改善傷口癒合的方法

2023-08-13 04:35:36

專利名稱：改善傷口癒合的方法
技術領域：
本發明涉及傷口癒合的過程。特別的，本發明涉及改善穿孔鼓膜或傷口癒合或閉合的新方法，以及使疤痕形成最小化和除去壞死組織的方法。本發明還涉及用於研究傷口癒合過程的動物模型，以及鑑別和評價改善穿孔鼓膜或傷口癒合的藥物和治療方法的篩選方法。
背景技術：
緩慢或不適當的傷口癒合危害著許多人群的生活質量。一種可存在問題的傷口癒合的特別類型為鼓膜(鼓室膜)穿孔的癒合。雖然大多數的穿孔可以自然癒合，可通過先於內生結締組織產生之前的角質化鱗狀上皮增生達到閉合，但是仍然有一些穿孔無法癒合，通常導致聽力喪失或其它併發症。為什麼一些穿孔能癒合，然而其它的卻保持未閉合，仍然是目前亟待解決的問題。此外，在美國每年有超過125萬的人遭受燒傷，有650萬人患有由於壓力、靜脈停滯、或糖尿病導致的慢性皮膚潰瘍。
傷口癒合為一種動態的組織改造(remodeling)過程，它包括富含纖維蛋白和纖連蛋白的基質在傷口部位的形成，中性白細胞和巨噬細胞的浸潤，表皮角質細胞在傷口邊緣的增殖及其通過臨時基質的遷移，含有新發育的血管和遷移的炎症細胞和成纖維細胞的肉芽組織的形成，和傷口收縮。皮膚傷口癒合的研究表明，蛋白酶在許多步驟中扮演著重要的角色。現有的完備記錄表明，發生於傷口癒合和其它ECM改造過程中的細胞外基質(ECM)的降解依賴於炎症細胞分泌的各種蛋白水解酶的作用，和基質組織細胞成分的作用。許多不同的蛋白酶被認為在傷口癒合過程中有利於基質的改造(Sakselaand Rifkin，Annu.Rev.Cell Biol.4，93-126(1988))。然而，該過程的精確機理，以及它們是如何調控的，都知之甚少。
纖溶酶原-活化系統纖溶酶原-活化系統為一種多用的，暫時調控的酶系統，其中纖溶酶原被活化成為蛋白水解酶-纖溶酶，下述兩種生理纖溶酶原激活劑(PAs)組織型纖溶酶原激活劑(tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)中的任何一種都能促進該過程的發生。該系統的活化首先是由外部信號導致的特定細胞釋放tPA或uPA而引發的，並導致局部表現出胞外蛋白酶活性(Vassalli et al.J.Exp.Med.159，1653-1668(1984)；Saksela Rifkin，1988，supra)。PA-系統同時也由直接抑制PAs和纖溶酶的特殊抑制劑調控，抑制劑包括PA-抑制劑1(PAI-1)，PA-抑制劑2(PAI-2)，蛋白酶連接蛋白1(PN-1)和α2-抗纖溶酶(Saksela Rifkin，1988，supra；Ny et al.，Thromb Res.71(1)1-45(1993))。所有的這些屬於絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的抑制劑，均為被同族蛋白酶酶切的自殺抑制劑(Wilczynska et al.，J Biol Chem.270(50)29652-5(1995)；Wilczynska et al.，Nat Struct Biol.4(5)354-7(1997))。PA-系統最重要的特性在於由纖溶酶原轉變為纖溶酶形式導致的放大作用。
研究發現PAs與一些類型的基質金屬蛋白酶(MMPs)一起存在於傷口的邊緣，其中的基質金屬蛋白酶包括間質膠原酶(MMP-1)，溶基質素-1(MMP-3)，以及明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)的潛在形式。PAs和MMPs的表達都是由炎症介質和細胞因子誘導產生的，這表明上述兩個酶系統的作用可能是一致的。目前，已知MMPs是作為能通過限制性蛋白水解作用活化的潛在前體酶合成的，但是體內發生該活化作用的確切機制還不為人知。纖溶酶是涉及金屬蛋白酶一些亞基活化作用的推測因子之一(Lijnen，Thromb Haemost 86(1)324-33(2001))。
