診斷性標誌物的製作方法

2024-03-01 03:36:15

診斷性標誌物的製作方法
【專利摘要】本發明提供基於ERBB2基因的甲基化狀態來預測對癌症療法的響應的方法。本發明的一個方面提供一種基於ERBB2基因的甲基化狀態來預測對EGFR抑制劑療法的響應的方法。
【專利說明】診斷性標誌物
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年8月31日提交的美國臨時申請N0.61/529，917的權益，其公開內容通過提述完整併入本文。
發明領域
[0003]本發明提供基於基因甲基化狀態來預測對癌症療法的響應的方法。
[0004]發明背景
[0005]本發明針對用於診斷和治療癌症患者的方法。具體地，本發明針對用於確定哪些患者將最受益於使用表皮生長因子受體(EGFR)激酶抑制劑治療的方法。
[0006]癌症是大範圍細胞惡性的通用名，其特徵在於不受調控的生長、缺少分化、和侵入局部組織並轉移的能力。這些贅生性惡性以各種患病程度影響體內的每個組織和器官。
[0007]在過去的數十年中已開發出多種治療劑來治療各種類型的癌症。最普遍使用的抗癌劑類型包括:DNA燒化劑(例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide))、抗代謝物(例如甲氨蝶呤、葉酸拮抗劑和5_氟尿喃唳、喃唳拮抗劑)、微管破壞物(例如長春新 鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、紫杉醇)、DNA嵌入劑(例如多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunomycin)、順鉬)、和激素療法(例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟他胺(flutamide))。
[0008]表皮生長因子受體(EGFR)家族包含4種緊密相關的受體(HER1/EGFR、HER2 (ERBB2)、HER3 (ERBB23)和HER4 (ERBB4))，其牽涉細胞應答如分化和增殖。EGFR激酶或其配體TGFa的過表達經常與許多癌症有關，包括乳腺癌、肺癌、結直腸癌、卵巢癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭和頸癌、成膠質細胞瘤和星形細胞瘤，且認為促進這些腫瘤的惡性生長。還發現EGFR基因(EGFRvIII)中的一種特定的缺失突變增加細胞致瘤性。EGFR刺激的信號傳導途徑的活化促進潛在促進癌症的多種過程，例如增殖、血管發生、細胞運動和侵入、降低的細胞凋亡和藥物抗性誘導。增加的HER1/EGFR表達經常與晚期疾病、轉移和不良預後關聯。例如，在NSCLC和胃癌中，已顯示增加的HER1/EGFR表達與高轉移率、較差的腫瘤分化和增加的腫瘤增殖相關。
[0009]ERBB2過表達通常被視為不良預後的預測物，特別是在患有牽涉腋淋巴結的原發性疾病的患者中(Slamon等，Science235:177-182 (1987) ；Slamon等,Science244:707-712 (1989) ;Ravdin 和 Chamness, Genel59:19-27 (1995)；以及 Hynes和 Stem, Biochim Biophys Actal 198:165-184(1994))，而且與對包括 CMF (環磷醯胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶)和蒽環類抗生素在內的激素療法和化療方案的敏感性和/或抗性關聯(Baselga 等，Oncologyll (3Suppl2):43-48(1997))。用 HER2 抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)治療的患者是基於HER2過表達/擴增選擇用於治療的。參見例如W099/31140、US2003/0170234、W001/89566。
[0010]已在NSCLC和成膠質細胞瘤中觀察到激活受體的內在蛋白酪氨酸激酶活性和/或增加下遊信號傳導的突變。然而，突變作用作為賦予對EGF受體抑制劑例如厄洛替尼(erlotinib) ( TARCEVAk )或吉非替尼(gefitinib) (IRESSA?)的敏感性的原理機制一
直是有爭議的。最近，已報告全長EGF受體的突變體形式預測對EGF受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的響應性(Paez, J.G.等(2004) Science304:1497-1500 ；Lynch, T.J.等(2004)N.Engl.J.Med.350:2129-2139)。細胞培養研究顯示表達EGF受體的突變體形式的細胞系(即H3255)對通過EGF受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼的生長抑制更敏感，且需要高得多濃度的吉非替尼來抑制表達野生型EGF受體的腫瘤細胞系。這些觀察表明EGF受體的特定突變形式可能反映對EGF受體抑制劑的更大的敏感性但不鑑定完全不響應的表型。
[0011]開發用作抗腫瘤劑的直接抑制EGFR的激酶活性的化合物，以及通過阻斷EGFR活化來降低EGFR激酶活性的抗體是大量研究努力的領域所在(de Bono J.S.和R0winsky，E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine8:S19-S26 ；Dancey,J.和 Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery2:92-313)。數項研究已顯示、披露或表明一些EGFR激酶抑制劑在與某些其他抗癌劑或化療劑或治療組合使用時可能改進腫瘤細胞或贅生物殺傷(例如 Herbst, R.S.等(2001) Expert Opin.Biol.Ther.1:719-732 ；Solomon, B.等(2003)Int.J.Radi at.0ncol.Biol.Phys.55: 713-723 ；Krishnan, S.等(2003) Frontiers inBioscience8, el-13 ；Grunwald,V.和 Hidalgo, M.(2003)J.Nat.Cancer Inst.95:851-867 ；Seymour L.(2003) Current Opin.1nvestig.Drugs4 (6): 658-666 ；Khal iI, Μ.Y.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3:367-380 ；Bulgaru, A.M.等(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.3:269-279 ；Dancey, J.和 Sausville, E.A.(2003)Nature Rev.DrugDiscovery2:92-313 ；Ciardiello, F.等(2000) Cl in.Cancer Res.6:2053-2063 ;和專利公開文本 No:US2003/0157104)。
[0012]厄洛替尼(例如厄洛替尼HCl，亦稱為TARCEVAk或031-774)是口服可用的
EGFR激酶的抑制劑。在體外，厄洛替尼已在許多人腫瘤細胞系(包括結直腸癌和乳腺癌中)顯示出針對EGFR激酶的實質抑制性活性(Moyer J.D.^ (1997) Cancer Res.57:4838),而且臨床前評估顯示針對許多表達EGFR的人腫瘤異種移植物的活性(Pollack，V.A.等(1999) T.Pharmacol.Exp.Ther.291:739)。最近，厄洛替尼在許多適應證的I期和II期試驗中顯示有前景的活性，所述適應證包括頭和頸癌(Soulieres, D.，等(2004) J.Clin.0ncol.22: 77), NSCLC (Perez-Soler R,等(2001) Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.迎:310a，摘要 1235)、CRC(Oza, M.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.22:196a,摘要 785)和MBC(Winer, E.，等(2002)fceast Cancer Res.Treat.並:5115a，摘要 445)。在 III 期試驗中，厄洛替尼單一療法在患有晚期治療不應性NSCLC的患者中顯著延長存活、延遲疾病進展和延遲肺癌有關症狀的惡化(Shepherd, F.等(2004) J.Clin.0ncology,益:14S (Julyl5Supplement)，摘要7022)。儘管許多關於厄洛替尼的臨床試驗數據涉及其在NSCLC中的使用，但來自Ι/Π期研究的初步結果已顯示厄洛替尼和卡培他濱(capecitabine)/厄洛替尼組合療法在患有大範圍的人實體腫瘤類型(包括CRC(0za，M.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.22:196a，摘要 785)和MBC(Jones, R.J.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.益:45a，摘要180))的患者中的有前景的活性。2004年11月美國食品和藥物管理局(FDA)批准了在至少一種在前的化療方案失敗後，將厄洛替尼用於治療患有局部晚期或轉移性的非小細胞肺癌(NSCLC)的患者。厄洛替尼是表皮生長因子受體(EGFR)類中在III期臨床試驗中顯示晚期NSCLC患者存活增加的唯一藥物。
