它的接頭的一個例子是膽固醇-TEG-亞磷醯胺，其中該膽固醇是結合物，四甘醇(「TEG」)和磷酸鹽充當接頭。
另外，用於闡明結合物、結合物的運用、以及製造包含結合物的dsRNAs的方法在下面的參考文獻中揭露美國專利申請系列號10/406,908，提交於2003年4月2日，公布為美國專利申請號2004/0198640；美國專利申請系列號10/613,077，提交於2003年7月1日，2004年12月30日公布為美國專利申請號2004/0266707；以及PCT/US04/10343，國際提交日2004年4月1日，在2004年10月21日公布為WO2004/090105 A2，其中每一上述的申請以引用的方式併入本文。然而，包含結合物的s iRNA可以通過本領域公知的任意方法合成。
VI.減少非靶向 當用來靶向並且沉默一個基因的siRNA無意地靶向並且沉默一或多個另外的基因時就發生了非靶向。這樣的非靶向的發生是由於siRNA的有義和/或反義鏈和非靶mRNA之間互補水平的變化。由非靶向引起後果包括對關鍵基因的沉默，並引起多種表型(例如，細胞死亡，細胞分化)。此外，非靶向可以在多種的表型篩選中產生假陽性。因此，非靶向的後果代表了實行大規模的、基因組範圍的基於siRNA的表型篩選要面臨的挑戰性障礙。相應地，減少以及消除任意的非基因沉默是有益的。
在一個具體實施方案中，可以通過利用siRNAs庫減少或抑制將非靶向的後果。與單一的siRNA相比siRNAs庫已經顯示出可以引起較少的非靶效應。如上所述，該庫可能包含兩個或更多siRNAs，它們基本上與一個靶mRNA的不同的子序列互補或與不同的靶mRNAs的子序列互補。例如，第一siRNA和第二siRNA可以包含基本上與一種靶mRNA的第一和第二子序列互補的反義序列。第一和第二子序列可以是互不重疊的或重疊的。基因沉默組合物可以包括具有二，三、四，五個或更多不同siRNAs的庫。當至少兩種siRNA直接針對相同目標時，由於使用了siRNAs庫而減少非靶效應的好處是特別顯著的。此外，修飾的siRNA庫，具有髮夾結構的siRNA庫，或者具有結合物的siRNA庫是具有優勢的。利用siRNA庫的益處在下述文獻中描述美國專利申請，10/714,333，提交於2003年11月14日，相關的PCT申請PCT/US03/36787，作為WO2004/045543 A2公布於2004年6月3日，美國專利申請10/940,892提交於2004年9月14日，作為美國專利申請公布2005/0255487和美國專利申請公布2005/0246794，其中每個文獻以引用的方式併入本文。
非靶向的減少或者特異性的增加還可以通過使用低於誘導非靶效應的siRNA濃度而實現。例如，轉染100nM的單一siRNA可以誘導90％的沉默，然而高濃度的該siRNA可能同時誘導非靶效應。相反，四種siRNAs(例如，總濃度100nM，每個25nM)組成的庫可以相似地誘導產生90％的沉默。因為每個siRNA是四分之一的濃度，非靶的總量是較少的。因此，為了獲得帶有抑制的非目靶效應或者沒有非靶效應的沉默，可在低濃度使用高度功能性的siRNA，或者靶向至相同基因的siRNA庫，庫中每種siRNA具有足夠低的濃度以儘量減少非靶效應。優選地，siRNAs的總量可以以小於或等於100nM的濃度進行轉運。更優選地，siRNAs的總量可以以小於或等於50nM的濃度進行轉運.更加優選地，siRNAs的總量可以以小於或等於25nM的濃度進行轉運。更加優選地，siRNAs的總量可以以小於或等於10nM的濃度進行轉運。最優選地，siRNAs的總量可以以小於或等於1nM的濃度進行轉運。
在另一個具體實施方案中，抑制或者終止非靶效應的另一個方法是將熱力學不穩定性引入至第二反義核苷酸上的該雙鏈體鹼基配對中。例如，這可以通過在siRNA反義核苷酸和其靶mRNA上應該與之互補的核苷酸之間的錯配而實現。另外地，在siRNA反義鏈或者有義鏈上插入或者刪除一個核苷酸可以在雙鏈體中產生一個凸起，該雙鏈體形成於siRNA反義鏈或者有義鏈和靶mRNA或者非靶序列之間。另外，還可以將熱力學不穩定性引入從5』末端起的第三、第四、第五、第六、和/或第七個反義核苷酸。然而，產生的熱力學不穩定性可以導致對於其它序列的沉默(例如，其它的或者次要的非靶效應)，但是可以通過使用合理設計的熱力學不穩定性而避免。
VII.多核苷酸載體 在一個具體實施方案中，本發明包括可以與siRNA相互作用，並且運輸該siRNA穿過細胞膜的多核苷酸載體。然而，在本發明轉染模式的其它具體實施方案中可以以沒有載體的方式實施，例如通過電泳、沉澱、粒子轟擊、光穿孔、以及顯微注射。通常，多核苷酸載體包括正電荷，其與在多核苷酸主鏈上帶負電荷的磷酸相互作用。多核苷酸載體是在細胞核酸轉運領域內是公知的。優選的多核苷酸載體包括多聚體、脂質、脂多聚體、脂質-肽混合物等等，其能夠絡合siRNA並且以保持基因沉默功能且不會過度有毒的方式將siRNA轉運進入細胞。因此，可根據在此描述的通過優化RTF以鑑別用於某種的系統或者細胞的最佳的多核苷酸載體方法來實施常規試驗。
在一個具體實施方案中，脂質或者脂質-肽混合物優選的用於引導siRNA進入靶細胞。一般地，該脂質是陽離子脂質。可用於引導siRNA進入細胞的陽離子脂質特徵為具有很少毒性或沒有毒性(例如，定義為小於15-20％毒性)，其可以通過AlamarBlue或等效的細胞生活力分析而測量。另外，脂質可以轉運足夠量的siRNA進入細胞以便誘導基因沉默。脂質是可以從各種商業的資源中獲得，包括而不局限於Invitrogen(LIPOFECTAMINETM，LIPOFECTAMINETM2000)，Ambion(siPORTTM)，B-Bridge International(siFECTORTM)，Mirus(TransIT-TKOTM)，以及Qiagen(RNAiFECTTM)。然而，並非所有的脂質是功能等效的並且某些脂質可以更適合於特定的細胞系。因此，可以使用上述最優化過程以確定用於轉運siRNA至特定細胞系的適當脂質以及脂質濃度。此外，脂質-肽混合物可以增強轉運siRNA進入細胞。與一個或多個蛋白質、脂質、脂質-聚糖、或者其它的細胞膜組分具有親合性的肽可以與siRNA結合，並且可以獨立於脂質使用，或者更有效地同一種或多種脂質相結合以形成多核苷酸載體使用。這樣的脂質-肽混合物可以提高siRNA的RTF。膽固醇結合物可以相似地與siRNA偶聯在一起並且獨立於多核苷酸載體使用或者有效地與其聯合而使用。
簡要地，為了鑑別一個給定的脂質是否適用於siRNA RTF，可以在各種脂質、培養基、以及siRNA濃度下使用在此描述的優化RTF方法來檢驗兩個或更多個孔中的siRNAs。隨後，使用本領域公知的方法量化對於該靶基因沉默的水平以及細胞死亡的水平。用於siRNA RTF的合適脂質包括但是不局限於OLIGOFECTAMINETM，TransIT-TKOTM，或者TBIO Lipid 6TM(Transgenomic part#24-1001-05).更優選地，本發明使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)。最優選地，本發明使用脂質DharmaFECTTM1，DharmaFECTTM2，DhaxmaFECTTM3，DharmaFECTTM4(Dharmacon，Inc.)其已經特異地設計用於遞送siRNA。術語「DharmaFECTTM」(後面是任何數碼1，2，3，或者4)或者短語「DharmaFECTTM轉染試劑」，是指一或多種基於脂質的轉染試劑，其已經最優化用於轉染siRNA而不是較大的核酸(例如，質粒)。
功能性的siRNA-脂質複合物的形成可以通過混合siRNA以及脂質而製備。因此，在選定濃度下適當體積的脂質可以與一定體積的培養基和/或緩衝液結合以形成具有合適的脂質濃度的脂質-培養基或者脂質-緩衝液。例如，體積大約為5-50微升(「μL」)的脂質培養基可以包括大約0.03-2微克(「μg」)脂質以用來置於96-孔板中的每個孔中，並且脂質的量可以根據其他孔的大小而變化。對用於siRNA RTF的培養基和/或緩衝液的選擇可以改善RTF操作方案的效率。一些培養基包含一種或多種在RTF期間誘導細胞毒性和/或非特異性基因調節的添加劑。優選的培養基或者緩衝液的例子包括Opti-MEMTM(GIBCO，Cat.#31985-070)，HyQ-MEM-RSTM(HyClone，Cat.#SH30564.01)，Hanks Balanced Salt SolutionTM，或功能相同的培養基。合適的培養基可以通過使用在此描述的最優化操作方案來鑑別。