許多報導表明，MMPs，金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)，PAs和PA-抑制劑的表達或活化在傷口癒合過程中發生變化，同時還表明，纖溶酶在皮膚傷口癒合中起作用(Romer et al.，Nat.Med.2287-292(1996))。此外，Verheijen的美國專利5925350和6033664描述了採用uPA或tPA促進慢性或非癒合性傷口癒合的應用。在這些研究中，強調了上述促進機制不與纖維蛋白溶酶活性或壞死組織清除相關。同時，還提供了一種改善鼓膜癒合的特殊方法，即在局部給藥高濃度的透明質酸鹽(hyaluronan)(Laurent et al.，ArchOtolaryngol Head Neck Surg1141435-1441(1988))或鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF；Fina et al.，Laryngoscope103(7)804-809(1993))。
雖然對傷口癒合及其各種調控機制的理解加深了，以及提出了有前景的治療方法，但是慢性或非癒合性鼓膜穿孔或其它傷口的癒合仍然是現存的醫學問題和社會問題。因此，本領域需要提出新的加速傷口癒合過程的改進方法，例如鼓膜穿孔、燒傷和皮膚潰瘍的癒合，任何壞死組織的除去，和疤痕形成的最小化等。同時，還需要提出新的篩選方法，通過該方法能鑑別和評估用於上述治療方法的藥物。本發明滿足了該領域的這些需要以及其它需求。
發明概述本發明涉及一種通過給藥纖溶酶原，改善鼓膜穿孔癒合，或在癒合過程中使疤痕形成最小化的新方法。
因此，本發明提供了一種改善需要治療的受治療者的鼓膜穿孔癒合的方法，該方法包括向受治療者給藥一種包含有效量改善鼓膜穿孔癒合的纖溶酶原的組合物的步驟。優選的，所述的受治療者為人類，所述的纖溶酶原為人纖溶酶原。該組合物還包括一種藥學上可接受的載體，同時也可以是水性溶液形式，膠體，洗液，軟膏，粉劑，糊劑，繃帶，傷口敷料，或其它合適的輸送載體形式。所述的纖溶酶原可以是局部的或全身的給藥。在局部給藥的情況下，所給藥的組合物可以包含約為0.05mg至約10mg的纖溶酶原，優選約為0.5至約5mg的纖溶酶原。
所述的組合物可以通過加速穿孔癒合，減少壞死組織，和減少傷口部位疤痕組織形成來改善癒合。在一具體實施方案中，纖溶酶原的給藥重複至少一次，優選每天至少一次。
本發明還提供了一種在需要治療的受治療者的癒合傷口上減少疤痕形成的方法，該方法包括向受治療者給藥一種包含有效量的減少疤痕形成的纖溶酶原的組合物的步驟。例如，所述的纖溶酶原可以減少纖維蛋白的沉積。所述的受治療者優選為人類受治療者，所述的纖溶酶原優選為人纖溶酶原。在一具體實施方案中，所述的纖溶酶原局部給藥，所述的組合物包含約為0.5mg至約5mg纖溶酶原/平方釐米傷口面積。
本發明還提供了一種加速需要治療的患病個體的傷口癒合的方法，該方法包括向患病個體給藥一種包含有效量的改善傷口癒合的纖溶酶原的組合物的步驟。可選的，所述的傷口為慢性傷口。所述的受治療者可以是人類受治療者，在該情況下，所述的纖溶酶原優選為，雖然不是必須的，人纖溶酶原。在所述的纖溶酶原局部給藥的情況下，可以按每平方釐米傷口面積，大約0.5mg至約5mg纖溶酶原的量給藥。
本發明還提供了一種加速需要治療的患病個體的傷口癒合的方法，該方法包括向患病個體給藥一種包含有效量的改善傷口癒合的纖溶酶的組合物的步驟。可選的，所述的傷口為慢性傷口。在一具體實施方案中，所述的受治療者為人類受治療者，所述的纖溶酶為人纖溶酶。如果所述的組合物是採用局部給藥的方式給藥，所述的組合物可以包括，例如，大約0.005mg至約0.5mg的纖溶酶原/平方釐米傷口面積。