[0013]抗贅生性藥物理想地將選擇性殺傷癌細胞，關於其對非惡性細胞的毒性有較寬的治療指標。它還會保留它對惡性細胞的功效，甚至在延長暴露於藥物之後。不幸的是，沒有一種目前的化療具有這類理想概況。相反，大多數具有非常窄的治療指標。此外，暴露於稍微亞致死濃度的化療劑的癌細胞將非常經常地形成對這類藥劑的抗性，而且還相當經常地形成對幾種其他抗贅生性藥劑的交叉抗性。另外，對於任何給定的癌症類型，甚至在使用較新的基因靶向療法如EGFR激酶抑制劑時也經常不能預測哪個/些患者很可能應答特定治療，如此需要大量試驗和錯誤來發現最有效的療法，這對患者經常帶來相當大的風險和不適。
[0014]如此，需要更有效的用於贅生物形成和其他增殖性病症的治療，和更有效的用於確定哪些腫瘤將響應哪種治療的手段。用於增強現有藥物的治療功效的策略牽涉其施用時間安排中的變化，以及其與其他抗癌劑或生化調控劑的組合使用。組合療法公知為是一種相對於使用治療有關劑量的單獨每種藥劑，能產生更大功效和減少的副反應的方法。在一些情況中，藥物組合的功效是加和性的(組合的功效約等於單獨每種藥物的效果之和)，但在其他情況中，該效果是協同性的(組合的功效大於單獨給出的每種藥物的效果之和)。
[0015]靶物特異性的治療辦法如厄洛替尼一般與相比於常規細胞毒性劑的降低的毒性有關，因此，有助於其在組合方案中使用。在厄洛替尼與貝伐單抗(Mininberg，E.D.，等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.22:627a,摘要 2521)和吉西他濱(gemcitabine)(Dragovich, T., (2003)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.22:223a,摘要 895)組合的 I/II 期研究中已觀察到有前景的結果。在NSCLC III期試驗中的最近數據顯示與標準化療組合的一線厄洛替尼或吉非替尼未改進存活(Gatzemeier, U., (2004)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.23:617(摘要 7010) ；Herbst, R.S., (2004)Proc.Am.Soc.Clin.0ncol.23:617(摘要 7011) ；Giaccone, G.,等(2004) J.Clin.0ncol.22:777 ；Herbst, R.,等(2004) J.Clin.0ncol.22:785)。然而，胰腺癌III期試驗顯示一線厄洛替尼組合吉西他濱確實改進存活。
[0016]幾個小組已研究了潛在的生物標誌物來預測患者對EGFR抑制劑的響應(參見例如，W02004/063709, W02005/017493, W02004/111273、W02004/071572 ；US2005/0019785和US2004/0132097)。一種這類生物標誌物是上皮和間充質表型。在大多數癌症轉移期間，在腫瘤細胞中發生一項重要的變化，稱為上皮-到-間充質轉變(EMT) (Thi ery, J.P.(2002)Nat.Rev.Cancer2:442-454 ；Savagner,P.(2001)Bioessays23:912-923 ；Kang Y.和 Massague, J.(2004)Cel1118:277-279 ; Julien-GriIle, S.，等 CancerResearch63:2172-2178 ；Bates, R.C.等(2003)Current Biologyl3:1721-1727 ；Lu Z.,等(2003)Cancer Cell.4(6):499-515)。緊密結合在一起且展現極性的上皮細胞產生間充質細胞，其更寬鬆地保持在一起，展現出極性的降低且具有行進的能力。這些間充質細胞能傳播到原始腫瘤周圍的組織中，侵入血管和淋巴管，並行進至新位置，在該處分裂並形成另外的腫瘤。EMT不發生在健康細胞中，除了在胚胎發生期間以外。在正常情況下，TGF-β充當生長抑制劑，然而在癌症轉移期間，TGF- β開始促進EMT。
[0017]上皮和間充質表型與特定的基因表達模式關聯。例如，上皮表型在W02006101925中顯示為與E-1丐粘蛋白、Brk、Y-連環蛋白(catenin)、α -連環蛋白、角蛋白8、角蛋白18、連接蛋白31、plakophilin3、stratafinl、核纖層蛋白α 5和ST14的高表達水平有關，而間充質表型與波形蛋白、纖連蛋白、微纖維蛋白-1、微纖維蛋白-2、膠原α2(?ν)、膠原α 2 (V)、L0XL1、巢蛋白(nidogen)、Cll 或 f9、肌腱蛋白(tenascin)、N-鈣粘蛋白、胚 EDB+纖連蛋白、微管蛋白α 3和上皮形成素(epimorphin)的高表達水平有關。
[0018]表觀遺傳學(epigenetics)是對由基礎DNA序列中變化以外的機制導致的基因表達或細胞表型中的可遺傳變化的研究，因此名稱為ep1-(希臘語:在上、之上、外部)_遺傳學。這類變化的例子包括DNA甲基化和組蛋白修飾，兩者均作用於調控基因表達而不改變相關基因的序列。這些變化可以是體細胞可遺傳的，其經由生物體剩餘生命中的細胞分裂，而且還可以傳遞到生物體的後續世代。然而，在生物體的基礎DNA序列中沒有變化；相反，是非遺傳因素導致生物體的基因有不同的行為或表達。
[0019]DNA甲基化是高等生物中正常生物發育和細胞分化中至關重要的部分。DNA甲基化穩定地改變細胞中的基因表達模式，從而細胞能「記得其曾在何處」;例如，在胚胎發育期間程序化為胰島的細胞在生物體的整個生命中在沒有告訴它們必須保持島的持續信號的情況下保持為胰島。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其他已摻入宿主基因組的有害元件隨時間的表達。DNA甲基化還形成染色質結構的基礎，這使得細胞能從DNA的單個不可變序列形成多細胞生命所需要的無數特徵。DNA甲基化還在幾乎所有類型的癌症的形成中起著至關重要的作用。在胞嘧啶位置5的DNA甲基化具有降低基因表達的特定效果，且已在檢查的每個脊椎動物中發現。在成人體細胞組織中，DNA甲基化通常發生在CpG 二核苷酸背景中，而非CpG甲基化在胚胎幹細胞中是普遍的。
[0020]「CpG」是「一C一磷酸一G—」的縮寫，即胞嘧啶和鳥嘌呤由僅一個磷酸分開；磷酸將任意兩個核苷在DNA中連接在一起。「CpG」記法用於將此線性序列與胞嘧啶和鳥嘌呤的CG鹼基對區分開來。CpG 二核苷酸中的胞嘧啶可經甲基化以形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在哺乳動物中，將基因內的 胞嘧啶甲基化能關閉該基因。將甲基基團添加到DNA的酶稱為DNA甲基轉移酶。在哺乳動物中，70%至80%的CpG胞嘧啶是甲基化的。存在具有更高的CpG位點濃度的基因組區域，稱為CpG島。這些「CpG島」還具有高於預期的GC含量(即>50% )0哺乳動物基因組中的許多基因具有與基因起始關聯的CpG島。因此，CpG島的存在被用來協助基因的預測和注釋。CpG島對於甲基化是頑固性的，這可能有助於維持開放的染色質構型。另外，這能產生對轉變突變的降低的易受損性，因此導致續存更高平衡密度的CpG。基因啟動子內CpG位點的甲基化能導致其沉默，這是在許多人癌症中發現的一種特徵(例如腫瘤抑制基因的沉默)。相反，CpG位點的低甲基化與癌細胞內癌基因的過表達有關。
[0021]發明概述
[0022]本發明的一個方面提供一種測定腫瘤細胞生長對通過EGFR激酶抑制劑的抑制的敏感性的方法，其包括檢測樣品腫瘤細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因的低甲基化指示所述腫瘤細胞生長對使用EGFR抑制劑的抑制敏感。本發明的另一個方面提供一種鑑定很可能受益於使用EFGR抑制劑治療的癌症患者的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，其中如果ERBB2基因的甲基化狀態檢測為低甲基化，那麼將所述患者鑑定為很可能受益於使用EGFR抑制劑治療。在一個實施方案中，如果所述患者被鑑定為將很可能受益於使用EGFR抑制劑治療的患者，那麼對所述患者施用治療有效量的EGFR抑制劑。
[0023]本發明的另一個方面提供一種在患者中治療癌症的方法，其包括對所述患者施用治療有效量的EGFR抑制劑，其中所述患者在施用EGFR抑制劑之前診斷為具有展現出ERBB2基因低甲基化的癌症，其中ERBB2基因低甲基化指示該受試者對EGFR抑制劑的治療響應性。
[0024]本發明的另一個方面提供一種為癌症患者選擇療法的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，並且當ERBB2基因檢測為低甲基化時，選擇EGFR抑制劑作為療法的步驟。在一個實施方案中，對所述患者施用治療有效量的EGFR抑制劑，如例如厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)。
[0025]本發明的另一個方面提供一種測定細胞中ERBB2基因的過表達的方法，其包括檢測細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因低甲基化指示所述細胞中ERBB2的過表達。
[0026]本發明的另一個方面提供一種在患者中治療癌症的方法，其包括對所述患者施用治療有效量的HER2抑制劑，其中所述患者在施用HER2抑制劑之前診斷為具有展現出ERBB2基因低甲基化的癌症，其中ERBB2基因低甲基化指示該受試者對HER2抑制劑的治療響應性。
[0027]本發明的另一個方面提供一種為癌症患者選擇療法的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，並且當ERBB2基因檢測為低甲基化時，選擇HER2抑制劑作為療法的步驟。在一個實施方案中，對所述患者施用治療有效量的HER2抑制劑，如曲妥珠單抗或T-DMl。
[0028]在上述方法的某些實施方案中，在ERBB2基因的一部分中檢測甲基化狀態。用於檢測甲基化狀態的基因部分為例如增強子區，或增強子區和啟動子區。在一個實施方案中，用於檢測甲基化狀態的基因部分包含SEQ ID N0:1的核酸序列。在一個實施方案中，用於檢測甲基化狀態的基因部分由SEQ ID N0:1的核酸序列組成。在一個實施方案中，用於檢測甲基化狀態的基因部分包含6CpG重複區。在一個實施方案中，用於檢測甲基化狀態的基因部分包含SEQ ID N0:2的核酸序列。在一個實施方案中，用於檢測甲基化狀態的基因部分由SEQ ID NO:2的核酸序列組成。
