一種檢測結核抗體的化學發光免疫分析試劑盒的製作方法

2023-05-28 02:42:26 1

專利名稱：：一種檢測結核抗體的化學發光免疫分析試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明利用化學發光免疫分析與生物素-親和素系統相結合，提供了一種檢測結核抗體的化學發光免疫分析試劑盒及其製備方法。
背景技術：
：結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，結核病又稱為癆病和"白色瘟疫"，是一種古老的傳染病，可侵入人體全身各種器官。結核病共分為5類原發性肺結核、血行播散型肺結核、繼發性肺結核、結核性胸膜炎及其他肺外結核等，結核病是當今對人類最具威脅的感染性疾病之一，也是單一傳染因子導致死亡的最常見原因，已超過愛滋病、瘧疾、腹瀉、熱帶病死亡人數的總和，嚴重危害人類健康，成為全球重大公共衛生問題。據世界衛生組織(WHO)統計，目前全球人口的1/3曾經感染過結核分枝桿菌，每年出現大約800萬新病例，約300萬人死於該病。1993年4月23曰，在倫敦召開的第46屆世界衛生大會上，世界衛生組織史無前例地宣布"全球結核病處於緊急狀態"。1998年，再次發出"遏制結核病行動刻不容緩"的呼聲。在我國結核病是國家重點控制的傳染病，但結核病的疫情依然相當嚴重，部分地區有蔓延趨勢，患病人數在世界居第2位，佔全球結核病人的1/4，在傳染病中居第l位，傳染性肺結核病人約150萬，每年約有12.7萬人死於結核。降低結核病死亡率的關鍵是早期診斷，從而能準確及時的制定合理、科學的治療方案。、結核病的初步診斷技術主要有1、痰塗片檢查簡便易行、準確性高，但陽性率低；2、痰結核菌培養可信度高，但費時、昂貴且易受用藥的影響，應用受到限制；3、胸部X光準確快速，但易與其他肺部疾病混淆；以上診斷技術普遍存在靈敏度低、特異性差、耗時長等缺點，因此與對結核病的診斷價值有限。隨著分子生物學技術的迅速發展，用高度敏感的方法檢測結核菌及其特異性DNA片段，如PCR、生物探針和基因晶片等，在結核菌檢測方面有簡便、敏感、特異等優點，但需要相應的檢測設備，技術要求髙，費用高，難以推廣。目前ELISA、金標等免疫診斷技術檢測血清中結核抗體，具有簡便快速、無需精密儀器、易於推廣等特點，但當前所用的診斷抗原，存在假陽性率高、特異性差等缺點，因此尋找強特異性及免疫原性的診斷抗原，將幾種抗原聯合檢測能提高靈敏度，不影響特異性，比單一抗原法具有更髙的敏感性，對結核病的診斷和方法學建立具有十分重要的意義。結核菌抗原38KD是一種分泌蛋白，具有良好的抗原性；ESAT-6抗原是一種分泌性抗原，在結核菌感染早期產生，並被宿主系統識別，蛋白分子表位眾多，且僅在致病性結核菌中表達，不存在於其他非致病性分支桿菌中，因而是一種具有診斷價值的特異性抗原；CFP10也是一種分泌性抗原，編碼與ESAT-6相鄰，均位於結核桿菌的基因區；因此這3種抗原聯合檢測結核菌感染，具有靈敏度高、特異性強等優點，對結核病的血清學診斷具有很高價值。本發明則採用38KD、ESAT-6、CFP10抗原聯合檢測血清中的結核抗體。生物素-親和素系統(BAS)是近年來發展起來的一種新型生物反應放大系統。生物素與親和素間的結合親和力高、特異性強，具有的多級放大作用。將親和素(鏈黴親和素)包被固相載體，抗體或抗原與生物素結合，然後通過親和素一生物素反應而使生物素化的抗體或抗原固相化，這種方法不僅可增加吸附的的抗體或抗原量，而且包被均勻、牢固，其結合位點充分暴露，提高了反應的敏感性。本發明即採用這種包被方法，增加了檢測的靈敏度。"目前化學發光免疫分析法是一種較先進而有效的方法。其優點是把高靈敏的化學發光分析方法和特異性強的免疫分析方法相結合，是目前發展和推廣應用較快的免疫分析方法，主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩定且有效期長、方法穩定快速、檢測範圍寬、搡作簡單自動化程度高等優點。
