新的表達載體及其應用的製作方法

2023-06-07 12:26:06

專利名稱：新的表達載體及其應用的製作方法
1.發明的領域本發明涉及新的載體，含所述載體的DNA疫苗和基因療法，製備載體和含所述載體的DNA疫苗和基因療法的方法，以及所述載體的治療應用。更特別地，本發明涉及新的載體，包括(a)核-錨定蛋白的表達基因盒，它含有(i)能夠與特定DNA序列結合的DNA結合結構域和(ii)能夠與核成分結合的結構域，和(b)形成核-錨定蛋白的錨定蛋白結合位點的多聚體化DNA序列，和可選擇地(c)目的DNA序列的一個或多個表達盒。特別地，發明涉及缺少乳頭狀瘤病毒複製起始點的載體。發明還涉及缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點的載體。發明進一步涉及在受試者中表達目的DNA序列的方法。
2.發明的背景用適合的載體將同源或異源的基因轉移到動物或人體中正在成為具有巨大潛力的技術，以治療具有遺傳背景的疾病，或預防或治療感染性疾病。已經開發了數種病毒和非病毒載體並在動物和人受試者中試驗傳遞一個基因/多個基因，被傳遞的基因通過突變而有缺陷因而是無功能的。這種載體的實例包括腺病毒載體、皰疹病毒載體、逆轉錄酶病毒載體、慢病毒載體和腺相關的載體。
已經證明接種疫苗是預防感染原所致疾病的高度有效和經濟的方法。自從引種牛痘病毒作為抗天花病毒(天花)的減毒疫苗後，已經開發了抗許多人類病原體的疫苗並被常規使用。今天天花已通過接種疫苗被根除，預期不久脊髓灰質炎病毒也有相同的結果。數種兒童疾病如百日咳、白喉和破傷風可以通過接種疫苗被有效地預防。
一般地，最成功的病毒疫苗是致病病毒的活的無毒突變種。此方法成功的關鍵是活病毒靶向相同的器官、相同類型和相似數量的細胞，因此通過在接受者中的繁殖引起長時間的免疫反應而不致病或僅導致輕微的疾病。實際上，活的減毒疫苗產生亞臨床感染，這是自然特有的免疫方式。結果，可以誘導完全的免疫反應包括體液的、細胞的和先天的反應，得到了長時間的、有時是終身的抗病原體免疫防護。
儘管活的減毒疫苗是最有效的，但它們可能引起有害的副作用。這樣，減毒的病毒疫苗可能回復成有毒株，或在減毒病毒對成人不致病的情況下，仍可能在嬰兒或傷殘人中致病。就引起慢性感染的病毒如人免疫缺陷病毒1和2型來說確實如此。由病毒和細菌蛋白或免疫原肽組成的疫苗很少可能引起有害的副作用，但可能不如活疫苗有效力。特別是在抗致慢性感染的微生物疫苗的情況下，如某些病毒和細胞內細菌。
但是，免疫反應的強度和類型還依賴於病毒蛋白如何被處理和它們如何通過抗原遞呈細胞(APCs)如巨噬細胞和樹突狀細胞被遞呈給免疫系統。蛋白和肽抗原通過APCs的內吞作用被攝取，經過核內體通路被處理成小的免疫原肽並由MHC(主要組織相容性複合體)II型抗原[在人類為HLA(人白細胞抗原)II型]遞呈給T-淋巴細胞(T-細胞)。相反，在APCs或可能的靶細胞中為進行免疫反應而重新合成的蛋白將經胞漿通路被處理並由MHC I型抗原(在人類為HLA I型)遞呈給T細胞。一般地，經II型通路的免疫原肽遞呈會引起輔助/誘導T細胞活化，將依次引起B細胞活化並產生抗體反應。相反，經I型MHC的遞呈促進能夠識別和破壞被病毒感染的細胞的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)的誘導。
在1990年代早期，提出了模擬通常由活的減毒疫苗完成的抗原處理和遞呈的方法[Ulmer，J.B.等人Science 259(1993)1745-1749]。據其顯示，將真核生物表達載體以環形DNA的形式注射進肌肉，引起肌肉細胞(或許是其它細胞)攝取此DNA，能夠誘導目的基因的表達並產生免疫反應，特別是針對由插入基因編碼的蛋白的CTLs形式細胞免疫反應。從觀察到此現象後，DNA免疫法已成為在實驗動物中誘導對異源蛋白的免疫反應的標準方法，採用數種DNA疫苗的人類研究正在進行中。
通常，在這些疫苗研究中使用的DNA載體含有目的基因克隆位點；強病毒啟動子如CMV病毒的極早期啟動子以驅動目的基因的表達；聚腺苷醯作用區；和抗生素抗性基因；和DNA載體(質粒)在細菌細胞中傳播的細菌複製起始點。
用上面描述的載體，有可能在實驗動物或人給予載體後獲得可檢測水平的目的基因表達，給予載體可採用顆粒轟擊技術直接注射到肌肉或皮膚，或者通過在溶液中應用載體而直接用在黏膜上。但是，由這些載體獲得的表達是暫時的載體傾向於從轉染的細胞中漸漸消失並不傳遞給分裂細胞群中的子細胞。目的基因的暫時表達和靶向細胞的有限數量大概是用上面描述的DNA載體免疫的受試者中僅觀察到暫時的免疫反應的主要原因。因而，例如Boyer等人觀察到，在用近似於上面描述的載體數次免疫的人類受試者中，僅有對HIV-1 Env和Rev蛋白的暫時免疫反應[Boyer，J.D.，J Infect Dis 181(2000)476-483]。
開發用於基因治療和DNA接種疫苗的新產品的興趣不斷增長。例如攜帶目的基因表達盒的乳頭狀瘤病毒載體已被建議用做候選者。
到目前為止，已經鑑定了超過70個亞型的人乳頭狀瘤病毒(HPVs)和許多不同的動物乳頭狀瘤病毒[zur Hausen，H.和de Villiers E.，AnnuRev Microbiol 48(1994)427-447；Bernard，H.，等人，Curr Top MicrobiolImmunol 186(1994)33-54]。所有的乳頭狀瘤病毒具有相似的基因組構成，且所有翻譯開放閱讀框(ORFs)的位置是高度保守的。
乳頭狀瘤病毒在不同的身體部位感染皮膚或黏膜的鱗狀上皮細胞並導致形成良性腫瘤，在某些情況下可發展成惡性腫瘤。乳頭狀瘤病毒基因組作為多拷貝核質粒在感染的細胞中複製並保存。複製、游離基因保存、後期基因表達和病毒組裝與上皮組織的分化密切相關在分化的上皮細胞中，乳頭狀瘤病毒DNA游離基因複製發生於最初的擴增性複製、其次即複製休眠，和第三個過程，即無性複製中[Howley，P.M.；乳頭狀瘤病毒體病毒及其複製。病毒學，Fields，B.C.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.，主編，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，USA，1996，第二版，2045-2076頁]。
兩個由E1和E2開放閱讀框編碼的病毒因子已經顯示對啟動細胞中乳頭狀瘤病毒來源的DNA複製是必要的和充分的[Ustav，M.和Stenlund，A.，EMBO J 10(1991)449-57；Ustav，M.，等人，EMBO J 10(1991)4321-4329；Ustav，E.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 90(1993)898-902]。
啟動DNA複製的結構域已被定義為BPV1[Ustav，M.，等人，EMBO J10(1991)4321-4329]、HPV1a[Gopalakrishnan，V.和Khan，S.，見前]、HPV11[Russell，J.，Botchan，M.，J Virol 69(1995)651-660]、HPV18[Sverdrup，F.和Khan，S.，J Virol 69(1995)1319-1323；Sverdrup，F.和Khan，S.，J Virol 68(1994)505-509]和許多其它者。特徵性地，所有這些起始片段具有高A/T含量，並含有數個重疊的獨立E1蛋白識別序列，它們一起構成E1結合位點[Ustav，M.，等人，EMBOJ 10(1991)4321-4329；Holt，S.，等人，J Virol 68(1994)1094-1102；Holt，S.和Wilson，V.，JVirol 69(1995)6525-3652；Sedman.T.，等人.J Virol 71(1997)2887-2996]。此外，這些功能性起始片段含有E2結合位點，大多數情況下它對於啟動體內的DNA複製是必要的(Ustav，E.，等人，見前)。E2蛋白可促進E1識別起始點的第一個步驟。在單體E1與起始點開始結合後，E1的多聚化作用即被啟動。它導致具有ori融合活性的複合物形成。E2已被認為對DNA複製啟動後的步驟沒有影響[Lusky，M.，等人，ProcNatl Acad Sci USA 91(1994)8895-8899]。
BPV1 E2 ORF編碼三個蛋白，源於選擇性啟動子使用和可選擇的mRNA剪接[Lambert，P.，等人，Annu Rev Genet 22(1988)235-258]。所有這些蛋白可彼此形成同型-和雜二聚體並與12bp不對稱的迴文序列5′-ACCNNNNNNGGT-3′特異地結合[Androphy，E.，等人，Nature 325(1987)70-739]。
在BPV1基因組中有17個E2結合位點，在HPV基因組中為4個位點，它們在啟動病毒DNA複製(Ustav，E.，等人，見前)和調節病毒基因表達(Howley，P.M.，乳頭狀瘤病毒體病毒及其複製，病毒學，Fields，B.C.，Knipe，D.M.，Howley，P.M.，主編，PhiladelphiaLippincott-Raven Publishers，1996.第二版，2045-2076頁)中起決定性作用。結構和突變分析顯示了在E2蛋白總長中有3個截然不同的結構域。N-末端部分(殘基1至210)是轉錄和複製活化結構域。其後是鬆散的鉸鏈區(殘基211至324)和羧基末端結合DNA的二聚作用結構域(殘基325至410)[Dostatni，N.，等人，EMBO J 7(1988)3807-3816；Haugen，T.，等人.EMBO J 7(1988)4245-4253；McBride，A.，等人，EMBO J 7(1988)533-539；McBride，A.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 86(1989)510-514]。根據X線晶體照相術的數據，E2的結合DNA二聚作用結構域具有雙對稱的八鏈反平行β片層結構，由兩個同樣的″半片層″亞單位組成[Hegde，R.，等人，Nature 359(1992)505-512；Hegde，R.，J NuclMed 36(6 Suppl)(1995)25S-27S]。E2反式-活化結構域的功能元件具有非常高的結構完整性，如通過突變分析[Abroi，A.，等人，J Virol 70(1996)6169-6179；Brokaw，J.，等人，J Virol 71(1996)23-29；Grossel，M.，等人，J Virol 70(1996)7264-7269；Ferguson，M.和Botchan，M.，JVirol 70(1996)4193-4199]和X線晶體照相術[Harris，S.，和Botchan，M.R.，Science 284(1999)1673-1677和Antson，A.等人，Nature 403(2000)805-809]所證實的。此外，X線晶體照相術顯示，E2蛋白的N-末端結構域形成二聚結構，其中Arg 37在二聚體形成中有重要的功能(Antson，A.，等人，見前)。
如前面已經描述的，1型牛乳頭狀瘤病毒的反式E2蛋白和其順式多結合位點對於游離基因的基因元件附著於染色質都是必需的和充分的。此現象被認為提供了在病毒感染分裂細胞的過程中分隔病毒基因組的機制[llves，I.，等人，J Virol.73(1999)4404-4412]。
到目前為止，沒有公開的乳頭狀瘤載體或其它載體滿足提出的最佳疫苗的標準和必要條件，對DNA疫苗和常規疫苗也是如此。(應當注意到，這些必要條件是優選的但不是用作疫苗所必須的。)首先，最佳的疫苗必須產生保護性免疫並具有最小的不良反應。因此疫苗應該沒有對接受者有毒和/或引起疾病症狀的成分。其次，最佳的疫苗必須誘導病原體特異的免疫反應，即它必須引起對所需病原體的強烈和可測量的免疫反應而不引起對疫苗其它成分的免疫反應。這兩個必要條件意味著要用作DNA疫苗的載體應當最理想地僅表達所需的基因並最理想地不在宿主中複製，或含有任何與接受者同源的序列，因為載體與宿主基因組間同源的核苷酸序列可影響載體整合進宿主基因組。第三，最佳的疫苗必須誘導正確類型的免疫反應；即它必須產生體液的和細胞的免疫反應以對細胞內和細胞外的病原體起作用。最後，最佳的疫苗必須是穩定的，即在儲存和製備所用的各種苛刻的環境下，它必須在疫苗製劑中足夠長時間地保持其在體內產生免疫反應的效力。此外，疫苗應當有合理的價格。更進一步地，接種的途徑和方法也是優化DNA免疫法的重要考慮因素。
在開發DNA疫苗時，所需基因的表達穩定性有時是主要的問題。於是，以前的技術關注於在受體細胞中保持功能或保存載體，但經常以安全性為代價。例如，Ohe，Y.，等人[Hum Gene Ther 6(3)(1995)325-333]公開了能夠穩定的、高水平基因表達的乳頭狀瘤病毒載體，建議用於基因治療。從所述載體中刪除了轉化早期基因E5、E6和E7，但仍然含有編碼其它乳頭狀瘤病毒基因的核苷酸序列如E1和E2基因，它們與病毒複製有關。因此，載體產生幾種其它的乳頭狀瘤蛋白，可能引起有害的免疫反應並導致載體整合進接受者的危險。另外，由於含有E1基因，載體是可複製的。此外，其體積較大因而在製備過程中接受細菌修飾。
國際專利申請PCT/EE96/00004(WO 97/24451)公開了能夠長期保存在宿主細胞中的載體，以及用這種載體在表達E1和E2的哺乳動物宿主細胞中獲得長期生產目的基因產物的方法。這些載體含有乳頭狀瘤病毒的最小複製起始點(MO)、乳頭狀瘤病毒的微型染色體維持元件(MME)和編碼該基因產物的基因，MO和MME由不同於天然乳頭狀瘤病毒序列的DNA序列組成，在一些實施例中是E1基因。此外，在一些實施例中公開了經常基本上由10個E2結合位點組成的含MME的載體。為了表達，這些載體需要在宿主或載體中有E1蛋白存在。這給載體賦予了複製功能。這些載體也表達除目的基因以外的E1蛋白和E2蛋白，並含有如兔β-球蛋白序列的序列，它與人類序列部分同源，引起整合到人基因組的嚴重危險，這樣降低了這些載體作為DNA疫苗的效力。另外，由於其大小(接近15kb)，載體在細菌細胞內的製備階段是不穩定的，細菌複製機器傾向於通過載體的隨機拼接修飾載體，產生不合要求的表達產物，包括完全缺少目的基因的產物。
國際專利申請PCT/EE96/00004(WO 97/24451)進一步公開了E1和E2是載體的游離基因長期複製所必需的唯一病毒蛋白。另外，BPV1基因組的功能保存與最小起始點(MO)的存在相關，據稱對於載體在細胞中的長期保持或穩定保存儘管不是充分的，但是必需的。此外，據稱順式元件即BPV1的微型染色體維持元件對於BPV1的穩定複製是需要的。特別地，據稱多聚E2結合位點(E2BS)對於載體的穩定保存是必需的。
明確地需要改進可用作DNA疫苗的新載體。
因此，本發明的一個目的是提供新的載體，它們能夠在宿主體內大量和數量不斷增加的不同細胞中長期保存，並因而能夠提供所需抗原的穩定表達。
本發明的另一個目的是提供新的載體，它們在最初接受載體的細胞中長期保存並在有絲分裂的細胞分裂後將載體傳遞給子細胞。
而本發明的另一個目的是提供新的載體，它們除一條或多條目的基因以外，僅優選地表達在受體細胞中長期保存所必需的基因，從而沒有對接受者有毒或引起疾病症狀的成分。
本發明進一步的目的是提供新的載體，它們模擬減毒的活病毒疫苗，特別是模擬其在體內繁殖的功能，而不引起任何大量的疾病跡象且不表達在注射DNA疫苗的宿主中引起不良反應的有害蛋白。
本發明更進一步的目的是提供新的載體，它們不在接受者內複製。
本發明還有另一個目的是提供新的載體，當它們被用作DNA疫苗時引起體液的和細胞的免疫反應。
而本發明的另一個目的是提供新的載體，它們適合於在細菌細胞內的大規模生產。
而本發明的另一個目的是提供新的載體，它們不是宿主特異的，因此能夠在各種細菌細胞中生產。
本發明另外的目的是提供新的載體，它們被用作一條或多條目的基因的攜帶載體。
本發明進一步的目的是提供新的載體，它們被用於基因治療，作為基因治療劑，並用於在體內生產大分子藥物。
3.發明的概述本發明公開了新的載體，它滿足一條或多條目的基因攜帶載體或最佳DNA接種疫苗載體的必要條件，且優選地沒有以往載體的技術缺點和副作用。
本發明基於驚人的發現，即載體(質粒)攜帶(i)編碼核-錨定蛋白的DNA序列表達基因盒，和(ii)所述在增殖細胞中傳播的核-錨定蛋白的高親合性結合位點多拷貝。結果，即使載體不複製，攜帶載體的細胞數量也增加。當載體另外攜帶一條或多條目的基因時，表達一條或多條目的基因的這種細胞數量同樣地增加而沒有載體的複製。於是，發明的載體缺少乳頭狀瘤病毒複製起始點。在優選的實施例中，發明的載體缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點。
因此，本發明公開了在DNA接種疫苗和基因治療中以及作為基因治療藥的，被用作一條或多條目的基因攜帶載體的新載體。在特殊實施例中，所述載體能夠傳播，如果需要能夠在不斷增加數量的細胞中長時間的表達一條或多條目的基因。本發明載體優選地僅表達核-錨定蛋白，如果需要則表達一條或多條目的基因和任意的可選擇標記物。但是，它們優選地缺少任何冗餘的、致癌性轉化的或潛在有毒性的序列，從而消除了以前公開的或建議用作DNA疫苗的載體的嚴重缺點，即抗其它病毒成分的超敏性反應。在發明的某實施例中，這是通過細胞中低水平表達的核-錨定蛋白來實現的。同時，本發明載體誘導體液的和細胞的免疫反應，其中一條或多條目的基因包括在載體中。
本發明載體利於在體外(如，以生產水平)和體內(如，接種疫苗)使用。
本發明涉及在附加權利要求中列出的發明主題。
本發明涉及表達載體，包括(a)可操作地與異種啟動子連接的編碼核-錨定蛋白的DNA序列，所述核-錨定蛋白含有(i)與特定DNA序列結合的DNA結合結構域，和(ii)與核成分結合的功能性結構域或其功能相等區；和(b)形成核-錨定蛋白結合位點的多聚體化DNA序列，其中所述載體缺少乳頭狀瘤病毒的複製起始點。在優選的實施例中，發明的載體缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點。
在某些實施例中，核成分是有絲分裂的染色質、核基質、核結構域10(ND10)或核結構域POD。
在某些特殊的實施例中，核錨定-蛋白是染色質-錨定蛋白，且所述的功能性結構域結合有絲分裂的染色質。
在某些實施例中，核-錨定蛋白含有鉸鏈或連接子區。
在某些實施例中，核-錨定蛋白是真核生物、原核生物或病毒來源的天然蛋白。在某些特殊的實施例中，天然蛋白是病毒來源的。
在某些實施例中，核-錨定蛋白是真核生物來源的天然蛋白。
在某些實施例中，核-錨定蛋白是乳頭狀瘤病毒或EB病毒的蛋白。
在特殊的實施例中，核-錨定蛋白是1型牛乳頭狀瘤病毒的E2蛋白或EB病毒核抗原1。
在特殊的實施例中，核-錨定蛋白是1型牛乳頭狀瘤病毒的E2蛋白。
在特殊的實施例中，核-錨定蛋白是高遷移率組蛋白。
在某些實施例中，核-錨定蛋白是非天然的蛋白。
在某些實施例中，核-錨定蛋白是重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白。
在特殊的實施例中，重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白含有任何組合的DNA結合結構域和功能性結構域，前者與所述的特定DNA序列結合，後者與核成分結合，其中所述的與核成分結合的功能性結構域是乳頭狀瘤病毒的、EB病毒的或高遷移率組蛋白的。
在某些特殊的實施例中，重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白含有任何組合的DNA結合結構域和功能性結構域，前者與所述的特定DNA序列結合，後者與核成分結合，其中所述的與核成分結合的功能性結構域是1型乳頭狀瘤病毒的E2蛋白的、EB病毒核抗原1的或高遷移率組蛋白的。
在某些實施例中，載體進一步包括目的DNA序列的一個或多個表達基因盒。
在某些實施例中，目的DNA序列是感染性病原體的。在某些實施例中，感染性病原體是病毒。在某些特殊的實施例中，病毒選自人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、C型肝炎病毒、流感病毒和腸道病毒。
在某些實施例中，目的DNA序列是細菌的。在某些實施例中，細菌選自沙眼衣原體、結核分支桿菌和肺炎支原體。在特殊的實施例中，細菌是沙門氏菌。
在某些實施例中，目的DNA序列是真菌性病原體的。在某些實施例中，真菌性病原體是白色念珠菌。
在某些實施例中，目的DNA序列是HIV來源的。
在特殊的實施例中，目的DNA序列編碼HIV的非結構調控蛋白。在更特殊的實施例中，HIV的非結構調控蛋白是Nef、Tat和/或Rev。在特殊實施例中，HIV非結構調控蛋白是Nef。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼HIV的結構蛋白。在特殊的實施例中，目的DNA序列是編碼HIV gp120/gp160的基因。
在某些實施例中，發明的載體包括由編碼Nef、Tat和/或Rev的目的DNA序列組成的第一個表達基因盒，和由編碼Nef、Tat和/或Rev的目的DNA序列組成的第二個表達基因盒。
在某些實施例中，發明的載體包括由編碼Nef、Tat和/或Rev的目的DNA序列組成的第一個表達基因盒，和由編碼HIV結構蛋白的目的DNA序列組成的第二個表達基因盒。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼與癌症相關的蛋白。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼與免疫成熟、免疫反應調節或自體免疫反應調節相關的蛋白。在特殊的實施例中，該蛋白是APE-CED。
在特殊實施例中，目的DNA序列是Aire基因。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼在任何遺傳性單基因疾病中缺陷的蛋白。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼大分子藥物。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼細胞因子。在某些特殊的實施例中，細胞因子是選自IL1、IL2、IL4、IL6和IL12的白介素。在某些其它的特殊實施例中，目的DNA序列編碼幹擾素。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼有生物學活性的RNA分子。在某些特殊的實施例中，有生物學活性的RNA分子包括抑制性反義RNA和核糖酶分子。在某些特殊的實施例中，抑制性反義RNA或核糖酶分子對抗致癌基因的作用。
發明的載體適合用於在體內生產治療性大分子物質。
在某些實施例中，本發明提供了用作藥劑的載體。
在某些實施例中，本發明提供了用作攜帶載體的載體，以傳遞一條或多條目的基因或一條或多條目的DNA序列，如編碼感染原蛋白或肽、治療劑、大分子藥物或其任何組合的基因、多個基因、或一條或多條DNA序列。
在某些特殊的實施例中，發明提供了用作藥劑的載體以治療遺傳的或獲得的基因缺陷。
在某些實施例中，本發明提供了用作抗感染原的治療性DNA疫苗的載體。
在某些實施例中，本發明提供了用作治療劑的載體。
本發明進一步涉及給受試者提供蛋白的方法，所述方法包括給予受試者發明的載體，其中所述的載體(i)進一步包括編碼要提供給受試者的蛋白的第二條DNA序列，其第二條DNA序列可操作地與第二個啟動子連接，和(ii)不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
本發明進一步涉及在受試者中誘導對蛋白的免疫反應的方法，該方法包括給予受試者發明的載體，其中所述的載體(i)進一步包括編碼所述蛋白的第二個DNA序列，其第二個DNA序列可操作地與第二個啟動子連接，和(ii)不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
本發明進一步涉及在需要所述治療的患者中治療感染性疾病的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的發明載體，其中目的DNA序列編碼由感染原的免疫原性抗原決定簇組成的蛋白。
本發明進一步涉及在需要所述治療的患者中治療遺傳的或獲得的基因缺陷的方法，該方法包括給予所述患者治療有效量的發明載體，其中所述的目的DNA序列編碼被所述遺傳的或獲得的基因缺陷影響的蛋白。
本發明進一步涉及在受試者中表達DNA序列的方法，該方法包括給予所述受試者發明的載體。