[0029]在所述方法的某些實施方案中，如果ERBB2基因或其部分低於約50%或低於約20%甲基化，那麼ERBB2基因的甲基化狀態認為是低甲基化狀態。
[0030]在上述方法的某些實施方案中，甲基化狀態通過焦磷酸測序檢測。在上述方法的某些實施方案中，ERBB2基因來自福馬林固定、石蠟包埋的(FFPE)組織或來自新鮮冷凍的組織。在上述方法的某些實施方案中，在焦磷酸測序前將從所述組織樣品分離的ERBB2基因預擴增。
[0031]在上述方法的某些實施方案中，所述腫瘤細胞是NSCLC腫瘤細胞或者所述癌症是NSCLC。
[0032]附圖簡述
[0033]圖1顯示ERBB2增強子區的核酸序列(SEQ ID NO:1),其含有28個CpG甲基化位點(SEQ ID NO:1)。
[0034]圖2描繪NSCLC手術切除的原發性腫瘤和匹配的正常組織中ERBB2甲基化狀態的焦磷酸測序分析的結果。
[0035]圖3描繪上皮樣和間充質樣NSCLC細胞系中ERBB2甲基化狀態的定量焦磷酸測序分析的結果。
[0036]圖4顯示NSCLC細胞中ERBB2mRNA的相對表達，其使用基於TaqMan的Fludigm基因表達分析。
[0037]圖5描繪細胞系中ERBB2增強子CpG位點的百分比甲基化。細胞系按照對厄洛替尼處理的敏感性排序。
[0038]圖6描繪焦磷酸測序分析的結果，其顯示NSCLC手術切除的原發性腫瘤和匹配的正常組織中6個CpG位點中每一處的甲基化百分數。
[0039]圖7描繪ERBB2表達高和低的腫瘤細胞中ERBB2增強子區的百分比甲基化。
[0040]圖8描繪自存檔的FFPE載玻片衍生的47份NSCLC原發性腫瘤樣品中ERBB2甲基化的焦磷酸測序分析和上皮/間充質狀態。
[0041]發明詳述
[0042]1.定義
[0043]除非另有定義，本文中所使用的所有技術術語，符號及其它科學術語意圖具有本發明所屬領域中技術人員通常所理解的含意。在有些情況中，為了清楚和/或便於提及，本文對具有通常所理解含意的術語給出了定義，而且本文中這些定義的內含不應必然解釋為代表了與本領域通常所理解含意的實質差異。本文中所描述或提到的技術和規程一般得到了本領域技術人員的充分理解，而且通常利用常規方法得以採用，諸如例如Samtoook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第 2版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y中記載的廣泛使用的分子克隆方法。適當時,涉及使用商品化試劑盒和試劑的規程一般依照製造商規定的方案和/或參數進行，除非另有記載。
[0044]在描述所述方法、試劑盒及其用途前，應理解本發明不限於特定的方法學、方案、細胞系、動物種或屬、構建體，且如此描述的試劑當然可以變化。還應理解本文中使用的術語學僅用於描述具體實施方案的目的，且不意圖限制本發明的範圍，這將僅由所附權利要求限制。
[0045]必須注意的是，如本文中和所附權利要求中使用的，單數形式「一個/ 一種」和「該」包括複數指代物，除非上下文另外清楚地指示。
[0046]貫穿本說明書和權利要求書中，詞「包含/包括」或其變體將理解為暗示納入所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。
[0047]術語「癌症」在動物中指具有致癌細胞典型特徵的細胞存在，所述特徵如不受控的增殖、永生化、轉移潛力、快速生長和增殖速率、和某些特徵性形態學特徵。癌症細胞經常將以腫瘤的形式，但這類細胞可在動物中單獨存在，或可在血液流中作為獨立細胞循環，如白血病細胞。
[0048]如本文中使用的，除非另外指示，「異常細胞生長」指獨立於正常調控機制的細胞生長(例如失去接觸抑制)。這包括以下異常生長:(I)通過表達突變的酪氨酸激酶或過表達受體酪氨酸激酶來增殖的 腫瘤細胞(腫瘤)；(2)其他增殖性疾病的良性和惡性細胞，其中發生異常酪氨酸激酶活化；(4)通過受體酪氨酸激酶增殖的任何腫瘤；(5)通過異常絲氨酸/蘇氨酸激酶活化增殖的任何腫瘤；和(6)其他增殖性疾病的良性和惡性細胞，其中發生異常絲氨酸/蘇氨酸激酶活化。
[0049]如本文中使用的，除非另外指示，術語「治療/處理」意指在患者中逆轉、減輕、抑制進展、或預防(部分或完全地)腫瘤生長、腫瘤轉移或其他致癌或贅生性細胞。
[0050]如本文中使用的，除非另外指示，術語「治療/處理」指治療/處理的行為。
[0051]短語「一種治療方法」或其等同體，在應用於例如癌症時指設計為減少或消除動物中的癌症細胞數，或減輕癌症症狀的作用規程或過程。
[0052]「一種治療」癌症或另一種增殖性病症的「方法」不必然指事實上將消除癌細胞或其他病症，事實上將減少細胞數或病症，或事實上將減輕癌症或其他病症的症狀。
[0053]術語「治療有效的藥劑」意指將引發研究者、獸醫、醫學醫師或其他臨床醫師尋求的組織、系統、動物或人的生物學或醫學應答的組合物。
[0054]術語「治療有效量」或「有效量」意指將引發研究者、獸醫、醫學醫師或其他臨床醫師尋求的組織、系統、動物或人的生物學或醫學應答的受試化合物或組合的量。
[0055]術語「ErbBl」、「HERl」、「表皮生長因子受體」和「EGFR」和「EGFR激酶」在本文中可交換使用且指 EGFR,如例如在 Carpenter 等 Ann.Rev.Biochem.56:881-914 (1987)中披露的，包括其天然存在的突變體形式(例如一種缺失突變體EGFR，如Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211 (1990)中的)。erbBl 指編碼 EGFR 蛋白產物的基因。
[0056]如本文中使用的，術語「EGFR激酶抑制劑」和「EGFR抑制劑」指本領域中目前已知的或未來將鑑定的任何EGFR激酶抑制劑，其包括在對患者施用時導致與患者中EGF受體活化有關的生物學活性(包括另外從EGFR天然配體對EGFR的結合得到的任一種下遊生物學效應)受抑制的任何化學實體。這類EGFR激酶抑制劑包括能阻斷EGFR活化或EGFR活化的任一種下遊生物學效應(與患者中的癌症治療有關)的任何藥劑。這類抑制劑能通過直接結合受體的胞內域並抑制其激酶活性起作用。或者，這類抑制劑能通過佔據EGF受體的配體結合位點或其部分起作用，由此使得受體為其天然配體不可達的，從而阻止或降低其正常生物學活性。或者，這類抑制劑能通過調控EGFR多肽的二聚體化，或EGFR多肽與其他蛋白質的相互作用，或增強EGFR的遍在蛋白化和胞吞降解起作用。EGFR激酶抑制劑包括但不限於低分子量抑制劑、抗體或抗體片段、反義構建體、小抑制RNA(即通過dsRNA的RNA幹擾；RNAi)和核酶。在一個優選的實施方案中，所述EGFR激酶抑制劑是特異性結合人EGFR的小有機分子或抗體。
[0057]EGF受體功能的抑制劑已顯示臨床效用，而且描述最可能受益於治療的患者亞組的關鍵EGF受體信號傳導途徑的定義已成為一個重要的研究領域。已在NSCLC和成膠質細胞瘤中觀察到活化受體的內在蛋白質酪氨酸激酶活性和/或增加下遊信號傳導的突變。體外和臨床研究已顯示wt EGF受體細胞系和腫瘤之間在其對EGF受體抑制的細胞應答中的相當大的變異性，這部分已顯示為源自磷脂醯肌醇3-激酶途徑的EGF受體獨立性的活化，導致抗細胞凋亡絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt的持續的磷酸化。PI3激酶活化的備選路徑和由此的EGF受體抑制劑不敏感性的分子決定物是一個積極的研究領域。例如強烈活化PI3激酶途徑的胰島素樣生長因子I受體(IGF-1受體)牽連對EGF抑制劑的細胞抗性。在介導對選擇性EGF受體抑制的不敏感性中經由PI3激酶途徑也能施加存活信號的細胞-細胞和細胞-粘著網絡的作用不那麼清楚且將假定為影響對EGF受體阻斷物的細胞敏感性。在缺少對胞外基質的粘附或細胞-細胞接觸的情況下腫瘤細胞維持生長和存活信號的能力是重要的，不僅在細胞遷移和轉移的背景中，而且還在維持傷口樣腫瘤環境中的細胞增殖和存活中，其中胞外基質被重塑且細胞接觸抑制減少。我們先前定義了與NSCLC細胞系對厄洛替尼的體外敏感性相關的EMT基因表達籤名(Yauch等，2005，Clin CancerResll, 8686-8698)。
[0058]表述「 ErbB2 」和「 HER2 」在本文中可交換使用且指人HER2蛋白，例如Semba等,PNAS(USA)82:6497-6501 (1985)和 Yamamoto 等 Nature319:230-234(1986)中描述的(Genebank登錄號X03363)。術語「erbB2」指編碼人ErbB2的基因且「neu」指編碼大鼠pl85neu的基因。
[0059]「ErbB3」 和 「HER3」 指如例如在美國專利 N0.5，183，884 和 5，480，968 以及 Kraus等 PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)中披露的受體多肽。
[0060]術語「 ErbB4 」和「 HER4 」在本文中指如例如在以下披露的受體多肽:歐洲專利申請 No599, 274 ；Plowman 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:1746-1750 (1993)；和Plowman等，Nature, 366:473-475(1993)，包括其同等型，例如如1999年4月22日公開的W099/19488中披露的。
[0061]「低甲基化」意指可能甲基化的CpG位點中多數是未甲基化的。在某些實施方案中，低甲基化意指ERBB2基因部分中低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%、低於5%、或低於I %的可能的甲基化位點是甲基化的。在一個實施方案中，EBB2基因部分包含ERBB2的增強子區。在一個實施方案中，EBB2基因部分包 含SEQ ID NO:1的ERBB2增強子區，其含有28個CpG甲基化位點。在又一個實施方案中，低甲基化意指相比於在正常水平例如在非腫瘤細胞中表達的ERBB2基因，更少的可能甲基化的位點是甲基化的。在另一個實施方案中，低甲基化意指ERBB2基因的增強子區中沒有一個CpG位點是甲基化的。