本發明還包括一種在需要治療的受治療者的正在癒合的傷口上減少壞死組織形成的方法，該方法包括向受治療者給藥一種包含有效量的減少壞死組織形成的纖溶酶原組合物的步驟。可選的，所述的纖溶酶原減少纖維蛋白的沉積。在一具體實施方案中，所述的受治療者為人類受治療者，所述的纖溶酶原為人纖溶酶原。如果局部給藥，則所給藥的組合物的量相應的為，例如，大約0.5mg至約5mg的纖溶酶原/平方釐米傷口面積。
本發明還提供一種鑑別用於促進傷口癒合的藥物的方法，該方法包括(i)將測試藥物給藥於患有鼓膜穿孔的動物；(ii)評價鼓膜穿孔癒合的程度，壞死組織形成，和疤痕形成中的至少一種；(v)將癒合的程度，壞死組織形成，或疤痕形成與對照值相比較；和(vi)選擇癒合程度高於或壞死組織或疤痕形成低於對照值的任何一種測試藥物作為用於促進傷口癒合的藥物。所述的動物可以是，例如，一種野生型動物或缺乏內源纖溶酶原表達的轉基因動物，優選的為一種小鼠或一種大鼠。在一具體實施方案中，所述的測試藥劑通過局部給藥的方式給藥。所述的對照值可以是，例如，在沒有給藥測試藥劑的第二個動物中的癒合程度或疤痕或壞死組織的形成。
本發明還涉及一種從傷口癒合中減少疤痕形成的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原的組合物，用於減少疤痕形成。
此外，本方法還涉及通過纖溶酶原減少纖維蛋白沉積的方法。當受治療者為人類時，則纖溶酶原為人纖溶酶原。更進一步，本方法涉及局部給藥和一種組合物，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原。
本發明還涉及一種加速傷口癒合的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原或纖溶酶的組合物，用於促進傷口的癒合。此外，當傷口為慢性傷口時，還可以應用所述的方法。當受治療者為人時，則所述的纖溶酶原或纖溶酶為人纖溶酶原或人纖溶酶。更進一步，本方法涉及局部給藥和一種組合物，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原或纖溶酶。本方法還適用於所述傷口為慢性傷口的情況。
本發明還涉及一種從傷口癒合中減少壞死組織形成的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原的組合物，用於減少壞死組織形成。此外，本方法還涉及通過纖溶酶原減少纖維蛋白沉積。當受治療者為人類時，則纖溶酶原為人纖溶酶原。更進一步，本方法涉及局部給藥，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原。
本發明還涉及一種鑑別用於促進傷口癒合的藥物的方法，所述的方法包括(i)將測試藥物給藥於患有鼓膜穿孔的動物；(ii)評價鼓膜穿孔癒合的程度，壞死組織形成，和疤痕形成中的至少一種；(v)將癒合的程度，壞死組織形成，或疤痕形成與對照值相比較；和(vi)選擇癒合程度高於或壞死組織或疤痕形成低於對照值的任何一種測試藥物作為用於提高傷口癒合的藥物。
此外，所述方法應用於當所述動物選自野生型動物或缺乏內源纖溶酶原表達的轉基因動物的情況。更進一步，所述方法應用於當所述給藥為局部給藥的情況。本方法應用於當所述動物為小鼠或大鼠的情況。
本方法應用於當所述的對照值為沒有給藥測試藥物的第二個動物中的癒合程度或疤痕或壞死組織的形成的情況。
參考下述的詳細描述以及結合相應的附圖，有助於更好的理解本發明的上述特性和其它的優點。
附圖簡述

圖1A和1B在對野生型大鼠進行鼓膜穿孔後，中耳室的炎症反應的時間進程(A)和穿孔的回縮(B)。在穿孔後給藥50μl(50μg(1mg/ml)—■—；或0.5mg(10mg/ml)—▲—)的纖溶酶原或對照(PBS—_—))溶液，且其後每24小時給藥一次。