本發明進一步涉及在受試者中表達DNA序列、治療遺傳的或獲得的基因缺陷、治療感染性疾病、誘導對蛋白的免疫反應、和向受試者提供蛋白的方法，其中發明的載體不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
在某些實施例中，發明的載體被用於在細胞或生物體內生產由所述目的DNA序列編碼的蛋白。
本發明進一步提供了製備權利要求1、2或17的載體的方法，包括(a)培養含所述載體的宿主細胞和(b)回收載體。在特殊的實施例中，製備發明載體的方法進一步包括在步驟(a)之前用所述的載體轉化所述宿主細胞的步驟。在某些特殊的實施例中，宿主細胞是原核細胞。在特殊的實施例中，宿主細胞是大腸桿菌。
本發明進一步涉及以含發明載體為特徵的宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞是細菌細胞。在某些其它實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。
本發明進一步涉及含發明載體的攜帶載體。
本發明進一步涉及含發明載體的藥學組合物和適合的製藥賦形劑。
本發明進一步涉及含發明載體的DNA疫苗。
本發明進一步涉及含發明載體的基因治療劑。
本發明進一步涉及製備DNA疫苗的方法，所述方法包括將發明的載體與適合的製藥賦形劑結合。
本發明進一步涉及製備用於基因治療的藥劑的方法，所述方法包括將發明的載體與適合的藥學賦形劑結合。
4.圖表的描述

圖1顯示質粒super6的簡圖。
圖2顯示質粒VI的簡圖。
圖3顯示質粒II的簡圖。
圖4顯示在Jurkat細胞中從載體super6、super6wt、VI、VIwt和II表達Nef和E2蛋白。
圖5顯示質粒產物1的簡圖。
圖6A顯示質粒NNV-1和NNV-2的簡圖和圖6B顯示質粒和NNV-2wt的簡圖。
圖7顯示Jurkat細胞中從質粒NNV-1、NNV-2、NNV-1wt、NNV-2-wt、super6和super6wt表達Nef蛋白。
圖8顯示Jurkat細胞中從質粒NNV-2-wt、NNV-2-wtFS和產物1表達Nef和E2蛋白。
圖9顯示P815細胞中從質粒NNV-2-wt、NNV-2-wtFS和產物1表達Nef和E2蛋白。
圖10顯示CHO細胞中從質粒NNV-2-wt、NNV-2-wtFS和產物1表達Nef和E2蛋白。
圖11顯示RD細胞中從質粒NNV-2-wt、NNV-2-wtFS和產物1表達Nef蛋白。
圖12顯示在CHO、Jurkat細胞和P815細胞中表達RNA分子。
圖13顯示NNV-2wt在細菌細胞中的穩定性。
圖14顯示作為CHO和Jurkat細胞系中的非複製游離基因成分的NNV-2wt的穩定性Southern印跡分析。
圖15顯示載體NNV2wt、NNV2wtFS和產物1不能進行HPV-11複製因子依賴的複製。
圖16顯示質粒2wtd1EGFP的簡圖。
圖17顯示質粒gf10bse2的簡圖。
圖18顯示質粒2wtd1EGFPFS的簡圖。
圖19顯示質粒NNVd1EGFP的簡圖。
圖20顯示用質粒2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、NNVd1EGFP或僅用載體DNA轉染的Jurkat細胞生長曲線。
圖21顯示用質粒2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS、gf10bse2或僅用載體DNA轉染的Jurkat細胞的生長曲線。
圖22顯示在用載體2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS或NNVd1EGFP轉染的Jurkat細胞群中d1 EGFP陽性細胞百分比的改變。
圖23顯示在用載體2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS或gf10bse2轉染的Jurkat細胞群中d1 EGFP陽性細胞百分比的改變。
圖24顯示在用載體2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS或NNVd1EGFP轉染的Jurkat細胞群中表達d1 EGFP的細胞數目的改變。
圖25顯示在用載體2wtd1EGFP、2wtd1EGFPFS或gf10bse2轉染的Jurkat細胞群中表達d1 EGFP的細胞數目的改變。
圖26.T細胞對重組體Nef蛋白(5毫克/孔)的反應，在用1毫克GTU-Nef免疫的5名患者中通過T細胞增殖檢測。
圖27.T細胞對重組體Nef蛋白(5毫克/孔)的反應，在用20毫克GTU-Nef免疫的5名患者中通過T細胞增殖檢測。
圖28.T細胞對重組體Nef蛋白(5毫克/孔)的反應，在用1毫克GTU-Nef免疫的#1患者中通過T細胞增殖檢測。結果給出T細胞增殖試驗的刺激指數(Nef S1)和分泌到上清的IFN-γ。
圖29.(A)質粒pEBO LPP；(B)質粒s6E2d1 EGFP；(C)質粒FRE2d1EGFP圖30.質粒FREBNAd1EGFP
圖31.載體不幹擾細胞增殖圖32.載體以不同的動力學保存在細胞中圖33.在轉染的總細胞群中，表達d1EGFP的細胞數目隨時間的改變圖34.在轉染的總細胞群中，表達d1EGFP的細胞數目隨時間的改變。(A)人胚胎細胞系293；(B)小鼠細胞系3T6圖35.Nef和E2抗體反應圖36.Rev和Tat抗體反應圖37.Gag和CTL反應圖38.(A)GTU-1；(B)GTU-2Nef；(C)GTU-3Nef；(D)super6wtd1EGFP；(E)FREBNAd1EGFP；(F)E2BSEBNAd1EGFP；(G)NNV-Rev圖39.(A)pNRT；(B)pTRN；(C)pRTN；(D)pTNR；(E)pRNT；(F)p2TRN；(G)p2RNT；(H)p3RNT；(I)pTRN-iE2-GMCSF；(J)pTRN-iMG-GMCSF圖40.(A)pMVINTR；(B)pMV2NTR；(C)pMV1N11TR；(D)pMV2N11TR圖41.(A)pCTL；(B)pdgag；(C)psynp17/24；(D)poptp17/24；(E)p2mCTL；(F)p2optp17/24；(G)p3mCTL；(H)p3optp17/24圖42.(A)pTRN-CTL；(B)pRNT-CTL；(C)pTRN-dgag；(D)pTRN-CTL-dgag；(E)pRNT-CTL-dgag；(F)pTRN-dgag-CTL；(G)pRNT-dgag-CTL；(H)pTRN-optp-17/24-CTL；(I)pTRN-CTL-optp17/24；(J)pRNT-CTL-optp17/24；(K)p2TRN-optp17/24-CTL；(L)p2RNT-optp17/24-CTL；(M)p2TRN-CTL-optp17/24；(N)p2RNT-CTL-optp17/24；(O)p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；(P)p2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；(Q)p3TRN-CTL-optp17/24；(R)p3RNT-CTL-optp17/24；(S)p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；(T)p3RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；(U)FREBNA-RNT-CTL-optp17/24；(V)super6wt-RNT-CTL-optp17/24；(W)E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24；(X)pCMV-RNT-CTL-optp17/24圖43.multireg抗原的表達分析。
圖44.由蛋白免疫顯性部分組成的multireg抗原的表達分析。
圖45.通過免疫螢光檢驗分析multireg抗原的細胞內定位。
圖46.gag編碼的結構蛋白和CTL多抗原決定簇的表達分析。
圖47.p17/24蛋白在RD細胞膜內的定位。
圖48.含dgag和CTL的多基因在Cos-7細胞中的表達分析。
圖49.在Jurkat細胞中表達的多HIV抗原的Western印跡分析。
圖50.TRN-CTL-optp17/24和RNT-CTL-optp-17/24抗原及E2蛋白從GTU-1、GTU-2和GTU-3載體的表達分析。
圖51.從不同載體表達的多HIV抗原的保存。
圖52.多HIV抗原在RD細胞中的細胞內定位。
5.發明的詳細描述5.1發明的載體本發明基於出乎意外的發現，即表達載體能夠在增殖細胞群中傳播，表達載體攜帶(A)核-錨定蛋白基因的表達基因盒，核-錨定蛋白結合(i)特定DNA序列和(ii)適合的核成分，和攜帶(B)所述核-錨定蛋白的多聚體化DNA結合序列。這種核-錨定蛋白包括但不限於染色質-錨定蛋白，如1型牛乳頭狀瘤病毒E2蛋白(BPV1 E2；SEQ ID NO50)。DNA結合序列可以是，但不限於，多聚體化的E2結合位點。根據以前的技術，不能期望例如乳頭狀瘤病毒的隔離/分隔功能可以分別地被表達，給疫苗載體添加隔離/分隔功能可保證載體在增殖細胞群中的分布。另外，根據以前的技術，不能期望可以構建不依賴複製起始點而發揮作用的功能性載體。
如本發明所用的術語「核-錨定蛋白」是指與特定DNA序列結合併能夠給載體提供核區域化功能的蛋白，即，指能夠將載體錨定或附著到特定的核區室的蛋白。
在發明的某些實施例中，核-錨定蛋白是天然的蛋白。這些核區室的實例是有絲分裂的染色質或有絲分裂的染色體、核基質、核結構域如ND10和POD等。核-錨定蛋白的實例是1型牛乳頭狀瘤病毒(BPV1)E2蛋白、EBNA1(EB病毒核抗原1；SEQ ID NO52)和高遷移率組(HMG)蛋白等。如本發明所用的術語「核-錨定蛋白的功能相等物」是指天然的或非天然來源的、具有核-錨定蛋白特性的蛋白或多肽。
在本發明的某些其它實施例中，發明的核-錨定蛋白是重組體蛋白。在發明的某些特殊實施例中，核-錨定蛋白是融合蛋白、嵌合蛋白或通過分子建模獲得的蛋白。與本發明有關的融合蛋白或通過分子建模獲得的蛋白，其特徵是能夠與核成分結合併能夠結合對DNA特異的序列。在發明優選的實施例中，這種融合蛋白是由發明的載體編碼的，發明的載體也含有其上結合有融合/嵌合蛋白的特定DNA序列。核成分包括但不限於染色質、核基質、ND10結構域和POD。為減低幹擾宿主細胞內源性基因表達的危險，DNA結合結構域和相應的DNA序列優選地為宿主細胞/宿主生物體非內源性的。這些結構域包括但不限於，1型牛乳頭狀瘤病毒(BPV1)E2蛋白(SEQ ID NO50)的、EB病毒核抗原1(EBNA1；SEQ ID NO52)的和高遷移率組(HMG)蛋白(HMG盒)的DNA結合結構域。
發明的載體可進一步包含「目的DNA序列」，它編碼如免疫原或治療藥的蛋白(包括肽或多肽)。在發明的某些實施例中，目的DNA序列編碼有生物學活性的RNA分子如反義RNA分子或核糖酶。
攜帶核-錨定蛋白基因表達基因盒和所述核-錨定蛋白多聚體化結合位點的發明表達載體在增殖細胞群中傳播。這意味著高拷貝數量的載體或質粒被傳遞進靶細胞中，且應用核-錨定蛋白的隔離/分隔功能及其多聚體化結合位點保證了載體在細胞分裂期間分配到子細胞中。
發明的載體缺少乳頭狀瘤病毒複製起始點。進一步，在優選的實施例中，發明的載體缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點。刪除了乳頭狀瘤病毒複製起始點或哺乳動物複製起始點就形成了超過本領域以前載體的改進，有幾個原因。(1)同本領域以前載體相比，複製起始點的刪除減小了發明載體的大小。這種大小的減低增加了載體的穩定性並促進被宿主細胞攝取。(2)複製起始點的刪除減少了與宿主細胞基因組重組的危險，從而降低了有害副作用的危險。(3)複製起始點的刪除使得可以通過調節給予載體的量簡單地控制劑量。相反，對於起作用的複製起始點，在確定所需劑量時必須考慮載體的複製。(4)如果載體不連續地給予宿主生物體，缺少複製起始點使宿主生物體從其體內清除載體，從而更好地控制要在宿主生物體內表達的DNA序列的水平。進一步，如果載體的存在僅在治療過程中需要，而在健康個體中是不需要的，那麼生物體從其體內清除載體的能力是有益的。
用於本發明載體的核-錨定蛋白基因可以是任何適合的DNA序列，編碼具有所需特性的天然或人造蛋白如重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白。因此，天然核-錨定蛋白的基因可以是病毒蛋白基因如牛乳頭狀瘤病毒E2蛋白或EB病毒的EBNA1(EB病毒核抗原1)，真核生物蛋白基因如高遷移率組(HMG)蛋白或類似蛋白，或是原核蛋白基因，該基因含有能夠結合特定DNA序列的DNA結合結構域和能夠結合核成分的功能性結構域。可選擇地，含有能夠結合特定DNA序列的DNA結合結構域和能夠結合核成分的功能性結構域的核-錨定蛋白基因也可以包括DNA序列，編碼具有附著於適當核結構的能力的細胞蛋白結構域，核結構如有絲分裂的染色體、核基質或核結構域如ND10或POD。
可選擇地，可以使用編碼非天然或人造蛋白如重組體蛋白或融合蛋白或通過分子建模獲得的蛋白的DNA序列，這些蛋白含有能夠結合如乳頭狀瘤病毒特定DNA序列的DNA結合結構域，如BPV1的E2蛋白DNA結合結構域，但其中核-錨定蛋白如E2蛋白的N-末端已經被任何具有相似能力的適合蛋白的結構域取代，例如，被EB病毒核抗原1序列N-末端結構域取代。相似地，可以使用編碼重組體蛋白或融合蛋白的DNA序列，蛋白含有能夠結合核成分的功能性結構域，如乳頭狀瘤病毒的N-末端結構域如BPV1的E2蛋白，但其中核-錨定蛋白C-末端結合DNA的二聚作用結構域，如E2蛋白C-末端，已經被充足DNA結合能力的任何蛋白結構域取代，如BPV-1 E2蛋白和EBNA-1的DNA結合結構域。
在本發明優選的實施例中，核-錨定蛋白是染色質-錨定蛋白，它含有與特定DNA序列結合的DNA結合結構域和能夠結合有絲分裂染色質的功能性結構域。本發明中使用的這種染色質-錨定蛋白及其多聚體化結合位點的優選實例是1型牛乳頭狀瘤病毒E2蛋白和E2蛋白多聚體化結合位點。就E2來說，傳播功能的機制是由於E2蛋白的雙重功能E2蛋白經蛋白N-末端結構域附著到有絲分裂染色體上的能力，和E2蛋白C-末端結構域序列特異性結合的能力，它保證將含有多聚體化E2結合位點的載體接到有絲分裂的染色體上。從而給載體提供隔離/分隔功能。
在發明的另一個優選的實施例中，染色質-錨定蛋白基因的表達基因盒包括細胞、病毒或重組體來源的任何適合蛋白的基因，所述蛋白具有與BPV1 E2類似的特性即，經一個結構域附著於有絲分裂染色質和經另一個結構域共同地將DNA結合到對此DNA結合結構域特異的多聚體化結合位點上的能力。
在特殊實施例中，從BPV1獲得的序列被用在本發明載體中，它們被大大地縮短長度以僅僅包括BPV1的兩個元件。首先，它們包括E2蛋白編碼序列，轉錄自異源真核生物啟動子並在異源的聚腺苷醯作用位點上聚腺苷化。其次，它們包括以集簇形式摻入載體的E2蛋白多結合位點，其中的位點可以是頭尾相接結構或可以通過間隔定位包含在載體中。這兩個元件都是必需的且令人驚訝地足以發揮載體在增殖細胞中的傳播功能。相似地，當本發明載體中使用其它適合來源的DNA序列時，應用相同的原理。
根據本發明，含有能夠結合特定DNA序列的DNA結合結構域和能夠結合核成分的功能性結構域的核-錨定蛋白的基因表達盒，如像BPV1 E2的染色質-錨定蛋白基因表達盒，包括異源真核生物啟動子，核-錨定蛋白編碼序列，如染色質-錨定蛋白編碼序列例如BPV1 E2蛋白編碼序列，和polyA位點。可以使用控制核-錨定蛋白表達的不同異源真核生物啟動子。這些異源真核生物啟動子的核苷酸序列是本領域熟知的並容易得到。這些異源真核生物啟動子具有不同的強度和組織特異性。在優選的實施例中，核錨定蛋白以低水平表達。
如本發明文中所定義的，多聚體化DNA結合序列即含多聚結合位點的DNA序列，是結合DNA的二聚作用結構域結合的區域。本發明載體的多聚體化DNA結合序列可含有任何適合的DNA結合位點，假如它滿足上面的必要條件。
在優選的實施例中，本發明載體的多聚體化DNA結合序列可包含已知的17個不同親合性E2結合位點中的任一個，以六聚物或更高寡聚物、八聚物或更高寡聚物、十聚物或更高寡聚物形式。也可應用含不同E2結合位點的寡聚物。本發明載體中使用的特別優選的E2結合位點是BPV1高親合性位點9和10，親合性位點9是最優選的。當涉及更高寡聚物時，其大小僅受構建條件的限制，可含有6至30個同樣的結合位點。發明優選的載體前後依次含有10個BPV-1 E2結合位點9。當多聚體化DNA結合序列由不同的E2結合位點組成時，其大小和組成成分僅受構建操作方法的限制。因而它們可含有兩個或多個不同的E2結合位點附著於一系列6至30個，最優選地10個E2結合位點上。1型牛乳頭狀瘤病毒基因組(SEQ ID NO49)含有17個與E2親合性不同的E2蛋白結合位點。E2結合位點被Li等人描述[Genes Dev 3(4)(1989)510-526]，在此整體合併為參考文獻。
可選擇地，多聚體化DNA結合序列可由任何適合的多聚特定序列組成，這些序列能夠共同地將蛋白結合到質粒上，如EBNA1或適合的HMG蛋白的序列。EBNA-1的21×30bp結合位點重複區位於EB病毒基因組(SEQ ID NO51)的7421位核苷酸至8042位核苷酸區域內。這些EBNA-1結合位點在以下文獻中被描述Rawlins等人，Cell 42(3)(1985)859-868；Reisman等人，Mol Cell Biol 5(8)(1985)1822-1832；及Lupton和Levine，Mol Cell Biol 5(10)(1985)2533-2542，所有這三者均在此整體合併為參考文獻。
多聚體化DNA結合序列相對於結合DNA的二聚作用結構域表達盒的位置是不重要的，可以在質粒中的任何位置。因此，多聚體化DNA結合序列可以位於目的基因表達盒的下遊或上遊，接近於目的基因啟動子的位置是優選的。
適當時，發明的載體還含有，轉錄該基因或多個基因或目的DNA序列的適合啟動子、附加調控序列、聚腺苷醯作用序列和內含子。優選地，載體還可包括細菌質粒複製起始點和一個或多個可選擇標記物的基因以促進在細菌宿主中製備載體，及適合的啟動子以表達抗生素選擇基因。
可選擇的標記可以是在DNA疫苗中允許的任何適合的標記，像卡那黴素或新黴素以及其它的標記。此外，在適當的情況下，發明的載體中可以包括其它的陽性和陰性選擇標記。
本發明載體僅包括對長期保存必要和足夠的DNA序列，例如BPV1 DNA序列。所有可能引起不良反應的多餘序列，如致癌序列，已被刪除。因此在優選的發明載體中，E2編碼序列通過突變分析被修飾，使其僅表達E2蛋白，且重疊的E3、E4和E5序列已通過誘導突變被失活而不能翻譯E3、E4和E5的開放閱讀框。發明的載體不含有乳頭狀瘤病毒複製起始點。優選地，發明的載體進一步不含有在哺乳動物細胞或哺乳動物中起作用的複製起始點。
更進一步，本發明載體不是宿主特異的，因為核-錨定蛋白如E2蛋白的表達是由非天然的或異源啟動子控制的。根據選擇的特殊啟動子，這些啟動子可在大範圍的哺乳動物細胞中起作用，或者它們可以是細胞或組織特異的。本發明載體所用的核-錨定蛋白如E2蛋白的啟動子實例是胸苷激酶啟動子、人細胞巨化病毒極早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒LTR，等。為表達目的基因，優選的啟動子是保證目的基因高水平表達的強啟動子，這種啟動子的一個實例是人細胞巨化病毒極早期啟動子。
5.2發明的載體作為表達目的DNA序列的媒介物要經發明載體表達的一個基因、多個基因或一條DNA序列或多條DNA序列可以是任何需要表達的目的DNA序列。因此，載體可含有感染性微生物病原體如病毒的一個基因或多個基因或一條DNA序列或多條DNA序列，不能夠製備或使用針對它們的活的減毒疫苗或滅活疫苗。這些目的DNA序列包括以下來源的基因或DNA序列病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、C型肝炎病毒、流感病毒、腸道病毒等；細胞內細菌如沙眼衣原體、結核分支桿菌、肺炎支原體等；細胞外細菌如沙門氏菌；或真菌如白色念珠菌。
在優選的發明實施例中，載體含有編碼HIV早期調控蛋白的基因，即非結構調控蛋白Nef、Tat或Rev，優選為Nef。在發明的另一個優選的實施例中，發明的載體含有編碼HIV結構蛋白的基因。在另一個優選的實施例中，本發明載體含有編碼HIV早期調控蛋白和/或結構蛋白任何組合的兩個或更多基因。舉例說明性的這些組合的實例是，編碼Nef蛋白的基因和編碼Tat蛋白的DNA序列的組合，可能與編碼HIV外殼糖蛋白gp120/gp160的DNA序列一起，或與併入人造重組體蛋白的病原體蛋白的任何免疫原性抗原決定簇組合在一起。
可選擇地，發明的載體可含有遺傳或獲得性基因缺陷的基因或DNA序列，如黑素瘤分化抗原的序列，像酪氨酸酶A編碼序列或編碼β-catenins的序列。
在優選的發明實施例中，載體含有癌症或其它突變性疾病相關蛋白的編碼基因如APECED基因，優選地，疾病涉及免疫成熟和自體和非自體免疫反應的調節。
在發明的另一個優選的實施例中，載體含有任何DNA序列，編碼在遺傳性單基因遺傳病中缺陷的蛋白。
在發明的另一個優選的實施例中，載體含有任何DNA序列，編碼要在體內傳遞和生產的大分子藥物。
製備發明載體的本發明方法包括以下步驟(A)培養含發明載體的宿主細胞，和(B)回收該載體。在某些特殊的實施例中，步驟(A)前用發明的載體轉化宿主細胞。
發明的載體優選地在適合的細菌宿主細胞如大腸桿菌中擴增。發明的載體是穩定的並以高拷貝數在細菌細胞中複製。如果發明的載體要在細菌宿主細胞中擴增，發明的載體含有細菌複製起始點。細菌複製起始點的核苷酸序列是熟練的技術人員熟知的並可容易地獲得。
通過以高拷貝數轉染進哺乳動物宿主，載體隨細胞分裂傳播，攜帶載體的細胞數增加而載體沒有複製，每個細胞能夠表達目的蛋白。
發明的載體引起所需蛋白的高表達。例如，如實施例4、7-10所顯示的在許多不同的細胞系中可顯示HIV Nef蛋白、綠螢光蛋白(EGFP)和AIRE蛋白的高表達，數據表明不僅陽性細胞數，而且由目的基因編碼的蛋白的量均隨時間升高。
發明的載體還引起體液的和細胞的反應，如實施例9和10所顯示的。結果表明本發明載體可有效地用作DNA疫苗。
本發明的疫苗含有本發明的載體或所述載體在適合的藥物賦形劑中的混合物。例如，疫苗可含有載體混合物，載體中含有HIV三個不同調控蛋白和/或HIV結構蛋白的基因。
發明的疫苗採用標準的疫苗配方方法配製，以生產通過任何常規途徑，即肌肉內、皮內等途徑用藥的疫苗。
發明的載體可含有ISS刺激序列以激發機體的免疫反應。
發明的疫苗能夠以常規的預防性方式使用來防止個體感染，可選擇地，發明的疫苗可被用作治療性疫苗與常規藥物一起使用，特別是在病毒感染情況下。
如上提到的，具有在宿主細胞中傳播機制的本發明載體發現有大量的應用，用作疫苗，在基因治療中，在基因傳遞中以及作為治療性免疫原。發明的載體可用來給基因缺陷的宿主傳遞正常的基因，從而實現基因病的治癒或治療。更進一步，此載體可傳遞外源性免疫原性蛋白的基因，如微生物或自體腫瘤抗原的基因，以用來開發抗微生物或癌症的疫苗。更進一步，發明的載體可傳遞適合的標記物質的基因到核，被用來研究細胞功能或用於診斷學。最後，發明的載體可被用來特異地傳遞大分子藥物基因到核，從而能夠形成新的治療原則來治療和治癒疾病，其中重要的是藥物表達在作用位點、細胞核。這些藥物可以是化學的大分子如具有治療或治癒效果的任何蛋白或多肽，它們幹擾任何核機制，如複製或轉錄或輸送物質出入核。
特別地，為了調節生物體抗外源抗原的特異免疫反應(免疫治療)，或促進免疫系統抗突變的自體抗原的活性，本發明載體可被用來表達特殊的細胞因子，像白介素類(1L1，IL2，IL4，IL6，IL12和其它)或幹擾素。通過表達涉及多巴胺合成的基因如酪氨酸羥化酶以及其它可能具有相似作用的基因缺陷，本發明載體還被用於補充因喪失多巴胺能神經元而引起的不可逆神經變性的腦功能障礙，這是帕金森氏病的原因。本發明載體還用於表達調節腦活動的蛋白和肽，像多巴胺受體、CCK-A和CCK-B受體，以及神經營養因子如GDNF、BDNF和其它調節腦活動的蛋白。進一步，本發明載體被用於在肝細胞中長期表達因子IX和在肌肉細胞中表達α-抗胰島素，以補充各自生物體的不足。
5.3靶疾病和紊亂在某些實施例中，發明的載體被用作疫苗。在某些實施例中，發明的載體含有編碼蛋白或肽的目的DNA序列。通過給予受試者這種載體，由目的DNA序列編碼的蛋白或肽被表達並刺激對目的DNA序列編碼的蛋白或肽特異的免疫反應。