[0062]I1.方法和組合物
[0063]本發明部分涉及以下發現，即ERBB2基因的低甲基化與ERBB2的高表達和癌症對使用EGFR激酶抑制劑治療的敏感性相關。因此，本發明提供一種測定癌症患者中腫瘤對通過EGFR激酶抑制劑的細胞生長抑制的敏感性的方法，其包括獲得腫瘤樣品並分析腫瘤樣品以檢測ERBB2的甲基化狀態，其中ERBB2的低甲基化狀態的檢測指示所述腫瘤細胞生長對通過EGFR抑制劑治療的抑制敏感。
[0064]因此，在一個實施方案中，提供一種測定腫瘤細胞生長對通過EGFR激酶抑制劑的抑制的敏感性的方法，其包括檢測樣品腫瘤細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因的低甲基化指示所述腫瘤細胞生長對使用所述EGFR抑制劑的抑制敏感。
[0065]本發明的另一個方面提供一種鑑定很可能受益於使用EFGR抑制劑治療的癌症患者的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品(如來自癌性腫瘤的樣品)檢測ERBB2基因的甲基化狀態，其中如果ERBB2基因檢測為低甲基化，那麼將所述患者鑑定為很可能受益於使用所述EGFR抑制劑治療。在一些實施方案中，基於低甲基化狀態對患者施用治療有效量的EGFR抑制劑。
[0066]此外，本文中提供鑑定更可能展現出受益於使用EFGR抑制劑的療法的患者的方法，所述方法包括檢測ERBB2基因部分中的低甲基化，其中分析的ERBB2基因序列部分的低於約 50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、或 1% 的甲基化指示該
患者更可能受益於治療。
[0067]本發明的另一個方面提供一種基於取自患者癌症的樣品(如癌性腫瘤的樣品)中ERBB2基因的甲基化狀態，為癌症患者選擇療法的方法。在一個實施方案中，選擇治療的方法包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測所述ERBB2基因的甲基化狀態，並且當所述ERBB2基因檢測為低甲基化(甲基化狀態認為是低甲基化的狀態)時，選出一種EGFR抑制劑作為療法的步驟。然後，基於該選擇方法，對患者施用治療有效量的EGFR抑制劑。在一些實施方案中，所述EFGR抑制劑是厄洛替尼、西妥昔單抗或帕尼單抗。
[0068]本發明的另一個方面提供一種當患者患有特徵為ERBB2低甲基化的癌症時，使用EGFR抑制劑來治療患者的方法。
[0069]本發明的再一個方面提供一種測定ERBB2基因是否在細胞如癌細胞中過表達的方法，其包括檢測細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因低甲基化的測定指示細胞中ERBB2的過表達。
[0070]先前已將ERBB2基因的過表達與對HER2抑制劑如曲妥珠單抗(HERCEPTTN?,Genentech, Inc.)和 T-DMl 的響應關聯。參見例如，W099/31140、US2003/0170234、W001/89566。如此，本發明的另一個方面提供一種當患者患有特徵為ERBB2低甲基化的癌症時，使用HER2抑制劑來治療患者的方法。因此，本文中提供鑑定更可能展現出受益於包含HER2抑制劑的療法的益處的個體的方法，所述方法包括檢測ERBB2基因部分中的低甲基化，其中 ERBB2 序列的低於約 50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%,15%,10%,5%,2%、或I %的甲基化指示該個體更可能受益於治療。
[0071]在一個實施 方案中，本發明提供一種在患者中治療癌症的方法，其包括對所述患者施用治療治療有效量的HER2抑制劑，其中所述患者在施用所述HER2抑制劑之前診斷為患有特徵為ERBB2低甲基化的癌症，其中所述ERBB2低甲基化指示該受試者對所述HER2抑制劑的治療響應性。在一個實施方案中，所述HER2抑制劑是小分子或抗體。在一個實施方案中，所述HER2抑制劑是抗體如曲妥珠單抗或T-DMl。
[0072]本發明的另一個方面提供一種為癌症患者選擇療法的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，並且當ERBB2基因檢測為低甲基化時，選出一種HER2抑制劑作為療法的步驟。
[0073]在檢測ERBB2基因的甲基化狀態的上文方法的一些實施方案中，針對甲基化狀態分析的ERBB2基因部分包含增強子區。在一些實施方案中，ERBB2基因部分包含增強子區和啟動子區。在一些實施方案中，ERBB2基因部分是在chrl7:37，861，100-37，863，650 (NCBI build37/hgl9)處的染色體位置或包含其的基因部分。在一些實施方案中，ERBB2基因部分是由SEQ ID N0:1代表的序列。在一些實施方案中，ERBB2基因部分包含SEQ ID NO:1的6CpG重複區。在一個實施方案中，ERBB2基因部分包含SEQ ID NO:2的6CpG重複區。
[0074]在一些實施方案中，在定量甲基化特異性PCR之前，將ERBB2基因的一部分預擴
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[0075]在上文方法的某些實施方案中，當檢測到分析的ERBB2基因序列部分低於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、或 I % 甲基化時，ERBB2 基因或該基因特定部分的甲基化狀態視為低甲基化的。
[0076]可通過許多方法學來分析樣品中各種生物標誌物的存在和/或水平/量，其中許多是本領域中已知且熟練技術人員理解的，包括但不限於免疫組織化學(「IHC」)、Western印跡分析、免疫沉澱、分子結合測定法、ELISA、ELIFA、螢光激活細胞分選(「FACS」)、MassARRAY、蛋白組學、基於血液的定量測定法(如例如血清ELISA)、生化酶活性測定法、原位雜交、Southern分析、Northern分析、全基因組測序、聚合酶鏈式反應(「PCR」)(包括定量實時PCR( 「qRT-PCR」)和其他擴增類型檢測方法，如例如分支的DNA、SISBA、TMA等)、RNA_Seq、FISH、微陣列分析、基因表達概況分析、和/或基因表達系列分析(「SAGE」)，以及可通過蛋白質、基因和/或組織陣列分析實施的許多種測定法中的任一種。用於評估基因和基因產物狀態的典型方案見於例如Ausubel等編，1995，Current Protocols In MolecularBiology, Units2(Northern Blotting),4(Southern Blotting),15 (Immunoblotting)和18 (PCR Analysis)。還可使用多重免疫測定法如那些可從Rules Based Medicine or MesoScale Discovery( 「MSD」)獲得的。
[0077]用於評估DNA甲基化的方法是公知的。例如，Laird(2010)Nature ReviewsGeneticsll:191-203提供關於DNA甲基化分析的綜述。在一些實施方案中，評估甲基化的方法包括將基因組DNA隨機剪切或隨機片段化，用甲基化依賴性或甲基化敏感性限制酶切割DNA，隨後選擇性鑑定和/或分析切割或未切割的DNA。選擇性鑑定可包括例如，分離切割和未切割的DNA (例如通過大小)並量化感興趣的切割或未切割的序列。參見例如，美國專利N0.7，186，512。在一些實施方案中，所述方法可涵蓋在限制酶消化後擴增完整的DNA，由此僅擴增在擴增區域中未被限制酶切割的DNA。參見例如，美國專利申請N0.10/971,986 ；11/071,013 ;和10/971,339。在一些實施方案中，擴增可使用基因特異性的引物進行。或者，可將接頭添加到隨機片段化的DNA的端，所述DNA可用甲基化依賴性或甲基化敏感性限制酶消化，完整DNA可使用與接頭序列雜交的引物擴增。在一些實施方案中，可實施第二步驟來測定DNA的擴增池中特定基因的存在、缺失或量。在一些實施方案中，使用實時定量PCR來擴增DNA。
[0078]在一些實施方案中，所述方法包括量化基因組DNA群體內的靶序列中的平均甲基化密度。在一些實施方 案中，所述方法包括使基因組DNA與甲基化依賴性限制酶或甲基化敏感性限制酶在允許基因座中至少一些潛在的限制酶切割位點的拷貝保持未切割的條件下接觸；量化基因座的完整拷貝；並將擴增產物的量與代表對照DNA甲基化的量的對照值比較，由此相比於對照DNA的甲基化密度量化基因座中的平均甲基化密度。
[0079]DNA基因座的甲基化的量可通過以下來測定:提供包含該基因座的基因組DNA樣品，將DNA用甲基化敏感或甲基化依賴性的限制酶切割，然後在感興趣的DNA基因座處量化完整DNA的量或量化切割DNA的量。完整或切割DNA的量將依賴於含有該基因座的基因組DNA的起始量，基因座中甲基化的量，和在基因組DNA中甲基化的基因座中核苷酸的數目(即部分)。DNA基因座中的甲基化量可通過將完整DNA或切割DNA的量與在類似處理的DNA樣品中代表完整DNA或切割DNA的量的對照值比較來測定。對照值能代表已知或預測數目的甲基化核苷酸。或者，對照值能代表來自另一種細胞(例如正常、未患病的)中的同一基因座或第二基因座的完整或切割DNA的量。
[0080]通過在允許基因座中至少一些潛在的限制酶切割位點的拷貝保持未切割的條件下使用甲基化敏感性或甲基化依賴性限制酶，隨後量化剩餘的完整拷貝，並將該量與對照比較，能測定基因座的平均甲基化密度。如果使甲基化敏感性限制酶與DNA基因座的拷貝在允許基因座中至少一些潛在的限制酶切割位點的拷貝保持未切割的條件下接觸，那麼剩餘的完整DNA將與甲基化密度直接成比例，如此可與對照比較來測定樣品中基因座的相對甲基化密度。類似地，如果使甲基化依賴性限制酶與DNA基因座的拷貝在允許基因座中至少一些潛在的限制酶切割位點的拷貝保持未切割的條件下接觸，那麼剩餘的完整DNA將與甲基化密度成反比，如此可與對照比較來測定樣品中基因座的相對甲基化密度。這類測定法披露在例如美國專利申請Ser.N0.10/971, 986中。