發明內容本發明解決以上診斷技術的不足，將鏈親和素包被固相載體，使38KD、ESAT-6、CFP10抗原生物素化，與鏈親和素結合，加入待測樣本後，再加入酶標記的相同抗原，與載體上包被的抗原和被測樣品中的結核抗體形成"雙抗原夾心"結構，最後加入化學發光底物液，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，具有比酶聯免疫分析更強的特異性，臨床符合率也大大提高，可為結核抗體的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。本發明的目的是提供一種檢測結核抗體的試劑盒及其製備方法。本發明的試劑盒包括陰性對照、陽性對照，鏈親和素化的固相載體，生物素標記的抗原，鹼性磷酸酶標記的抗原，濃縮洗滌液以及化學發光底物液。其中，所述鏈親和素包被的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管；所述化學發光底物的發光劑為AMPPD、CSPD或CDP-Star;優選地，所述化學發光底物液為2.4%Tris、16%NaCl、0.4%KC1、1.5°/。HCl、20。MMPPD和0.l%Proclin300;所述濃縮洗滌液為Tris-HCl緩衝液。本發明的技術方案為1)將鏈親和素包被的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。2)鏈親和素包被固相載體的製備將適當濃度的鏈親和素與0.05MpH值為7.2的PBS緩衝液混合，將所得混合液負載於固相載體上；酪蛋白封閉液(含1%酪蛋白、l°/。Proclin300、1.21%Tris和0.88%NaCl的pH7.5的Tris緩衝液)封閉；抽溼乾燥後用鋁箔袋密封，2-8'C保存。3)將38KD、ESAT-6、CFP10結核抗原混合在一起，用PBS將純化的抗原稀釋；加入過碘酸鈉，4。C反應lOmin;裝入透析袋，對PBS透析2次，每次lh，再轉入NaHC03中透析；加入二甲基亞碸溶解的生物素醯肼，室溫作用12h;加入硼氣化鉀溶液，再對PBS4'C透析24h，即為生物素化的結核抗原，加等體積甘油，4'C保存備用。4)用戊二醛法將鹼性磷酸酶與結核菌抗原偶聯，加入等量甘油，4'C保存。5)將正常人血清過濾除菌後，經含有0.5%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋後製成陰性對照；將結核抗體陽性血清過濾除菌後滅活後，經含有0.5y。BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋後製成陽性對照。6)配製濃縮洗滌液配製pH值為7.4的25倍濃縮的Tris-HCl緩衝液，經純化水稀釋25倍後使用。-7)配製化學發光底物液所述化學發光底物液包含2.4OTris、16%NaCl、0.4%KC1、1.5%HC1、20%AMPPD和0.l%Proclin300。8)分裝上述各組分，組裝為成品。本發明的試劑盒，通過大量臨床實驗，選擇了最佳的測定方法，既有效地利用了化學發光技術原理，又充分利用了生物素-親和素系統，並使用高特異性的38KD、ESAT-6、CFP10抗原，確保了檢測的靈敏度與特異性，能夠準確地檢測出多種結核病血清中的結核抗體，可用於結核病的臨床血清學診斷。具體實施例方式實施例1製備本發明的結核抗體化學發光免疫分析檢測試劑盒本發明的結核抗體測定試劑盒包括鏈親和素包被的微孔板，陰、陽性對照，生物素化的結核菌抗原，鹼性磷酸酶標記的結核菌抗原，濃縮洗滌液及化學發光底物液；一、鏈親和素包被微孔板的製備(1)包被將0.05MpH值為7.2的PBS緩衝液與適當濃度的鏈親和素混勻製成包被液，加至發光板內，每孔100nL，4'C過夜；具體地，PBS緩衝液配製方法為2.2gNaH2P04*2H20，12,9gNa2HP(V12H20，9gNaCl，用純化水定容至lOOOmL,調pH至7.2。(2)封閉配製酪蛋白封閉液，分別將12.lgTris，8.8gNaCl，10g酪蛋白，lmlProclin300加至lOOOmL純化水中，用HCl調pH至7.5。每孔分別加酪蛋白封閉液200pL,4'C過夜，甩掉封閉液，在吸水紙上拍幹。室溫除溼乾燥18-24小時，然後用鋁箔袋密封，28t:保存。二、生物素化結核菌抗原的製備1)從結核分枝桿菌H37Rv株基因組中擴增38KD、ESAT-6和CFP10抗原的基因，連接入pBVILl表達載體，在大腸桿菌HB101株中進行表達，獲得了結核分枝桿菌38KD、ESAT-6、CFP10抗原；2)用0.lmol/LpH值為7.4的PBS將純化的結核菌抗原稀釋為1~2mg/mL;3)加入60mmol/L過砩酸鈉0.lmL,4'C反應10min;4)裝入透析袋，對PBS透析2次，每次lh，再轉入0.lmol/LNaHC03中透析lh;5)加入二甲基亞碸溶解的生物素醯肼(16mg/mL)0.3mL,室溫作用12h;6)加入硼氫化鉀溶液(5mg/mL)0.lmL，室溫作用3h後，再對PBS4。