在特殊的實施例中，發明的載體被用來治療和/或預防由感染原引起的感染性疾病和/或狀態。這些疾病和狀態包括但不限於，由細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲等病原體引起的感染性疾病。在更特殊的本發明實施例中，感染性疾病是獲得性免疫缺陷綜合症。
優選地，需要治療或預防病毒性疾病時，使用編碼含已知病毒抗原決定簇分子的DNA序列。例如，這種編碼抗原性抗原決定簇的DNA序列可製備自病毒，包括但不限於A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、I型單純皰疹病毒(HSV-1)、II型單純皰疹病毒(HSV-11)、牛瘟病毒、鼻病毒、ECHO病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、細胞巨化病毒、棘皮病毒、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)和II型人免疫缺陷病毒(HIV-11)。
優選地，在需要治療或預防細菌性感染時，使用編碼含已知細菌抗原決定簇分子的DNA序列。例如，這種編碼抗原性抗原決定簇的DNA序列可製備自細菌，包括但不限於分支桿菌、立克次氏體、支原體、奈瑟氏菌屬和軍團菌屬。
優選地，在需要治療或預防原生動物感染時，使用編碼含已知原生動物抗原決定簇分子的DNA序列。例如，這種編碼抗原性抗原決定簇的DNA序列可製備自原生動物，包括但不限於利什曼原蟲、kokzidioa和錐體蟲。
優選地，在需要治療或預防寄生蟲感染時，使用編碼含已知寄生蟲抗原決定簇分子的DNA序列。例如，這種編碼抗原性抗原決定簇的DNA序列可製備自寄生蟲，包括但不限於衣原體和立克次氏體。
在其它特殊的實施例中，發明的載體被用於在受試者中治療和/或預防腫瘤疾病。在這些實施例中，目的DNA序列編碼對腫瘤疾病特異或與其相關的蛋白或肽。作為非限制性實施例，新生物疾病可以是纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴血管肉瘤、淋巴血管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨癌、精原細胞瘤、胚胎細胞癌、維爾姆斯瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病如急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(原粒細胞、早幼粒細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅細胞性白血病)；慢性白血病(慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；和脾大性紅細胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症和重鏈病，等。
在本發明的某些其它實施例中，目的DNA序列編碼因蛋白編碼基因遺傳性紊亂或獲得性突變而無功能或功能障礙的蛋白。這種遺傳病包括但不限於，代謝性疾病如動脈硬化症(受影響的基因APOE)；癌症如家族性腺瘤樣結腸息肉(受影響的基因APC基因)；自體免疫疾病如自體免疫多內分泌病-念珠菌病-外胚層發育異常(受影響的基因APECED)；肌肉病如杜興氏肌營養不良(受影響的基因DMD)；神經系統疾病如阿爾茲海姆病(受影響的基因PS1和PS2)。
還是在另一個實施例中，發明的載體被用來治療和/或預防由病理性高活性的一種蛋白引起的疾病和紊亂。在發明的這些實施例中，目的DNA序列編碼過度活化的蛋白的一種拮抗劑。這些拮抗劑包括但不限於，反義RNA分子，核糖酶，抗體和顯性失活蛋白。在發明的特殊實施例中，目的DNA序列編碼一種癌基因的抑制劑。
在某些實施例中，目的DNA序列編碼一種可拮抗腫瘤生長的分子。在發明的特殊實施例中，目的DNA序列編碼一種腫瘤抑制劑，如，但不限於p53。在其他的特殊實施例中，目的DNA序列編碼凋亡的一種激動劑，如但不限於，Caspase。
發明提供了一些方法，其中目的DNA序列在受試者中表達。在某些實施例中，含有目的DNA序列的一個或多個表達基因盒的載體給予受試者，其中受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒E1蛋白。
5.4使用本發明的治療方法5.4.1重組DNA在發明的各種實施例中，發明的載體包括含有目的DNA序列的一個或多個表達基因盒。目的DNA序列編碼一種蛋白和/或生物學活性的RNA分子。在兩種情況下，在基因治療時，DNA序列均被插入至發明的載體中以在重組細胞或宿主的細胞中表達。
如在此所使用的，一種表達基因盒是指與可使發明的蛋白在一個合適的宿主細胞中表達的一個或多個調控區或增強子/啟動子序列可操作連接的目的DNA序列。「可操作地連接」是指一種結合方式，其中調控區和要被表達的DNA序列被連接，並以可允許轉錄，對於蛋白時允許翻譯的方式被定位。
目的DNA序列的轉錄所必需的調控區由發明的載體提供。在一個相容性宿主構建物系統中，細胞轉錄因子，如RNA聚合酶將與載體的調控區結合以影響目的DNA序列在宿主生物體中的轉錄。基因表達需要的調控區的準確性質可在宿主細胞之間有所不同。通常，需要一種啟動子，它能夠結合RNA聚合酶和促進可操作連接的DNA序列的轉錄。這種調控區包括參與啟動轉錄和翻譯的5』非編碼序列，如TATA盒，加帽序列，CAAT序列，和類似序列。編碼序列的3』非編碼區含有轉錄終止調控序列，如終止子和聚腺苷酸化位點。
結構性和誘導性調控區都可用來表達目的DNA序列。當宿主細胞的最佳生長條件和高水平表達目的DNA序列的條件不同時，需要使用誘導性啟動子。可使用的調控區的實例在下面提供(章節5.4.4)。
為了將有調節功能的DNA序列，如啟動子附著於目的DNA序列或將目的DNA序列插入進載體中的克隆位點，提供了合適的相容性限制位點的連接子或接頭，可採用本領域熟知的技術連接於cDNA的末端[Wu等人，Methods in Enzymol 152(1987)343-349)。使用限制性酶的切割作用跟隨在建立鈍端的修飾作用之後，所述的修飾是在連接作用之前通過在單鏈的DNA末端回退消化或填充而進行。可選擇的是，應用PCR使用含有所需限制性酶位點的引物通過擴增DNA將限制性酶導入進DNA的片斷中。
含有可操作地連接於調控區(增強子/啟動子序列)的目的DNA序列的載體被直接導入進合適的宿主細胞中以表達目的DNA序列而不需進一步克隆。
為了在哺乳動物宿主細胞中表達目的DNA序列，可使用多種調控區，例如，SV40早期和晚期啟動子，巨細胞病毒(CMV)極早期啟動子，和魯斯氏肉瘤病毒長末端重複區(RSV-LTR)啟動子。可用於哺乳動物細胞的誘導性啟動子包括但不限於與金屬硫蛋白II基因，小鼠乳腺腫瘤病毒腎上腺皮質激素反應性長末端重複區(MMTV-LTR)，β-幹擾素基因，和hsp70基因有關的啟動子[Williams等人，Cancer Res.49(1989)2735-42；Taylor等人，Mol.Cell Biol.，10(1990)165-75]。使用熱休克啟動子或應激啟動子驅動目的DNA序列在重組宿主細胞中表達是有益的。
另外，表達載體含有可選擇的或可篩選的標記物基因用於最初分離，鑑定或跟蹤含有載體的宿主細胞。許多選擇系統可用於哺乳動物細胞，包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶[Wigler等人，Cell 11(1977)223]，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶[Szybalski和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48(1962)2026]，和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶[Lowy等人，Cell 22(1980)817]基因分別用於tk-，hgprt-或aprt-細胞。抗代謝物抗性也可用做選擇二氫葉酸還原酶(dhfr)的基礎，可賦予對氨甲喋呤的抗性[Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)3567；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)1527]；gpt，可賦予對黴酚酸的抗性[Mulligan Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)2072]；新黴素磷酸轉移酶(neo)，可賦予對氨基糖苷G-418的抗性[Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150(1981)1]；和潮黴素磷酸轉移酶(hyg)，可賦予對潮黴素的抗性[Santerre等人，1984，Gene 30(1984)147]。可使用其他可選擇的標記物，如，但不限於組氨醇和Zeocin。
5.4.2表達系統和宿主細胞為了應用發明的方法，宿主細胞和/或宿主生物體優選不表達牛乳頭狀瘤病毒E1蛋白。而且，優選發明的載體不表達牛乳頭狀瘤病毒E1蛋白。
優選地哺乳動物宿主細胞包括但不限於來自下列來源的細胞人，猴和嚙齒類動物(見，例如，Kriegler M.在「基因傳遞和表達實驗室手冊」，New York，Freeman Co.1990)，如由SV40(COS-7，ATCC CRL1651)轉化的猴腎細胞系；人胚胎腎細胞系(293，293-EBNA，或為懸浮培養生長亞克隆的293細胞，Graham等人，J.Gen.Virol.，36(1977)59；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞-DHFR[CHO，Urlaub和Chasin。Proc.Natl.Acad.Sci.77(1980)4216]；小鼠sertoli細胞[Mather，Biol.Reprod.23(1980)243-251]；小鼠成纖維細胞(NIH-3T3)，猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲青猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。
發明的載體可被合成和從已知的DNA序列通過本領域熟知的技術組裝而成。調控區和增強子元件可具有多種來源，天然的和合成的。一些宿主細胞可從商業渠道獲得。
含有目的DNA序列的發明載體可通過本領域已知的技術被導入至宿主細胞中，包括但不限於，對於原核細胞，細菌轉化(Hanahan，1985，DNA克隆，實踐方法，1109-136)，對於真核細胞，磷酸鈣介導的轉染[Wigler等人，Cell 11(1977)223-232]，脂質體介導的轉染[Schaefer-Ridder等人，Science 215(1982)166-168]，電穿孔[Wolff等人，Proc Natl Acad Sci 84(1987)3344]，和微注射[Cappechi，Cell 22(1980)479-4889]。
在一個特殊的實施例中，表達發明DNA序列的細胞系可採用含有可選擇標記物的載體來進行改造。通過實例而不是限制，在導入載體後，改造的細胞可在一種富集的培養基中生長1-2天，然後更換為選擇性培養基。載體中的可選擇標記物可賦予對選擇作用的抗性，並最好僅允許含有具有可選擇標記物的載體的細胞在培養中生長。
5.4.3疫苗方法在某些實施例中，含有目的DNA序列的一個表達基因盒的發明載體給予一個受試者以誘導免疫反應。特殊地，目的DNA序列編碼一種蛋白(例如，肽或多肽)，可在其表達過程中誘導特異免疫反應。這種蛋白的實例在章節5.3中進行描述。
為了傳遞發明的載體作為疫苗，其方法可選自本領域已知的方法和/或在章節5.4.6中描述。
5.4.4基因治療方法在一個特殊的實施例中，含有目的DNA序列的表達基因盒的發明載體被給予以治療或預防多種疾病。目的DNA序列編碼一種蛋白和/或一種生物學活性的RNA分子。基因治療是指通過給予受試者一種已表達的或可表達的DNA序列進行的治療。在發明的這個實施例中，DNA序列產生它們編碼的可介導治療效應的蛋白或RNA分子。
根據本發明可使用本領域中用於基因治療的任何方法。實例的方法在下面描述。
對於基因治療方法的總體綜述，見Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 12(1993)488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3(1991)87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993)573-596；Mulligan，Science 260(1993)926-932；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62(1993)191-217；May，TIBTECH 1，1(5)(1993)155-215。可使用的重組DNA技術領域中普遍已知的方法見Ausubel等人，(主編)，分子生物學現代方法，John Wiley Sons，NY(1993)；和Kriegler，基因傳遞和表達，實驗室手冊，Stockton Press，NY(1990)中的描述。
具有組織特異性，並已經在轉基因動物中使用的下列動物調控區可在特殊的組織類型中用來表達目的DNA序列在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶1基因控制區[Swift等人，Cell 38(1984)639-646；Ornitz等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50(1986)399-409；MacDonald，Hepatology 7(1987)425-515]；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區[Hanahan，Nature 315(1985)115-122]，在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區[Grosschedl等人，Cell 38(1984)647-658；Adames等人，Nature 318(1985)533-538；Alexander等人，Mol.Cell.Biol.7(1987)1436-1444]，在睪丸，乳腺，淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區[Leder等人，Cell 45(1986)485-495]，在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區[Pinkert等人，Genes andDevel.1(1987)268-276]，在肝臟中有活性的α-甲胎蛋白基因控制區[Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5(1985)1639-1648；Hammer等人，Science 235(1987)53-58；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區[Kelsey等人，Genes and Devel.1(1987)161-171]，在髓樣細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區[Mogram等人，Nature 315(1985)338-340；Kollias等人，Cell 46(1986)89-94]；在腦中的少突膠質細胞中有活性的髓磷脂鹼性蛋白基因控制區[Readhead等人，Cell 48(1987)703-712]；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區[Sani，Nature 314(1985)283-286]，和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區[Mason等人，Science 234(1986)1372-1378]。
傳遞fro的基因治療手術的方法在本領域中是熟知的和/或在章節5.4.6中描述。
5.4.5抑制性反義和核糖酶在發明的某些實施例中，發明的載體含有編碼反義或核糖酶RNA分子的目的DNA序列。產生和使用這種分子的技術是本領域中的專業技術人員所熟知的。
反義RNA分子通過與靶向的mRNA雜交和防止蛋白翻譯來作用直接阻斷mRNA翻譯。反義方法涉及設計與靶基因mRNA互補的寡核苷酸。反義寡核苷酸將與互補的靶基因mRNA轉錄物結合併阻止翻譯。儘管是優選的，但不需要絕對的互補性。
與RNA的一部分「互補的」序列，如在此所提到的，其含義是指具有足夠互補性，能與至少RNA的非聚合A部分雜交形成穩定雙鏈體的序列；因此在雙鏈反義核酸的情況下，檢測雙鏈體DNA的單鏈或檢測形成的三聯體。雜交的能力將根據互補性的程度和反義核酸的長度而變化。通常，雜交的核酸越長，與RNA不匹配的鹼基越多，可含有並仍然形成穩定的雙鏈體(或三聯體，在情況可能時)。本領域的專業技術人員可使用標準的方法確定錯配的可耐受程度以確定雜交複合體的熔點。
反義核酸應該至少為6個核苷酸的長度，優選寡核苷酸的長度範圍是從6至大約50個核苷酸。在特殊的方面，寡核苷酸至少為10個核苷酸，至少17個核苷酸，至少25個核苷酸或至少50個核苷酸。在發明的另一個實施例中，反義核酸為至少100，至少250，至少500，和至少1000個核苷酸的長度。
無論何種靶序列的選擇，優選體外研究首先定量反義寡核苷酸抑制基因表達的能力。優選這些研究使用可區分反義核酸抑制和寡核苷酸的非特異性生物學效應的對照。也優選這些研究比較靶RNA或蛋白與內參照RNA或蛋白的水平。可選擇地，期望使用反義DNA序列獲得的結果與使用對照DNA序列獲得的結果進行比較。優選對照DNA序列與被檢測的寡核苷酸大致具有相同的長度，寡核苷酸的DNA序列與反義序列的差異僅需要阻止與靶序列的特異雜交。
當使用與靶基因編碼區序列互補的反義DNA序列時，這些與轉錄的，未翻譯區互補的序列是最優選的。
為了從發明的載體中表達生物學活性的RNA，如反義RNA分子，編碼生物學活性的RNA分子的DNA序列可操作地連接於一個強的polIII或pol II啟動子。在患者中使用這樣一種構建物轉染靶細胞將導致產生足夠轉錄量的單鏈RNA，它們將與內源靶基因轉錄物形成互補鹼基對，並因此阻止靶基因mRNA的翻譯。例如，發明的載體可被導入，例如，被細胞攝取，並引導反義RNA的轉錄。這樣的載體可通過本領域中的標準重組DNA技術方法來構建。編碼反義RNA的序列的表達可通過任何本領域已知的啟動子來作用於哺乳動物，優選人的細胞。這些啟動子可以是誘導性的或結構性的。這些啟動子包括但不限於SV40早期啟動子區[Bernoist和Chambon，Nature 290(1981)304-310]，包含在羅斯肉瘤病毒的3個長末端重複區內的啟動子[Yamamoto等人，Cell 22(1980)787-797]，皰疹胸苷激酶啟動子[Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78(1981)1441-1445]，金屬硫蛋白基因的調控序列[Brinster等人，1982，Nature 296(1982)39-42]等。
在發明的某些實施例中，發明的載體含有編碼核糖酶的一條DNA序列。設計用來催化切割靶基因mRNA轉錄物的核糖酶分子也可用來防止靶基因mRNA的翻譯，和因此產生的靶基因產物的表達[見，如PCT國際申請WO90/11364，公開於1990年10月4日；Sarver等人，Science 247(1990)1222-1225]。
核糖酶是能夠催化RNA特異斷裂的酶性RNA分子。[綜述見Rossi，Current Biology 4(1994)469-471]。核糖酶作用的機制涉及核糖酶分子與互補的靶RNA的序列特異性雜交，然後發生核苷酸內切的斷裂。核糖酶分子的組合物必須包括與靶基因mRNA互補一條或多條序列，必須包括熟知的可引起mRNA斷裂的催化序列。對於這條序列，見，如美國專利第5,093,246，它在此整體合併為參考文獻。
當在位點特異識別序列上斷裂mRNA的核糖酶被用來破壞靶基因mRNA時，優選使用錘頭形核糖酶。錘頭形核糖酶可在與靶mRNA形成互補鹼基對的側向區指示的位置斷裂mRNA。唯一需要的是靶mRNA具有以下的兩個鹼基的序列5′-UG-3′。錘頭形核糖酶的構建和生產是本領域中為人熟知的，並更詳細地描述在Myers，1995，分子生物學和生物技術綜合Desk Reference，VCH Publishers，New York，(見，特別是圖4，833頁)和在Haseloff Gerlach，Nature，334 1988)585-591，在此整體加入合併為參考文獻。
優選核糖酶被改造，以便斷裂識別位點的位置靠近靶基因mRNA的5′末端，即增加效率，儘量減小非功能性mRNA轉錄物的細胞內累積。
本發明的核糖酶也包括RNA核糖核酸內切酶(此後稱為″Cech-型核糖酶″)如嗜熱四膜蟲中天然存在的酶(也稱為IVS，或L-19 IVS RNA)和已經由Thomas Cech及其合作者廣泛描述的[Zaug等人，Science，224(1984)574-578；Zaug和Cech，Science，231(1986)470-475；Zaug等人，Nature，324(1986)429-433；已公開的世界專利申請第WO 88/04300由大學專利公司申請；Been Cech，Cell，47(1986)207-216]。Cech-型核糖酶具有8個鹼基對的活性位點，可與靶RNA序列雜交，然後發生靶RNA的斷裂。發明包括那些Cech型核糖酶，可靶向存在於靶基因中的8個鹼基對活性位點。
核糖酶的表達可在一個強結構性pol III或pol II啟動子的控制下，這樣轉染的細胞將產生足夠數量的核糖酶以破壞內源性靶基因信息和抑制翻譯。因為核糖酶不象反義分子，它是催化性的，所以為了效率需要更低的細胞內濃度。
在一些例子中，其中在此描述的反義和/或核糖酶分子用來抑制突變體基因表達，可能技術有效地減少或抑制正常靶基因等位基因產生的mRNA的翻譯，就出現了這樣的可能性，其中存在的正常靶基因產物的濃度低於正常基因表現型所需的濃度。在這種情況下，為了保證維持實質上正常水平的靶基因活性，所以編碼和表達抑制正常靶基因活性的多肽的核酸分子，可通過基因治療方法被導入至細胞中，如在下面5.4.4章節所描述的那些，不包括那些無論使用反義，核糖酶，或三鏈螺旋處理都敏感的序列。可選擇地，在靶基因編碼細胞外蛋白的例子中，優選共同給予正常的靶基因蛋白以維持靶基因活性必需的水平。
給予核糖酶和反義RNA分子的方法在本領域中是熟知的和/或在章節5.4.6中描述。
5.4.6藥物製劑及其應用方式在一個優選的方面，發明的藥劑包括發明的一種實質上純化的載體(如，實質上不含有限制其效力或產生不需要的副作用的物質)。以發明的方法給予藥劑的受試者優選是一種動物，包括但不限於以下的動物如奶牛，豬，馬，雞，貓，狗等，優選是一種哺乳動物，最優選的是人類。
在某些實施例中，發明的載體直接在體內應用，其中目的DNA序列被表達產生其編碼產物。這可以通過任何本領域已知的大量方法來完成。可使用發明的載體以便核酸序列成為細胞內的。發明載體的給予可通過直接注射裸DNA；使用微粒轟擊(如，基因槍；Biolistic，Dupont)；用脂類或細胞表面受體或轉染劑包被；包裹在微粒或微囊體中；與已知可進入細胞核的肽連接使用；與要進行受體介導的胞吞作用的配體連接使用[見，如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262(1987)4429-4432](可用於特異地表達受體的靶細胞類型)；等。在一個特殊的實施例中，化合物或組合物可被遞送在一個囊泡中，特別是脂質體中[見Langer，Science249(1990)1527-1533；Treat等人，1989，脂質體在感染性疾病和癌症的治療中，Lopez-Berestein和Fidler(主編)，Liss，New York，353-365頁；Lopez-Berestein，同上，317-327頁]。
在某些實施例中，發明的載體用脂類或細胞表面受體或轉染劑包被，或連接於已知可進入細胞核的同源框樣肽[見，如Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)1864-1868]，等。
在某些其他的實施例中，形成核酸-配體複合體，其中配體含有一個fusogenic病毒肽以破壞內涵體，使核酸避免溶酶體的降解。