脂質-培養基或者脂質-緩衝液可以通過多種方法被引入孔中，包括手持式單一移液器及多通道移液器，或者更先進的自動化的移液系統，其可以注射所定體積的脂質溶液進入孔中。該脂質溶液可以在包含乾燥基因沉默組合物的孔中培養一段足夠溶解或者懸浮該siRNA的時間，並且形成siRNA-脂質複合物(例如，lipoplexes)。通常，siRNA溶解以及lipoplex形成的過程需要大約20分鐘，但是通常至多120分鐘。該複合物形成過程一般來說在室溫下完成，但是也可以在4-37℃範圍下完成。在有些情況下，可以通過短暫(例如，幾秒-幾分鐘)攪動多孔板)以混合該脂質以及siRNA，從而提高siRNA溶解以及複合物形成。
VIII.孔的排列 在一個具體實施方案中，包括許多具有不同的乾燥基因沉默組合物的孔的siRNA RTF板可以按預定排列安排這些孔。這樣的排列可以與siRNA RTF板所使用的分析類型相一致。也就是說，當研究一個基因家族時，靶向至相同基因的siRNA可以安排在同一列或者行中，同時靶向至不同基因siRNA可以安排在不同的列或者行中。因此，孔可以根據預先選出的排列進行安排以便特定的siRNAs在板上以預先選出的模式放置。該預先選出的模式包括對照孔，例如那些包括一種或多種陰性的和/或陽性的siRNA對照，以及轉染對照。此外，該預先選出的模式包括沒有或基本上沒有siRNA的孔，其可以作為對照和用於校準。
在不同多孔板的孔中具有預先乾燥的siRNA以便多個板可以同時製備，這是有益的。這可以允許多孔板在標準位置上具有含標準量siRNA的基因沉默組合物，這有利於在多重實驗中使用標準化的多孔板，該多重試驗可以在不同時間實施並且不會引起板間的多變性。標準化板排列的使用可以提供一系列的板，其能在一段時間內使用後一起進行數據分析。
例如，一個包含許多列的孔的板可以包括位於第一列的轉染對照，位於第二列的用於RNAi的陽性對照，位於第三列的用於RNAi的陰性對照，位於第四列的直接針對單一靶的siRNAs庫，以及位於隨後列的包含第四列的siRNA庫的特定成員，例如從第五直到第十二列。另外地，該第五列直到第十二列可以包含處於第四列庫中的不同濃度的每種siRNA，孔到孔之間siRNA的量增加或者減少。每個孔可以包括庫中每種siRNA的一個濃度，或者庫中每種siRNA的二、三、四、五、或更多個濃度可以出現在不同的孔中。可以使用的siRNA濃度的數目僅僅由板上孔的數目所限制；然而，多個板可以通過推廣至所有板的預定模式配置從而一起使用。
相應地，siRNA濃度梯度的預先選出模式可以作為一個可被觀測的模式使用，以便可以通過觀測在特定濃度下的特定siRNA引發的沉默水平而確定庫中每種siRNA的最佳量。例如，在第四列的連續的每行中具有連續地增加或者減少的總庫siRNA量。另外，連續的列可以包括連續地增加或者減少的特定庫siRNA的量。
圖IA和IB顯示了與上述濃度排列相似的板排列的具體實施方案。雖然孔顯示為正方形，但應該認識到它們可以是任意形狀。此外，該多孔板可以包括許多孔，並且描述的孔的數目僅僅用於舉例。在圖中孔按照如下的定義「Tc」表示轉染對照多孔，其中逐漸增加的相應數字區分不同的轉染對照；空白孔表示沒有或基本上沒有任意siRNA的孔；「+」表示陽性對照；「-」表示陰性對照；「P1」直到「P1N」表示在一個濃度梯度下沉默第一基因的第一庫；「P2」直到「P2N」表示在一個濃度梯度下沉默第二基因的第二庫；「1A」直到「1N」表示在一個濃度梯度下的第一庫的第一特定的siRNA；「2A」直到「2N」表示在一個濃度梯度下的第一庫的第二特定的siRNA；「3A」直到「3N」表示在一個濃度梯度下的第一庫的第三特定的siRNA；「4A」直到「4N」表示在一個濃度梯度下的第二庫的第一特定的siRNA；「5A」直到「5N」表示在一個濃度梯度下的第二庫的第二特定的siRNA；以及「6A」直到「6N」表示在一個濃度梯度下的第二庫的第三特定的siRNA。因此，圖IA顯示了分析單一庫的多孔板，並且圖IB顯示了分析多重庫的多孔板。另外，多孔板可以包括超過兩個庫。此外，該庫以及單一siRNA可以是合理地設計的，和/或具有修飾或者結合物。
另外，可以組織關於板排列的具體實施方案以使得該板包含的siRNA針對單一生物學相關途徑、細胞代謝過程、細胞事件、調控的蛋白質、胚胎的過程，特定染色體位置、細胞周期、有機體或者器官發育、細胞分化、炎性過程、增殖的過程、血管生成等等。在另一個具體實施方案中，可以在板上排列siRNAs的靶基因，它們是已知的和/或猜測的和疾病或者失調或者先於疾病或者失調的生物過程有牽連。在另一個具體實施方案中，多孔板包括作為miRNA抑制劑的siRNA。在另一個具體實施方案中，用於研究具有和已知的或者猜測的上遊和下遊效應相關的siRNA的生物學途徑的板排列的原則可以是蛋白質，而不是激酶。關於這些及用於多種研究的其他板排列的附加描述可以參見所引用的美國臨時申請系列號60/678,165。
在另一個具體實施方案中，可以將siRNA排列在多孔板中，該siRNA靶向至具有一或多個單核苷酸多態性(「SNP」)的基因。可以製備這樣的多孔板以便評定特定的SNP對表型、生物學功能、疾病狀態、或者其它的事件的影響。例如，SNP板可能包含具有不同的siRNA(s)的孔，包括下述的(i)針對第一目標的第一siRNA；(ii)和與第一siRNA相差一個鹼基對的第二siRNA，其包括一個SNP；(iii)由第一siRNA和第二siRNA組成siRNA庫；和(iv)對照siRNA。此外，第一目標和第二目標可以編碼用於潛在地致死對(lethal pair)。
在另一具體實施方案中，多孔板可以包含一種siRNA的排列，該siRNA直接針對於一個或多個基因，並已經知道敲低這些基因會誘導特定的疾病狀態。這樣的孔可以編制起來以便通過靶向這樣基因的連續siRNA促進特定疾病的研究。用這種方法，科研工作者可以研究各種疾病狀態，所包括的狀態與下述疾病相關癌、神經病學疾病、糖尿病、新陳代謝病、骨、軟骨、肌肉、心臟、腎、肝臟、前列腺、胃腸道疾病等等。這些板的孔可以包含單獨的siRNA或者siRNA庫。
另外，可以排列多孔板以在不同的孔中包括大量不同的修飾的和/或未修飾的siRNAs。例如，一個96-孔板可能包含下列內容10-12孔的未修飾的第一siRNA；10-12孔的修飾的第一siRNA；10-12孔的未修飾的第二siRNA；10-12孔的修飾的第二siRNA；10-12孔的未修飾的第三siRNA；10-12孔的修飾的第三siRNA；10-12孔的未修飾的第四siRNA；10-12孔的修飾的第四siRNA。第一、第二、第三和第四siRNAs可以是針對同一靶mRNA的不同區域，其可以是重疊的或者不重疊的，或者它們可以針對編碼不相關蛋白質的不同mRNA，或者具有相似的功能或者在相同生物學途徑中起作用的蛋白質。
在另一個具體實施方案中，可以排列多孔板以使一些孔包含庫，同時一些孔包含單一種類的siRNA。因此，該多孔板可以具有不同的孔，其包含下列物質(i)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(ii)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，和第四siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(iii)第一siRNA，第二siRNA，第三siRNA，和第五siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(iv)第一siRNA，第二siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(v)第一siRNA，第三siRNA，第四siRNA，和第五siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(vi)第二siRNA，第三siRNA，和第四siRNA，第五siRNA，其中任意一個可以是修飾的或者未修飾的；(vii)第五siRNA，其可以是修飾的或者未修飾的；(vii)第六siRNA，其可以是修飾的或者未修飾的；(viii)第七siRNA，其可以是修飾的或者未修飾的；(ix)第八siRNA其可以是修飾的或者未修飾的；(x)第九siRNA，其可以是修飾的或者未修飾的；和/或(xi)對照siRNA. 另外，可以編制多孔板的排列以便研究siRNAs文庫，其可以以陣列格式提供。優選地，該陣列包含RTF siRNA文庫。siRNA文庫可用於研究整個基因家族或者調控通路。這些siRNA文庫包含預先選定的多組合理設計的siRNA試劑庫，該siRNA試劑靶向被證實的與特定的通路有關的或者從系統發生上與所示基因家族有關的基因。另外，這樣的siRNA文庫的例子可以參見表1。
表1 siRNA文庫 表1中描述了組成siRNA文庫的siRNAs，美國臨時申情系列號60/678,165提供了關於利用基因沉默以研究表格1中鑑別出的途徑更完整的說明，以及關於板排列和可以使用siRNA庫研究的基因種類的附加描述。