[0081]在一些實施方案中，可使用定量擴增方法(例如定量PCR或定量線性擴增)來量化限制性消化後由擴增引物側接的基因座中完整DNA的量。定量擴增的方法披露於例如美國專利 N0.6，180，349 ;6，033，854 ；和 5，972，602，以及例如 Gibson 等，GenomeResearch6:995-1001(1996) ；DeGraves 等，Biotechniques34 (I):106-10，112-5(2003)；Deiman B 等，Mo I Biotechnol.20 (2): 163-79 (2002)。
[0082]用於檢測DNA甲基化的其他方法可牽涉在用亞硫酸氫鹽處理DNA之前和之後的基因組測序。參見例如，Frommer 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1827-1831 (1992)。當將亞硫酸氫鈉與DNA接觸時，未甲基化的胞嘧啶被轉化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不被修飾。
[0083]在一些實施方案中，將從亞硫酸氫鹽轉化後的DNA擴增的PCR產物的限制酶消化用於檢測 DNA 甲基化。參見例如，Sadri&Hornsby, Nucl.Acids Res.24:5058-5059 (1996)；Xiong&Laird, Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)。
[0084]在一些實施方案中，單獨或與其他方法組合地使用MethyLight測定法來檢測DNA甲基化(參見 Eads 等，Cancer Res.59:2302-2306 (1999))。簡言之，在 MethyLight 方法中，基因組DNA在亞硫酸氫鈉反應中轉化(亞硫酸氫鹽方法將未甲基化的胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶)。然後，實施感興趣DNA序列的擴增，其使用與CpG 二核苷酸雜交的PCR引物。通過使用僅與得自未甲基化DNA的亞硫酸氫鹽轉化的序列(或者與未轉化的甲基化序列)雜交的引物，擴增可指示引物雜交之處序列的甲基化狀態。類似地，擴增產物可使用一種探針檢測，該探針特異性結合得自未甲基化(或甲基化)DNA的亞硫酸氫鹽處理的序列。如果期望的話，可將兩種引物和探針均用於檢測甲基化狀態。如此，用於與MethyLight使用的試劑盒可包括亞硫酸氫鈉以及在經亞硫酸氫鹽處理的甲基化和未甲基化DNA之間區分的引物或可檢測標記的探針(包括但不限於Taqman或分子信標探針)。其他試劑盒組分可包括，例如DNA擴增所需的試劑，包括但不限於PCR緩衝液、脫氧核苷酸；和熱穩定的聚合酶。
[0085]在一些實施方案中，單獨或與其他方法組合地使用Ms-SNuPE (甲基化敏感性單核苷酸引物延伸，MethyIation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension)來檢測DNA 甲基化(參見 Gonzalgo&Jones Nucleic Acids Res.25:2529-2531 (1997))。Ms-SNuPE技術是用於基於DNA的亞硫酸氫鹽處理來評估特定CpG位點處的甲基化差異，接著是單核苷酸引物延伸的定量方法。簡言之，使基因組DNA與亞硫酸氫鈉反應來將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而留下5-甲基胞嘧啶不變。然後使用特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的PCR引物來實施對期望靶序列的擴增，將所得產物分離並用作在感興趣的CpG位點處甲基化分析的模板。
[0086]在一些實施方案中，單獨或與其他方法組合地使用甲基化特異性PCR( 「MSP」)反應來檢測DNA甲基化。MSP測定法必須首先通過亞硫酸氫鈉來修飾DNA，將所有未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，隨後使用特異於甲基化相對於未甲基化DNA的引物進行擴增。參見，Herman 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826, (1996);美國專利N0.5，786，146。在一些實施方案中，DNA甲基化通過QIAGEN PyroMark CpG Assay預設計的焦磷酸測序DNA甲基化測定法檢測。
[0087]在一些實施方案中，使用高通量DNA甲基化分析來測定細胞甲基化狀態以確定對EGFR抑制劑的敏感性。簡言之，從細胞或組織樣品(例如腫瘤樣品或血液樣品)分離基因組DNA並在亞硫酸氫鈉反應中轉化(亞硫酸氫鹽方法將未甲基化的胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶)，其使用本領域中的標準測定法。將經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物擴增、片段化並與含有來自整個基因組的CpG位點的陣列雜交，其使用本領域中的標準測定法。雜交後，將陣列成像，並使用本領域中的標準測定法處理用於分析DNA甲基化狀態。在一些實施方案中，所述組織樣品是福馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是新鮮冷凍的組織。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增，其通過使用 Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR 系統和 Platinum Taq0 在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前使用基於Taqman的測定法將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，所述亞硫酸氫鈉反應使用Zymo EZ DNA甲基化試劑盒進行。在一些實施方案中，擴增經亞硫酸氫鹽轉化的DNA並與陣列雜交,其使用Illumina InfiniumHumanMethylation450Beadchip 試劑盒。在一些實施方案中，將陣列在 Illumina iScanReader上成像。在一些實施方案中,將圖像用GenomeStudio軟體甲基化模塊處理。在一些實施方案中，使用Bioconductor Iumi軟體程序包來分析甲基化數據。參見Du等，Bioinformatics, 24(13):1547-1548 (2008)。
[0088]在一些實施方案中，使用亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)鑑定ERBB2DNA甲基化位點以確定對EGFR抑制劑的敏感性。簡言之，從細胞或組織樣品(例如腫瘤樣品或血液樣品)分離基因組DNA並在亞硫酸氫鈉反應中轉化(該亞硫酸氫鹽方法將未甲基化的胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶)，其使用本領域中的標準測定法。將經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物用設計為特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的引物(例如亞硫酸氫鹽特異性引物)擴增並連接到載體中用於轉化到宿主細 胞中，其使用本領域中的標準測定法。在選出含有PCR擴增的、經亞硫酸氫鹽轉化的、感興趣的DNA產物的宿主細胞之後，分離DNA產物並測序以確定甲基化的位點，其使用本領域中的標準測定法。在一些實施方案中，所述組織樣品是福馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是FFPE組織，其已經過處理用於IHC分析；例如針對ERBB2表達。在一些實施方案中，所述組織樣品是通過IHC顯示極少或無ERBB2表達的FFPE組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是新鮮冷凍的組織。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增,其使用Invitrogen Superscript IIIOne-Step RT-PCR系統和Platinum Taq0在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前使用基於Taqman的測定法將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，所述亞硫酸氫鈉反應使用Zymo EZ DNA甲基化金試劑盒進行。在一些實施方案中，設計為特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express軟體設計的。在一些實施方案中，所述亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物是使用Invitrogen Superscript IIIOne-Step RT-PCR System和Platinum Taq PCR擴增的。在進一步的實施方案中，PCR擴增的、經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物使用Invitrogen TOPO TA克隆試劑盒連接到載體中。在一些實施方案中，宿主細胞是細菌。在一些實施方案中，分離的PCR擴增的、經亞硫酸氫鹽轉化的、感興趣的DNA產物使用Applied Biosystems3730xIDNA Analyzer測序。在一些實施方案中，設計為特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的引物是使用Qiagen PyroMark AssayDesign軟體設計的。在一些實施方案中，經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物是使用InvitrogenSuperscript III One-Step RT-PCR System 和 Platinum Taq PCR 擴增的。在進一步的實施方案中，PCR擴增的、經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物使用Qiagen Pyromark Q24測序並用Qiagen PyroMark 軟體分析。