還是在另一個實施例中，發明的載體通過靶向特異受體而在體內被靶向細胞的特異攝取和表達(見，如PCT申請WO92/06 180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188，和WO93/20221)。
用於發明的方法包括但不限於，皮內，肌肉內，腹膜內，靜脈內，皮下，鼻內，硬膜下，和口服途徑。用於發明的方法進一步包括通過任何方便的途徑給藥，例如通過輸注或快速注射，通過穿過上皮或黏膜皮膚連接的吸收(如，口腔黏膜，直腸和腸黏膜等)。在一個特殊的實施例中，需要將發明的載體通過注射，通過導管，通過栓劑，或通過植入體來應用，所述的植入體由多孔的，無孔的或凝膠材料組成，包括膜，如sialastic膜，或纖維。注意必須使用載體不吸收的材料。給藥可以是全身性的或局部的。
在某些實施例中，發明的一種載體與其他的生物活性劑如化學治療劑或增強免疫系統的藥劑一起使用。
還是在另一個實施例中，用於發明的方法包括經一種可控釋放系統的遞送。在一個實施例中，可使用一種泵[見Langer，見前；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14(1989)201；Buch-wald等人，Surgery 88(1980)507；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321(1989)574]。在另一個實施例中，可使用聚合材料[見可控釋放的醫學應用，1974，Langer和Wise(主編)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida；可控藥物的生物利用度，藥物產品設計和性能，1984，Smolen和Ball(主編)，Wiley，New York；Ranger和Peppas，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23(1983)61；也見Levy等人，Science 228(1985)190；During等人，Ann.Neurol.25(1989)351；Howard等人，J.Neurosurg.71(1989)105]。
其他可控釋放系統的討論見Langer的綜述，Science 249(1990)1527-1533。
發明的藥物組合物含有治療有效量的發明載體和一種合適的藥物運載體。在一個特殊的實施例中，術語「合適的藥物運載體」的含義是由聯邦或州政府的管理機構批准的或列於美國藥典或其他廣泛被藥典公認可用於動物，更特別用於人的物質。術語「運載體」是指稀釋劑，佐劑，賦形劑或給予治療藥物的運載體。這種合適的藥物運載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油，動物，植物或合成來源的油，如花生油，豆油，礦物油，麻油和類似物。當藥物組合物靜脈給藥時，水是優選的運載體。鹽水溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可用作液體運載體，特別是作為可注射的溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，大米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，乾燥的脫脂奶，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇和類似物。如果需要，組合物也含有最小量的溼潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可採取溶液，懸液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊，散劑，持續釋放劑型的形式和類似物。組合物被製成為栓劑，含有傳統的粘合劑，以及如三甘油三酯的運載體。口服劑型可含有標準的運載體如藥物級的D-甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。合適的藥物運載體的實例描述在E.W.Martin的「雷明頓藥物科學」。這些組合物將含有治療有效量的發明核酸，優選以純化的形式，與合適量的載體一起為患者提供給藥的恰當形式。製劑劑型應該符合給藥的方式。
在一個特殊的實施例中，發明的藥物根據常規的步驟被製成為一種可適合靜脈內給予人類的藥物組合物。典型地，靜脈給藥的組合物是無菌等滲緩衝的水溶液。當需要時，發明的藥物也包括一種溶解劑，和一種局部麻醉劑如利多卡因以緩解注射部位的疼痛。通常，各種成分可單獨提供或以單位藥劑的形式混合在一起，例如凍幹的粉末或在密封容器中的無水濃縮物，如安瓿，或顯示活性劑量的sachette。當發明的藥劑通過輸注給藥時，它可用含有藥物級水或鹽水的輸液瓶來配製。當發明的藥物通過注射給藥時，提供了一安瓿注射用水或鹽水以便各種成分再給藥前被混合在一起。
為含服給藥，組合物可採取以常規方法製成的片劑或錠劑形式。
為吸入給藥，根據本發明使用的化合物可方便地以噴霧劑形式從氣溶膠包裝或噴霧器中噴出而遞送，使用合適的推進劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。就加壓氣溶膠來說，可通過設置一個閥門來釋放計量的劑量而確定用藥單位。用在吸入器或吹入器中的例如明膠的膠囊和藥筒可製成含有化合物和合適的粉末基質如乳糖或澱粉的混合粉末製劑。
在治療或預防適應症疾病中會有效的發明載體的量，可通過標準的臨床技術來確定。另外，可選擇性的使用體外實驗來幫助確定最佳的劑量範圍。要在製劑中應用的準確劑量也依賴於給藥的途徑，適應症疾病的程度，並應該根據臨床醫生的判斷和每個患者的情況而定。有效的劑量可從體外或動物模型檢測系統得到的劑量反應曲線中推導出來。
本發明可能通過參考下列非限制性的實例而更好地被理解，它們被提供作為發明的範例。下面的實例是為了更充分地舉例說明發明的優選實施例。但它們絕不能被解釋為要限制本發明的廣闊範圍。
6.實例6.1.實例1載體super6和super6wt的克隆和表達特性分析載體質粒super6(圖1)和super6wt分別從前一代為基礎的基因接種載體VI(圖2)和VIwt製備。載體VI和VIwt主要是合成的細菌質粒，含有來自卡那黴素抗性標記物基因的一個轉座子Tn903[Oka，A.等人，JMol Biol 147(1981)217-226]和需要在大腸桿菌細胞中繁殖的pMB1複製子的一種修飾形式[Yanisch-Perron，C.等人，Gene 33(1985)103-119]。載體VI和VIwt也含有與HSV1 TK引導序列和兔β-球蛋白基因序列組合在一起的巨細胞病毒極早期啟動子，它們都來自質粒pCG[Tanaka，M.等人，60(1990)Cell 375-386]。後面的元件是從來自HIV-1菌株HAN2隔離群的nef編碼序列中表達所需要的[Sauermann，U.，等人，AIDSResearch.Hum.Retrov.6(1990)813-823]。Nef表達載體攜帶成簇的十個高親合性E2結合位點(來自質粒pUC1910BS，未公開)，正好在CMV啟動子上遊。
母載體VI含有修飾的E2編碼序列E2鉸鏈區(胺基酸192-311)被來自EB病毒EBNA1蛋白的四個甘氨酸-丙氨酸重複區置換[Baer，R.J.等人，Nature 310(1984)207-211]。由這條序列編碼的蛋白命名為E2d192-311+4G。母載體VIwt含有具有點突變的1型牛乳頭狀瘤病毒野生型E2蛋白的一個表達基因盒，該點突變通過兩個終止密碼子被導入E3和E4 ORF中以消除這些開放閱讀框(ORF)的編碼能力。在載體中，E2編碼序列被克隆在羅斯肉瘤病毒前病毒5′LTR[Long，E.O.等人，Hum.Immunol.31(1991)229-235]和牛生長激素聚腺苷醯區[Chesnut，J.D.，et al.，J Immunol Methods 193(1996)17-27]。
質粒載體super6和super6wt的構建是通過從各自的母載體VI和VIwt中刪除除兔β-球蛋白基因的第二個內含子以外的所有nef基因下遊的β-球蛋白序列。β-球蛋白序列(特別是外顯子片段)顯示與人β-球蛋白基因中的序列具有一些同源性，而內含子卻缺少與人基因組序列任何明顯的同源性。內含子使用具有一些錯配的寡核苷酸通過PCR從質粒pCG中擴增[Tanaka，M.等人，Cell 60(1990)375-386]以修飾內含子的剪接供體和受體位點與共有的基序完全匹配。來自pHook的1型單純皰疹病毒胸苷激酶基因聚腺苷醯區[Chesnut，J.D.等人，J ImmunolMethods 193(1996)17-27]然後被克隆緊靠內含子3』末端，因為在母載體中可使用兔β-球蛋白聚腺苷醯信號。
通過使用Nef和E2的單克隆抗體進行的Western印跡分析由質粒載體super6和super6wt表達的Nef和E2蛋白的表達特性，並與由VI和VIwt表達的Nef和E2蛋白的表達特性比較[Towbin等人，Proc NatlAcad Sci USA 76(1979)4350-4354]。首先，Jurkat細胞(一種人T細胞成淋巴細胞系)通過電穿孔使用1μg super6，super6WT或等克分子量的質粒VI，VIwt轉染[Ustav等人，EMBO J 2(1991)449-457]。可使用等克分子量的載體II(圖3)作為對照，它含有一個相同的Nef基因盒，但沒有E2編碼序列。運載體DNA可用作陰性對照。簡言之，質粒和運載體DNA與細胞懸液在0.4cm電穿孔試管中被混合(BioRadLabo-ratories，Hercules，USA)，然後使用具有電容擴充器(BioRadLaboratories，Hercules，USA)的基因脈衝儀IITM進行電脈衝(200V；1mF)。
轉染後49小時，細胞用含有50mM Tris-HCl pH6.8；2％SDS，0.1％溴酚藍，100mM二硫蘇糖醇，和10％(v/v)甘油的標本緩衝液處理而被裂解。裂解物在10％或12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝膠上泳動，隨後轉移至一張0.45μmPVDF硝化纖維膜(Millipore)上。膜首先用含有5％脫脂奶(無脂肪)，50mM Tris-HCl pH7.5中0.1％Tween 20；150mM NaCl的阻斷溶液阻斷過夜，然後與稀釋的單克隆抗Nef抗血清(1∶100)或抗E2抗血清(1∶1000)在阻斷溶液中孵育1小時。在每個孵育步驟後，通過用TBS-0.1％Tween-20衝洗條帶3次去除未結合蛋白。最初免疫球蛋白結合的檢測是通過將條帶與辣根過氧化物酶交聯的抗鼠IgG(Labas，Estonia)進行孵育，然後採用一種化學發光檢測系統來顯色(AmershamPharmacia Biotech，United Kingdom)。
結果在圖4中顯示。Nef蛋白的表達在板A顯示，E2蛋白的表達在板B上顯示。箭頭表示Nef和E2蛋白的正確分子大小。E2d192-311+4GA的表達水平非常低，因此在圖4中顯示的印跡中未見。
從質粒super6，super6wt，VI和VIwt表達的Nef的量(圖4A中1-4道)是相當相似的(圖4，板A，1至4道)。從質粒II(5道)中產生更少的蛋白。Nef蛋白的表達水平高於含有wtE2的載體(參照，1道與2道比較，3道和4道比較)。這是根據來自這些質粒的E2和E2d192-311+4GA蛋白的表達水平(圖4，板B)。
6.2.實例2在系列產物1和NNV中克隆和分析質粒的表達特性為了增加大腸桿菌中載體super6和super6wt的拷貝數，在這些載體中進行了進一步修飾。Tn903卡那黴素抗性基因，pMB1複製子和十個E2結合位點通過HindIII/Nhe1消化被去除，然後用逆轉錄酶病毒載體pBabe Neo的HindIII/Nhe1片段置換[Morgenstern，J.P.和Land，H.，Nucteic Acids Research 18(1990)3587-3596]。這個片段含有修飾的pMB1複製子和Tn5卡那黴素抗性基因，可在細菌中對質粒進行不嚴格的高拷貝數複製。新的質粒分別命名為產物1(圖5)，產物1wt。重新將十個E2結合位點插回至產物1的CMV啟動子上遊的鈍端Nhe1位點中不成功的結果是分別產生了新的載體NNV，僅有兩個結合位點被整合進質粒中。
另外十個E2結合位點從質粒pUC1910BS中被插入至新的載體中，剛好在E2表達基因盒的下遊。這些新的載體命名為NNV-1和NNV-2(圖6A)。為了用wtE2置換E2d192-311+4GA(刪除了E3和E4ORF)，含有Bsp1201片段的E2d192-311+4GA編碼序列被含有來自super6wt的類似Bsp1201片段的wtE2置換。產生的質粒分別命名為NNV-1wt和NNV-2wt(圖6B)。NNV系列的載體中數字1或2標記了相對E2表達基因盒的10個E2結合位點區域的方向。
來自NNV質粒的Nef蛋白，即NNV-1，NNV-2，NNVwt和NNV-2wt的表達特性，在通過電穿孔在1ig質粒的濃度下轉染Jurkat細胞後，進行分析，並通過Western印跡基本上與如實例1中所描述的與來自super6和super6wt的Nef蛋白的表達特性進行比較。用來轉染的Super6和super6wt的量分別為0.95和1ig。結果在圖7中顯示。
NNV-1和NNV-2載體與質粒super6相似的可能性在圖8的泳道1和2與泳道5的比較中是很明顯的。這個結果同樣適用於載體NNV-1wt，NNV-2wt和super6wt(泳道3和4與圖7中泳道6比較)。根據以前的結果，表達wtE2的質粒較E2d192-311+4GA載體產生更多的Nef蛋白(在圖7中泳道1和泳道3，泳道2與泳道4比較)。由此可見，並因為來自NNV-2wt的Nef表達稍高於NNV-1wt，載體NNV-2wt可選擇進行進一步的檢測。
6.3實例3NNV-2wt的表達特性分析為了分析NNV-2wt的表達特性，4種不同的細胞系即Jurkat(人T細胞淋巴母細胞)、P815(小鼠肥大細胞瘤細胞)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)系和RD(人胚胎橫紋肌肉瘤細胞)，通過電穿孔被轉染，並分析它們Nef和E2的表達。為了顯示由E2蛋白和E2寡聚化結合位點介導的轉錄激活和維持特性，缺少E2結合位點(圖5)的產物1wt被用作對照。另外的對照質粒是質粒NNV-2wtFS，它與NNV-2wt的不同是在E2編碼序列中有導入的移碼，因此它不表達功能性E2蛋白。
每個細胞系基本上通過實例1中所述的電穿孔用不同量的載體DNA被轉染。大約轉染後2天和5天測定時間點。分析的結果在圖8至10中顯示。
Jurkat細胞用0.5μg或2μg NNV-2wt(圖8中泳道1，2，8，和9)，等量的質粒NNV-2wtFS(圖8中泳道3，4，10，和11)和產物1wt(圖8中泳道5，6，12，和13)或僅用運載體(圖8中泳道7和14)轉染。轉染後44小時(泳道1-7)和114小時(泳道8-14)測定時間點Nef和E2蛋白的表達基本上如實例1中所述的Western印跡來分析。
P815細胞用0.5μg或2μg NNV-2wt(圖9中泳道1，2，8，和9)，等量的質粒NNV-2wtFS(圖9中泳道3，4，10，和11)和產物1wt(圖9中泳道5，6，12，和13)或僅用運載體(圖9中的泳道7和14)轉染。轉染後45小時(泳道1-7)和119小時(泳道8-14)測定時間點Nef蛋白的表達基本上用實例1中所述的Western印跡來分析。轉染後119小時使用抗E2抗體的印跡未顯示，因為沒有檢測到特異的信號。通常，在這些細胞中與E2蛋白表達水平相關的Nef蛋白表達水平，證實了這樣的事實，E2蛋白的功能是激活轉錄，輔助質粒在增殖的細胞中維持一段更長的時間。
CHO細胞用0.5μg或2μgNNV-2wt(圖10中的泳道1，2，8和9)和等量的質粒NNV-2wtFS(圖10中的泳道3，4，10，和11)和產物1wt(圖10中的泳道5，6，12和13)或僅用運載體(圖10中的泳道7和14)轉染。轉染後48小時(泳道1-7)和114小時(泳道8-14)測定時間點。Nef和E2蛋白的表達基本上如實例1中所述的Western印跡分析。
RD細胞用0.5μg或2μg NNV-2wt(圖11中的泳道1，2，8和9)和等量的質粒NNV-2wtFS(圖11中的泳道3，4，10和11)和產物1wt(圖11中的泳道5，6，12和13)或僅用運載體(圖11中的泳道7和14)轉染。轉染後39小時(泳道1-7)和110小時(泳道8-14)測定時間點。Nef的表達水平基本上如實例中所述的Western印跡來分析。
在所有四種細胞系中，在NNV-2wt較早的時間點(圖8-11中的泳道1-7)和較晚的時間點(圖8-11中的泳道8-14)測定的Nef蛋白表達水平高於對照質粒。從圖8中泳道8和泳道10和12的比較，也從圖8，9和10中的泳道9與泳道11和13的比較中很顯然，NNV-2wt的優勢在更晚的時間點上更為明顯。
對於NNV-2wt載體，這些質粒的RNA表達模式也可採用Northern分析法來分析[Alwine，J.C，等人，Proc Natl Acad Sci USA 74(1977)5350-5354]。為此目的，Jurkat和CHO細胞用2μg NNV-2wt轉染。為了轉染P815細胞，使用10μg NNV-2wt。基本上如實例1中所述進行轉染。轉染後48小時，採用RNAeasy試劑盒(Qiagen)提取總RNA，含有21μg(P815)，15μg(CHO)或10μg(Jurkat)RNA的標本在變性條件(含有20mM MOPS pH7.0；2mM NaOAc；1mM EDTA pH8.0；2.2M甲醛的1.3％瓊脂糖凝膠)下通過電泳進行分析。電泳緩衝液含有除甲醛以外的相同成分。樣品載入含有甲醯胺和甲醛的緩衝液中。電泳後，分離的RNA點樣至HybondN+膜(Amersham Pharmacia Biotech，UnitedKingtom)上，與放射標記的nef編碼序列，E2編碼序列或整個載體探針雜交。用運載體轉染的細胞的RNA作為對照。Northern印跡分析的結果在圖12中顯示。
結果表明，沒有互補mRNA以外的其他RNA種類從載體中表達，因為與nef和E2特異雜交(圖12中泳道1-12與泳道13-18相比)相比用整個載體探針檢測沒有其他的信號。
6.4實例4分析NNV-2wt與有絲分裂染色體的附著
CHO細胞中NNV-2wt與有絲分裂染色體的附著通過原位雜交螢光(FISH)來分析[Tucker J.D.等人，見J.E.Celis(主編)，細胞生物學實驗室手冊，2卷，450-458頁。Academic Press，Inc.New York，NY.1994.]。
在用1μg NNV-2wt或用等摩爾量的對照質粒NNV-2wtFS和產物1wt(基本上如實例1中所述進行)通過電穿孔轉染後36小時，培養物用秋水仙素(Gibco)處理以阻滯處於有絲分裂中期的細胞。簡言之，細胞與加入至培養基中終濃度為0.1μg/ml的秋水仙素接觸1-4小時以阻斷細胞周期於有絲分裂期。被阻斷的細胞通過胰蛋白酶處理後被回收，懸浮在0.075M KCl溶液中，在室溫下孵育15分鐘，固定在冰冷的甲醇冰醋酸(3∶1，體積/體積)中。為了進行原位雜交分析，分裂中期展開的染色體和分裂間期的核通過將細胞懸液滴落在溼載玻片上而被製備。從一個培養物中製備幾個載玻片。
雜交探針通過缺口翻譯產生，使用生物素-16-dUTP作為標記，質粒產物1wt作為模板。一個典型的缺口翻譯反應混合物包含缺口翻譯緩衝液，未標記的dNTP，生物素-16-dUTP，和大腸桿菌DNA聚合酶。
染色體製劑在70℃ 70％甲醯胺(pH7.0-7.3)中變性5分鐘，然後立即在一系列漂洗中脫水(70％，80％，和96％冰冷的乙醇漂洗，每次3分鐘)，和風乾。雜交混合物(18μl每個載玻片)由2×SSC中的50％甲醯胺(1×SSC為0.15M NaCl加0.015M枸櫞酸鈉)，10％糖酐酯，150ng生物素標記質粒探針DNA和10μg鯡精運載體DNA組成。在70℃變性5分鐘後，探針DNA用於每個載玻片上，固定在一個蓋玻片下，37℃在溼盒中雜交過夜。45℃漂洗載玻片，3次更換2×SSC，nd 2×SSC含有0.1％IGEPAL CA-630(Sigma Chemical Co.)。在免疫螢光檢測前，載玻片在PNM(含有5％脫脂奶粉和0.02％疊氮化鈉的緩衝液[PN緩衝液(1升水中有25.2g Na2HPO4□7H2O，0.83g NaH2PO4·_□H2O和0.6ml IGEPAL CA-630])中預孵育5分鐘。
之後，用異硫氰酸螢光素(FITC)結合的extravidin檢測探針。信號用生物素標記的抗親和素抗體和第二輪的extravidin-FITC處理來放大。在每個步驟之間，載玻片在含有0.05％IGEPAL CA-630的PN緩衝液中室溫下漂洗2×5分鐘。染色體用亞丙基復染，在p-苯二胺antifade封固劑中被封固。
載玻片用安裝有合適濾鏡裝置的Olympus VANOX-S螢光顯微鏡下進行分析。
結果在表1中顯示。
表1.NNV-2wt的染色體附著
數據清晰表明E2蛋白及其結合位點是染色體附著所需的，因為僅NNV-2wt有而其他兩種載體沒有這種能力。
6.5實例5細菌細胞增殖過程中NNV-2wt的穩定性檢測了在細菌細胞增殖過程中NNV-2wt的穩定性。質粒NNV-2wt與感受態大腸桿菌細胞DH5α菌株混合[如Inoue，H.等人，Gene 96(1990)23-28所述製備]，在冰上孵育30分鐘。隨後，細胞懸液37℃熱休克3分鐘，緊接著在冰上迅速冷卻。1毫升LB培養基加入至標本中，混合物在37℃孵育45分鐘並猛烈振搖。最後，一部分細胞接種在含有LB培養基和50μg/ml卡那黴素的培養皿中。第二天，來自單個集落中的細胞被轉移至含有相同培養基的新培養皿中。重複這個步驟直至已經生長了四代細菌，分析來自每代集落的質粒DNA。
每代的一個集落用來接種在含有50μg/ml的2ml LB培養基中，然後在37℃猛烈振搖孵育過夜。收穫細胞，用典型地煮沸裂解從細胞中提取質粒DNA。[Sambrook，S.等人，分子克隆，實驗室手冊。第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York]。標本用限制性內切酶Xba1(Fermentas，Lithuania)消化，用瓊脂糖凝膠電泳分析，育用來轉化的原始DNA比較。結果在圖13中顯示。
如在圖13中所見，載體在大腸桿菌細胞傳代過程中是穩定的與用來轉化的DNA相比，沒有觀察到發生重排的集落(泳道9)。
6.6實例6NNV-2wt在真核細胞中的穩定性作為非複製的游離基因元件的質粒NNV-2wt的穩定性也在真核細胞中被分析。為此目的，CHO和Jurkat細胞用2μg NNV-2wt轉染。細胞的總DNA在轉染後24，72或96小時被提取。簡言之，細胞在20mMTris-HCl pH8.0；10mM EDTA pH8.0；100mM NaCl；0.2％SDS中；在200μg/ml蛋白酶K(Fermentas，Lithuania)的存在下被裂解。下一步，標本依次用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉澱。核酸重新懸浮在10mMTris-HCl pH8.0；1mM EDTA pH8.0；20μg/ml RNase A(Fermentas，Lithuania)中，在37℃孵育1小時。最後DNA用醋酸銨和乙醇再沉澱，用70％漂洗，重新懸浮在10mM Tris-HCl pH8.0；1mM EDTA pH8.0中。標本用不同的限制性內切酶消化用在質粒上具有兩個識別位點的Eco811(Fermentas，Lithuania)，用不能切斷NNV-2wt DNA的Hind111(Fermentas，Lithuania)，和用僅能消化在大腸桿菌細胞中合成的DNA的Dpn1(New England Biolabs，USA)。限制性DNA在TAE瓊脂糖電泳中被分離，使用一個載體特異的放射標記探針通過Southern印跡分析[Southern，E.M.J.Mol.Biol.98(1975)503-517]。結果在圖14中圖解。Eco811消化的片段大小(圖14中的泳道1，2和7)分別和標記物泳道相比很明顯，在測定中沒有檢測到載體的排列。在Hind III(圖14中的泳道3，4和8)或Hind111/Dpn1(圖14中的泳道5，6和9)消化的情況下，在不同於標記物泳道的位置上沒有觀察到信號，表明沒有觀察到整合和/或複製反應。