實施例 所提供的下列實施例用來以本領域技術人員能夠實現本發明的方式描述本發明的一些具體實施方案。另外，以下實施例包括實際上已實行的以及預言性的實驗。用於以下實施例的另外的實施例以及附加信息可參見下述參考文獻律師記錄號16542.1.2，題為「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY GENE SILENCINGPOOLS」，發明者為Barbara Robertson，Ph.D.等人；律師記錄號16542.1.3，題為「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY CONTROL GENE SILENCING COMPOSITIONS」，發明者為Barbara Robertson，Ph.D.等人；以及美國臨時申請系列號60/678,165。用於實施例的多核苷酸序列可以參見美國臨時申請系列號60/678,165的表I-IV。
實施例1 本發明的多核苷酸可以通過現在已知的或者將來開發的任意可用於製備能形成siRNA的多核苷酸的方法來合成。在此描述的包含修飾的siRNA雙鏈體的一條鏈，可以利用下述文獻描述的物質以及方法而進行化學合成，這些文獻是Scaringe，S.A.(2000)Advanced 5』-silyl-2』-orthoester Approach to RNAOligonucleotide Synthesis，Methods Enzymol.，317，3-18；Scaringe，S.A.(2001)RNA Oligonucleotide Synthesis via 5』-silyl-2』-orthoester Chemistry，Methods，23，206-217；美國專利號5,889,136；美國專利號6,008,400；美國專利號6,111,086；以及美國專利號6,590,093；每個文獻以引用的方式併入本文。簡要地說，合成法可以利用保護核苷鹼基的5』-O-甲矽烷基-2 』-O-原酸酯-3』-O-亞磷醯胺或者其它的保護基團以便將修飾的或者未修飾的核苷酸引入具有特定的siRNA序列的多核苷酸中。該合成是按典型方式進行的，從而該多核苷酸以3』到5』的方向從固體支持介質上延伸。
實施例2 如實施例1所描述的，siRNA雙鏈體的有義鏈以及反義鏈是在分開的反應過程中化學合成的。簡要地，每個合成方法是相似的並且開始於核苷酸從固體聚苯乙烯支持物上的連續延伸，3』-最末端核苷已經共價地連接於該支持物上，其中該有義核苷X21和反義核苷Y21是連接在該支持物上。然後利用重複循環以從3』到5』方向的序列-特異性的方式連續地添加核苷至該結合支持物的樣品(support boundspecies)上上。該反應循環是這樣實行的第一個循環添加該有義核苷X20至X21或者反義核苷Y20至Y21；第二個循環添加有義核苷X19至X20X21或者反義核苷Y19到Y20Y21，並且延伸直到該整個有義或者反義鏈完成。每個循環由四個步驟組成結合支持物的樣本的5』-羥基的脫保護；待引入的核苷的反應偶聯基團結合至結合支持物的樣本的5』-羥基；未反應的5』-羥基的加帽；以及該核苷酸間連鍵的氧化。一般地，該反應偶聯基團是5』-甲矽烷基-2』-原酸酯-3』亞磷醯胺例如5』-O-二苯甲基氧基(benzhydroxy)-雙(三甲基矽烷基氧基trimethyl silyloxy)甲矽烷基-2』-O-雙(2-乙醯基氧基乙基)鄰位甲酸基-3』-O-(N，N-二異丙基)甲基亞磷醯胺(例如，結構1)。可以合成在位置1和2(例如，mXq，q＝1和2)具有2』-O-甲基核苷的有義鏈。利用序列-適合的5』-甲矽烷基-2』-O-甲基3』-亞磷醯胺將這些修飾的核苷引入進來，特別地，利用5』-O-二苯甲基氧基(benzhydroxy)-雙(三甲基矽烷基氧基)-甲矽烷基-2』-O-甲基-3』-O-(N，N-二異丙基)甲基亞磷醯胺(例如結構2)。結構1和2有如下特徵B是一個核苷鹼基例如腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷或者尿嘧啶核苷；Z是一個用於環外胺的保護基團(例如，異丁醯用於A和G，乙醯基用於C)。可以合成在5』-末端核苷酸上(例如，位置1)具有一個磷酸基的反義鏈。通過化學手段利用N，N-雙異丙基氨基-雙(2-氰乙基)亞磷醯胺(例如，結構3))將這些磷酸基團引入進來。完整的有義鏈如下5』＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3』。完整的反義鏈如下3』＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3Y2Y1-PO4＜5』。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq核苷是2』-O-甲基核苷包括2』-O-甲基-A，2』-O-甲基-C，2』-O-甲基-G，2』-O-甲基-U。該有義鏈以及反義鏈可以形成雙鏈體siRNA。

結構1
結構2
結構3 實施例3 另一個siRNA雙鏈體是用與實施例2所描述的基本上相同的合成過程來製備的。更特別地，有義鏈是根據實施例2中的描述而製備的，並且反義鏈除了核苷mY1以及mY2包括2』-O-甲基核苷之外也是同樣地製備的。相應地，在反義鏈上的2』-O-甲基核苷是根據實施例2中的描述與有義鏈相合併。完整的有義鏈如下5』＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3』。完整的反義鏈如下3』＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3mY2mY1-PO4＜5』。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq和mYq核苷是2』-O-甲基核苷包括2』-O-甲基-A，2』-O-甲基-C，2』-O-甲基-G，2』-O-甲基-U。該有義鏈以及反義鏈可以形成如實施例2所描述的雙鏈體siRNA。
實施例4 另一個siRNA雙鏈體是用與實施例2所描述的基本上相同的合成過程來製備的。更特別地，有義鏈是根據實施例2中的描述而製備的，並且反義鏈除了核苷mY2包括2』-O-甲基核苷之外也是同樣地製備的。相應地，在反義鏈上的2』-O-甲基核苷是根據實施例2所描述的用於有義鏈的方式而引入的。完整的有義鏈如下5』＞HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH＜3』。完整的反義鏈如下3』＞HO-Y21Y20Y19Y18Y17Y16Y15Y14Y13Y12Y11Y10Y9Y8Y7Y6Y5Y4Y3mY2Y1-PO4＜5』。Xq以及Yq核苷包括A，C，G，或U。mXq和mYq核苷是2』-O-甲基核苷包括2』-O-甲基-A，2』-O-甲基-C，2』-O-甲基-G，2』-O-甲基-U。該有義鏈以及反義鏈可以形成如實施例2所描述的雙鏈體siRNA。
實施例5 在下列實施例中，使用細胞培養物來研究基因沉默、mRNA探測、細胞毒性、轉染效率等等。相應地，該細胞培養物可以通過本領域公知的方法維持和培養。可以通過分支DNA(「B-DNA」)分析(Genospectra，Fremont，CA)或等效的本領域已知的技術來研究表達和基因沉默的水平。基因沉默研究的細胞毒性評估可以使用AlamarBlue分析(Biosource International，Camarillo California)，由此來評估由實驗程序產生的細胞死亡的程度。
實施例6 反向轉染(「RTF」)操作方案是使用DNA和siRNA來確定是否一種配置用於DNA的RTF程序可以直接交叉地應用於siRNA。相應地，使用多種脂質、脂質濃度、以及質粒或者siRNA濃度將DNA和siRNA反向轉染進入細胞。質粒DNA的RTF是利用96-孔聚-L-賴氨酸板實施的，其中將在50μL體積中含有62.5-250ng pCMV-Luc(例如，公知的螢光素酶表達質粒)的溶液加入孔中並乾燥。隨後，在不同的孔中用LIPOFECTAMINETM2000培養基，OLIGOFECTAMINETM培養基，以及TRANSIT-TKOTM培養基(Opti-MEMTM)溶解並且複合該pCMV-Luc，其中在30μL的總體積下向每孔添加0.125-1微克(「μg」)的脂質。在加入含10,000個Hela細胞的70μL培養基以獲得100μL總體積之前，使複合物在30-60分鐘內形成。該板溫育48小時然後用STEADYGLOWTM試劑盒(Promega)檢測螢光素酶的表達。
作為對照，利用正向轉染程序將pCMV-Luc引入細胞。特別地，以每孔10,000個細胞的密度將Hela細胞塗覆在96-孔板中。第二天，用LIPOFECTAMINETM2000與不同量的pCMV-Luc在室溫下複合20分鐘，再與Opti-MEMTM(例如，每20μLLIPOFECTAMINETM2000質粒混合物使用80μL Opti-MEMTM)混合。從每個孔中移除培養基，然後順序添加50μL Opti-MEMTM，50μL脂質-CMV-Luc質粒-培養基複合物。這些程序完成後，CMV-Luc質粒和脂質最終量分別在每孔5-50ng和0.125-1.0μg之間。