C透析24h,其間換液34次，即為生物化的結核抗原，加等體積甘油，小量分裝，4'C保存備用。使用時，取一定量生物素化的結核抗原，按l:800濃度加到稀釋液中，4匸保存。稀釋液為包含0.24%BSA、0.l訂ritonX-100和0.1。/。Proclin300的磷酸鹽緩衝液。三、陰、陽性對照的製備陰性對照將正常人血清過濾除菌後，加到含有0.5y。BSA的磷酸鹽緩衝液中，配製成濃度為l:200的溶液，分裝後2-8'C保存；陽性對照將結核抗體陽性血清過濾除菌並且滅活後，加到含有0.5仰SA的磷酸鹽緩衝液中，配製成濃度為1:180的溶液，分裝後2-8X:保存。四、鹼性磷酸酶標記結核抗原的製備用戊二醛交聯法將結核抗原與鹼性磷酸酶偶聯在一起，加l/3甘油，小量分裝，4'C以下保存。使用時，取一定量的酶標結核抗原，加到含有l.2%Tris、0.5%BSA和0.ly。Proclin300的稀釋液中，充分混勾，配製成濃度為1:1600的酶標記物，2~8'C保存。五、濃縮洗滌液的製備配製pH值為7.4的25倍濃縮的Tris-HC1緩衝液，包含30gTris、200gNaCl、5gKCl、18.7SmLHCl和lmLProclin300,置2-8。C避光保存。純化水稀釋25倍後使用。六、化學發光底物液的製備基於lOOOmL化學發光底物液，包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mLAMPPD和lmLProclin300,置2-8。C避光保存。七、將各組分組裝為成品試劑盒。實施例2-3製備本發明的結核抗體化學發光免疫分析檢測試劑盒除分別以塑料珠、塑料管作為載體，其餘均以與實施例l相同的方法製備結核抗體化學發光免疫分析檢測試劑盒。實施例4本發明的試劑盒的使用方法1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡30分鐘；2)將試劑盒提供的濃縮洗滌液液用純化水稀釋25倍後使用；3)加生物素化的抗原50nL於各孔內；然後設陰性對照3孔，每孔50)aL;陽性對照2孔，每孔50nL;空白l孔，其餘孔加待測樣品50"，用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37'C溫育30分鐘；4)洗板5次，每孔400nL,最後在乾淨的吸水紙上扣幹；5)除空白孔外，其餘孔加酶標記物50nL，振蕩混勾，貼上封板膜，置37'C溫育30分鐘；6)洗板3次，每孔400uL,最後在乾淨的吸水紙上扣幹；7)每孔加化學發光底物液100nL,振蕩混勻，室溫避光反應30分鐘。8)必須於加化學發光底物液後的第30~60分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間l秒/孔。9)結果判定根據測定標本(S)的RLU值與臨界值(CUT-OFF)的比值確定。臨界值(CUT-OFF)=2.1x陰性對照孔平均RLU值；若S/C0值^1,則為陽性反應，說明樣本中含有結核抗體；若S/C0值〈1,則為陰性反應，說明樣本中不含有結核抗體。實施例5本發明的試劑盒與ELISA試劑盒對血樣檢測比較本發明的試劑盒與ELISA試劑盒同時檢測臨床確診的活動性結核病患者血清160例，非結核性疾病患者血清253例，正常人對照血清120例，檢測結果見下表l:表1本發明的試劑盒與ELISA試劑盒檢測結果tableseeoriginaldocumentpage10從表l可以看出，本發明的試劑盒對活動性結核病患者的陽性檢出率明顯高於ELISA試劑盒，而檢測非結核性疾病患者的陽性率(即假陽性率)卻明顯少於ELISA試劑盒，對正常人血清檢測均為陰性，可見本發明的試劑盒比ELISA試劑盒更敏感、特異、準確。實施例6本發明的試劑盒對幾種結核病血清中結核抗體的檢測由於結核病種類較多，本發明的試劑盒對幾種發病率較多的結核病患者，採集新鮮血清檢測結核抗體，檢測情況如下表2:表2本發明試劑盒檢測結果tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11從表2可以看出，本發明試劑盒對結核性胸膜炎、腎結核、淋巴結核和腸結核病患者血清中結核抗體的檢出率均達到了100%,對其它幾種結核病結核抗體的檢出率，也較目前結核抗體的檢測試劑大大提高，說明本發明試劑盒具有更高的臨床符合率，可為目前結核病的檢測提供更準確、可靠的價值。