6.7實例7在存在人乳頭狀瘤病毒複製因子的情況下分析NNV-2wt的複製以前已經證明乳頭狀瘤病毒蛋白能夠啟動來自其他許多人和動物乳頭狀瘤病毒的含異種ori質粒的複製[Chiang，C.M.等人，Proc NatlAcad Sci USA 89(1992)5799-5803]。儘管NNV-2wt不含有完整的複製起始點，但檢測到在1型人乳頭狀瘤病毒E1和E2蛋白的存在下複製是如何啟動的。CHO細胞用1mg載體NNV-2wt，NNV-2wtFS或產物1單獨或與4.5μg HPV-11 E1表達載體pMT/E1 HPV11或與相同量的pMT/E1 HPV11和4.5μg HPV-11 E2蛋白表達載體pMT/E2 HPV11一起轉染，如圖15上部所示。轉染基本上如實例1中所述進行。E1和E2表達載體在以前被描述過(Chiang，C.M.等人，見前)。含有質粒HPV110RI的等摩爾量的HPV-11複製起始點用相同的表達載體轉染作為一個陽性對照。
低分子量DNA通過改良的Hirt裂解在轉染後67小時被提取[Ustav等人，EMBO J 2(1991)449-457]。簡言之，用PBS漂洗的細胞在冰上以1∶2的比例向皿中加入鹼性裂解液I(50mM葡萄糖；25mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA，pH8.0)和II(0.2M NaOH；1％SDS)裂解5分鐘。裂解物用0.5體積溶液III(醋酸鉀和醋酸的混合物，鉀為3M，醋酸為5M)中和。離心後，上清液用異丙醇沉澱，重新懸浮和在55℃孵育在20mM Tris-HCl pH8.0；10mM EDTA pH8.0；100mM NaCl；0.2％SDS中；在200μg/ml蛋白酶K(Fermentas，Lithuania)的存在下。下一步，標本依次用苯酚和氯仿提取，然後用乙醇沉澱。核酸重新懸浮在10mMTris-HCl pH8.0；1mM EDTA pH8.0；20μg/ml RNase A(Fermentas，Lithuania)中，並在65℃孵育30分鐘。標本用線性化核酸內切酶(對載體是Nde1(Fermentas，Lithuania)；或對HPV110R1是Hind111(Fermentas，Lithuania))和Dpn1(New England Biolabs，USA)消化(斷裂非複製的DNA)，然後基本上如前面所述使用載體特異的放射標記探針進行Southern印跡分析。對於雜交的陽性對照，可使用線性化載體和HPV11OR1的合適標記物(圖15中泳道標記為M)。如在圖15中所示結果所見，在任何載體質粒的情況下未檢測到複製信號。
6.8實例8分析分裂細胞中E2及其結合位點依賴的載體隔離功能如在前面已經描述的，反式的牛乳頭狀瘤病毒1型E2蛋白和其順式的多結合位點都是必需的，足以進行游離基因基因元件的染色質附著。這種現象被認為在分裂細胞中病毒感染的過程中提供了分隔病毒基因組的機制[IIves，I.等人，J Virol.73(1999)4404-4412]。因為兩種功能元件也包含在我們的載體系統中，本研究的目的是分析在分裂細胞群中維持轉錄活性載體元件的E2蛋白和寡聚化結合位點的重要性。
為此目的，載體NNV-2wt和superGwt的Nef編碼序列被來自載體pd1 EGFP-N1(Clontech Laborato-ries)的綠螢光蛋白(d1 EGFP)的不穩定形式的編碼序列置換。因為這種蛋白的半衰期很短，只有1小時，它不能在細胞中積累，通過流式細胞儀檢測到的d1 EGFP表達與這些細胞中存在的轉錄活性載體有關。
從NNV-2wt中nef編碼序列被去除，來自pd1EGF-N1的Sma1-Not1片段被插入而替代它。新的載體命名為2wtd1EGFP(圖16)。相似的置換發生在super6wt中，分別產生gf1Obse2(圖17)。限制性核酸內切酶Spe1的識別序列被導入至正好在十個E2BS上遊的super6wt中的EcoRI位點中。載體gf1 Obse2來自這個載體中，通過將含有Nde1-Bst11071片段的Nef編碼序列置換為含有來自2wtd1EGFP的片段的d1 EGFP編碼序列，用相同的酶切斷。
也製備缺乏功能性E2編碼序列或其結合位點的陰性對照質粒。在2wtd1 EGFP中通過將含有Bsp1201-Bsp1201的E2編碼序列用來自質粒NNV-2wtFS的相似片段置換，移碼被導入進E2編碼序列中。得到的載體命名為2wtd1EGFPFS(圖18)。為了構建對照質粒NNVd1 EGFP(圖19)，來自2wtd1 EGFP的整個E2表達盒(以及細菌複製子)通過Bst1107和Nhe1的消化被去除。複製子從質粒產物1中作為HindIII(填入)-Nhe1片段被再構建。
Jurkat細胞如實例1所述通過電穿孔用1μg載體2wtd1EGFP或等克分子量的質粒2wtd1EGFPFS，NNVd1EGFP，gf1Obse2或僅用運載體DNA轉染。在轉染後不同的時間點，等分的細胞懸液被收集來分析，此後標本用新鮮的培養基稀釋。在每個時間點，細胞的總數以及d1EGFP表達細胞的數量通過流式細胞(Becton-Dickinson FACSCaliburSystem)來計數。根據這些數據，使用僅用運載體轉染細胞作為背景螢光的陰性對照，計算d1EGFP表達細胞的百分比，標本中細胞總數和d1EGFP表達細胞數目的變化。計算細胞數目要考慮所進行的稀釋。最後，根據細胞計數儀關於流速波動的技術資料來計算誤差值。
進行兩個獨立的試驗。首先，在轉染後第8天分析從質粒2wtd1EGFP，2wtd1EGFPFS和NNVd1EGFP表達的d1EGFP的維持性。在第二個試驗中，在轉染後第13天分析來自質粒2wtd1EGFP，2wtd1EGFPFS和gf1Obse2表達的d1EGFP的維持性。
如在圖20和21中很明顯地，用任何載體或僅用運載體轉染的細胞的生長速度沒有差異。這意味著d1EGFP表達維持性的差異並不是由被轉染載體本身對細胞分裂的影響所引起的。也在檢測過程中，檢測到細胞的對數生長，除了直至圖20中顯示實驗中第二個時間點的時間周期以外。生長的這個滯後時間可能是由於細胞的電穿孔休克引起的，因為第一個時間點是在轉染後已經19小時採樣的。
如在圖22和23中所圖解的，表達綠螢光蛋白的百分比在用每種質粒轉染的所有細胞群中均減少，因為載體在細胞中不能複製。但在圖表中可見，如果與2wtd1EGFP或gf10bse2相比，在對照載體中陽性細胞的部分下降更迅速。如果互相比較，gf10bse2明顯優於2wtd1EGFP(圖23)。在對照質粒2wtFSd1EGFP和NNVd1EGFP之間的維持性也具有顯著的差異(圖22)。
如果數據表示為細胞群中d1EGFP表達細胞數目的變化，載體的這些差異更為明顯(圖24和25)。在檢測過程中對照質粒陽性細胞的數目沒有明顯地改變。相比，使用2wtd1EGFP時，表達d1EGFP細胞的數目在轉染後第一周內增加，比對照標本大約高5至10倍(圖24)。在此時間點後，數目開始降低(圖25)。使用gf10bse2載體時維持性的差異是最強地。在分析的時間內陽性細胞的數目持續增加。兩周後它較2wtd1 EGFP轉染的標本高6倍，較移碼突變體轉染的細胞群高45倍(圖25)。
數據清晰的表明本發明的載體系統具有一種以核錨著蛋白為基礎的隔離的活性機制，即可促進其在增殖的細胞群中維持的牛乳頭狀瘤病毒1型E2蛋白及其結合位點作為一個轉錄活性元件。
6.9實例9克隆AIRE基因進入SUPER6WT並在上皮細胞系中表達編碼AIRE(AIRE＝自體免疫調節劑)蛋白的AIRE基因在常染色體遺傳症候群APECED(自體免疫性多內分泌腺疾病念珠菌病外胚層營養障礙)中是被突變的。AIRE表達在胸腺髓質的少量上皮細胞中，和外周血和外周淋巴器官的樹突狀細胞中。因此APECED的治療可通過將未突變的AIRE基因體外轉移至外周血樹突狀細胞中，然後將糾正的樹突狀細胞回輸給患者。為了檢測這種可能性，人AIRE基因和同源鼠AIRE基因轉移至COS-1細胞。
為了將AIRE基因克隆進Super6wt中，製備載體的maxi-製劑。首先根據生產廠商的方案Super6wt的轉染在TOP10細胞(Invitrogen的化學感受態大腸桿菌)中完成。簡言之，細胞在冰上孵育30分鐘，之後在+42℃的水浴中30秒進行熱休克。然後細胞直接轉移至冰上2分鐘，在250μl SOC培養基(2％胰蛋白腖，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)中生長，+37℃振搖1小時。
平板接種在LB板上完成，使用卡那黴素(50μg/ml)選擇。對於maxiprep，集落轉移至含有卡那黴素(50μg/ml)的150ml LB溶液中，+37℃生長過夜並振搖。Maxiprep製劑使用Qiagen′s質粒Maxi試劑盒根據生產廠商的方案來完成。
BamHI和Sa11制性酶的消化用來檢查載體。反應混合物在10μl的總體積中含有500ng Super6w，5U BamHI，5U Sa11，2μl 2XTANGO緩衝液(限制性酶和緩衝液均來自Fermentas)和無菌水。消化在+37℃進行1小時。
被消化的載體用1X TAE緩衝液中的1μg/ml溴乙啡啶在1％瓊脂糖凝膠上檢查。
為了將PCR擴增的AIRE基因和Aire基因片段克隆進Super6wt中，4μg Super6wt用10U Not1限制性酶(MB1 Fermentas，在2μl酶緩衝液中，加入無菌水至終體積20μl)消化。消化在+37℃進行1.5小時，之後1U ZIP酶(鹼性磷酸酶)加入至反應混合物中繼續孵育30分鐘。完成ZIP酶的處理通過防止載體自我連接，復原為環狀形式，從而加速AIRE基因向載體中的插入作用。消化後載體用GFXTM PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)純化，並溶解為0.2微克/微升的濃度。
人和鼠AIRE基因PCR產物也用Not1限制性酶消化。26μl PCR產物，3μl合適的酶緩衝液和10U Not1限制性酶(緩衝液和酶來自MB1Fermentas)用於消化。消化在+37℃進行2小時，之後消化的PCR產物被純化，溶解在無菌水中至10μl的體積。
PCR擴增和消化的人和鼠AIRE基因通過T4 DNA連接酶(MBIFermentas)連接於Super6wt。取出消化的插入DNA(總體積為10μl)，加入1.5μl連接酶緩衝液(MBI Fermentas)，5U T4 DNA連接酶和無菌水至終體積15μl。連接反應在+17℃反應過夜。
連接反應後，取出10μl連接反應混合物根據生產廠商的方案轉染進TOP10細胞中。細胞在冰上孵育30分鐘，之後在+42℃水浴30秒進行熱休克。然後細胞直接轉移至冰上2分鐘，生長在250μl SOC培養基(2％胰蛋白腖，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)中，+37℃振搖1小時。
轉染的細菌細胞被接種至LB卡那黴素平板中，第二天挑選集落至2ml含有卡那黴素的LB培養基(1％胰蛋白腖，0.5％酵母提取物，170mM NaCl)中，+37℃生長過夜。
來自選擇集落的Miniprep DNA製劑用Qiagen′s質粒Mini試劑盒純化，溶解在50μl體積的無菌水中。插入物的存在和大小用Not1和BamHI消化來檢查。取出10μl miniprep DNA來消化，加入5U Not1和5UBamHI酶，2ml R+酶緩衝液和無菌水至終體積20μl。消化在+37℃進行1小時。
插入的方向用BamHI限制性酶來分析。取出10μl minprep DNA，加入5U BamH1，2μl BamHI緩衝液(MBI Fermentas)和無菌水至終體積20μl。消化在+37℃進行1小時，產物用1XTAE中的EtBr在1％瓊脂糖凝膠上檢查。
根據這些結果，含有鼠AIRE基因的質粒和含有人AIRE基因的質粒被挑選出來，製備maxipreps。簡言之，含有目的質粒的0.5ml大腸桿菌細胞懸液或miniprep培養物加入至含有卡那黴素(50μg/ml)的150ml LB培養基中，在+37℃生長過夜。Maxiprep DNA採用Qiagen’s質粒Maxi試劑盒製備。
含有鼠AIRE基因的質粒被指定為pS6wtmAIRE，含有人AIRE基因的質粒指定為pS6wthAIRE。
產生的載體從兩個末端測序大約500bp以確認插入物的法向和正確性。測序採用雙脫氧法用PE Biosystem′s Big Dye Terminator RR-mix進行，它含有用不同螢光標記物標記的四個不同的連接雙脫氧核苷酸三磷酸鹽。
含有AIRE基因和AIRE基因片段的質粒被插入至選擇的細胞系中，轉染後用Western印跡來檢查蛋白的表達。
Cos-1細胞用胰蛋白酶-EDTA(Bio Whittaker Europe)溶液收穫，以10×106細胞/ml懸浮在Dulbecco′s MEM(LifeTechnotogies)培養基中，取出250μl細胞懸液進行轉染。Cos-1細胞的轉染採用電穿孔使用2.5×106細胞，50μg鮭精DNA作為運載體和5μg合適的載體來進行。轉染用pS6wthAIRE，pS6wtmAIRE，Super6wt，pCAIRE，psiAIRE和pCAIRES1-4來進行。pCAIRE和psiAIRE是陽性的人AIRE對照，pCAIRE S1-4是陽性的鼠AIRE對照，Super6wt是陰性對照。
電穿孔採用Biorad′s基因脈衝儀使用電容960μFd，240V和1次脈衝來完成。脈衝後，細胞在室溫下保留10分鐘，加入400μl培養基。細胞轉移至5ml培養基中，在1000rpm離心5分鐘。細胞被平板接種，在+37℃，5％CO2生長3天。
細胞用胰蛋白酶-EDTA收穫並離心。然後細胞用500ml 1XPBS(0.14mM NaCl，2.7mM KCl，7.9μM Na2HPO4，1.5μM KH2PO4)衝洗一次。加入50μl PBS和100μl SDS加樣緩衝液(5％巰基乙醇，16μM溴酚藍，20μM二甲苯藍，1.6μM Fi-coll 400)，細胞在+95℃加熱10分鐘。
為了進行western印跡分析，在SDS電泳緩衝液(25mM Tris，250mM glysin，0.1％SDS)中用10％分離和5％成層膠製備SDS-PAGE。細胞標本和生物素化分子量標記物加樣在膠上，在150V進行電泳1小時50分鐘。用轉移緩衝液中的冷卻器，100V室溫下1.5小時，將蛋白轉移到硝化纖維膜上。
膜在5％奶的TBS(0.05M Tris-Cl，0.15M NaCl，pH7.5)液中室溫阻斷30分鐘。一抗混合物，以1∶100的稀釋度在5％奶的TBS液中的抗AIRE6.1(人)和抗AIRE8.1(鼠)抗體加至膜上，在+4℃孵育過夜。膜用0.1％Tween的TBS液5分鐘衝洗兩次，一次用TBS衝洗5分鐘。二抗，以1∶500的稀釋度在5％奶的TBS液中的生物素化抗鼠IgG室溫孵育1小時。衝洗膜，加入以1∶1000的稀釋度在5％奶的TBS液中的辣根過氧化物酶親和素D。膜在室溫下孵育1小時，並衝洗。過氧化物酶的底物用5ml氯萘酚，20ml TBS和10μl過氧化氫來製備，並加至膜上。顯色後用TBS衝洗膜並乾燥。
人AIRE的檢測抗體(抗anti-AIRE6.1)在用pS6wthAIRE，pCAIRE和psiAIRE轉染的標本中檢測到AIRE蛋白的表達。鼠AIRE檢測抗體在用pS6wtmAIRE和pCA1RE S1-4轉染的細胞中同樣也檢測到鼠AIRE。陰性對照(Super6wt)顯示沒有AIRE/aire蛋白。
6.10實例10在用NNV-NEF構建物免疫的小鼠中檢測對HIV.1NEF的細胞和體液免疫反應DNA免疫法為了研究發明載體體液免疫的誘導作用，使用5-8周齡的雄性和雌性BALB/c(H-2d)小鼠。為了進行DNA免疫，小鼠用1.2mg戊巴比妥(腹腔內注射)，使用DNA包被的金顆粒在剃毛的腹部皮膚上接種DNA。用Helios基因槍(Bio-Rad)採用300psi的壓力進行接種。金顆粒直徑為1μm，～1μg DNA/盒。小鼠用0，4或8μg/鼠的DNA總量免疫小鼠兩次(在0天和第7天)。對照小鼠用沒有nef基因，即NNV-δnef的8μg普通載體免疫。
最後一次免疫後兩周從小鼠的尾部獲取血標本。在最後一次免疫後4周處死小鼠，血標本(100μl)收集至含有10μl 0.5M blotting(++vs.+)的Eppendorf管中，在ELISA(更高的OD)中，較多更高劑量的小鼠超過EDTA截止點。從這些每隻鼠的標本中計算血白細胞的絕對數/ml。收集血清進行抗體測定，儲存在-20℃。無菌條件下去除脾臟，稱重，然後混勻為單細胞懸液，用於T，B和NK細胞測定和染色。
檢測發明載體的體液免疫原性為了通過Western印跡檢測Nef特異抗體，用發明的載體構建物免疫的小鼠的血清標本以1∶100稀釋在5％奶的TBS液中，用於重組HIV-1 Nef蛋白製備的硝化纖維條上。為了製備硝化纖維條，純化的重組蛋白在含有1％SDS和1％2-巰基乙醇的標本緩衝液中煮沸，然後在10或12.5％聚丙烯醯胺凝膠上電泳，隨後轉移至0.45μm硝化纖維紙上。條帶首先用2％BSA在5％脫脂奶-TBS中被阻斷，然後用稀釋的血清(1∶100)孵育過夜。孵育後，未結合的蛋白通過用TBS-0.05％Tween-20衝洗條帶3次，用水衝洗兩次而去除。衝洗後，條帶用1∶500稀釋的生物素化抗鼠IgG(Vector Laboratories，USA)探測2小時。進一步衝洗後，加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶-親和素(VectorLaboratories，USA)1小時，再次衝洗條帶，用過氧化氫酶底物4-氯-1-萘酚(Sigma，USA)檢測結合的抗體。
血清也在ELISA中檢測以確定由每種構建物誘導的準確的抗體效價。Nef抗體ELISA如以前所述(Thtinen等人，2001)進行。簡言之，Nunc Maxi Sorp平板用50ng Nef(isolate HAN)包被，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的2％BSA阻斷，1∶100至1∶25000稀釋度的血清加入至相似的孔中，孵育過夜。大量衝洗後，加入二抗，過氧化物酶結合的抗鼠IgG或IgM(DAKO)，平板孵育2小時，然後衝洗。磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中底物(2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸，ABTS，Sigma)產生的顏色強度使用Labsys-tems Multiscan Plus ELISA-平板讀數器在405nm測定。陽性抗體反應的光學密度截止值如下測定截止值＝OD(x1 對照鼠血清)+3 SD.
檢測發明載體細胞免疫原性為了分析發明載體誘導細胞免疫的能力，進行T細胞和B細胞檢測乙基細胞表面的染色。
T細胞增殖測定。脾細胞被懸浮在終濃度1×106/ml添加了10％FCS(GibcoBRL)，1％青黴素-鏈黴素(GibcoBRL)和50μM β-巰基乙醇(Sigma)的RPMI-1640(GibcoBRL)中。細胞孵育在微量滴定板中，200μl/孔僅加入培養基或不同的刺激物。刺激物的終濃度為刀豆凝集素A5μg/ml，HIV-Nef-蛋白，濃度為1和10μg/ml，和陰性對照抗原HIV-gag濃度為1和10μg/ml。所有反應進行四次。在孵育的第六天，每孔收集100μl上清液，儲存在-80℃進行細胞因子測定。在收穫前6小時，向每孔中加入1μCi3H-胸苷(Amersham Pharmacia Biotech)。收穫細胞，在閃爍掃描計數器中測定摻入的放射活性(cpm)。如下計算刺激指數(S1)S1＝平均測定cpm/平均培養基cpm.
淋巴細胞活化。T和B細胞活化用抗CD3-FITC加抗CD69-PE(早期活化標記物)和抗CD19-FITC加抗CD69-PE抗體(所有來自Pharmingen)通過新鮮脾細胞的雙重表面染色而檢測。染色用流式細胞儀(FACScan，Becton Dickinson)分析。
CTL測定。鼠脾細胞與固定的抗原遞呈細胞(用MVA-HIV-nef或對照MVA-F6感染的P-815細胞)共培養5天，之後在標準的4小時51鉻釋放試驗中測定[Hiserodt，J.等人，J Immunol 135(1995)53-59；Lagranderie，M.等人，J Vi-rol 71(1997)2303-2309)MVA-HIV-nef感染的或對照靶細胞。在CTL測定中特異性溶解10％或更多被認為是陽性的。
細胞因子測定。為了分析是否小鼠發生了Th1型或Th2反應，從抗原刺激的細胞培養上清液中測定IFN-γ和IL-10。如上所述從抗原刺激的細胞中收集上清液。原炎性細胞因子TNF-α和IL-10在免疫的小鼠血清中被測定。用市售的ELISA試劑盒(Quantikine，RD Systems)測定所有的細胞因子。
自發的增殖。自發的脾細胞增殖通過在培養基中培養的細胞對3H-胸苷的攝取僅測定6天。
抗雙鏈(ds)DNA抗體。在免疫小鼠，陽性對照小鼠(mrl/lpr，Dr.GeneShearer惠贈，NIH，USA)和正常小鼠的血清中測定dsDNA抗體。抗體在多聚L-賴氨酸結合的λ噬菌體dsDNA上用ELISA檢測。結果在表2和3中顯示。
表2顯示了用HIV-Nef質粒DNA免疫的小鼠的全部免疫學結果。儘管用來體外T細胞刺激的HIV-1 Nef重組蛋白可在每個免疫組中誘導細胞的一些非HIV-特異性增殖。在用0.4μg質粒(均數SI＝72.2)免疫小鼠的均數SI與其他相比明顯增加。而且，陰性對照蛋白HIV-gag不能誘導任何T細胞反應。僅有在具有nef特異性增殖的組中小鼠的T細胞也產生nef特異性的IFN-γ。沒有免疫的小鼠有產生IL-10的細胞，顯示在免疫小鼠中的T細胞反應是Th1型，不是Th2型。與T細胞反應相比，用較高濃度nef質粒DNA(8μg)免疫的小鼠與用0.4μg免疫的小鼠相比具有較強的B細胞反應用更高劑量免疫的小鼠中的體液反應在最後一次免疫後3周已經可以檢測到，但兩者在Western印跡中檢測到的反應都較強。檢測到的抗體屬於IgG類型，未檢測到IgM反應。沒有小鼠產生E2特異抗體。
用0.4μg HIV-nef質粒DNA免疫的小鼠與其它組的免疫小鼠和正常小鼠(3.8×106/ml)相比外周血中白細胞的數目是增加的(6.38×106/ml)(表3)。與其它小鼠(9％和10％)相比，同樣的小鼠具有兩倍的活化T細胞(21％，CD3+CD69+)。這種結果與對HIV-Nef的陽性T細胞反應有關係(表2)，因為具有對Nef有陽性T細胞反應的小鼠在其脾臟中活化T細胞的數目也是增加的。表3的結果也顯示與陽性對照血清(OD＝1,208)相比沒有免疫小鼠形成抗dsDNA抗體，表明免疫沒有副作用。
表2小鼠HIV-1 HIV-1 IFN-g IL-10 HIV-1 E2nefgag nefSI*SI Th1Th2Ab AbNNV-Nef81 6 1 - - ++ -2 8 1 - - ++ -3 13 2 - - ++ -4 15 1 - - ++ -5 7 1 - - ++ -均數9.81.2NNV-NEF0.41 24 1 + - + -2 1121 + - + -3 83 1 + - + -4 73 1 + - + -5 69 1 + - +均數72.2 1NNV-ΔNef81 6 1 - - - -2 nt nt - - - -3 11 1 - - - -4 23 2 - - - -5 12 1 - - - -均數13 1.25
*SI＝刺激指數 nt＝未檢測到-′，陰性+′，陽性+′+′，強陽性表3Mice WBCCD3 CD3+CD69+ CD19 CD19+CD69+ 抗dsDNA％％ ％％ 抗體×106/ml 脾脾 脾脾 OD(1∶10稀釋度)NM10.35520.25530.231均數 0.280NNV-Nef81 5 ntnt ntnt 0.3872 4.3504 113 0.4573 4.9574 154 0.5144 4.3556 154 0.3675 5.1545 7 0 0.478均數 4.72 544.75(9％) 122.750.441NNV-Nef0.41 3.9ntnt ntnt 0.4182 8 419 185 0.2633 7.5398 259 0.3754 5 469 166 0.2855 7.54310 137 0.396均數 6.38 42.25 9(21％)186.750.347NNV-ΔNef81 4.5614 9 2 0.4132 4.6594 151 0.3533 3.8506 175 0.3824 3.1467 258 0.4485 3.5ntnt ntnt 0.501均數 3.9545.25(10％) 16.5 4 0.419
正常小鼠的平均WBC＝3.8×106/ml.