將對照siRNA反向轉染入相同的細胞系以便和DNA RTF相對比。將具有25μL體積內含大約62.5-250納克的親環素B siRNA(例如，環3)加入96-孔聚L-賴氨酸板上並且乾燥。在不同的孔中用LIPOFECTAMINETM2000培養基，OLIGOFECTAMINETM培養基，TRANSIT-TKO培養基或″siRNA168″-培養基(Opti-MEMTM)溶解並且複合該SiRNA，其中在總體積為25μL下向每孔添加0.156-1.25μg的脂質。「siRNA168」是-種定製用於siRNA轉運的脂質。在加入含10,000個Hela細胞的75μL培養基以獲得100μL總體積之前，使複合物在30-60分鐘內形成。該板溫育48小時然後用B-DNA分析測定人親環素B mRNA的下調水平。
這些研究的結果在圖2A-2F中提供，其是顯示RTF程序功效的圖表。該圖表表明RTF程序對DNA和siRNA具有不對等的轉運水平。使用正向轉染方案，pCMV-Luc容易轉染和在細胞中表達，而RTF操作方案則轉運不佳。與此相反，已確定利用LIPOFECTAMINETM2000對環3siRNA成功進行RTF的情況，並且其提供了極好的基因沉默。這些結果證明DNA和siRNA在RTF方案中的具有完全不同的性質。另外，數據表明脂質在siRNA RTF中的效力顯著地變化。
實施例7 研究與siRNA功能相關的RTF操作方案以實現基因沉默的能力。在單一細胞密度或者每孔10,000個細胞的條件下利用每100mL 0.031-0.5μg脂質的脂質濃度反向轉染不同siRNAs的功能性(例如，F50-F95)。特別地，分別具有95、90、75、和50的沉默功能的環3、環14、環28、和環37以不同濃度懸浮在無RNA酶的水中然後沉澱並乾燥在96-孔板的孔底面上。添加大約25μL的DharmaFECTTM1-OptiMEMTM至每個孔中以獲得最終每100μL0.031-0.5μg的脂質濃度，用以在加入每孔10,000個Hela細胞之前在室溫下溶解並複合該siRNA30-60分鐘。四天後研究該基因沉默。
圖3A-3F是從基因沉默分析中獲得結果的圖示。正如在該圖表中顯示的，同種等功能性的siRNA(例如，環28，2天)或者較弱功能性的siRNA(例如，環37，0天)相比，高度功能性的siRNAs(例如，環3和14)表現出較長時間(例如，4天)的沉默。因此，選擇通過合理設計的功能性siRNA可以大大地改善基因沉默的持久性。
實施例8 利用正向轉染操作方案分析siRNA誘導產生非靶效應的能力。特別地，以正向轉染方式轉染修飾的和未修飾的IGF1R-73siRNAs進入細胞，然後從細胞裂解物中純化mRNA並利用Agilent微陣列進行分析。該修飾包括在第一和第二有義核苷酸添加2』-O-甲基，還有在第二反義核苷酸添加2』-O-甲基，還有在反義5』末端核苷酸的5』位置上添加磷酸基。簡要地，將從未經處理的或者siRNA處理的細胞中分離的μg總RNA進行擴增，然後使用Agilent’s Low Input RNA FluorescentLinear Amplification Kit標記Cy5TM或者Cy3TM(Perkin Elmer)。依照標準操作規程使用Agilent’s人類IA(V2)寡量微陣列(例如，22,000序列)實行雜交，其中用每個Cy-3TM和Cy-5TM標記的原料添加750納克到每個陣列上。載片使用6X和0.06X含有0.025％N-十二醯甲甘氨酸的SSPE衝洗，再使用Agilent’s無水乾燥和穩定溶液進行乾燥。在Agilent微陣列掃描器(G2505B型)上掃描每個樣品陣列的生物複製物，並且使用特徵提取(Feature Extraction)軟體(v6.1.1或v7.5.1)加工原始圖象。使用Spotfire Decision Site 7.2軟體和Spotfire功能性基因組模數實行更進一步的分析。在自身與自身(self-self)的雜交中，具有小於2.8的低信號基因從該分析中移除，該得分通過計算自以10為底的綠色和紅色加工信號總和的對數值而獲得的。2倍參數截止值(例如，對數比率＞0.3或者＜-0.3)被應用於進行比較分析的基因上。不使用逸出值標誌(outlier flagging)。
圖4是表明這些實驗結果的圖像，並且顯示siRNA IGF1R-73下調了多組基因。在圖4中，非靶向在圖像右側頂端以較淺的顏色線顯示，其是未修飾的siRNA。另一方面，修飾的siRNA沒有顯示實質上的非靶向。這些非靶效應是高度有害的，因為在基因組siRNA篩選是它們可以產生假陽性。
實施例9 用具有毒性基序的siRNA研究修飾的siRNA減少非靶效應和減少非靶效應產生的表型的能力。該毒性siRNA是經過如下修飾的在第一和第二有義核苷酸添加2 』-O-甲基，以及在第二反義核苷酸添加2 』-O-甲基，還有在反義5』末端核苷酸的5』位置添加磷酸基。這些修飾顯著地減少了經過雙鏈體產生的非靶效應。
圖5是當毒性siRNA被修飾後所出現的細胞毒性的圖示。該圖表顯示八個單獨的未修飾的毒性siRNA(例如，MAP2K2 d3、SRD5A1 d1、SRD5A1 d2、SRD5A1 d4、SRD5A2 d3、PDE8A、STKI 13和CHD4)都減少細胞生活力到低於75％。與此相反，化學修飾的八個雙鏈體顯著地減少siRNA-誘導的毒性同時沒有顯著地改變靶特異性的沉默。這些發現證明對siRNA添加化學修飾可以消除非靶效應產生的表型。
實施例10 通過用100％人類血清溫育的siRNA來研究s iRNA抗核酸酶的穩定性。然後在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上檢驗該siRNA。圖6是該凝膠的圖像，其顯示了未修飾的siRNA在有RNA酶存在的情況下迅速地降解並且具有按分鐘計量的半衰期。如所示，在可見的多核苷酸帶的位置上劃線以使其清晰。相應地，修飾的siRNA能在研究過程中保持其完整性。因此，該結果指出修飾的siRNA可以在長時間內保持其完整性。這是重要的，因為本發明的板包含乾燥的siRNA，這些板可能需要幾周到幾月的貯藏期限，其間存在RNA酶汙染和siRNA降解的可能。
實施例11 研究了穩定修飾的siRNA抵抗RNA酶降解的能力。該穩定siRNA具有下列修飾在第一和第二有義核苷酸上的2』-O-甲基；在所有的有義嘧啶核苷酸(例如，C和U)上的2』-O-甲基；在所有的反義嘧啶核苷酸上的2』-F修飾；以及在反義5』末端核苷酸的5』上磷酸基。圖7包括了四個修飾的siRNA(例如，M1-M4)和四個未修飾的siRNA(例如，U1-U4)的圖示。該圖表顯示與未修飾的siRNA相比，修飾的siRNA顯著地抗降解。修飾模式將siRNA清半衰期從幾分鐘增加到了大於100小時。
實施例12 研究了穩定修飾的siRNA經受通過RNA酶的降解仍保持功能性的能力。該功能性試驗是用如實施例11描述的修飾siRNA經過正向轉染來進行的並且與未修飾的siRNA作比較。圖8顯示了在較長的一段時間後能保存對於預定目標的功能性沉默的化學修飾模式。當通過未修飾siRNA產生的沉默持續了4-5天時，修飾的siRNA可沉默該既定目標超過7天。因此，該化學修飾應該也能提高使用RTF方式的沉默功效。
實施例13 研究了與未修飾的siRNA相比，在RTF操作方案中使用穩定修飾的siRNA的能力。該穩定修飾的siRNA具有與實施例11描述的靶向人親環素B(環3)的siRNA上相同的修飾。水溶液中的該siRNA乾燥在經聚L-賴氨酸處理的96-孔板的孔中以便在添加125μL脂質-培養基和細胞時得到61.5、125、或者250nM的濃度。脂質溶液LIPOFECTAMINETM2000-Opti-MEMTM，TKO-Opti-MEMTM，or DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM以每100μL含0.125、0.25、或者0.5μg總脂質的濃度添加至該孔中以溶解並複合siRNA30-60分鐘。每個孔中添加大約10,000個Hela細胞，並且在分析毒性以及親環素B mRNA沉默之前培養48小時。
圖9A顯示了修飾的以及未修飾的siRNA執行相似操作，每100μL的LIPOFECTAMINETM2000中僅僅0.125μg就產生了可接受程度的細胞生活力。雖然更高水平的脂質會產生不能接受的細胞死亡水平，但是可以看出在每100μL0.25μg脂質條件下，修飾的雙鏈體比未修飾的雙鏈體誘導較低的毒性。這一觀測提示該修飾模式具有一種額外的、限制經RTF引入的siRNA所產生的細胞毒性的益處。圖9B顯示了通過使用LIPOFECTAMINETM2000的修飾的以及未修飾的雙鏈體誘導的基因沉默是幾乎相同的。