權利要求1、一種檢測結核抗體的化學發光免疫分析試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括鏈親和素包被的固相載體，陰、陽性對照，生物素化的抗原，鹼性磷酸酶標記的抗原，濃縮洗滌液及化學發光底物液。2、如權利要求l所述的試劑盒，其特徵在於，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。3、如權利要求l所述的試劑盒，其特徵在於，所述化學發光底物液為包含2.4%Tris、16%NaCl、0.德C1、1.5%HC1、20。/。AMPPD和0.l%Proclin300的溶液。4、如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述化學發光底物發光劑為AMPPD、CSPD或CDP-Star。5、根據權利要求l所述的試劑盒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟以鏈親和素包被固相載體；配製陰、陽性對照；使結核桿菌抗原生物素化；以鹼性磷酸酶標記結核桿菌抗原；配製濃縮洗滌液及化學發光底物液；分裝上述陰、陽性對照、酶標記物、濃縮洗滌液和化學發光底物液；以及組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述鏈親和素包被固相載體的步驟為將適當濃度的鏈親和素與0.05MpH值為7.2的PBS緩衝液混合製成包被液，並將其負載於固相載體上；然後將酪蛋白封閉液負載於上述固相載體上。7、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述陰性對照是正常人血清經0.5%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋後製備而成；陽性對照是結核抗體陽性血清經0.5%BSA的磷酸鹽緩衝液稀釋後製備而成。8、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述結核桿菌抗原生物素化的步驟包括純化結核桿菌38KD、ESAT-6、CFP10抗原；用0.lmol/LpH值為7.4的PBS將純化的抗原稀釋為1~2mg/mL;加入60mmol/L過碘酸鈉0.lmL，4'C反應10min;裝入透析袋，對PBS透析2次，每次lh，再轉入0.lmol/LNaHC03中透析lh;加入二甲基亞碸溶解的生物素醯肼(16mg/raL)0.3mL，室溫作用12h;加入硼氫化鉀溶液(5mg/mL)0.lmL，室溫作用3h後，再對PBS4'C透析24h,其間換液34次，即為生物素化的結核抗原，加等體積甘油，4'C保存備用。9、如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述化學發光底物液為包含2.4%Tris、確aCl、O.綴Cl、1.5%HC1、20。MMPPD和0.l%Proclin300的溶液。10、如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述化學發光底物發光劑為AMPPD、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發明涉及一種檢測結核抗體的試劑盒及其製備方法。本試劑盒由鏈親和素包被固相載體，陰、陽性對照，生物素化結核抗原，鹼性磷酸酶標記結核抗原，濃縮洗滌液及化學發光底物液組成。本試劑盒採用雙抗原夾心反應原理及生物素-親和素系統包被固相載體，這種方法不僅包被均勻牢固，抗原純度大大提高，而且可以增加抗原吸附量，節約成本，具有敏感性高、特異性強等特點，能夠準確地檢測出多種結核病血清中的結核抗體，為臨床診斷和結核病普查提供更加可靠的依據。文檔編號G01N33/569GK101377494SQ200810104148公開日2009年3月4日申請日期2008年4月16日優先權日2008年4月16日發明者宋勝利,應希堂,坤張,胡國茂,趙娟娟,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司