nt，未檢測到a-dsDNA陽性對照血清OD為1.208(1∶10稀釋度)6.11.實例11在HIV感染患者中原型HIV疫苗GTU-NEF的安全性和免疫原性NNV-2-Nef疫苗的生產(檢查是否使用NNV-2或NNVwt-2)以生產許可號第LLDnro 756/30/2000(由Finnish National Agencyfor Medicines在21.12.2000公布)根據實例2製備研究性疫苗NNV-2-Nef。
生產過程完全符合現行藥品優良製造規範(cGMP)的要求，提供了適合用於臨床I期和II期研究的質粒DNA製劑。生產過程包括四個步驟a)建立母細胞庫和工程細胞庫b)發酵c)純化d)無菌充填疫苗詳細來說，NNV-2-Nef從大腸桿菌細菌中產生。根據特殊標準操作規範從純培養和發布的研究細胞庫中建立含有大腸桿菌DH5αT1噬菌體抵抗細胞株的母細胞庫(MCBs)和工程細胞庫(WCBs)。
a)建立母細胞庫和工程細胞庫建立細胞庫系統的示意步驟如下被圖解說明復甦一瓶用NNV-2-Nef質粒轉化的研究細胞庫[大腸桿菌DH5αT1噬菌體抵抗細胞株(Gibco RBL)。
接種培養物在限制性Luria Bertani培養基-平板(含有25μg/ml卡那黴素)中37℃孵育過夜(14-16h)。
從平板中選擇單個集落，接種至50ml限制性Luria Bertani培養基(含有25μg/ml卡那黴素)中37℃孵育過夜(14-16h)
測量細菌培養物的光密度(OD600＝2.0-6.0)向細菌培養物中添加甘油將培養物-甘油混合物分成等分標記和儲存母細胞庫在相同的圖表之後，使用一瓶母細胞庫作為起始物質建立工程細胞庫。對MCB和WCB進行的常規檢測為微生物特性，沒有汙染，通過影印培養法評價質粒的穩定性和質粒的特性(限制性酶消化和測序)。
b)發酵。在發酵中，用NNV-2-Nef(WCB)轉化的DH5αT1噬菌體抵抗大腸桿菌株(Gibco RBL，UK)首先培養在平板上。在發酵反應器中實際發酵前，從平板中單個集落接種在100ml液體預培養中。在5L發酵罐(B.Braun Medical)中以批次進料系統為基礎進行發酵，之後收穫細胞。1升培養基組合物含有7g酵母提取物，8g來自大豆粉的蛋白腖，10g NaCl，800ml注射用水(WFI)，1N NaOH，pH7.0，卡那黴素50mg/ml(Sigma)，矽除泡劑(Merck)，1M K2PO4(Bio Whittaker)。
在發酵運轉的開始，通過採樣管獲取1ml標本，測定最初的細胞密度(OD600)。預培養用來接種發酵培養基。在發酵過程中，新鮮的培養基和1M鉀磷酸鹽緩衝液，pH6.5-7.3，被用泵加料進反應器中。培養基的添加可在被消耗前補充基本營養素，磷酸鹽緩衝液可維持pH含量。當發酵過程持續大約5小時，在發酵作用結束(大約發酵10小時後)時，如上取出1ml標本，測定細胞密度。發酵後，培養基被離心(10,000rpm，30分鐘，+4℃)，細菌團塊(50-60g)被回收。
c)純化。用於純化DNA的方法學根據QIAGEN加工規模技術(Qiagen質粒純化手冊11/98)。NN2-Nef採用下列的步驟純化將細菌團塊再懸浮在重懸浮緩衝液(100-150ml，RT)中用裂解緩衝液(100-150ml，5分鐘，RT)裂解用中和緩衝液(100-150ml，+4℃)中和孵育(30分鐘，+4℃)離心(10,000rpm，30分鐘，+4℃)過濾上清液(0.22微米)用內毒素清除緩衝液(60-90ml)去掉內毒素用平衡緩衝液(350ml，流速10ml/min)平衡超純柱將裂解物裝填至柱上(流速4-6ml/min)用衝洗緩衝液衝洗柱(3L，過夜，流速4-6ml/min)用洗脫緩衝液洗脫質粒DNA(400ml，流速3.1ml/min)過濾洗脫液(0.22微米)用異丙醇沉澱DNA離心(20000g，30分鐘，4℃)純化的質粒DNA用在純化中的緩衝液如下。再懸浮緩衝液含有50mM Tris-Cl，pH8.0，加RNase A(50mg)；裂解緩衝液為200mM NaOH；中和緩衝液為3M醋酸鉀，pH5.5；內毒素清除緩衝液含有750mM NaCl，10％Triton X-100；50mM MOPS，pH7.0；平衡緩衝液含有750mM NaCl，50mM MOPS，pH7.0；衝洗緩衝液含有1M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％異丙醇；和洗脫緩衝液含有1.6M NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％異丙醇。
d)無菌充填代表終料的純化DNA溶解在0.9％無菌生理鹽水中，終濃度為1mg/ml，當天無菌過濾(0.22微米)。純化的料是人工充填(充填體積0.5ml)於使用蒸汽滅菌Finnpipette和無菌無內毒素管口的Schott 1+型玻璃瓶中。充填NN2-Nef疫苗的瓶子立即被封閉，標記，根據特殊標準操作規範(SOP)包裝。
2.給予患者檢測的疫苗接受高活性抗逆轉錄酶病毒治療(HAART)的十個HIV-1感染患者用表達HIV-1Nef基因(Clade B)的試驗性DNA疫苗NN2-Nef免疫。為了免疫，隔兩周給予臀肌兩次肌內注射。劑量為1和20微克/次注射。血標本在-4，0，1，2，4，8和12周採集。分析標本的體液(ELISA，Western印跡)和細胞介導的免疫反應(T細胞亞群，T細胞增殖，ELISPOT，細胞因子表達，細胞內細胞因子)。
對參與研究的每個患者進行臨床檢查。臨床檢查包括患者問診(既往史)和測量體重。心肺功能通過聽診和叩診來檢查，記錄血壓和心率。淋巴結，肝和甲狀腺的增大通過觸診確定。
對每個訪診者進行評價疫苗安全性的實驗室檢查。這些檢查包括
血液學計算紅血細胞計數，血紅蛋白，白細胞總數和分類，血小板計數，凝血酶原時間和位於基線水平的活化的部分凝血酶原激酶時間；平均紅細胞體積和血紅蛋白含量。
免疫學核和ds-DNA抗體。
血清化學總膽紅素，鹼性磷酸酶，SGOT/SLT或SGPT/ALT，血清肌酐，蛋白電泳，總血清膽固醇，甘油三酸酯。葡萄糖(基線水平)，鈉，鉀和鈣。
尿分析量標蛋白，葡萄糖，酮，潛血，膽色素，pH，比重和尿沉澱物的顯微鏡檢查(RBC，WBC，上皮細胞，細菌，管型)，當量標檢測顯示有一種或多種異常值時。
病毒負載增加超過1個對數10值應該在2周後進行確定性病毒負載測定。
沒有患者對疫苗接種產生自覺或他覺的不良反應。在接種時期內重複進行的臨床化學實驗記錄表(詳見材料和方法)中未觀察到不良的實驗室異常。
進行下列的免疫學研究淋巴細胞增殖試驗(LPA)外周血單核細胞(PBMC)通過Ficoll-Hypaque密度梯度(Pharmacia)離心從肝素化的靜脈血中分離，在添加5％備用的熱滅活AB+血清(Sigma)、抗生素(100U/ml青黴素和100μg/ml；鏈黴素；Gibco)和L-穀氨醯胺(完全培養基，CM)的RPMI 1640培養基(Gibco)中重懸浮為1×106細胞/ml。然後在瓶底微量滴定板中建立四重培養(1×105PBMC/孔)，細胞在存在或缺少以下刺激物的情況下孵育6天rNef(0.2，1和5μg/ml)，GST(0.2，1和5μg/ml)，結核菌素的純化蛋白衍生物(PPD，12.5μg/ml；Statens Seruminstitut)，白色念珠菌抗原(20μg/ml；GreerLaboratories)和植物血球凝集素(PHA；5μg/ml；Life Technologies)。孵育期的最後6小時，向培養物中加入3H-胸苷(1μCi/孔；Amersham)，收穫細胞至玻璃纖維濾膜上，在γ-計數儀上測量摻入的放射活性。結果表示為δcpm(抗原存在時的cpm-沒有抗原時的cpm)或刺激指數(存在抗原時的cpm/沒有抗原時的cpm)。
結果顯示於圖26和27中。在疫苗接種前，沒有一個疫苗接種者顯示對待測抗原，HIV-1 Nef抗原顯示明顯的T細胞增殖反應。相對比，接受1微克劑量待測疫苗組5個疫苗接種者中的2個(患者1和3)(圖26)和接受20微克待測疫苗組5個中的2個(患者9和10)(圖27)顯示在首次疫苗接種後發生很強的T細胞增殖反應。第二次接種後，1微克組中的1個疫苗接種者(患者2)發生反應。
IFN-γ測定疫苗誘導免疫反應的類型(Th1/Th2)通過測定抗原(rNef，rGST，PPD)或有絲分裂原(PHA)刺激PBMC後6天陳舊的培養上清液中釋放的γ-幹擾素(IFN-γ)進行評價。為了進行測定，使用市售的ELISA試劑盒(RDQuantikine)。測定使用定量夾心酶免疫測定技術，其中IFN-γ特異的單克隆抗體已經被包被在微量板上。標準品和標本被移至孔中，固定的抗體可結合任何存在的IFN-γ。在洗掉任何未結合的物質後，IFN-γ的酶聯多克隆特異抗體加入至孔中。在衝洗去掉任何未結合的抗體-酶試劑後，底物溶液加入至孔中，根據最初步驟中結合的細胞因子的量成比例的顯色。終止顯色，測量顏色的密度。
#1患者的IFN-γ反應數據顯示於圖28。如所見到的，對rNef抗原反應的疫苗接種者，其顯著的IFN-γ反應與T細胞增殖有關，表明在接種者中見到的反應事實上是TH1型。
HIV-1感染的特點是較低的或總體上缺少對所有HIV蛋白的細胞介導免疫反應。結果顯示在這些患者中使用異常低劑量的DNA疫苗NN2-Nef可能誘導強烈的CMI。使用的劑量對通常DNA疫苗所需的劑量來說是最小的。因此，例如Merch宣稱最近他們的試驗性HIV疫苗獲得了良好的結果，但需要的劑量從1000至5000微克(1AV1報導，2002)。
6.12實例12構建表達EB病毒(EBV)EBNA-1蛋白並含有EBNA-1(FR元件)20個結合位點的質粒為了構建表達EB病毒(EBV)EBNA-1蛋白和含有EBNA-1(FRelement)的20個結合位點的質粒，BPV-1 E2結合位點首先用EBVEBNA-1結合位點(oriP沒有DS元件)置換。質粒FRE2d1EGFP(圖29)的構建通過隔離pEBO LPP質粒(圖29A)的Xmi(Acc1/Eco321(EcoRV)DNA片段(鈍末端具有Klenow酶)(片段含有EBNA-1的20個結合位點)，通過鈍末端連接作用將其插入進s6E2d1EGFP(圖29B)(鈍末端具有Klenow酶)Spe1/Nhe1位點中。在進一步的試驗中構建的質粒FRE2d1EGFP(圖29)被用作陰性對照。它含有EBNA-1蛋白的結合位點，代替了BPV1 E2 10結合位點，表達E2，但不表達EBNA-1。
下一步，在FRE2d1EGFP質粒中編碼BPV-1 E2蛋白的序列被如下編碼EBV EBNA-1蛋白的序列置換。pEBO LPP質粒的Xmi(Acc1)/EcoRI片段被隔離，鈍末端具有Klenow酶，被插入進FRE2d1EGFP質粒(鈍端連接Klenow酶)的Xba1/Xba1位點中。載體FRE2d1EGFP以前生長在缺少Dam甲基化的大腸桿菌菌株DH5α中，因為一個Xba1位點對甲基化是敏感的。構建的質粒FREBNAd1EGFP(圖30)表達EBNA-1蛋白，含有EBNA-1的20個結合位點。
為了表達，Jurkat、人胚胎腎細胞系293(ATCC CRL 1573)和鼠成纖維細胞系3T6細胞(ATCC CCL 96)被維持生長在添加了10％胎牛血清(FCS)的Iscove′s限制性Dulbecco′s培養基(IMDM)中。4百萬個細胞(Jurkat)，75％匯合的培養皿(293)或的75％匯合培養皿(3T6)用來進行每一次轉染，轉染如下通過電穿孔進行。細胞通過離心收穫(1000rpm，5分鐘，20℃，Jouan CR 422)，重新懸浮在含有5mM Na-BES緩衝液(pH7.5)的完全培養基中。250μl細胞懸液的細胞與50μg運載體DNA(鮭精DNA)和1μg(在Jurkat和3T6的情況下)或5μg(在293的情況下)質粒DNA混合，Jurkat細胞在200V和1000μF下電穿孔，293細胞在170V和950μF，3T6細胞在230V和975μF。轉染的Jurkat細胞接種在6-cm皿中，其中含有5ml培養基；1/3轉染的293和3T6細胞接種在6-cm皿中，其中含有5ml培養基；2/3的細胞接種在10-cm皿中，其中含有10ml培養基。
轉染的細胞被分析d1EGFP蛋白(修飾的增強綠螢光蛋白)的表達。所有構建的質粒表達d1EGFP蛋白，通過使用流式細胞儀測量螢光而進行檢測。因為d1EGFP蛋白的半衰期很短，因此它不能積累，這種蛋白的表達反應了細胞中存在轉錄活性質粒。使用Becton-Dickinson FACSCalibur系統。Jurkat細胞懸液的體積在每個時間點前被測量(大約每24個小時後)，如果體積小於5ml，添加損失體積的培養基。根據細胞懸液的密度，取出適當體積進行測定(1或2ml)，添加相同量的培養基。以後當計算稀釋度時要考慮這一點。
對於第一個時間點，6cm皿的293細胞懸浮在5ml培養基中進行測定。在以後的每一個時間點中，從10cm皿中取出一半細胞，懸浮在5ml培養基中，然後進行測定。適當體積被加入至細胞懸液的剩餘部分中。對於第一個時間點，6cm皿的3T6細胞懸浮在1ml胰蛋白酶中，然後用100μl FCS滅活。對於此後的每個時間點，10cm皿的細胞懸浮在2ml胰蛋白酶中。1ml這種懸液如前所述被處理。加入9ml培養基至懸液的剩餘部分。在測定前被分析的細胞立即從孵箱中取出。在每個時間點前確定適當的流速(500-1000細胞/秒)，使用僅以運載體DNA轉染的細胞作為對照。使用三個不同的參數來測定細胞的大小，表面結構和螢光。
結果在圖31中以圖表顯示。僅用運載體DNA轉染的細胞用來測量細胞系的自發螢光。1％這種自發螢光被認為是背景螢光，此後從d1EGFP螢光中減去。接收到的數據採用Microsoft Excel程序分析。
表達d1EGFP細胞的百分比的計算，是使用僅用運載體轉染的細胞作為背景螢光的陰性對照。如在圖33中所示，兩個載體以不同的動力學被維持在細胞中。
表達d1EGFP細胞的數目的計算，要考慮稀釋度，使用僅用運載體轉染的細胞作為背景螢光的陰性對照。如在圖53中所示，表達EBNA-1和攜帶EBNA-1特異的多聚結合位點的質粒非常有效地被維持在被轉染的細胞中。轉染後第一天，大約8×104細胞表達EGFP。在第8天，在維持的載體(FREBNAd1EGFP)中，表達質粒陽性d1EGFP細胞的數目增加10倍至8×105。缺少EBNA-1表達(FRE2d1 EGFP)的質粒或沒有EBNA-1結合位點，質粒陽性細胞的數目仍然可以保持，或在許多情況下減少。這個事實反映了隔離/分隔EB病毒的機制。如果EBNA-1被表達，質粒攜帶了EBNA-1的結合位點，EBNA1和EBNA-1結合位點產生的維持和隔離功能對質粒提供了維持的功能。相同的機制和相同的成分實際上為EB病毒在生活周期的隱藏期提供了隔離功能。
相似的結果也在人胚胎細胞系293中和鼠細胞系3T6(圖34)中獲得。作為293和3T6細胞維持性的對照，分別使用s6HPV11和2wtFS。
6.13實例13GTU-多基因載體的免疫原性GTU-1-多基因載體的免疫原性在實例12中製備的6個不同的多基因疫苗構建物，即GTU-1-RNT，GTU-1-TRN，GTU-1-RNT-CTL，GTU-1-TRN-CTL，GTU-1-TRN-optgag-CTL，和GTU-1-TRN-CTL-optgag載體的免疫原性在小鼠中被檢測。載體被轉化進TOP10或DHSα細胞中，採用市售的Qiagen柱來製備MegaPreps。用Pierce內毒素清除凝膠去掉內毒素。
根據生產廠商(Bio-Rad)的說明書稍加修改，將待測微粒包被在1μm金顆粒上。Balb/c小鼠用Helios基因槍使用400psi的壓力和0.5mg金/盒的量被免疫。小鼠在周0，1和3被免疫3次。小鼠在最後一次免疫後兩周被處死。
小鼠被分為6個檢測組(5隻鼠/組)，如下接受3×1μg DNAGroup1.GTU-1-RNTGroup2.GTU-1-TRNGroup3.GTU-1-RNT-CTLGroup4.GTU-1-TRN-CTLGroup5.GTU-1-TRN-optgag-CTLGroup6.GTU-1-TRN-CTL-optgagGroup7.對照小鼠，用不裝填DNA的空金顆粒免疫每隻鼠的尾血標本進行體液反應。首次免疫前從麻醉鼠中取出首次免疫前的標本。在第三次免疫前從麻醉鼠中取出第二個標本。處死時，全血標本用來進行白細胞計數，收集血清進行體液免疫性測定。
使用標準方法用ELISA檢測血標本中的抗體。Nunc Maxi Sorp板用100ng Nef，Rev，Tat，Gag，CTL或E2蛋白包被，阻斷，向相同的孔中加入稀釋度為1∶100的血清過夜孵育。衝洗後，用稀釋(1∶500)的二抗，過氧化物酶交聯的抗鼠IgG(DAKO)孵育板2小時。從磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液中的底物(2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)產生的顏色強度在405nm使用Lab systems ELISA-平板讀數儀進行測量。
所有在載體在所有小鼠中均誘導Nef抗體，而沒有小鼠顯示有E2，CTL或Rev抗體(圖35，36和表4)。一些用GTU-1-RNT或GTU-1-RNT-CTL免疫的小鼠也產生Tat抗體(圖36和表4)。而且，用含有optgag序列的載體免疫的小鼠也產生Gag抗體，但構建物GTU-1-TRN-optgag-CTL是較構建物GTU-1-TRN-CTL-optgag更好的一種抗體誘導劑(圖37和表4)。抗體主要誘導IgG1類，表明是通常在採用基因槍免疫所見的一種Th2型反應。下面顯示的抗體測定是當小鼠被處死時收集的血清中進行。
結果顯示多基因構建物，可表達幾種HIV基因成為融合蛋白，能誘導對大多數基因產物的免疫反應。但基因在多基因和相應蛋白在融合蛋白中的方向和順序可極大地影響結果。因此，僅當Tat基因被置於融合蛋白一側(具有RNT基序的載體)時可見對Tat的反應，而不是當Tat為氨基末端蛋白(具有TRN基序的載體)時。對Gag蛋白的反應僅見於使用載體時，其中Gag置於含有Th分支和CTL抗原決定簇的CTL之前。
表4
6.14.實例14表達NEF、REV和TAT的雜合蛋白在不同組合物中的表達(多調控)為了產生HIV多基因載體，具有多克隆位點的GTU-1載體(圖38A)用作主鏈。完整的Nef，Rev和Tat編碼序列通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，並相互以不同的順序附著在多調控(multireg)抗原編碼可讀框(Nef-Tat-Rev，Tat-Rev-Nef，Rev-Tat-Nef，Tat-Nef-Rev和Rev-Nef-Tat；分別為序列Id.No.1至5)上。序列被克隆至GTU-1載體的Bsp1191和Not1位點上。
相似地，表達GTU-2和GTU-3載體的Nef蛋白(圖38B和38C；NNV-2wt也見圖6B)也用作產生HIV多基因載體的主鏈。另外，表達增強的綠螢光蛋白或d1EGFP的載體super6wt(super6wt d1 EGFP；圖17和圖38D)和使用EBNA-1蛋白的質粒及其結合位點(FREBNAd1EGFP；圖38E)用作基因傳遞單位(GTU)的平臺。為了控制「非-GTU」載體，表達Rev的適當的巨細胞病毒(CMV)載體NNV-Rev和含有d1EGFP質粒的質粒EBNA-1和E2BS(分別為NNV-Rev和E2BSEBNAd1EGFP；圖38G和F)用作主鏈。
為了製備不同的GTU-2和GTU-3載體(pNRT，pTRN，pRTN，pTNR和pRNT；和p2TRN和p2RNT；和p3RNT，分別為圖39A-E，39F-G和39H)，載體GTI-2Nef和GTU-3Nef中的Nef基因分別被多調控抗原使用Nde1和Pag1位點取代。字母N(ef)，R(ev)和T(at)的序列在名稱上顯示了各自蛋白編碼序列在多基因中的位置。也製備兩個載體，含有置入Salt位點的IRES元件，跟隨在多抗原或E2編碼序列後(分別為pTRN-iE2-GMCSF和pTRN-iMG-GMCSF；圖391和J)。後面的序列，控制鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)編碼序列的翻譯，與IRES一起被克隆進單個BspTI位點中。
另外，一組載體，其中僅有調控蛋白的免疫顯性部分用來構成聚合蛋白，它們被克隆進GTU-1(pMVINTR，pMV2NTR，pMV-1NHTR和pMV2N11TR；圖40A-D)的Bsp1191和Not1位點中。在pMV2構建物的情況下，可被細胞內蛋白酶消化的連接子可分隔來自不同調控蛋白的多抗原的區域。
進一步製備GTU-1，GTU-2和GTU-3載體，它們表達由gag基因編碼的結構蛋白或由前述CTL抗原決定簇組成的人工聚合蛋白。編碼的序列如Bsp119I和Not1消化的PCR產物被克隆進GTU-1載體(pCTL＝BNmCTL，pdgag＝pBNdgag，psynp17/24＝pBNsynp17+24，poptp17/24＝pBNoptp17/24；Figures 41A-D)中，在Nde1-Pac1片段中被轉移至GTU-2(p2mCTL和p2optp17/24；圖41E和F)和GTU-3(p3mCTL和p3optp17/24；圖41G和H)中。
被稱為CTL(序列Id.No.10)的編碼片段含有來自涉及許多以前鑑定的CTL抗原決定簇的pol和env區的片段。優化密碼子選擇以便僅涉及在人細胞中頻繁使用的密碼子。這種編碼序列也含有可用於效力檢測的被詳細定性的鼠CTL抗原決定簇，和一個被抗鼠CD43抗體識別的抗原決定簇。還包括顯性優勢的SIV p27抗原決定簇以用於獼猴的效力研究。
dgag含有Han2隔離體gag區的截斷p17(在13aa起始)+p24+p2+p7(p1和p6除外)(序列Id.No.11)。synp17/24(序列Id.NO.12)編碼Han2 HIV-1的p17+p24多肽。在人細胞中密碼子選擇被修飾為最佳。以前鑑定的富含AU的RNA不穩定元件也通過這種方式被去除。optp17/24編碼(序列Id.NO.13)區非常類似於synp17/24，例外的是在此造成的兩個同義突變不改變蛋白組成，但去掉了一個潛在的剪接受體位點。
進一步建立了一組多HIV載體，含有多調控抗原和結構性抗原如單個聚合蛋白pTRN-CTL，pRNT-CTL，pTRN-dgag，pTRN-CTL-dgag，pRNT-CTL-dgag，pTRN-dgag-CTL，pRNT-dgag-CTL，pTRN-optp-17/24-CTL，pTRN-CTL-optp17/24，和pRNT-CTL-optp17/24；p2TRN-optp17/24-CTL，p2RNT-optp17/24-CTL，p2TRN-CTL-optp17/24，p2RNT-CTL-optp17/24，p2TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF，和p2RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF；和p3TRN-CTL-optp17/24，p3RNT-CTL-optp17/24，p3TRN-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF，和p3RNT-CTL-optp17/24-iE2-mGMCSF，圖42A-T。
為了克隆，作為第一個步驟，終止密碼子從調控多抗原編碼序列中去除。然後結構性抗原編碼序列通過克隆加入至框末端的Not1位點中以重構Not1位點。如果CTL和gag都被加入，第一個抗原編碼序列不含有終止密碼子。通常，在GTU-1的情況下進行克隆，以便分別製備GTU-2(p2…)和GTU-3(p3…)載體，使用Nde1和PagI的位點質粒GTU-2Nef和GTU-2Nef中的Nef基因被置換。但RNT-optp17/24-CTL抗原被直接構建進GTU-2載體中。
使用Eco-1051和Not1的位點(super6wt-RNT-CTL-optp17/24和FREBNA-RNT-CTL-optp17/24；分別見圖43V和42U)，HIV多抗原被克隆進載體super6wtd1EGFP和FREBNAd1EGFP，而不是dtEGFP。如果指定，IRES和鼠mGM-CSF被克隆進GTU-2和GTU-3載體中，位於E2編碼序列之後，進入來自pTRN-iE2-mGMCSF(使用相同的限制性酶切斷)的位點Mph11031和Eco911中。
最後，對於應用EBNA-1的系統(含有EBNA-1，具有E2結合位點的表達基因盒)，「非GTU」對照載體E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24(圖42W)用如FREBNA-RNT-CTL-optp-17/24相同的方式製備。常規的表達多HIV抗原(圖42D)的CMV載體pCMV-RNT-CTL-optp17/24的製備通過使用Nde1和PagI的位點從各自的GTU-1載體中克隆多HIV編碼片段。
6.15.實例15僅攜帶調控蛋白免疫顯性區的多調控抗原的表達特性1.多調控抗原的細胞內定位由發明的載體所表示的多調控抗原的細胞內定位通過使用基本上如實例4中所述的Nef，Rev和Tat蛋白的單克隆抗體在RD細胞中的原位免疫螢光來研究。結果總結在表5中，在圖45中進行圖解。由完整的Nef，Rev和Tat蛋白組成的所有抗原顯示在細胞漿中的唯一定位。最初設計的變體蛋白稱為N(ef)T(at)R(ev)，在Rev序列前具有移碼，顯示僅有核定位。攜帶調控蛋白截斷序列的多調控抗原定位在細胞漿中。在這種情況下，經常可觀察到象「包涵體」的明顯結構。這種情況也同樣發生在攜帶從pMV2載體中表達的蛋白酶位點的抗原中。但在這些情況下也檢測到核中的蛋白(圖45)。
表5.多調控抗原中的細胞內定位構建物 抗-Nef 抗-Rev 抗-Tat空 陰性陰性陰性GTU-1pTRN胞漿內強染色胞漿內較好的染色胞漿內陽性染色pNTR核中強染色 陰性染色核中陽性染色pRNT胞漿內強染色胞漿內良好染色 胞漿內良好染色pNRT強，胞漿胞漿內良好染色 胞漿內良好染色pRTN強，胞漿胞漿內良好染色 胞漿內陽性染色pTNR強，胞漿胞漿內良好染色 胞漿內良好染色pMV1NTR 強胞漿內細胞漿+包涵體 細胞漿+包涵體pMV1N11TR 強 細胞漿+包涵體 細胞漿+包涵體pMV2NTR 核中和胞漿中的包涵體核中和胞漿中的包涵體 核中和胞漿中的包涵體pMV2N11TR 在核和胞漿中僅有包涵體 核和胞漿中僅有包涵體 核和胞漿中僅有包涵體dgag和p17+p24蛋白的細胞內定位也在RD細胞中通過免疫螢光用單克隆抗p24抗體進行分析。根據Jurkat細胞中的Western印跡結果，不能檢測到-dgag。但p17/24蛋白顯示定位在漿膜上(圖45)。CTL蛋白的定位未顯示，因為沒有合適的抗體可用。
6.2實例15從POL分析編碼重組GAG抗原和細胞毒性T細胞抗原決定簇(CTL)的載體6.2.1.表達通過Western印跡分析表達CTL cds的載體或來自gag區的蛋白的表。如在圖46A和46B中所示，CTL和dgag表達很清晰的在Cos-7細胞中被證實為預測大小的蛋白(分別為25kD和47kD)。Nef，Rev和Tat的共轉染明顯增強了dgag蛋白的表達。我們將其解釋為REV蛋白對GAG mRNA表達的作用結果。我們也試圖在Jurkat細胞中從GTU-1載體中表達dgag蛋白，但我們沒能檢測到任何信號(圖46C)。密碼子選擇的分析顯示對於人細胞wt GAG序列沒有最佳的密碼子選擇。當最優化密碼子選擇時(構建物psynp17/24和poptp17/24)，強的p17+p24(40kD)蛋白表達在Jurkat細胞中被檢測到(圖46C和46D)。
6.2.2.細胞內定位對於dgag和p17+p24蛋白，也在RD細胞中通過免疫螢光使用抗p24Mab分析細胞內定位。類似在Jurkat細胞中的Western印跡結果，不能檢測到dgag。Thep17/24蛋白顯示定位在漿膜中(圖47)。CTL蛋白的定位由於缺少合適的抗體未被分析。
6.16實例16多調控+結構性蛋白作為多HIV抗原表達作為下一步，分析了由常規的多基因和gag編碼的蛋白和/或作為單個多肽的CTL多抗原決定簇組成的多HIV抗原。在圖48上，Western印跡顯示了幾種轉染進Cos-7細胞中的多HIV抗原表達載體的表達。很明顯地發現所有調控性+結構性多抗原的表達水平明顯低於RNT或TRN蛋白。所有檢測到的多HIV抗原在凝膠上的遷移為顯著的條帶，靠近預測大小為(73kD的多調控+CTL位置附近；大小為95kD的多調控+dgag和120kD的多調控+CTL+dgag)。類似於RNT和TRN，RNT-CTL的遷移較TRN-CTL更慢。在TRN和RNT構建物的情況下，多調控-CTL-dgag的組合也都顯示較多調控-dgag-CTL更高的表達水平。
多HIV抗原的更詳細的分析在Jurkat細胞中進行。出於此原因，大多數構建的多HIV抗原(多調控+結構性)，包括多調控+CTL+optp17/24(預測大小為113kD)使用抗原不同部分的抗體通過Western印跡進行分析。在圖49中顯示的結果基本上類似於前面章節Cos-7細胞中所報導的結果。如在前面試驗中所見，含有多抗原的dgag在Jurkat細胞中表達的雜交蛋白水平非常低。載體pTRNdgag中的表達在所有印跡中未檢測到。在用從含有其他dgag的抗原表達載體轉染的細胞中獲取的材料上樣的泳道中，在預測分子量大小的位置上僅在Nef單抗雜交的印跡上檢測到非常微弱的信號。相反，如果dgag部分用密碼子優化的p17/24替換，可觀察到表達水平的增加。因為最初選擇TRN-CTL-optp17/24和RNT-optp17/24來進一步分析，所有從所有含有這些表達基因盒的GTU載體中分析抗原的表達。也分析來自這些質粒的E2蛋白表達。結果在圖50中被圖解。在載體之間多抗原和E2蛋白兩者的表達水平沒有大的差異。E2的表達水平受IRES元件的影響不明顯，該元件在質粒中緊隨鼠GM-CSF基因，如E2一樣由相同的mRNA翻譯而來。
6.17.實例17抗原表達的維持在分裂細胞的群體中質粒的維持性可通過綠螢光蛋白和Nef蛋白作為標記物來證明。也分析從不同的GTU或非GTU載體中產生的RNT-CTL-optp17/24抗原表達的維持性。特別是，GTU-1(pRNT-CTL-optp17/24)，GTU-2(p2 RNT-CTL-optp17/24)，GTU-3(p3RNT-CTL-optp17/24)，super6wt(super6wt-RNT-CTL-optp17/24)載體的每一種都使用E2蛋白及其結合位點來發揮質粒維持活性。在這個試驗中，也包括使用GTU載體FREBNA-RNT-CTL-optp17/24的EBNA-1及其結合位點。作為陰性對照，也使用含有EBNA-1表達基因盒與E2結合位點(E2BSEBNA-RNT-CTL-optp17/24)的混合配對的「非GTU」質粒。也使用常規的CMV表達載體pCMV-RNT-CTL-optp17/24。
Jurkat細胞用等克分子數量的質粒轉染，在轉染後2天和5天使用抗Nef單克隆抗體來研究抗原表達。僅用運載體DNA的轉染用作陰性對照。結果列於圖51。
如從圖51中所見，在第二個時間點僅從GTU載體中檢測到表達。FREBNA-RNT-CTL-optp17/24中的抗原表達在兩個時間點都低，因為不像E2，EBNA-1不具有轉錄活化能力。
多調控+結構性聚合蛋白的細胞內定位也通過基本上如實例4中所述在RD細胞中通過原位免疫螢光分析來研究。結果在圖52中顯示。
在所有的結果中，使用抗Nef或抗p24單克隆抗體僅在細胞漿中檢測到定位。根據Western印跡數據，含有optp17/24的蛋白的表達水平大大高於含dgag片段的抗原。
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可對本發明進行許多修飾和變化，並不背離此精神和範圍，這將對於本領域專業技術人員是很明顯的。在此所述的特殊實施例僅以實例的方式提供，發明僅受附錄的權利要求書的條款以及這些權利要求所被授權的等效物的所有範圍限制。
序列表110FIT生物技術公司120新的表達載體及其應用13011041-006-228(2010149)140To be assigned1412002-05-03150FI 200109221512001-05-0316052170PatentIn version 3.121012111260212DNA213人工序列220
223含有Nef-Tat-Rev的雜交蛋白(NTR)4001atggtgggca agtggtcaaa atgtagtgga tggcctactg taagggaaag aatgaaacaa 60gctgagcctg agccagcagc agatggggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat120ggagcaatca caagtagcaa tacagcaact aataacgctg cttgtgcctg gctagaagca180caagaggaag aggaagtggg ttttccagtc agacctcagg tacctttaag accaatgact240tacaagggag ctttagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggtta300atttactccc caaaaagaca agagatcctt gatctgtggg tctaccacac acaaggctac360ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga420tggtgcttca agttagtacc agttgaacca gatgaagaag agaacagcag cctgttacac480cctgcgagcc tgcatgggac agaggacacg gagagagaag tgttaaagtg gaagtttgac540agccatctag catttcatca caaggcccga gagctgcatc cggagtacta caaagactgc600actagtgcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt cagactcatc660aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca ggcccgaaga720aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag tgagcggatt780cttagcactt ttctgggacg acctgcggag cctgtgcctc ttcagctacc gccgcttgag840agacttactc ttgattgtag cgaagattgt ggaaactctg ggacgcaggg ggtgggaagt900cctcaagtat tggtggaatc tcctgcagta ttggagccag gaactaaaga aaagcttgag960ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020
accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag 126021022111260212DNA213人工序列220
223雜交蛋白含有Tat-Rev-Nef(TRN)4002atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgctga 126021032111260212DNA213人工序列220
223含有Rev-Tat-Nef的雜交蛋白(RTN)
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223含有Tat-Nef-Rev的雜交蛋白(TNR)4004atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg tgggcaagtg gtcaaaatgt agtggatggc ctactgtaag ggaaagaatg360aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa420aaacatggag caatcacaag tagcaataca gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta480gaagcacaag aggaagagga agtgggtttt ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca540atgacttaca agggagcttt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa600gggttaattt actccccaaa aagacaagag atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa660ggctacttcc ctgattggca gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc720
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223含有Rev-Nef-Tat的雜交蛋白(RNT)4005atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat120cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt180agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga240cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct300caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc360aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct420gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc480acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa540gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga600gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc660ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat720tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc780aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc840ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta900gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag960ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag 126021062111164212DNA
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223含有Nef-Tat-Rev的免疫顯性部分的蛋白(NTR)4006atgggatggc ctactgtaag ggaaagaatg aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat 60ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca120gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaagagga agtgggtttt180ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca agggagcttt agatcttagc240cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggttaattt actccccaaa aagacaagag300atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca360ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gcttcaagtt agtaccagtt420gaaccagatg aagaagagaa cagcagcctg ttacaccctg cgagcctgca tgggacagag480gacacggaga gagaagtgtt aaagtggaag tttgacagcc atctagcatt tcatcacaag540gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa gactgcgctc tggccgccgt tgagccagta600gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaggacccc ttgtaccaat660tgctattgta aaaagtgttg ccttcattgc caagtttgtt tcacaagaaa aggcttaggc720atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag cgacgaagag ctcctcaaga cagtcagact780catcaagttt ctctaccaaa gcaaccctcc tcccagcaac gaggggaccc gacaggcccg840aagaaatccg gactggccat cctgctgagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc900atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga960agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg 1020attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt 1080gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga 1140agtcctcaag tattggtgga atga 116421072111173212DNA213人工序列220
223含有Nef-Tat-Rev的免疫顯性部分的蛋白由蛋白酶位點分離(NTR)4007atgggatggc ctactgtaag ggaaagaatg aaacaagctg agcctgagcc agcagcagat 60ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca120gcaactaata acgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaagagga agtgggtttt180ccagtcagac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca agggagcttt agatcttagc240cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggttaattt actccccaaa aagacaagag300atccttgatc tgtgggtcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca360ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gcttcaagtt agtaccagtt420
gaaccagatg aagaagagaa cagcagcctg ttacaccctg cgagcctgca tgggacagag480gacacggaga gagaagtgtt aaagtggaag tttgacagcc atctagcatt tcatcacaag540gcccgagagc tgcatccgga gtactacaaa gactgcgctc tggccttcaa gcgggttgag600ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt660accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc720ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt780cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca840ggcccgaaga aatccgtacg ggagaagcgg ctgctgagcg acgaagagct cctcaagaca900gtcagactca tcaagtttct ctaccaaagc aaccctcctc ccagcaacgaggggacccga 960caggcccgaa gaaatcgaag aagaaggtgg agagagagac agaggcagat ccgttcgatt 1020agtgagcgga ttcttagcac ttttctggga cgacctgcgg agcctgtgcc tcttcagcta 1080ccgccgcttg agagacttac tcttgattgt agcgaagatt gtggaaactc tgggacgcag 1140ggggtgggaa gtcctcaagt attggtggaa tga117321082111161212DNA213人工序列220
223含有Nef-Tat-Rev調節蛋白的免疫顯性部分的蛋白，從Nef的aal(N11TR)4008atgtggccta ctgtaaggga aagaatgaaa caagctgagc ctgagccagc agcagatggg 60gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca120actaataacg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg aagaggaagt gggttttcca180gtcagacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg gagctttaga tcttagccac240tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ttaatttact ccccaaaaag acaagagatc300cttgatctgt gggtctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca360gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct tcaagttagt accagttgaa420ccagatgaag aagagaacag cagcctgtta caccctgcga gcctgcatgg gacagaggac480acggagagag aagtgttaaa gtggaagttt gacagccatc tagcatttca tcacaaggcc540cgagagctgc atccggagta ctacaaagac tgcgctctgg ccgccgttga gccagtagat600cctagactag agccctggaa gcatccagga agtcagccta ggaccccttg taccaattgc660tattgtaaaa agtgttgcct tcattgccaa gtttgtttca caagaaaagg cttaggcatc720tcctatggca ggaagaagcg gagacagcga cgaagagctc ctcaagacag tcagactcat780caagtttctc taccaaagca accctcctcc cagcaacgag gggacccgac aggcccgaag840aaatccggac tggccatcct gctgagcgac gaagagctcc tcaagacagt cagactcatc900aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca ggcccgaaga960aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgattag tgagcggatt 1020cttagcactt ttctgggacg acctgcggag cctgtgcctc ttcagctacc gccgcttgag 1080agacttactc ttgattgtag cgaagattgt ggaaactctg ggacgcaggg ggtgggaagt 1140cctcaagtat tggtggaatg a 1161
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223由蛋白酶位點分離(N11TR)的含有調節蛋白Nef-Tat-Rev的免疫顯性部分的蛋白Nef的aal4009atgtggccta ctgtaaggga aagaatgaaa caagctgagc ctgagccagc agcagatggg 60gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca120actaataacg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg aagaggaagt gggttttcca180gtcagacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg gagctttaga tcttagccac240tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ttaatttact ccccaaaaag acaagagatc300cttgatctgt gggtctacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca360gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct tcaagttagt accagttgaa420ccagatgaag aagagaacag cagcctgtta caccctgcga gcctgcatgg gacagaggac480acggagagag aagtgttaaa gtggaagttt gacagccatc tagcatttca tcacaaggcc540cgagagctgc atccggagta ctacaaagac tgcgctctgg ccttcaagcg ggttgagcca600gtagatccta gactagagcc ctggaagcat ccaggaagtc agcctaggac cccttgtacc660aattgctatt gtaaaaagtg ttgccttcat tgccaagttt gtttcacaag aaaaggctta720ggcatctcct atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag780actcatcaag tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc840ccgaagaaat ccgtacggga gaagcggctg ctgagcgacg aagagctcct caagacagtc900agactcatca agtttctcta ccaaagcaac cctcctccca gcaacgaggg gacccgacag960gcccgaagaa atcgaagaag aaggtggaga gagagacaga ggcagatccg ttcgattagt 1020gagcggattc ttagcacttt tctgggacga cctgcggagc ctgtgcctct tcagctaccg 1080ccgcttgaga gacttactct tgattgtagc gaagattgtg gaaactctgg gacgcagggg 1140gtgggaagtc ctcaagtatt ggtggaatga117021010211663212DNA213人工序列220
223含有細胞毒性T-細胞表位Pol和Env基因的蛋白(CTL)40010atgatcaccc tgtggcagcg ccccctggtg gccctgatcg agatctgcac cgagatggag 60aaggagggca agatcagcaa gatcggcccc gccggcctga agaagaagaa gagcgtgacc120gtgctggacg tgggcgacgc ctacttcagc gtgcccctgg ataaggactt ccgcaagtac180
accgccttca ccatccccag catctggaag ggcagccccg ccatcttcca gagcagcatg240accaagaagc agaaccccga catcgtgatc taccagtaca tggacgacct gtacgtgccc300atcgtgctgc ccgagaagga cagctggctg gtgggcaagc tgaactgggc cagccagatc360tacgccggca tcaaggtgaa gcagctgatc ctgaaggagc ccgtgcacgg cgtgtacgag420cccatcgtgg gcgccgagac cttctacgtg gacggcgccg ccaaccgcgc cggcaacctg480tgggtgaccg tgtactacgg cgtgcccgtg tggaaggagg ccaccaccac cctggtggag540cgctacctgc gcgaccagca gctgctgggc atctggggct gcgcctgcac cccctacgac600atcaaccaga tgctgcgcgg ccctggccgc gccttcgtga ccatccgcca gggcagcctg660tag 663210112111266212DNA213人工序列220
223截短的Gag蛋白序列(dgag)40011atgttagaca aatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atatcaatta 60aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta120gaaacatcag aaggctgtag acagataatg ggacagctac aaccgtccct tcagacagga180tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaaag240atagaggtaa aagacaccaa ggaagcttta gacaaggtag aggaagagca aaacaacagt300aagaaaaagg cacagcaaga agcagctgac gcaggaaaca gaaaccaggt cagccaaaat360taccctatag tgcaaaacct acagggacaa atggtacatc aggccatatc acctagaact420ttaaatgcat gggtaaaagt agtggaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg480ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct aaacacagtg540gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagaaacca tcaatgagga agctgcagaa600tgggatagat tgcacccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca660aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca720aataatccac ctatcccagt aggagaaata tataagagat ggataatcct gggattaaat780aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggata taaaacaagg accaaaagaa840ccctttagag attatgtaga ccggttctat aaaaccctaa gagccgagca agctacacag900gaagtaaaaa attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaatcc agattgtaag960actattttaa aagcattagg accagcagct acactagaag aaatgatgac agcatgtcag 1020ggagtggggg gacccggcca taaagcaaga gttttggctg aagcaatgag ccaagtaaca 1080ggttcagctg ccataatgat gcagagaggc aattttagga accaaagaaa gactgttaag 1140tgtttcaatt gtggcaaaga agggcacata gccagaaatt gcagggcccc taggaaaaag 1200ggctgttgga aatgtggaaa ggaaggacat caaatgaagg attgcacaga aagacaggct 1260aattag 1266210122111092