圖10A顯示了TKO脂質濃度在每100μL0.125-0.5μg脂質之間沒有改變細胞生活力，其中所述的生活力為低於大約在對照中觀測到的80％。不幸地，如圖10B所示在這些條件下siRNA的沉默效果更加受限，其中幾乎所有濃度的siRNA在每100μL0.125μg脂質的條件下僅僅沉默了40％的親環素B，在每100μL0.25μg脂質的條件下沉默了大約50-70％，在每100μL0.5μg脂質的條件下沉默了大約80-90％。這些結果顯示化學修飾一點都沒有顯著改變該siRNA的毒性或者沉默效率。此外，由此可見並非所有的脂質都在RTF模式中提供相等的轉運。
圖11A顯示了在每100μL0.125μg的條件下，DharmaFECTTM1對於修飾的以及未修飾的siRNA的毒性是相似的，並且與LIPOFECTAMINETM2000和TKO相比是毒性較低的。另外，與未修飾的siRNA相比DharmaFECTTM1對於修飾的siRNA有較低的毒性。圖11B表示在每100μL0.125μg條件下基因沉默的效率是相似的。因此，在這些條件下，添加所描述的化學修飾至siRNA沒有改變雙鏈體的沉默效率。
實施例14 用靶向G6PD、GAPDH、PLK、和UQC的siRNA研究合理設計的siRNA庫沉默四個單獨基因的能力。在總siRNA濃度為100nM、每種siRNA濃度為6.25nM的條件下，使用LIPOFECTAMINETM2000正向轉染siRNA庫(例如，每個基因4種siRNA)進入細胞中，並且二十四小時後通過B-DNA進行分析。圖12是該結果的圖示，其顯示出由合理地設計的分子組成的庫能夠同時地沉默四個不同的基因。在一個RTF方式中靶向多個基因的能力將顯著地簡化使用RTF篩選大(例如，基因組規模的)規模siRNA的能力。
實施例15 研究了在RTF操作方案中細胞密度的重要性。環3、環14、環28、和環37 siRNA的溶液沉澱然後乾燥在聚L-賴氨酸塗鋪的96-孔板的底部上，得到最後濃度為4nM，8nM、15.5nM、31nM、62.5nM、125nM、和250nM。25μL DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM的脂質溶液添加至每個孔中以獲得每100μL0.015μg、0.031μg、0.063μg、0.125μg，或者0.25μg脂質的最終濃度。在每孔添加5,000、10,000、20,000、或者40,000個Hela細胞之前，使該DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM混合物溶解並且與該乾燥的siRNA複合30-60分鐘。「可接受的生活力」定義為大約80％或者更高的生活力。「可接受的沉默」定義為大約80％或更高的沉默。
圖13A是在每孔5,000個細胞的細胞密度條件下，第2天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.031μg脂質和125-250nM siRNA條件下，四個經檢驗的siRNA中的三個(例如，環3和環14，以及環28)提供了可接受水平的沉默。圖13B是毒性的相應圖示，其顯示直到脂質增加到每100μL0.125μg脂質情況下的最低水平的毒性。所有其它的情況在所有檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖14A是在每孔5,000個細胞的細胞密度條件下，第4天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.063μg脂質以及15.5nM-62.5nM的siRNA條件下，四個經檢驗的siRNA中的兩個(例如，環3和環14)提供了可接受程度的沉默。圖14B是毒性的相應圖示，其顯示除環37外，每100μL0.063μg脂質和15.5nM-62.5nM siRNA提供了可接受的毒性。所有的其它的情況在所有檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖15A是在每孔5,000個細胞的細胞密度條件下，第8天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示了沒有一個檢驗水平是合格的。圖15B是毒性的圖解說明，其顯示所有的情況是過度有毒的，其更多地是持續時間的作用而不是所述情況的真實毒性。
圖16A是在每孔10,000個細胞的細胞密度條件下，第1天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.063μg脂質的情況下，四個經檢驗的siRNA中的兩個(例如，環3和環14)提供了可接受程度的沉默。圖16B是毒性的相應圖示，其在最佳的沉默條件下具有最小值。所有的其它的情況在所檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖17A是在每孔10,000個細胞的細胞密度條件下，第2天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.063μg脂質的情況下，四個經檢驗的siRNA中的兩個(例如，環3和環14)提供了可接受程度的沉默。圖17B是毒性的相應圖示，其在最佳的沉默條件具有最小值。所有的其它的情況在所檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖18A是在每孔10,000個細胞的細胞密度條件下，第4天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.063μg脂質和4-31nM siRNA的情況下，四個經檢驗的siRNA中的兩個(例如，環3和環14)提供了可接受程度的沉默。圖18B是毒性的相應圖示，其在最佳的沉默條件下具有最小值。所有的其它的情況在所檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖19A是在每孔20,000個細胞的細胞密度條件下，第1天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.125μg脂質和125-250nM siRNA的情況下，四個經檢驗的siRNA中的一個(例如，環14)提供了可接受程度的沉默。圖19B是毒性的相應圖示，其在最佳的沉默條件下具有最小值。所有的其它的情況在所檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖20A是在每孔20,000個細胞的細胞密度條件下，第2天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示最多每100μL0.125μg脂質的情況下，四個經檢驗的siRNA中的兩個(例如，環3和環14)提供了可接受程度的沉默。圖20B是毒性的相應圖示，其在最佳的沉默條件具有最小值。所有的其它的情況在所檢驗的siRNA集合內產生了不能接受的沉默和/或細胞死亡水平。
圖21A是在每孔40,000個細胞的細胞密度條件下，第1天基因沉默的圖解說明。該圖表顯示沒有一種情況是可接受的。另外，圖21B顯示不可接受的毒性。該結果暗示反向轉染過程對細胞密度是極端敏感而且在此方式下小於每孔40,000個細胞(在一個96-孔板)的密度對於成功的基因敲低是優選的。
實施例16 通過siRNA RTF研究涉及激酶途徑的基因以確定與細胞生活力相關的基因。合理設計的靶向激酶家族的779個成員的siRNAs溶解在無RNA酶的水中然後乾燥在PLL塗鋪的96-孔板的每個孔中。對於125μL的總溶液每，個siRNA的量是大約25nM。添加在25μL總體積的Hanks平衡的鹽緩衝液中具有0.1μg DharmaFECTTM1脂質的脂質溶液至每個孔中，然後在添加含10,000個Hela細胞的培養基以獲得125μL最終體積之前，溫育20-40分鐘以溶解並且複合該siRNA。該板溫育24至72小時，然後用分析於細胞生活力。對單獨的脂質(例如，對照孔)處理的培養物和用激酶siRNA陣列的獨立成員處理的培養物的細胞生活力比較可以鑑別對HeLa細胞生活力不可缺少的基因。
實施例17 通過siRNA RTF研究涉及細胞因子受體家族的基因以確定對細胞生活力有作用的基因。合理設計的靶向該細胞因子受體家族中166個成員的siRNAs溶解在無RNA酶的水中然後乾燥在PLL塗鋪的96-孔板的每個孔中。對於125μL的總溶液，每個siRNA的量大約是25nM。添加在25μL總體積的Hanks平衡鹽水緩衝液中具有0.1μg DharmaFECTTM1脂質的脂質溶液至每個孔中，然後在添加含10,000個HT-29細胞的培養基以獲得125μL最終體積之前溫育20-40分鐘以溶解並複合該siRNA。該板溫育24到72小時然後用於分析細胞生活力。對單獨的脂質(例如，對照孔)處理的培養物和用細胞因子受體siRNA陣列的獨立成員處理的培養物的細胞生活力比較可以鑑別對HT-29細胞生活力不可缺少的基因。