[0089]在一些實施方案中，使用定量甲基化特異性PCR (QMSP)來鑑定ERBB2DNA甲基化位點以確定對EGFR或HER2抑制劑的敏感性。簡言之，從細胞或組織樣品分離基因組DNA並在亞硫酸氫鈉反應中轉化(該亞硫酸氫鹽方法將未甲基化的胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶)，其使用本領域中的標準測定法。在一些實施方案中，所述組織樣品是福馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是FFPE組織，其已經過處理用於IHC分析；例如針對ERBB2表達。在一些實施方案中，所述組織樣品是通過IHC顯示極少或無ERBB2表達的FFPE組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是新鮮冷凍的組織。經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物是使用設計為特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的引物(例如定量甲基化特異性PCR引物)擴增的。將經亞硫酸氫鹽轉化的DNA產物使用定量甲基化特異性PCR引物擴增並分析甲基化，其使用本領域中的標準測定法。在一些實施方案中，所述組織樣品是福馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織。在一些實施方案中，所述組織樣品是新鮮冷凍的組織。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增，其使用Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR 系統和 Platinum Taq0 在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，在亞硫酸氫鹽轉化前使用基於Taqman的測定法將從組織樣品分離的DNA預擴增。在一些實施方案中，所述亞硫酸氫鈉反應使用商品化的試劑盒進行。在一些實施方案中，所述亞硫酸氫鈉反應使用Zymo EZ DNA甲基化金試劑盒進行。在一些實施方案中，設計為特異於經亞硫酸氫鹽轉化的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express軟體設計的。在一些實施方案中，經亞硫酸氫鹽轉化的DNA是使用基於Taqman的測定法擴增的。在一些實施方案中，在Applied Biosystems7900HT上擴增經亞硫酸氫鹽轉化的DNA並使用AppliedBiosystems SDS 軟體分析。
[0090]在一些實施方案中，本發明提供測定ERBB2甲基化的方法，其通過I)對腫瘤樣品的IHC分析，接著是2)對從步驟I的IHC分析中使用的腫瘤組織提取的DNA的定量甲基化特異性PCR。簡言之，通過以下兩種方法之一從IHC載玻片移去蓋玻片:將載玻片置於冷凍器中達至少15分鐘，然後使用剃刀片從顯微鏡載玻片撬開蓋玻片。然後，將載玻片在二甲苯中室溫溫育以溶解封固劑。或者，將載玻片浸泡在二甲苯中直至蓋玻片脫落。這可能佔用數天。所有載玻片都通過5分鐘二甲苯(x3)和5分鐘100%乙醇(x2)的脫石蠟化規程。將組織用剃刀片從載玻片刮下，置於含有蛋白酶K的組織裂解緩衝液中，並在56°C過夜溫育。在其中組織在溫育後仍然存在的情況中，可再添加IOy I蛋白酶K，並將組織再溫育30分鐘。繼續DNA提取；例如通過使用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒。對從IHC載玻片直接提取的DNA進行QMSP分析，其使用如上文描述的QMSP3引物和探針。
[0091]在一些實施方案中，通過深度測序來對經亞硫酸氫鹽轉化的DNA測序。深度測序是其中多次讀序列的方法，如直接焦磷酸測序。深度測序可用於檢測稀有事件如稀有突變。對有限數目基因座的超深度測序可通過對PCR產物的直接焦磷酸測序和通過在單次運行中對超過100種PCR產物測序來實現。在對經亞硫酸氫鹽轉化的DNA測序中的挑戰源於其在胞嘧啶殘基到胸腺嘧啶(尿嘧啶)殘基的亞硫酸氫鹽轉化後的低序列複雜性。可引入降低代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulphite sequencing,RRBS)來減少序列冗餘，其通過僅選擇基因組的一些區域來通過DNA片段的大小-分斷分離(size-fractionation)測序(Laird, Pff Nature Reviewsll: 195-203 (2010))。革巴向可通過在測序前陣列捕捉或掛鎖捕捉(padlock capture)來完成。例如，在固定陣列上或通過溶液雜交選擇的靶向性捕捉能富集DNA或RNA寡核苷酸庫靶向的序列並且可在亞硫酸氫鹽轉化之前或之後實施。或者，掛鎖捕捉提供改進的富集效率，其通過組合兩種系留探針的增加的退火特異性，隨後使用通用引物來進行擴增，其允許比使用基因座特異性引物擴增更均衡的代表性。
[0092]其他甲基化檢測方法包括但不限於，甲基化的CpG島擴增(參見Toyota等，Cancer Res.59:2307-12 (1999))和記載於例如美國專利公開文本2005/0069879 ；Rein等，Nucleic Acids Res.26 (10): 2255-64 (1998) ;01ek等，Nat Genet.17 (3): 275-6 (1997)；Laird, Pff Nature Reviewsll: 195-203 (2010);和 PCT 公開文本 N0.TO00/70090)的那些。
[0093]在一些實施方案中，通過評估細胞中的ERBB2mRNA來測定細胞中的ERBB2表達。用於評估細胞中mRNA的方法是公知的，且包括例如使用互補DNA探針的雜交測定法(如使用特異於一種或多種基因的經標記riboprobe的原位雜交、Northern印跡和相關技術)和各種核酸擴增測定法(如RT-PCR，其使用特異於一種或多種基因的互補引物，和其他擴增類型檢測方法如例如分支的DNA、SISBA、TMA等)。在一些實施方案中，比較ERBB2在測試樣品與參照樣品中的表達。例如，測試樣品可以是腫瘤組織樣品，參照樣品可以是來自正常組織或細胞如PBMC。
[0094]來自哺乳動物的樣品可使 用Northern、點印記或PCR分析方便地測定。另外,這類方法可包括允許測定生物學樣品中靶mRNA的水平的一個或多個步驟(例如通過同時檢查「看家」基因如肌動蛋白家族成員的比較性對照mRNA序列的水平)。任選地，可測定擴增的靶cDNA的序列。
[0095]本發明的任選方法包括在組織或細胞樣品中通過微陣列技術來檢查或檢測mRNA如靶mRNA的方案。使用核酸微陣列，將來自測試和對照組織樣品的測試和對照mRNA樣品逆轉錄並標記以生成cDNA探針。然後，將探針與固定化在固體支持物上的核酸陣列雜交。陣列配置為使得陣列的每個成員的序列和位置都是已知的。例如，可將其表達與抗血管生成療法的增加或降低的臨床益處相關的基因選擇排列在固體支持物上。經標記探針與特定陣列成員的雜交指示該探針來源的樣品表達該基因。
[0096]依照一些實施方案，通過觀察前述基因的蛋白質表達水平來測量存在和/或水平/量。在某些實施方案中，所述方法包括使生物學樣品與針對本文中描述的生物標誌物的抗體在允許生物標誌物結合的條件下接觸，並檢測抗體與生物標誌物之間是否形成複合物。這類方法可以是體外或體內方法。
[0097]在某些實施方案中，使用IHC和染色方案來檢查樣品中生物標誌蛋白的存在和/或水平/量。已顯示組織切片的IHC染色是測定或檢測樣品中蛋白質存在的可靠方法。在一個方面，使用包括以下的方法測定生物標誌物的水平，包括:(a)使用抗體實施對樣品(如受試者癌症樣品)的IHC分析；並13)測定樣品中生物標誌物的水平。在一些實施方案中，相對於參照值測定IHC染色強度。
[0098]IHC可與另外的技術如形態學染色和/或螢光原位雜交組合實施。IHC有兩種一般性方法；直接和間接測定法。依照第一種測定法，直接測定抗體對靶抗原的結合。該直接測定法使用經標記的試劑，如螢光標籤或酶標記的一抗，其可以在沒有別的抗體相互作用的情況下可視化。在典型的間接測定法中，未綴合的一抗結合抗原，然後經標記的二抗結合該一抗。在二抗綴合於酶標記物的情況下，添加生色或產螢光底物以提供抗原的可視化。發生信號擴增，因為幾種二抗可以與一抗上的不同表位反應。
[0099]用於IHC的一抗和/或二抗通常用可檢測模塊標記。存在大量標記，其一般可分組成以下類別:(a)放射性同位素，如35S、14C、1251、3H和131I ； (b)膠體金顆粒；(C)螢光標記物，包括但不限於稀土螯合物(銪螯合物)、Texas Red、羅丹明、螢光素、丹醯、麗絲胺(Lissamine)、傘形酮(umbelIiferone)、藻紅蛋白(phycocrytherin)、藻藍蛋白、或商品化的螢光團如SPECTRUM 0RANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一種或多種的衍生物；(d)存在各種酶-底物標記物，且美國專利N0.4，275，149提供了對其中一些的綜述。酶標記物的例子包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利N0.4，737，456)、螢光素、2，3- 二氫酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶(Iactoperoxidase)、微過氧化物酶(microperoxidase)等。