212DNA213人工序列220
223Gag基因的p17/24蛋白的合成編碼序列(syn 17/24)40012atgggcgcaa gagcctccgt gctgagcggc ggagagctgg acaagtggga gaagatccgc 60ctgcgccccg gcggcaagaa gaagtaccag ctgaagcaca tcgtgtgggc cagccgcgag120ctggagcgct tcgccgtgaa ccccggcctg ctcgagacca gcgaaggctg ccgccagatc180atgggccagc tccagcccag cctccagacc ggcagcgagg agctgcgcag cctgtacaac240accgtggcca ccctgtactg cgtgcaccag aagatcgagg tgaaggacac caaggaggcc300ctggacaagg tggaggagga gcagaacaac agcaagaaga aggcccagca ggaggccgcc360gacgccggca accgcaacca ggtgagccag aactacccca tcgtgcagaa cctgcagggc420cagatggtgc accaggccat cagcccccgc accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag480gagaaggcct tcagccccga ggtgatcccc atgttcagcg ccctgagcga gggcgctacc540ccccaggacc tgaacaccat gctgaacacc gtgggcggcc accaggccgc catgcagatg600ctgaaggaga ccatcaacga ggaggccgcc gagtgggacc gcctgcaccc cgtgcacgcc660gggcccatcg cccccggcca gatgcgcgag ccccgcggca gcgacatcgc cggcaccacc720agcaccctcc aggagcagat cggctggatg accaacaacc cccccatccc cgtgggcgag780atctacaagc gctggatcat cctgggcctg aacaagatcg tccgcatgta cagccccacc840agcatcctgg acatcaagca gggccccaag gagcccttcc gcgactacgt ggaccgcttc900tacaagaccc tgcgcgccga gcaggccacc caggaggtga agaactggat gaccgagacc960ctgctggtgc agaacgccaa ccccgactgc aagaccatcc tcaaggccct gggacccgcc 1020gccaccctgg aggagatgat gaccgcctgc caaggcgtgg gcggccccgg ccacaaggcc 1080cgcgtgctgt ga 1092210132111092212DNA213人工序列223用於在真核細胞表達的最好的Gag基因的p17/24蛋白的合成編碼序列(optp17/24)40013atgggcgcaa gagcctccgt gctgagcggc ggagagctgg acaagtggga gaagatccgc 60ctgcgccccg gcggcaagaa gaagtaccag ctgaagcaca tcgtgtgggc cagccgcgag120ctggagcgct tcgccgtgaa ccccggcctg ctcgagacca gcgaaggctg ccgccagatc180atgggccagc tccagcccag cctccagacc ggcagcgagg agctgcgcag cctgtacaac240accgtggcca ccctgtactg cgtgcaccag aagatcgagg tgaaggacac caaggaggcc300ctggacaagg tggaggagga gcagaacaac agcaagaaga aggcccagca ggaggccgcc360gacgccggca accgcaacca agtcagccag aactacccca tcgtgcagaa cctgcagggc420cagatggtgc accaggccat cagcccccgc accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag480gagaaggcct tcagccccga ggtgatcccc atgttcagcg ccctgagcga gggcgctacc540
ccccaggacc tgaacaccat gctgaacacc gtgggcggcc accaggccgc catgcagatg600ctgaaggaga ccatcaacga ggaggccgcc gagtgggacc gcctgcaccc cgtgcacgcc660gggcccatcg cccccggcca gatgcgcgag ccccgcggca gcgacatcgc cggcaccacc720agcaccctcc aggagcagat cggctggatg accaacaacc cccccatccc cgtgggcgag780atctacaagc gctggatcat cctgggcctg aacaagatcg tccgcatgta cagccccacc840agcatcctgg acatcaagca gggccccaag gagcccttcc gcgactacgt ggaccgcttc900tacaagaccc tgcgcgccga gcaggccacc caggaggtga agaactggat gaccgagacc960ctgctggtgc agaacgccaa ccccgactgc aagaccatcc tcaaggccct gggacccgcc 1020gccaccctgg aggagatgat gaccgcctgc caaggcgtgg gcggccccgg ccacaaggcc 1080cgcgtgctgt ga 1092210142111926212DNA213人工序列220
223含有Tat-Rev-Nef和CTL(TRN-CTL)的雜交蛋白編碼序列40014atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440
tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920ctgtag 1926210152111926212DNA213人工序列220
223含有Rev-Nef-Tat和CTL(RNT-CTL)的雜交蛋白編碼序列40015atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat120cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt180agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga240cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct300caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc360aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct420gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc480acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa540gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga600gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc660ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat720tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc780aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc840ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta900gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag960ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500
atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920ctgtag 1926210162112529212DNA213人工序列220
223含有Tat-Rev-Nef和截短的蛋白(TRN-dgag)的雜交蛋白編碼序列40016atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260gccgtgttag acaaatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatatcaa 1320ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 1380ttagaaacat cagaaggctg tagacagata atgggacagc tacaaccgtc ccttcagaca 1440ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 1500aagatagagg taaaagacac caaggaagct ttagacaagg tagaggaaga gcaaaacaac 1560
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223含有Tat-Rev-Nef CTL和截短的Gag蛋白(TRN-CTL-dgag)的雜交蛋白編碼序列，40017atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020
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223含有Rev-Nef-Tat，CTL和截短的Gag蛋白(RNT-CTL-dgag)的雜交蛋白編碼序列40018atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat120cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt180agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga240cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct300caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc360aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct420gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc480acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa540gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga600gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc660ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat720tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc780aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc840ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta900gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag960ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920ctggcggccg tgttagacaa atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 1980tatcaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 2040ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga cagataatgg gacagctaca accgtccctt 2100cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 2160catcaaaaga tagaggtaaa agacaccaag gaagctttag acaaggtaga ggaagagcaa 2220aacaacagta agaaaaaggc acagcaagaa gcagctgacg caggaaacag aaaccaggtc 2280agccaaaatt accctatagt gcaaaaccta cagggacaaa tggtacatca ggccatatca 2340cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtggaagaga aggctttcag cccagaagta 2400atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta 2460
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223含有Tat-Rev-Nef、截短的Gag蛋白和CTL(TRN-dgag-CTL)的雜交蛋白40019atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gtgggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260
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223含有Rev-Nef-Tat，截短的Gag蛋白和CTL(RNT-dgag-CTL)的雜交蛋白編碼序列40020
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223含有Tat-Rev-Nef，截短的Gag蛋白和CTL(TRN-optp17/24-CTL)的雜交蛋白編碼序列40021atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300gatactagtg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcctcaagac agtcagactc360atcaagtttc tctaccaaag caaccctcct cccagcaacg aggggacccg acaggcccga420agaaatcgaa gaagaaggtg gagagagaga cagaggcaga tccgttcgat tagtgagcgg480attcttagca cttttctggg acgacctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accgccgctt540gagagactta ctcttgattg tagcgaagat tgtggaaact ctgggacgca gggggtggga600agtcctcaag tattggtgga atctcctgca gtattggagc caggaactaa agaaaagctt660gttggcaagt ggtcaaaatg tagtggatgg cctactgtaa gggaaagaat gaaacaagct720gagcctgagc cagcagcaga tggggtggga gcagcatctc gagacctgga aaaacatgga780gcaatcacaa gtagcaatac agcaactaat aacgctgctt gtgcctggct agaagcacaa840gaggaagagg aagtgggttt tccagtcaga cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac900aagggagctt tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggttaatt960tactccccaa aaagacaaga gatccttgat ctgtgggtct accacacaca aggctacttc 1020cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1080tgcttcaagt tagtaccagt tgaaccagat gaagaagaga acagcagcct gttacaccct 1140gcgagcctgc atgggacaga ggacacggag agagaagtgt taaagtggaa gtttgacagc 1200catctagcat ttcatcacaa ggcccgagag ctgcatccgg agtactacaa agactgcgcg 1260gccgtgggcg caagagcctc cgtgctgagc ggcggagagc tggacaagtg ggagaagatc 1320cgcctgcgcc ccggcggcaa gaagaagtac cagctgaagc acatcgtgtg ggccagccgc 1380
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223含有Tat-Rev-Nef，CTL和截短的Gag蛋白(TRN-CTL-optp17/24)雜交蛋白編碼序列40022atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaggacc 60ccttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgccttcatt gccaagtttg tttcacaaga120aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcctcaa180gacagtcaga ctcatcaagt ttctctacca aagcaaccct cctcccagca acgaggggac240ccgacaggcc cgaagaaatc gaagaagaag gtggagagag agacagaggc agatccgttc300
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ggacccgccg ccaccctgga ggagatgatg accgcctgcc aaggcgtggg cggccccggc 3000cacaaggccc gcgtgctgtg a 3021210232113021212DNA213人工序列220
223含有Rev-Nef-Tat，CTL和截短的Gag蛋白(RNT-CTL-dgag)蛋白(RNT-CTL-optp17/24)的雜交蛋白編碼序列40023atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat120cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt180agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga240cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct300caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc360aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct420gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc480acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa540gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga600gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc660ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat720tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc780aagttagtac cagttgaacc agatgaagaa gagaacagca gcctgttaca ccctgcgagc840ctgcatggga cagaggacac ggagagagaa gtgttaaagt ggaagtttga cagccatcta900gcatttcatc acaaggcccg agagctgcat ccggagtact acaaagactg caagcttgag960ccagtagatc ctagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctag gaccccttgt 1020accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctt cattgccaag tttgtttcac aagaaaaggc 1080ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctcc tcaagacagt 1140cagactcatc aagtttctct accaaagcaa ccctcctccc agcaacgagg ggacccgaca 1200ggcccgaaga aatcgaagaa gaaggtggag agagagacag aggcagatcc gttcgatgcg 1260gccgtcatca ccctgtggca gcgccccctg gtggccctga tcgagatctg caccgagatg 1320gagaaggagg gcaagatcag caagatcggc cccgccggcc tgaagaagaa gaagagcgtg 1380accgtgctgg acgtgggcga cgcctacttc agcgtgcccc tggataagga cttccgcaag 1440tacaccgcct tcaccatccc cagcatctgg aagggcagcc ccgccatctt ccagagcagc 1500atgaccaaga agcagaaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgtacgtg 1560cccatcgtgc tgcccgagaa ggacagctgg ctggtgggca agctgaactg ggccagccag 1620atctacgccg gcatcaaggt gaagcagctg atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 1680gagcccatcg tgggcgccga gaccttctac gtggacggcg ccgccaaccg cgccggcaac 1740ctgtgggtga ccgtgtacta cggcgtgccc gtgtggaagg aggccaccac caccctggtg 1800gagcgctacc tgcgcgacca gcagctgctg ggcatctggg gctgcgcctg caccccctac 1860
gacatcaacc agatgctgcg cggccctggc cgcgccttcg tgaccatccg ccagggcagc 1920ctggcggccg tgggcgcaag agcctccgtg ctgagcggcg gagagctgga caagtgggag 1980aagatccgcc tgcgccccgg cggcaagaag aagtaccagc tgaagcacat cgtgtgggcc 2040agccgcgagc tggagcgctt cgccgtgaac cccggcctgc tcgagaccag cgaaggctgc 2100cgccagatca tgggccagct ccagcccagc ctccagaccg gcagcgagga gctgcgcagc 2160ctgtacaaca ccgtggccac cctgtactgc gtgcaccaga agatcgaggt gaaggacacc 2220aaggaggccc tggacaaggt ggaggaggag cagaacaaca gcaagaagaa ggcccagcag 2280gaggccgccg acgccggcaa ccgcaaccaa gtcagccaga actaccccat cgtgcagaac 2340ctgcagggcc agatggtgca ccaggccatc agcccccgca ccctgaacgc ctgggtgaag 2400gtggtggagg agaaggcctt cagccccgag gtgatcccca tgttcagcgc cctgagcgag 2460ggcgctaccc cccaggacct gaacaccatg ctgaacaccg tgggcggcca ccaggccgcc 2520atgcagatgc tgaaggagac catcaacgag gaggccgccg agtgggaccg cctgcacccc 2580gtgcacgccg ggcccatcgc ccccggccag atgcgcgagc cccgcggcag cgacatcgcc 2640ggcaccacca gcaccctcca ggagcagatc ggctggatga ccaacaaccc ccccatcccc 2700gtgggcgaga tctacaagcg ctggatcatc ctgggcctga acaagatcgt ccgcatgtac 2760agccccacca gcatcctgga catcaagcag ggccccaagg agcccttccg cgactacgtg 2820gaccgcttct acaagaccct gcgcgccgag caggccaccc aggaggtgaa gaactggatg 2880accgagaccc tgctggtgca gaacgccaac cccgactgca agaccatcct caaggccctg 2940ggacccgccg ccaccctgga ggagatgatg accgcctgcc aaggcgtggg cggccccggc 3000cacaaggccc gcgtgctgtg a 3021210242113021212DNA213人工序列220
223含有Rev-Nef-Tat，截短的Gag蛋白和CTL(RNT-optp17/24-CTL)的雜交蛋白編碼序列40024atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gagctcctca agacagtcag actcatcaag 60tttctctacc aaagcaaccc tcctcccagc aacgagggga cccgacaggc ccgaagaaat120cgaagaagaa ggtggagaga gagacagagg cagatccgtt cgattagtga gcggattctt180agcacttttc tgggacgacc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccgcc gcttgagaga240cttactcttg attgtagcga agattgtgga aactctggga cgcagggggt gggaagtcct300caagtattgg tggaatctcc tgcagtattg gagccaggaa ctaaagaaac tagtgtgggc360aagtggtcaa aatgtagtgg atggcctact gtaagggaaa gaatgaaaca agctgagcct420gagccagcag cagatggggt gggagcagca tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc480acaagtagca atacagcaac taataacgct gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggaa540gaggaagtgg gttttccagt cagacctcag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggga600gctttagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggtt aatttactcc660ccaaaaagac aagagatcct tgatctgtgg gtctaccaca cacaaggcta cttccctgat720tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac tgacctttgg atggtgcttc780
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220
223含有Nef-Tat-Rev的雜交蛋白(NTR)40025Met Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu1 5 10 15Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala20 25 30Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr35 40 45Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu50 55 60Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr65 70 75 80Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly85 90 95Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu100 105 110Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr115 120 125Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys130 135 140Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His145 150 155 160Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys165 170 175Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu180 185 190His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp195 200 205Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr210 215 220Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg225 230 235 240Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile245 250 255Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val260 265 270Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu275 280 285Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu290 295 300Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly Thr Lys Glu Lys Leu Glu305 310 315 320
Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro325 330 335Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu His Cys340 345 350Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys355 360 365Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln370 375 380Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr385 390 395 400Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp405 410 415Pro Phe Asp21026211419212PRT213人工序列220
223含有Tat-Rev-Nef(TRN)的雜交蛋白40026Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu100 105 110Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn115 120 125Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg130 135 140Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg145 150 155 160Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln
165 170 175Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly180 185 190Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser195 200 205Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly Thr Lys Glu Lys Leu Val Gly Lys Trp210 215 220Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala225 230 235 240Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu245 250 255Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala260 265 270Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro275 280 285Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu290 295 300Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile305 310 315 320Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr325 330 335Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val340 345 350Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu355 360 365Pro Asp Glu Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His370 375 380Gly Thr Glu Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser385 390 395 400His Leu Ala Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr405 410 415Lys Asp Cys21027211419212PRT213人工序列220
223含有Rev-Tat-Nef的雜交蛋白(RTN)40027Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15
Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu50 55 60Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg65 70 75 80Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly85 90 95Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro100 105 110Gly Thr Lys Glu Thr Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp115 120 125Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys130 135 140Lys Lys Cys Cys Leu His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu145 150 155 160Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro165 170 175Gln Asp Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser180 185 190Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val195 200 205Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp Pro Phe Asp Lys Leu Val Gly Lys Trp210 215 220Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala225 230 235 240Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu245 250 255Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala260 265 270Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro275 280 285Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu290 295 300Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile305 310 315 320Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr325 330 335Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val340 345 350Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu355 360 365
Pro Asp Glu Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His370 375 380Gly Thr Glu Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser385 390 395 400His Leu Ala Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr405 410 415Lys Asp Cys21028211419212PRT213人工序列220
223含有Tat-Nef-Rev的雜交蛋白(TNR)40028Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly100 105 110Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala115 120 125Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala130 135 140Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu145 150 155 160Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val165 170 175Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe180 185 190Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg195 200 205Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro
210 215 220Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu245 250 255Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr260 265 270Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His275 280 285His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu290 295 300Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg305 310 315 320Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly325 330 335Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln340 345 350Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly355 360 365Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu370 375 380Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val385 390 395 400Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly405 410 415Thr Lys Glu21029211419212PRT213人工序列220
223含有Rev-Nef-Tat的雜交蛋白(RNT)40029Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu50 55 60
Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg65 70 75 80Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly85 90 95Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro100 105 110Gly Thr Lys Glu Thr Ser Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp115 120 125Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala130 135 140Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile145 150 155 160Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu165 170 175Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro180 185 190Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe Leu195 200 205Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gln210 215 220Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp225 230 235 240Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe245 250 255Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn260 265 270Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr Glu275 280 285Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His His290 295 300Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu Glu305 310 315 320Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro325 330 335Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu His Cys340 345 350Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys355 360 365Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln370 375 380Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr385 390 395 400Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp405 410 415
Pro Phe Asp21030211387212PRT213人工序列220
223含有Nef-Tat-Rev的免疫顯性部分的蛋白(NTR)40030Met Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu1 5 10 15Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His20 25 30Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala35 40 45Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro50 55 60Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser65 70 75 80His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro85 90 95Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr100 105 110Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro115 120 125Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu130 135 140Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu145 150 155 160Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala165 170 175Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys180 185 190Ala Leu Ala Ala Val Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys195 200 205His Pro Gly Ser Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys210 215 220Lys Cys Cys Leu His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly225 230 235 240Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln245 250 255Asp Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln
260 265 270Gln Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Gly Leu Ala Ile Leu275 280 285Leu Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu290 295 300Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg305 310 315 320Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser325 330 335Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro340 345 350Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser355 360 365Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val370 375 380Leu Val Glu38521031211390212PRT213人工序列220
223由蛋白酶位點分離(NTR)的含有Nef-Tat-Rev的免疫顯性部分的蛋白40031Met Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu1 5 10 15Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His20 25 30Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala35 40 45Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro50 55 60Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser65 70 75 80His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro85 90 95Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr100 105 110Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro115 120 125
Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu130 135 140Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu145 150 155 160Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala165 170 175Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys180 185 190Ala Leu Ala Phe Lys Arg Val Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro195 200 205Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr210 215 220Cys Lys Lys Cys Cys Leu His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly225 230 235 240Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala245 250 255Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser260 265 270Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Val Arg Glu275 280 285Lys Arg Leu Leu Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile290 295 300Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg305 310 315 320Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln325 330 335Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro340 345 350Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu355 360 365Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser370 375 380Pro Gln Val Leu Val Glu385 39021032211386212PRT213人工序列220
223含有調節蛋白Nef-Tat-Rev免疫部分的蛋白Nef的aal開始(N11TR)40032
Met Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro1 5 10 15Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly20 25 30Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp35 40 45Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln50 55 60Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His65 70 75 80Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys85 90 95Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe100 105 110Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu115 120 125Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glun130 135 140Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp145 150 155 160Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe165 170 175His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Ala180 185 190Leu Ala Ala Val Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His195 200 205Pro Gly Ser Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys210 215 220Cys Cys Leu His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile225 230 235 240Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp245 250 255Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln260 265 270Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Gly Leu Ala Ile Leu Leu275 280 285Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr290 295 300Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg305 310 315 320Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile325 330 335Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val340 345 350
Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu355 360 365Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu370 375 380Val Glu38521033211389212PRT213人工序列220
223由蛋白酶位點分離(N11TR)的含有調節蛋白Nef-Tat-Rev免疫顯性部分的蛋白從Nef的aal起始40033Met Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro15 10 15Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly20 25 30Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp35 40 45Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln50 55 60Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His65 70 75 80Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys85 90 95Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe100 105 110Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu115 120 125Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu130 135 140Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp145 150 155 160Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe165 170 175His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Ala180 185 190Leu Ala Phe Lys Arg Val Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp195 200 205Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys
210 215 220Lys Lys Cys Cys Leu His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu225 230 235 240Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro245 250 255Gln Asp Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser260 265 270Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Val Arg Glu Lys275 280 285Arg Leu Leu Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys290 295 300Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln305 310 315 320Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile325 330 335Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala340 345 350Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp355 360 365Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro370 375 380Gln Val Leu Val Glu38521034211220212PRT213人工序列220
223含有毒性T-細胞表位Pol和Env基因(CTL)的蛋白40034Met Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala Leu Ile Glu Ile Cys1 5 10 15Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Ala Gly20 25 30Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr35 40 45Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr50 55 60Ile Pro Ser Ile Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met65 70 75 80Thr Lys Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp
85 90 95Leu Tyr Val Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Leu Val Gly100 105 110Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly Ile Lys Val Lys Gln115 120 125Leu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Glu Pro Ile Val Gly130 135 140Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg Ala Gly Asn Leu145 150 155 160Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr165 170 175Thr Leu Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp180 185 190Gly Cys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Arg Gly Pro195 200 205Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser Leu210 215 22021035211421212PRT213人工序列220
223截短的Gag蛋白序列(dgag)40035Met Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys1 5 10 15Lys Tyr Gln Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg20 25 30Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln35 40 45Ile Met Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu50 55 60Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Lys65 70 75 80Ile Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu85 90 95Gln Asn Asn Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gly100 105 110Asn Arg Asn Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln115 120 125Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp
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223Gag基因的p17/24蛋白(Syn 17/24)40036Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp1 5 10 15Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Lys20 25 30His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro35 40 45Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Met Gly Gln Leu50 55 60Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn65 70 75 80Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Val Lys Asp85 90 95Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Gln Asn Asn Ser Lys100 105 110Lys Lys Ala Gln Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gly Asn Arg Asn Gln Val115 120 125Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His130 135 140Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu145 150 155 160Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser165 170 175Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly180 185 190Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu195 200 205Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala210 215 220Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr225 230 235 240Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile245 250 255Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys260 265 270Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly275 280 285Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu290 295 300Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr305 310 315 320Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
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223用於在真核細胞表達的最優化的Gag基因的p17/24蛋白(optp 17/24)40037Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp1 5 10 15Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Gln Leu Lys20 25 30His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro35 40 45Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Met Gly Gln Leu50 55 60Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn65 70 75 80Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Val Lys Asp85 90 95Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Gln Asn Asn Ser Lys100 105 110Lys Lys Ala Gln Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gly Asn Arg Asn Gln Val115 120 125Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His130 135 140Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu145 150 155 160Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser165 170 175Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly180 185 190Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu195 200 205Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala210 215 220Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
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223含有Tat-Rev-Nef和CTL(TRN-CTL)的雜交蛋白40038Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu100 105 110Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn115 120 125Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg
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223含有Rev-Nef-Tat和CTL的雜交蛋白(RNT-CTL)40039Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu50 55 60Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg65 70 75 80Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly85 90 95
Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro100 105 110Gly Thr Lys Glu Thr Ser Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp115 120 125Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala130 135 140Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile145 150 155 160Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu165 170 175Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro180 185 190Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe Leu195 200 205Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gln210 215 220Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp225 230 235 240Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe245 250 255Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn260 265 270Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr Glu275 280 285Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His His290 295 300Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu Glu305 310 315 320Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro325 330 335Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu His Cys340 345 350Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys355 360 365Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln370 375 380Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr385 390 395 400Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp405 410 415Pro Phe Asp Ala Ala Val Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala420 425 430Leu Ile Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys435 440 445
Ile Gly Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp450 455 460Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys465 470 475 480Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile485 490 495Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr500 505 510Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp515 520 525Ser Trp Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly530 535 540Ile Lys Val Lys Gln Leu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr545 550 555 560Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn565 570 575Arg Ala Gly Asn Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp580 585 590Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Val Glu Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln595 600 605Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln610 615 620Met Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Arg Gln Gly Ser625 630 635 640Leu21040211842212PRT213人工序列220
223含有Tat-Rev-Nef和截短的Gag蛋白(TRN-dgag)的雜交蛋白的編碼序列40040Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp
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223含有Tat-Rev-Nef，CTL和截短的Gag蛋白(TRN-TCL-dgag)的雜交蛋白的編碼序列40041Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu100 105 110Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn115 120 125Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg130 135 140Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg145 150 155 160Ile Leu Ser Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln165 170 175Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly180 185 190
Asn Ser Gly Thr Gln Gly Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser195 200 205Pro Ala Val Leu Glu Pro Gly Thr Lys Glu Lys Leu Val Gly Lys Trp210 215 220Ser Lys Cys Ser Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala225 230 235 240Glu Pro Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu245 250 255Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala260 265 270Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro275 280 285Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu290 295 300Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu GIy Leu Ile305 310 315 320Tyr Ser Pro Lys Arg Gln Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr325 330 335Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val340 345 350Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu355 360 365Pro Asp Glu Glu Glu Asn Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His370 375 380Gly Thr Glu Asp Thr Glu Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser385 390 395 400His Leu Ala Phe His His Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr405 410 415Lys Asp Cys Ala Ala Val Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala420 425 430Leu Ile Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys435 440 445Ile Gly Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp450 455 460Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe Arg Lys465 470 475 480Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile485 490 495Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Lys Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr500 505 510Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp515 520 525Ser Trp Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly530 535 540
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Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr900 905 910Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr915 920 925Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln Glu930 935 940Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro945 950 955 960Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu965 970 975Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala980 985 990Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Gly Ser Ala Ala Ile995 10001005Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys1010 1015 1020Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Arg Asn Cys Arg1025 1030 1035Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His1040 1045 1050Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn1055 1060210422111064212PRT213人工序列220
223含有Tat-Rev-Nef，CTL和截短的Gag蛋白(TRN-CTL-dgag)的雜交蛋白40042Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu50 55 60Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg65 70 75 80Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly85 90 95
Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro100 105 110Gly Thr Lys Glu Thr Ser Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp115 120 125Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala130 135 140Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile145 150 155 160Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu165 170 175Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro180 185 190Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe Leu195 200 205Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gln210 215 220Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp225 230 235 240Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe245 250 255Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Glu Glu Glu Asn260 265 270Ser Ser Leu Leu His Pro Ala Ser Leu His Gly Thr Glu Asp Thr Glu275 280 285Arg Glu Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His His290 295 300Lys Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Lys Leu Glu305 310 315 320Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro325 330 335Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu His Cys340 345 350Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys355 360 365Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr His Gln370 375 380Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp Pro Thr385 390 395 400Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Ala Asp405 410 415Pro Phe Asp Ala Ala Val Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ala420 425 430Leu Ile Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys435 440 445
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223含有Tat-Rev-Nef，截短的Gag蛋白和CTL(TRN-dgag-CTL)的雜交蛋白40043
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223含有Rev-Nef-Tat，截短的Gag蛋白和CTL(RNT-dgag-CTL)的雜交蛋白40044Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Phe Leu50 55 60Gly Arg Pro Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg65 70 75 80Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Asp Cys Gly Asn Ser Gly Thr Gln Gly85 90 95Val Gly Ser Pro Gln Val Leu Val Glu Ser Pro Ala Val Leu Glu Pro100 105 110Gly Thr Lys Glu Thr Ser Val Gly Lys Trp Ser Lys Cys Ser Gly Trp115 120 125Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Lys Gln Ala Glu Pro Glu Pro Ala Ala130 135 140Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile145 150 155 160Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu165 170 175Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro180 185 190Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Leu Asp Leu Ser His Phe Leu195 200 205Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Arg Gln210 215 220Glu Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp225 230 235 240Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe245 250 255
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223含有Tat-Rev-Nef，截短的Gag蛋白和CTL(RNT-dgag-CTL)的雜交蛋白40045Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp55 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu100 105 110Glu Leu Leu Lys Thr Val Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn115 120 125Pro Pro Pro Ser Asn Glu Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg130 135 140Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg145 150 155 160
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223含有Tat-Rev-Nef，CTL和截短的Gag蛋白(TRN-CTL-optp17/24)雜交蛋白的編碼序列40046Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Arg Thr Pro Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Leu20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Thr Arg Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ser Ser Gln Gln Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Lys Ser Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Ala Asp Pro Phe Asp Thr Ser Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu100 105 110
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223含有Rev-Nef-Tat，截短的Gag蛋白和CTL(RNT-optpl7/24-CTL)的雜交蛋白40048Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Val1 5 10 15Arg Leu Ile Lys Phe Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Asn Glu20 25 30Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg35 40 45
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221misc_feature2221205223n＝A，T，C or G40049
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權利要求
1.一個表達載體包括(a)可操作地與異種啟動子連接的編碼核-錨定蛋白的DNA序列，所述核-錨定蛋白含有(i)與特定DNA序列結合的DNA結合結構域，和(ii)與核成分結合的功能性結構域或其功能相等區；和(b)形成核-錨定蛋白結合位點的多聚體化DNA序列，其中所述的載體缺少乳頭狀瘤病毒的複製起始點。
2.根據權利要求1所述的載體，其中所述的載體缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點。
3.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核成分是有絲分裂的染色質、核基質、核結構域10(ND10)或核結構域POD。
4.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核錨定-蛋白是染色質-錨定蛋白，所述的功能性結構域結合有絲分裂的染色質。
5.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核錨定-蛋白含有鉸鏈或連接子區。
6.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核錨定-蛋白是真核生物、原核生物或病毒來源的天然蛋白。
7.根據權利要求6所述的載體，其中所述的天然蛋白是病毒來源的。
8.根據權利要求6所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是真核生物來源的天然蛋白。
9.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是乳頭狀瘤病毒或EB病毒的蛋白。
10.根據權利要求9所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是1型牛乳頭狀瘤病毒的E2蛋白或EB病毒核抗原1。
11.根據權利要求10所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是1型牛乳頭狀瘤病毒的E2蛋白。
12.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是高遷移率組蛋白。
13.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是非天然的蛋白。
14.根據權利要求13所述的載體，其中所述的核-錨定蛋白是重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白。
15.根據權利要求14所述的載體，其中所述的重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白含有任何組合的DNA結合結構域和功能性結構域，前者與所述的特定DNA序列結合，後者與核成分結合，其中所述的與核成分結合的功能性結構域是乳頭狀瘤病毒的、EB病毒的或高遷移率組蛋白的結構域。
16.根據權利要求15所述的載體，其中所述的重組體蛋白、融合蛋白或通過分子建模技術獲得的蛋白含有任何組合的DNA結合結構域和功能性結構域，前者與所述的特定DNA序列結合，後者與核成分結合，其中所述的與核成分結合的功能性結構域是1型乳頭狀瘤病毒的E2蛋白的、EB病毒核抗原1的或高遷移率組蛋白的結構域。
17.根據權利要求1或2所述的載體，其中所述的載體進一步包括目的DNA序列的一個或多個表達基因盒。
18.根據權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列是感染性病原體的序列。
19.根據權利要求18所述的載體，其中所述的感染性病原體是病毒。
20.根據權利要求19所述的載體，其中所述的病毒選自人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、C型肝炎病毒、流感病毒和腸道病毒。
21.根據權利要求18所述的載體，其中所述的目的DNA序列是細菌的。
22.根據權利要求21所述的載體，其中所述的細菌選自沙眼衣原體、結核分支桿菌和肺炎支原體。
23.根據權利要求21所述的載體，其中所述的細菌是沙門氏菌。
24.根據權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列是真菌性病原體的。
25.根據權利要求24所述的載體，其中所述的真菌性病原體是白色念珠菌。
26.根據權利要求20所述的載體，其中所述的目的DNA序列是HIV來源的。
27.根據權利要求26所述的載體，其中所述的目的DNA序列編碼HIV非結構調控蛋白。
28.根據權利要求27所述的載體，其中所述的HIV的非結構調控蛋白是Nef、Tat或Rev。
29.根據權利要求28所述的載體，其中所述的HIV的非結構調控蛋白是Nef。
30.根據權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列編碼HIV的結構蛋白。
31.根據權利要求30所述的載體，其中所述的目的DNA序列是編碼HIV gp120/gp160的基因。
32.根據權利要求17所述的載體，其中第一個所述的表達基因盒含有編碼Nef、Tat或Rev的目的DNA序列，其中第二個所述的表達基因盒含有編碼Nef、Tat或Rev的目的DNA序列。
33.根據權利要求17所述的載體，其中第一個所述的表達基因盒含有編碼Nef、Tat或Rev的目的DNA序列，其中第二個所述的表達基因盒由編碼HIV結構蛋白的目的DNA序列組成。
34.根據權利要求17所述的載體，其中的目的DNA序列編碼與癌症相關的蛋白。
35.根據權利要求17所述的載體，其中的目的DNA序列編碼與免疫成熟、免疫反應調節或自體免疫反應調節相關的蛋白。
36.根據權利要求35所述的載體，其中所述的蛋白是APECED。
37.根據權利要求17所述的載體，其中的目的DNA序列是Aire基因。
38.根據權利要求17所述的載體，其中的目的DNA序列編碼在任何遺傳性單基因病中缺陷的蛋白。
39.根據權利要求17所述的載體，其中的目的DNA序列編碼大分子藥物。
40.根據權利要求39所述的載體，其中的目的DNA序列編碼細胞因子。
41.根據權利要求40所述的載體，其中所述的細胞因子是選自IL1、IL2、IL4、IL6和IL12的白介素。
42.根據權利要求40所述的載體，其中的目的DNA序列編碼幹擾素。
43.根據權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列編碼有生物學活性的RNA分子。
44.根據權利要求43所述的載體，其中所述的有生物學活性的RNA分子選自抑制性反義和核酶分子。
45.根據權利要求44所述的載體，其中所述的抑制性反義RNA或核糖酶分子對抗致癌基因的作用。
46.權利要求17所述的載體被用作藥劑。
47.權利要求17所述的載體被用作攜帶載體以攜帶一個或多個目的基因或一條或多條目的DNA序列，如編碼感染原蛋白或肽、治療劑、大分子藥物或其任何組合的一個基因、多個基因，或一條或多條DNA序列。
48.權利要求17所述的載體被用作藥劑以治療遺傳的或獲得的基因缺陷。
49.權利要求17所述的載體被用作抗感染原的治療性DNA疫苗。
50.權利要求17所述的載體被用作治療劑。
51.權利要求17所述的載體被用作在細胞或生物體中生產由所述目的DNA序列編碼的蛋白。
52.權利要求17所述的載體被用作在體內生產治療性大分子藥物。
53.給受試者提供蛋白的方法，所述的方法包括給予受試者權利要求1或2所述的載體，其中所述的載體(i)進一步包括編碼要提供給受試者的蛋白的第二條DNA序列，其第二條DNA序列可操作地與第二個啟動子相連，和(ii)不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
54.在受試者中誘導對蛋白的免疫反應的方法，所述的方法包括給予受試者權利要求1或2所述的載體，其中所述的載體(i)進一步包括編碼所述蛋白的第二個DNA序列，其第二個DNA序列可操作地與第二個啟動子相連，和(ii)不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，且其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
55.在需要所述治療的受試者中治療感染性疾病的方法，所述的方法包括給予所述受試者治療有效量的權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列編碼含有感染原的免疫原性抗原決定簇的蛋白。
56.在需要所述治療的受試者中治療遺傳的或獲得的基因缺陷的方法，所述的方法包括給予所述受試者治療有效量的權利要求17所述的載體，其中所述的目的DNA序列編碼被所述遺傳的或獲得的基因缺陷影響的蛋白。
57.在受試者中表達DNA序列的方法，所述的方法包括給予所述受試者權利要求17所述的載體。
58.根據權利要求55、56或57中的方法，其中所述的載體不編碼牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1，其中所述的受試者不表達牛乳頭狀瘤病毒蛋白E1。
59.一種權利要求1或2中載體的製備方法，包括(a)培養含所述載體的宿主細胞；和(b)回收載體。
60.根據權利要求59中的方法，進一步包括在步驟(a)之前用所述載體轉化所述宿主細胞的步驟。
61.根據權利要求59中的方法，其中所述的宿主細胞是原核細胞。
62.根據權利要求59中的方法，其中所述的宿主細胞是大腸桿菌。
63.一種宿主細胞，其特徵在於含權利要求1或2所述的載體。
64.一種宿主細胞，其特徵在於含權利要求17所述的載體。
65.根據權利要求63中的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是細菌細胞。
66.根據權利要求63中的宿主細胞，其中所述的宿主細胞是哺乳動物細胞。
67.含權利要求1或2中載體的攜帶載體。
68.含權利要求17中載體的藥學組合物和適合的藥物賦形劑。
69.含權利要求17中載體的DNA疫苗。
70.含權利要求18中載體的DNA疫苗。
71.含權利要求19中載體的DNA疫苗。
72.含權利要求21中載體的DNA疫苗。
73.含權利要求24中載體的DNA疫苗。
74.含權利要求17中載體的基因治療劑。
75.製備權利要求69中DNA疫苗的方法，所述的方法包括將權利要求17所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
76.製備權利要求69中DNA疫苗的方法，所述的方法包括將權利要求18所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
77.製備權利要求69中DNA疫苗的方法，所述的方法包括將權利要求19所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
78.製備權利要求69中DNA疫苗的方法，所述的方法包括將權利要求21所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
79.製備權利要求69中DNA疫苗的方法，所述的方法包括將權利要求24所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
80.製備權利要求74中藥劑的方法，所述的方法包括將權利要求17所述的載體與適合的藥物賦形劑結合。
全文摘要
本發明涉及新的載體，含所述載體的DNA疫苗和基因療法，製備載體和含所述載體的DNA疫苗和基因療法的方法，以及所述載體的治療應用。更特別地，本發明涉及新的載體，包括(a)核－錨定蛋白的表達基因盒，它含有(i)能夠與特定DNA序列結合的DNA結合結構域和(ii)能夠與核成分結合的結構域，和(b)形成錨定蛋白結合位點的多聚體化DNA序列，和可選擇地(c)目的DNA序列的一個或多個表達盒。特別地，發明涉及缺少乳頭狀瘤病毒複製起始點的載體。核－錨定蛋白可以是1型牛乳頭狀瘤病毒的E2蛋白或EB病毒核抗原1。本發明還涉及缺少在哺乳動物細胞中起作用的複製起始點的載體。本發明進一步涉及在受試者中表達目的DNA序列的方法。
文檔編號C12N15/09GK1529758SQ02813304
公開日2004年9月15日 申請日期2002年5月3日 優先權日2001年5月3日
發明者K·克龍, K 克龍, V·布拉熱維奇, 任, M·塔蒂南, 倌, M·阿斯特弗, U·託茨, 崢, A·麥尼克, 固馗, A·蘭基, E·阿斯特弗 申請人:非特生物技術有限責任公司