實施例18 用具有毒性基序的siRNA研究了不同的包含脂質的基於水的溶液，在siRNARTF操作方案中減少或者抑制細胞毒性的能力。當單獨給藥或者和其它的壓力誘導因子(例如，毒性小分子、脂質溶液、脂質)聯合給藥進行研究時，一組包含基序AAA/UUU或者GCCA/UGGC的siRNAs可以誘導細胞壓力或者死亡。特別地，將直接針對於SRD5al(有義，5』CCGGAAATTTGAAGAGTAT SEQ.ID NO.2)基因的毒性siRNA乾燥在PLL塗鋪的板上。在這些研究中使用的毒性siRNA是未修飾的或者修飾的。第一種修飾包括在第一以及第二有義核苷酸上的2 』-O-甲基，在第二反義核苷酸上的2 』-O-甲基，以及在反義鏈(Mod T1)反義5』末端核苷酸5』碳上的磷酸基。第二種修飾包括在有義5』末端核苷酸上的5』脫氧核苷酸，在第二反義核苷酸上的2 』-O-乙醇基團，以及在反義5』末端核苷酸(Mod T2)5』碳上的磷酸基。
圖22是關於在Opti-MEMTM和HBSS中使用LIPOFECTAMINETM2000的細胞生活力的圖示。在Opti-MEMTM中未修飾的毒性siRNA在所有條件(例如，10nM以及100nM siRNA)之下不依賴脂質濃度的誘導大於20％細胞死亡。然而，每100μL0.04μg脂質具有大概80％的細胞生活力。另外，兩種修飾的siRNA都具有大於80％的細胞生活力。在HBSS中未修飾的毒性siRNA在每100μL總溶液0.04和0.06μg脂質條件下不會誘導細胞毒性。僅僅在每100μL總溶液0.1μg脂質下，100nM未修飾的siRNA的情況下觀測到大於20％的細胞毒性。所有的修飾的siRNA顯示出最小的毒性。這些結果顯示HBSS可以在RTF操作方案中減少毒性。此外，這些結果顯示化學修飾的siRNA是適合於RTF操作方案的並且可以限制產生壓力和毒性的非靶效應。
實施例19 用具有毒性基序的siRNA研究了在siRNA RTF方案中不同的脂質減少或者抑制細胞毒性的能力。通過添加化學修飾清除了經由這些分子產生的毒性，該修飾防止、限制、或者改變與非靶分子之間不完全結合。特別地，直接針對於SRD5al基因(有義，5』CCGGAAATTTGAAGAGTAT，SEQ ID NO.2)的毒性siRNA被沉澱並且乾燥在PLL塗鋪的96-孔板的孔底面上以獲得10或100nM的最終濃度。用於這些研究的毒性siRNA正如在實施例18一樣，是未修飾的或者修飾的，。
圖23A是針對不同脂質的細胞生活力圖示。LIPOFECTAMINETM2000-Opti-MEMTM未修飾的毒性的siRNA在所有條件(例如，10nM和100nM siRNA)下，不管脂質濃度如何(例如，0.04、0.06、0.08、和0.1μg每100μL溶液)都誘導大於20％的細胞死亡。在每100μL0.04μg時觀察到一個處於邊界值的特例，其中培養物生活力在80％左右。另外，修飾的siRNA減少了細胞毒性。DharmaFECTTM1-Opti-MEMTM未修飾的毒性siRNA在每100μL0.04和0.06μg脂質總溶液中具有10nM siRNA的情況下是沒有毒性的。在每100μL0.04和0.06μg脂質總溶液下，具有10nM和100nMsiRNA情況下觀察到細胞毒性大於20％。所有修飾的siRNA表現出最小毒性。
圖23B圖示了每個條件下所提供的沉默水平，其表明在所有的樣品中是大致相等的。因此，這些結果顯示DharmaFECTTM1通過儘量減少經由序列誘導的毒性水平提供了對RTF操作方案的改善，該毒性在很寬的脂質濃度範圍內壓迫細胞。此外，這些實驗表明化學修飾的siRNA適合於所描述的反向轉染方式並且在消除產生壓力和毒性的非靶效應中是有效的。
實施例20 在RTF操作方案中，研究了直接針對一選定基因的siRNA庫的能力。為測定針對一個靶的siRNA庫的效力，針對GAPDH，MAP2K1，or MAP2K2基因的單個siRNAs和3或4個siRNAs組成的庫通過使用DharmaFECTTM 1反向轉染進入Hela細胞。在這個研究中，siRNA按照如下設計並且包括如下的序列(例如，有義鏈，按5』-＞3』)GAPDH siRNA雙鏈體1(CAACGGAUUUGGUCGUAUU，SEQ.ID NO.3)，雙鏈體2(CAACGGAUUUGGUCGUAUU，SEQ.ID NO.3)，雙鏈體3(GAAUUUGGCUACAGCAACA，SEQ.ID NO.4)，以及雙鏈體4(GAAAUCCCAUCACCAUCUU，SEQ.ID NO.5)；MAP2K1siRNA雙鏈體1(GCACAUGGAUGGAGGUUCU，SEQ.ID NO.6)，雙鏈體2(GCAGAGAGAGCAGAUUUGA，SEQ.ID NO.7)，雙鏈體4(GAGCAGAUUUGAAGCAACU，SEQ.ID NO.8)，以及雙鏈體5(CCAGAAAGCUAAUUCAUCU，SEQ.ID NO.9)；MAP2K2siRNA雙鏈體1(CAAAGACGAUGACUUCGAA，SEQ.ID NO.10)，雙鏈體2(GAUCAGCAUUUGCAMGGAA，SEQ.ID NO.11)，雙鏈體4(GGAAGCUGAUCCACCUMGA，SEQ.ID NO.12)，以及雙鏈體7(GAAAGUCAGCAUCGCGGUU，SEQ.ID NO.13)。
圖24A是關於GAPGH沉默的具體實施方案結果的圖示，其表明庫與單獨的siRNA相比起到了相同或更好的作用。圖24B是關於MAP2K2沉默的具體實施方案結果的圖示，其表明庫與單獨的siRNA相比起到了相同或更好的作用。圖24C是關於GAPGH沉默的具體實施方案結果的圖示，其表明庫與單獨的siRNA相比起到了相同或更好的作用，其中在10nM條件下該庫提供了優於任何單獨的siRNA的沉默。在所有檢驗過的例子中，使用單獨的siRNA或者庫的基因沉默不會改變總體的細胞毒性(數據未顯示)。庫的另一個益處包括性能的一致性。例如，當靶向至GAPDH和MAP2K2的單獨雙鏈體有足夠的功能時(例如，在在1nM和100nM濃度之間的所有的8種siRNA條件下的大於80％沉默)，單一濃度(例如，50nM)下的單個的siRNA(例如，雙鏈體4)只能提供針對MAP2K1的大於80％的沉默。與此相反，靶向所有三個目標的siRNA庫在10nM，50nM和100nM的濃度下產生80％或者更高的沉默。這些結果顯示庫可以在RTF方式下增加基因沉默的一致性。
實施例21 在RTF操作方案中研究了siRNA庫針對於選定基因的能力。為了評估針對單個靶的siRNA庫的效力，組合針對多重目標的單獨siRNAs。使用DharmaFECTTM1將針對GAPDH、MAP2K1、或者MAP2K2的siRNAs反向轉染進入Hela細胞。用於這些分析的siRNA和在實施例20中的相同。
圖25A-25C是顯示多基因敲低兼容性的圖示。圖25A顯示了在有GAPDH雙鏈體1，MAP2K2雙鏈體1，和MAP2K1雙鏈體1(1，1&1)存在的情況下GAPDH的敲低；以及在有GAPDH雙鏈體2，MAP2K2雙鏈體2，和MAP2K1雙鏈體2(2，2&2)存在的情況下GAPDH的敲低；在有GAPDH雙鏈體4，MAP2K2雙鏈體4，和MAP2K1雙鏈體3(4，4&3)存在的情況下GAPDH的敲低；在有GAPDH雙鏈體5，MAP2K2雙鏈體7，和MAP2K1雙鏈體4(5，7&4)存在的情況下GAPDH的敲低；以及在由之前提到所有的雙鏈體組成的GAPDH，MAP2K2，和MAP2K1庫存在的情況下GAPDH的敲低。圖25B顯示在有圖25A描述的雙鏈體組合存在的情況下MAP2K2的敲低。圖25C顯示在有圖25A描述的所有雙鏈體組合存在的情況下MAP2K1的敲低。所有檢驗過的GAPDH siRNA都能實現大於75％的沉默，即使是有直接針對於MAP2K1和MAP2K2靶的競爭siRNA存在。相似地，可以實現針對MAP2K2的大於75％的沉默，即使有直接針對於GAPDH和MAP2K1的siRNAs存在。對於MAP2K1，沒有一種單獨的siRNA提供大於75％的沉默，但是靶向至siRNA的MAP2K1庫能夠在有靶向至GAPDH和MAP2K2的siRNA庫存在的情況下充分地發揮功能(在1-100nM)。本發明對多基因靶向方式的兼容性有顯著的改善，並且允許用戶簡化大型的基因組規模的篩選。
實施例32 上述實施例使用的一些示例性的siRNA序列在下面的表2中顯現。所有的序列是指有義鏈並且是定向為5』-＞3』方向。除非在上面的說明書正文中另有陳述，所有的反義鏈被假定為在雙鏈體區域與下面提供的有義鏈100％地互補。任一個dTdT突出端不是雙鏈體區域的一部分。另外的siRNA序列可以參見所引用的臨時申請中的表I-IV。