[0100]酶-底物組合的例子包括，例如辣根過氧化物酶(HRPO)和作為底物的過氧化氫酶；鹼性磷酸酶(AP)和作為生色底物的對硝基苯基磷酸；和β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)與生色底物(例如對硝基苯基-D-半乳糖苷酶)或產螢光底物(例如4-甲基傘形基(methylumbellife ryl)-P-D-半乳糖苷酶)。對於這些的一般性綜述，參見美國專利N0.4，275，149 和 4，318，980。
[0101]可將如此製備的標本封固並蓋上蓋玻片。然後確定載玻片評估，例如使用顯微鏡，並可採用本領域中常規使用的染色強度標準。在一些實施方案中，約1+或更高的染色模式得分是診斷性和/或預後性的。在某些實施方案中，IHC測定法中約2+或更高的染色模式得分是診斷性和/或預後性的。在其他實施方案中，約3或更高的染色模式得分是診斷性和/或預後性的。在一個實施方案中，理解當使用IHC檢查來自腫瘤或結腸腺瘤的細胞和/或組織時，通常在腫瘤細胞和/或組織中測定或評估染色(相對於可能存在於樣品中的基質或周圍組織)。
[0102]在備選的方法中，可使樣品與特異於生物標誌物的抗體在足以形成抗體-生物標誌物複合物的條件下接觸，然後檢測該複合物。可以許多途徑來檢測生物標誌物的存在，如通過Western印跡和ELISA規程，其用於測定很多種組織和樣品，包括血漿或血清。有大量使用這類測定形式的免疫測定技術，參見例如美國專利N0.4，016，043,4, 424，279和4，018，653。這些包括非競爭型的單位點和雙位點或「三明治式」測定法，以及傳統的競爭性結合測定法。這些測定法還包括經標記抗體對靶生物標誌物的直接結合。
[0103]選定的生物標誌物在組織或細胞樣品中的存在和/或水平/量還可經由功能性或基於活性的測定法來檢查。例如，如果生物標誌物是酶，可以進行本領域中已知的測定法來測定或檢測給定的酶活性在組織或細胞樣品中的存在。
[0104]在某些實施方案中，針對測定的生物標誌物的量中的差異和使用的樣品質量中的可變性，以及測定輪數之間的變異性兩者將樣品標準化。這類標準化可通過檢測並納入特定標準化生物標誌物(包括公知的看家基因如ACTB)水平來實現。或者，標準化可基於所有測定基因或其較大子集的均值或中值信號(全局標準化辦法)。在一個基因接一個基因的基礎上，將受試者腫瘤mRNA或蛋白質的測量的經標準化的量與在參照集中發現的量比較。每種mRNA或蛋白質每份測試腫瘤每位受試者的經標準化表達水平可表示為在參照集中測量的表達水平的百分數。在要分析的特定受試者樣品中測量的存在和/或表達水平/量將落在該範圍內的某個百分數處，這可通過本領域中公知的方法來測定。
[0105]在某些實施方案中，如下測定基因的相對表達水平:
[0106]相對表達基因I樣品I = 2exp (Ct看家基因_ Ct基因I)，Ct在樣品中測定。
[0107]相對表達基因I參照RNA = 2exp (Ct看家基因_ Ct基因I)，Ct在參照樣品中測
定。
[0108]標準化的相對表達基因I樣品I =(相對表達基因I樣品I/相對表達基因I參照 RNA)xlOO
[0109]Ct是閾值循環。Ct是反應中生成的螢光與閾值線相交的循環數。
[0110]將所有試驗均對參照RNA標準化，參照RNA是來自各種組織來源的RNA的廣泛混合物(例如參照RNA#636538，來自Clontech, Mountain View, CA) ?將等同的參照RNA包含在每次qRT-PCR運行中，從而允許在不同的實驗輪之間比較結果。
[0111]在一個實施方案中，所述樣品是臨床樣品。在另一個實施方案中，所述樣品用在診斷性測定法中。在一些實施方案中，所述樣品從原發性或轉移性腫瘤獲得。經常使用組織活組織檢查(biopsy)來獲得腫瘤組織的代表性的片/塊。或者，可以以已知或認為含有感興趣腫瘤細胞的組織或流體的形式間接獲得腫瘤細胞。例如，可通過切除、支氣管鏡檢、細針抽吸、支氣管刷檢、或從痰、胸膜液或血液獲得肺癌損傷的樣品。在一些實施方案中，所述樣品包括循環的腫瘤細胞；例如血液、尿液或痰中的循環癌細胞。可從癌症或腫瘤組織或從其他身體樣品如尿液、痰、血清或血漿檢測基因或基因產物。上文論述的用於檢測癌性樣品中靶基因或基因產物的相同技術可應用於其他身體樣品。癌細胞可能從癌損傷脫落並出現在這類身體樣品中。通過篩選這類身體樣品，可實現對這些癌症的簡單的早期診斷。另外，通過測試這類身體樣品中的靶基因或基因產物能更容易地監測治療的進展。
[0112]在某些實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織是來自同一受試者或個體的單一樣品或組合的多重樣品，其在不同於獲得測試樣品時的一個或多個時間點獲得。例如，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織在早於獲得測試樣品時的時間點從同一受試者或個體獲得。如果參照樣品在癌症的初始診斷期間獲得而測試樣品在癌症變成轉移性時的更晚時候獲得，那麼這類參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織可以是有用的。
[0113]在某些實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織是來自一個或多個並非該受試者或個體的健康個體的組合的多重樣品。在某些實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織是來自患有疾病或病症(例如癌症)的、並非該受試者或個體的一個或多個個體的組合的多重樣品。在某些實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織是來自一個或多個並非該受試者或個體的個體的正常組織的合併RNA樣品或合併的血漿或血清樣品。在某些實施方案中，參照樣品、參照細胞、參照組織、對照樣品、對照細胞或對照組織是來自患有疾病或病症(例如癌症)的、並非該受試者或個體的一個或多個個體的腫瘤組織的合併RNA樣品或合併的血漿或血清樣品。
[0114]在本發明的方法中，組織樣品可以是體液或排洩物如血液、尿液、唾液、糞、胸膜液、淋巴液、痰、腹水、前列腺液、腦脊髓液(CSF)、或任一種其他的身體分泌物或其衍生物。血液意為包括全血液、血漿、血清或血液的任何衍生物。在其中侵入性取樣方法不適宜或不方便的情況下，有時可優選在這類體液或排洩物中評估腫瘤上皮或間充質生物標誌物。
[0115]在本發明的方法中，腫瘤細胞可以是肺癌腫瘤細胞(例如非小細胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌腫瘤細胞、乳腺癌腫瘤細胞、頭和頸癌腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、結腸癌腫瘤細胞、卵巢癌腫瘤細胞、或來自如下文中描述的多種其他癌症中任一種的腫瘤細胞。所述腫瘤細胞優選為已知或預期表達EGFR的類型，來自實體腫瘤的所有腫瘤細胞均如此。EGFR激酶可以是野生型或突變體形式。
[0116]在本發明的方法中，腫瘤可以是肺癌腫瘤(例如非小細胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌腫瘤、乳腺癌腫瘤、頭和頸癌腫瘤、胃癌腫瘤、結腸癌腫瘤、卵巢癌腫瘤、或來自如下文中描述的多種其他癌症中任一種的腫瘤。所述腫瘤優選為其細胞已知或預期表達EGFR的類型，如所有實體腫瘤均如此。EGFR可以是野生型或突變體形式。
[0117]抑制劑和藥物組合物
[0118]適用於本發明的例示性EGFR激酶抑制劑包括，例如喹唑啉EGFR激酶抑制劑、吡啶並嘧啶EGFR激酶 抑制劑、嘧啶並嘧啶EGFR激酶抑制劑、吡咯並嘧啶EGFR激酶抑制劑、吡唑並嘧啶EGFR激酶抑制劑、苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制劑、羥吲哚EGFR激酶抑制劑、indolocarbazole EGFR激酶抑制劑、酞嗪EGFR激酶抑制劑、異黃酮EGFR激酶抑制劑、quinalone EGFR激酶抑制劑、和tyrphostin EGFR激酶抑制劑，如記載於以下專利公開文本的那些，和EGFR激酶抑制劑的所有藥學可接受的鹽和溶劑合物:國際專利公開文本 N0.W096/33980、W096/30347、W097/30034、W097/30044、W097/38994、W097/49688、TO98/02434、TO97/38983、TO95/19774、TO95/19970、TO97/13771、TO98/02437、W098/02438, W097/3288U W098/33798, W097/32880, W097/3288, W097/02266、W097/27199、W098/07726、W097/34895、W096/31510、W098/14449、W098/14450、W098/14451、W095/09847、W097/19065、W098/17662、W099/35146、W099/35132、W099/07701 和 W092/20642 ；歐洲專利申請 N0.EP520722、EP566226、EP787772、EP837063 和 EP682027 ;美國專利N0.5，747，498,5, 789，427,5, 650，415 和 5，656，643 ;和德國專利申請 N0.DE19629652。低分子量EGFR激酶抑制劑的其他非限制性例子包括Traxler, P.，1998，Exp.0pin.Ther.Patents8 (12): 1599-1625中描述的任一種EGFR激酶抑制劑。