實施例31 在一個實施例中，可以設計一個多孔RTF板或者系列多孔RTF板以便最優化用於siRNA的RTF。相應地，可以配置該板以包括任何下列變量(1)單獨siRNA或者庫siRNA的濃度在0.01-250nM之間，更優選地在0.05和100nM之間，更加優選地在0.1和50nM之間，進一步更加優選地在0.5和25nM之間，以及最優選地在0.75和10nM之間或者大約1nM；(3)多核苷酸載體的類型是脂質例如DharmaFECTTM1、DharmaFECTTM2、DharmaFECTTM3、或者DharmaFECTTM4、；(3)脂質多核苷酸載體的濃度為每100μL溶液0.05-1μg，更優選地每100μL溶液0.05-0.5μg脂質，更加優選地100μL溶液0.05-0.25μg脂質每，以及最優選地每100μL溶液0.05-0.1μg。(4)用於複合脂質的培養基和/或緩衝液的種類優選地是Opti-MEMTM，更優選地是HyQ-MEMTM，以及最優選地是緩衝鹽溶液例如Hanks緩衝鹽溶液或等效混合物；以及(5)細胞的種類和數量是密度為每大約0.3cm2至大約0.35cm2有1,000至35,000個細胞，優選的密度是2,000-30,000個細胞，更優選地2,000-20,000個細胞，更加優選地2,000-15,000個細胞，以及最優選地每大約0.3cm2至大約0.35cm2有2,000-10,000個細胞。該siRNA可用於研究選定目標基因的沉默，或者對照siRNA可用於以一種可重複的方式沉默已知的基因。
不背離其精神或者必要特徵的前提下本發明可以其它特定的形式予以實施。所描述的具體實施方案在各個方面僅僅作為說明性的而不是限制性的。因此，本發明的範圍是由所附權利要求所限定而不是通過上述描述來限定。在與權利要求等效的方法以及範圍內的所有改變都包括在其範圍內。
序列表
Dharmacon，Inc.
Robertson，Barbara
Leake，Devin
Robinson，Kathryn
Marshall，William S.
Khvorova，Anastasia S.
具有乾燥的基因沉默組合物的儀器和系統(APPARATUS AND SYSTEMHAVING DRY GENE SILENCING COMPOSITIONS)
律師記錄號(Attorney Docket No.)16542.1.1
60/630320
2004-11-22
60/678165
2005-05-04
34
PatentIn version 3.3
1
7
RNA
人類

misc_feature
(1)..(7)
shRNA loop
1
auaugug 7
2
19
DNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
siRNA targeting a SRD5a1 gene
2
ccggaaattt gaagagtat19
3
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
GAPDH siRNA 1
3
caacggauuu ggucguauu19
4
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
GAPDH siRNA 3
4
gaauuuggcu acagcaaca19
5
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
GAPDH siRNA 4
5
gaaaucccau caccaucuu19
6
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K1 siRNA 1
6
gcacauggau ggagguucu19
7
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K1 siRNA 2
7
gcagagagag cagauuuga19
8
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K1 siRNA 4
8
gagcagauuu gaagcaacu19
9
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K1 siRNA 5
9
ccagaaagcu aauucaucu19
10
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K2 siRNA 1
10
caaagacgau gacuucgaa19
11
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K2 siRNA 2
11
gaucagcauu ugcauggaa19
12
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K2 siRNA 4
12
ggaagcugau ccaccuuga19
13
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
MAP2K2 siRNA 7
13
gaaagucagc aucgcgguu19
14
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
Cyclo3 siRNA
14
acagcaaauu ccaucgugu19
15
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
Cyclo14 siRNA
15
ggccuuagcu acaggagag19
16
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
Cyclo28 siRNA
16
ggcuacaaaa acagcaaau19
17
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
Cyclo37 siRNA
17
uuccaucgug uaaucaagg19
18
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
gapdh 4 siRNA
18
ugguuuacau guuccaaua19
19
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
gapdh 3 siRNA
19
gaccucaacu acaugguuu19
20
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
gapdh 2

misc_feature
(1)..(19)
gapdh 2 siRNA
20
gaaaucccau caccaucuu19
21
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
gapdh 1 siRNA
21
caacggauuu ggucguauu19
22
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
UQCRC 1 siRNA
22
gcacacagcu uacuacauc19
23
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
UQCRC2 siRNA
23
gaaaugcccu gguaucuca19
24
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
UQCRC3 siRNA
24
gaaggaacgu gaugugauc19
25
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
UQCRC4 siRNA
25
gagauguggu cuuuaacua19
26
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
HSPLKSTK1 siRNA
26
caaccaaagu cgaauauga19
27
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
HSPLKSTK2 siRNA
27
gguaucagcu cugugauaa19
28
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
HSPLKSTK3 siRNA
28
gcaccgaaac cgaguuauu19
29
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
HSPLKSTK4 siRNA
29
gcacauaccg ccugagucu19
30
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
G6PD4 siRNA
30
acagauacaa gaacgugaa19
31
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
G6PD3 siRNA
31
acaucgccug cguuauccu19
32
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
G6PD2 siRNA
32
ucacgagucc ugcaugagc19
33
19
RNA
人類
33
auucacgagu ccugcauga19
34
19
RNA
人類

misc_feature
(1)..(19)
IGF1R-73siRNA
34
ugcugaccuc uguuaccuc19
權利要求
1.一種用於引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的反向轉染儀器，該儀器包含
多孔板，其具有用於轉染細胞的孔；以及
孔中的基本上乾燥的基因沉默組合物，該基因沉默組合物至少具有至少沉默第一靶基因的第一siRNA，該基因沉默組合物的配置使得至少第一siRNA能夠以足以轉染該孔中的細胞的量溶解或懸浮在含水培養基中，該至少第一siRNA具有髮夾結構、修飾、或者結合物中的至少一個。
2.根據權利要求1所述的儀器，其中所述修飾以下列中的至少一個為特徵具有磷酸基的5』反義末端核苷酸；具有2』修飾的有義核苷酸；具有2』修飾的反義核苷酸；或者具有2』滷素修飾的反義核苷酸。
3.根據權利要求2所述的儀器，其中所述修飾進一步地以下列中的至少一個為特徵
所述2』修飾選自由2』-O-脂肪族、2』-O-烷基、2』-O-甲基、2』-O-乙基、2』-O-丙基、2』-O-異丙基、2』-O-丁基、2』-O-異丁基、2』-O-CH2CH2OCH3、2』-O-CH2CH2OH、2』-原酸酯、2』-ACE基原酸酯及其組合所組成的組；或者
所述2』滷素修飾包括滷素，該滷素選自由氟、氯、溴、碘、及其組合組成的組。
4.根據權利要求3所述的儀器，其中所述修飾以下列中的至少一個為特徵具有2』修飾的第一和第二有義核苷酸；具有2』修飾的第一和第二反義核苷酸；或者具有2』修飾的第二反義核苷酸。
5.根據權利要求4所述的儀器，其中所述修飾進一步地以下列中的至少一個為特徵至少一個有義嘧啶核苷酸具有2』修飾；至少一個反義嘧啶核苷酸具有2』修飾；或者至少一個反義嘧啶核苷酸具有2』滷素修飾。
6.根據權利要求5所述的儀器，其中在第一位置以及第二位置的有義核苷酸包括2』-O-烷基修飾，在第二位置的反義核苷酸包括2』-O-烷基修飾，且5』反義末端核苷酸具有磷酸基。
7.根據權利要求1所述的儀器，其中所述結合物選自由胺基酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、抗原、毒素、激素、脂質、核苷酸、核苷、糖類、碳水化合物、聚乙二醇、聚丙二醇、甾體、膽固醇、磷脂、二醯基甘油以及三醯基甘油、脂肪酸、取代的碳氫化合物、未取代的碳氫化合物、酶、生物素、異羥基洋地黃毒甙元、多糖、硫醚、己基-S-三苯甲基硫醇、硫膽固醇、十二烷二元醇、十一烷基、磷脂、雙-十六烷基-rac-甘油、三乙基銨1，2-雙-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八烷基胺部分、己基氨基羰基-oxycholexterols、法呢基、香葉基、geranylgeranyl、標記物、螢光標記物、質量標記物、以及放射性標記物組成的組。
8.根據權利要求7所述的儀器，其中所述結合物選自由膽固醇以及螢光標記物組成的組。
9.根據權利要求8所述的儀器，其中所述結合物與有義鏈或者反義鏈的5』末端核苷酸或者3』末端核苷酸結合。
10.根據權利要求7所述的儀器，其中所述結合物是通過接頭而連接的，所述接頭選自由修飾的核苷酸、未修飾的核苷酸、聚醚、聚乙二醇、多元醇、聚丙烯、聚烷基胺、聚胺、亞精胺、聚酯、聚丙烯酸乙酯、聚磷酸二酯、碳水化合物、糖、丙二醇、乙二醇、烯烴、及其組合組成的組。
11.根據權利要求1所述的儀器，其進一步包含至少一個沒有siRNA的孔。
12.根據權利要求1所述的儀器，其進一步包含其中至少具有第一對照siRNA的至少一個孔。
13.根據權利要求12所述的儀器，其中所述對照siRNA包括能夠沉默已知基因的siRNA、轉染對照siRNA、具有螢光標記的siRNA、具有至少一個毒性基序的siRNA或者無功能的siRNA中的至少一個。
14.根據權利要求1所述的儀器，其中所述基因沉默組合物包括siRNAs庫。
15.根據權利要求1所述的儀器，其中所述至少第一siRNA是合理設計的。
16.根據權利要求1所述的儀器，其中在基因沉默組合物中siRNA的總量是以足以轉染僅該孔中的細胞的量而存在的。
17.根據權利要求16所述的儀器，其中當溶解或者懸浮在含水培養基中時，siRNA的總濃度小於大約100nM。
18.根據權利要求17所述的儀器，其中當溶解或者懸浮在含水培養基中時，siRNA的總濃度小於大約1nM。
19.根據權利要求1所述的儀器，其中該孔具有基本上平坦的底面。
20.根據權利要求19所述的儀器，其中該板由聚苯乙烯組成，並且該平坦的底部基本上用陽離子聚合物覆蓋。
21.一種用於引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的反向轉染儀器，該儀器包含
多孔板，其具有為轉染細胞而配置的孔；以及
孔中的基本上乾燥的基因沉默組合物，該基因沉默組合物至少具有至少沉默第一靶基因的第一siRNA，該基因沉默組合物的配置使得至少第一siRNA能夠以足以轉染該孔中的細胞的量溶解或懸浮在含水培養基中。
22.一種包括權利要求21所述的儀器的用於引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的系統，該系統包含
權利要求21的多孔板；以及
多核苷酸載體，其被配置用於與該至少第一siRNA複合。
23.根據權利要求22所述的系統，其中所述至少第一siRNA包括髮夾結構、修飾、或者結合物中的至少一個。
24.根據權利要求22所述的系統，其中所述siRNAs庫是合理設計的。
25.根據權利要求22所述的系統，其中在基因沉默組合物中siRNA的總量是以足以轉染僅該孔中的細胞的量而存在的。
26.一種用於引導siRNA進入細胞以引起基因沉默的反向轉染方法，該方法包含
提供包含基本上乾燥的基因沉默組合物的孔，該基因沉默組合物至少具有第一siRNA，該siRNA包括髮夾結構、修飾、或者結合物中的至少一個；
添加水溶液至該孔中以懸浮或者溶解該至少第一siRNA在溶液中；並且
在允許至少第一siRNA被引入細胞的條件下添加細胞至該孔中。
27.根據權利要求26所述的方法，其進一步包含
添加多核苷酸載體至該孔中以形成一種siRNA-載體複合物，其中該siRNA-載體複合物被懸浮或者溶解在溶液中；並且
將siRNA-載體複合物與細胞接觸。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述多核苷酸載體是脂質。
29.根據權利要求26所述的方法，其進一步包含在允許細胞生長、細胞分裂、和/或基因沉默發生的條件下維持該孔。
30.根據權利要求29所述的方法，其進一步包含沉默至少50％的目標多肽的產量。
31.根據權利要求30所述的方法，其進一步包含沉默至少80％的目標多肽的產量。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述細胞以每0.35cm2的細胞生長表面積含大約2×103至大約3×104細胞的量添加。
全文摘要
一種可用於引導siRNA進入細胞產生基因沉默效果的反向轉染儀器。本儀器包括一個具有用於轉染細胞的孔的多孔板。該孔包括一個基本上乾燥的基因沉默組合物，其至少具有沉默第一目標基因的第一siRNA。配置該基因沉默組合物至少使第一siRNA能夠以足以轉染該孔中細胞的量溶解或懸浮在液體培養基中。另外，該第一siRNA至少可以包括一個修飾或一個結合物。該反向轉染儀器可以附加細胞，多核苷酸載體，反向轉染試劑等等的試劑盒或系統的形式提供。
文檔編號C12N15/87GK101107352SQ200580047054
公開日2008年1月16日 申請日期2005年11月21日 優先權日2004年11月22日
發明者芭芭拉·羅伯遜, 德溫·利克, 凱薩琳·魯濱遜, 威廉·S·馬歇爾, 阿納斯塔西婭·赫沃羅瓦 申請人:達爾馬科恩有限公司