[0119]可依照本發明使用的低分子量EGFR激酶抑制劑的特定優選的例子包括[6，7_ 二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(亦稱為0S1-774、厄洛替尼或 TARCEVA? (厄洛替尼 HCl) ；0SI Pharmaceuticals/Genentech/Roche)(美國專利 N0.5，747，498 ;國際專利公開文本 N0.W001/34574 和 Moyer, J.D.等(1997) CancerRes.57:4838-4848) ;CI_1033 (之前已知為 PD183805 ；Pfizer) (Sherwood 等，1999，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40:723) ；PD-158780 (Pfizer) ；AG-1478 (University ofCalifornia) ；CGP-59326(Novartis) ；PK1-166(Novartis) ；EKB-569(Wyeth) ；Gff-2016(亦稱為GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate) ；GSK);和吉非替尼(亦稱為 ZDl839 或 IRESSA? ；Astrazeneca) (Woodburn 等，I"7, Proc.Am.Assoc.CancerRes.38:633)。可依照本發明使用的一種特別優選的低分子量EGFR激酶抑制劑是[6，7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即厄洛替尼)、其鹽酸鹽(即厄洛替尼HC1，TARCEVA?)、或其他鹽形式(例如甲磺酸(mesylate)厄洛替尼)。
[0120]基於抗體的EGFR激酶抑制劑包括任何抗EGFR抗體或抗體片段，其能部分或完全地阻斷EGFR通過其天然配體的活化。基於抗體的EGFR激酶抑制劑的非限制性例子包括記載於 Modjtahedi, H.，等，1993, Br.J.Cancer67:247-253 ；Teramoto, T.,等，1996，Cancer77:639-645 ;Goldstein 等，1995，Cl in.Cancer Res.1:1311-1318 ;Huang, S.M.,等,1999, Cancer Res.15:59 (8): 1935-40 ；和 Yang, X.,等,1999, CancerRes.59:1236-1243的那些。如此，EGFR激酶抑制劑可以是單克隆抗體Mab E7.6.3 (Yang, X.D.等(1999)Cancer Res.59:1236-43)、或MabC225 (ATCC登錄號HB-8508)，或具有其結合特異性的抗體或抗體片段。適宜的單克隆抗體EGFR激酶抑制劑包括但不限於MC-C225 (亦稱為西妥昔單抗或 ERBITUX? ； Imclone Systems)、ABX-EGF (Abgenix)、EMD72000 (MerckKgaA,Darmstadt)> RH3(York Medical Bioscience Inc.)和 MDX-447(Medarex/MerckKgaA)。
[0121 ] 多種HER2抑制劑是本領域中已知的。這些抑制劑包括抗HER2抗體。這些抗體優選是單克隆抗體。它們可以是所謂的嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。人源化抗HER2抗體的例子以INN名稱曲妥珠單抗和帕妥珠單抗(Pertuzumab)已知。曲妥珠單抗由GenentechInc.和F.Hoffmann-La Ro che Ltd在商標名HERCEPTIN?下銷售。曲妥珠單抗是具有鼠4D5抗體(ATCC CRL10463，根據布達佩斯條約於1990年5月24日保藏在美國典型培養物保藏中心，12301Parklawn Drive, Rockville, Md.20852)的抗原結合殘基或源自其的抗體。例示性的人源化 4D5 抗體包括如 US5821337 中的 huMAb4D5_l、huMAb4D5_2、huMAb4D5_3、huMAb4D5-4、huMAb4D5_5、huMAb4D5_6、huMAb4D5_7 和 huMAb4D5_8 ( HERCEPTIN'? )。
[0122]另一種合適的抗HER2抗體是曲妥珠單抗-MCC-DMl (T-DMl)，一種抗體-藥物綴合物(CAS註冊號139504-50-0)，其具有以下結構:
[0123]
【權利要求】
1.一種測定腫瘤細胞生長對通過EGFR激酶抑制劑的抑制的敏感性的方法，其包括檢測樣品腫瘤細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因的低甲基化指示所述腫瘤細胞生長對使用所述EGFR抑制劑的抑制敏感。
2.一種鑑定很可能受益於使用EFGR抑制劑治療的癌症患者的方法，其包括從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，其中如果ERBB2基因的甲基化狀態檢測為低甲基化，那麼將所述患者鑑定為很可能受益於使用所述EGFR抑制劑治療。
3.權利要求1或2的方法，其中在ERBB2基因的一部分中檢測甲基化狀態。
4.權利要求3的方法，其中所述ERBB2基因的一部分是增強子。
5.權利要求3的方法，其中所述ERBB2基因的一部分是增強子和啟動子。
6.權利要求3-5中任一項的方法，其中所述ERBB2基因的一部分包含6CpG重複區。
7.權利要求3-6中任一項的方法，其中所述ERBB2基因的一部分包含SEQID NO:1的核酸序列。
8.權利要求6的方法，其中所述ERBB2基因的一部分由SEQID N0:2的核酸序列組成。
9.權利要求1或2的方法，其中低甲基化由ERBB2基因的甲基化低於約50%指示。
10.權利要求9的方法，其中低甲基化由ERBB2基因的甲基化低於約20%指示。
11.權利要求3-8中任 一項的方法，其中低甲基化由所述ERBB2基因的一部分的甲基化低於約50%指示。
12.權利要求11的方法，其中低甲基化由所述ERBB2基因的一部分的甲基化低於約20%指示。
13.權利要求2的方法，其進一步包括如果所述患者被鑑定為將很可能受益於使用EGFR抑制劑治療的患者，那麼對所述患者施用治療有效量的EGFR抑制劑。
14.一種在患者中治療癌症的方法，其包括對所述患者施用治療有效量的EGFR抑制劑，其中所述患者在施用所述EGFR抑制劑之前診斷為具有展現出ERBB2基因低甲基化的癌症，其中ERBB2基因低甲基化指示所述受試者對所述EGFR抑制劑的治療響應性。
15.—種為癌症患者選擇療法的方法,其包括: a.從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，並 b.當ERBB2基因檢測為低甲基化時，選出EGFR抑制劑作為療法。
16.權利要求15的方法，其進一步包括對所述患者施用治療有效量的所述EGFR抑制劑。
17.權利要求15或16的方法，其中所述EGFR抑制劑是厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)或中白尼單抗(panitumumab)。
18.一種測定細胞中ERBB2基因的過表達的方法，其包括檢測所述細胞中ERBB2基因的甲基化狀態，其中ERBB2基因低甲基化指示所述細胞中ERBB2的過表達。
19.權利要求18的方法，其中在ERBB2基因的一部分中檢測甲基化狀態。
20.權利要求19的方法，其中所述ERBB2基因的一部分是增強子。
21.權利要求19的方法，其中所述ERBB2基因的一部分是增強子和啟動子。
22.權利要求18-21中任一項的方法，其中所述ERBB2基因的一部分包含6CpG重複區。
23.權利要求18-21中任一項的方法，其中所述ERBB2基因的一部分包含SEQID NO:1的核酸序列。
24.權利要求22的方法，其中所述ERBB2基因的一部分包含SEQID N0:2的核酸序列。
25.權利要求18的方法，其中低甲基化由ERBB2基因的甲基化低於約50%指示。
26.權利要求25的方法，其中低甲基化由ERBB2基因的甲基化低於約20%指示。
27.權利要求19-24中任一項的方法，其中低甲基化由所述ERBB2基因的一部分的甲基化低於約50%指示。
28.權利要求27的方法，其中低甲基化由所述ERBB2基因的一部分的甲基化低於約20%指示。
29.—種在患者中治療癌症的方法，其包括對所述患者施用治療有效量的HER2抑制劑，其中所述患者在施用所述HER2抑制劑之前診斷為具有展現出ERBB2基因低甲基化的癌症，其中ERBB2基因低甲基化指示所述受試者對所述HER2抑制劑的治療響應性。
30.一種為癌症患者選擇療法的方法，其包括: a.從來自所述患者的癌症的樣品檢測ERBB2基因的甲基化狀態，並 b.當ERBB2基因檢測為低甲基化時，選出HER2抑制劑作為療法。
31.權利要求30的方法，其進一步包括對所述患者施用治療有效量的所述HER2抑制劑。
32.權利要求31的方法,其中所述HER2抑制劑是曲妥珠單抗(trastuzumab)或曲妥珠單抗-DMl。
33.前述權利要求中任一項的方法，其中甲基化狀態通過焦磷酸測序檢測。
34.前述權利要求中任一項的方法，其中ERBB2基因來自福馬林固定、石蠟包埋的(FFPE)組織或來自新鮮冷凍的組織。
35.權利要求34的方法，其中在焦磷酸測序前將從所述組織樣品分離的ERBB2基因預擴增。
36.權利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞是NSCLC腫瘤細胞。
37.權利要求2、14或15中任一項的方法，其中所述癌症是NSCLC。
【文檔編號】C12Q1/68GK104024432SQ201280053486
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年8月30日 優先權日:2011年8月31日
【發明者】D.沙梅斯, T.E.加努阿里奧 申請人:基因泰克公司