發明詳述本發明涉及鼓膜穿孔的癒合和傷口的癒合。本發明還適用於以胞外基質結構，尤其是角質化組織，例如鼓膜，的變性(degeneration)或不良癒合為特徵的疾病和狀況。其它異常傷口癒合過程包括，糖尿病潰瘍，瘢痕瘤，疤痕過度增生，和皮膚替代物的應用。
本發明部分基於下述發現當在缺乏纖溶酶原的情況下，傷口癒合過程將無法適當的進展，這表明纖溶酶原在傷口癒合過程中，尤其是鼓膜穿孔的情況下扮演了關鍵的角色(見實施例和表1)。如實施例所示，在與野生型對照和其它轉基因模型相比較時，在缺乏纖溶酶原的大鼠中，鼓膜穿孔的癒合顯示出顯著的改變和異常(見表1)。在監測癒合的為期144天的實驗期間，在纖溶酶原缺陷型大鼠中，鼓膜穿孔無法適當的癒合，並導致了異常鼓膜的形成。同時還發現，經注射過人纖溶酶原後，纖溶酶原缺陷型小鼠回復了正常的癒合過程(見實施例2和5)；經纖溶酶原給藥後，野生型小鼠顯示出鼓膜癒合增強(實施例6)。此外，實驗表明是uPA而非tPA，也在正常的傷口癒合過程中起到了一些作用，因為在除去纖維蛋白沉積過程中需要uPA的參與(實施例3和4)。然而，沒有哪一個動物模型比纖溶酶原缺陷型小鼠更明顯地表現出缺乏正常的癒合，這表明，在傷口癒合過程中，纖溶酶原比uPA扮演了更重要的角色，甚至有可能是不同的角色。不受任何特定理論的束縛，本發現支持下述觀點無法適當的癒合可能是由發生在癒合過程中的炎症反應，角質細胞遷移，或基質改造事件的缺陷引起的。
正如表1的結果所示，uPA，tPA，和纖溶酶原在傷口癒合過程中扮演著不同的角色，其中纖溶酶原起了關鍵作用。此外，如實施例所示，與tPA或uPA相比，壞死組織和纖維蛋白的除去強烈的依賴於纖溶酶原/纖溶酶的存在或給藥。
表1野生型，uPA-缺陷型，tPA-缺陷型，和纖溶酶原-缺陷型小鼠中的鼓膜組織癒合時間和癒合組織外觀的比較
因此，纖溶酶原可以用於治療傷口癒合方面的疾病，以及作為加速的手段用於鼓膜和傷口癒合，用於對影響破裂上皮組織癒合的狀況或疾病的治療，用於減少疤痕形成或壞死組織聚積或形成的方法，以及用於上述治療的藥物的篩選方法。在傷口癒合過程中，進行纖溶酶原給藥，同時也能使鼓膜或其它上皮組織的疤痕形成或壞死組織蓄積最小化。例如，可將纖溶酶原與整形手術聯合給藥，從而減少，或防止，剩餘的疤痕，纖維蛋白沉積，或壞死組織形成的外觀。同時，纖溶酶原可以給藥於潰瘍或燒傷表面從而促進其癒合。
此外，本發明的方法還可用於改善局部或全部缺乏纖溶酶原情況下的傷口癒合，或改善非癒合或慢性癒合傷口的癒合。特別是，如實施例5所示，在損傷後的數周內重複纖溶酶原給藥，能減少胞外基質的堆積和重新開始正常的癒合，因此，該結果表明纖溶酶原能用於治療慢性傷口，例如潰瘍和褥瘡。
或者，纖溶酶本身能用於治療傷口癒合方面的疾病，以及作為加速的手段用於鼓膜和傷口癒合，對影響破裂上皮組織癒合的狀況或疾病的治療，或減少疤痕形成或壞死組織堆積或形成的方法。在傷口癒合過程中，進行纖溶酶給藥，同時也能使鼓膜或其它上皮組織的疤痕形成或壞死組織堆積最小化。例如，可將纖溶酶與整形手術聯合給藥，從而減少，或防止，剩餘的疤痕，纖維蛋白沉積，或壞死組織形成的外觀。同時，纖溶酶可以給藥於潰瘍，褥瘡，或燒傷表面從而促進其癒合。
本發明的組合物可以通過注射局部給藥，或以靜脈注射的方式給藥。優選的，雖然不是必須的，給藥方式是局部的，也就是，在鄰近傷口的部位給藥。當所述的纖溶酶原或纖溶酶通過注射方式給藥(例如，靜脈的，皮下的，肌內的)，將該物質製備成溶於藥學上可接受的液體的溶液形式，例如，等滲鹽溶液，是十分有利的。在一優選實施方案中，纖溶酶原或纖溶酶局部給藥，形成高濃度，例如在穿孔或傷口部位，存在至少200μg/mg的纖溶酶原或至少20μg/mg的纖溶酶。對於局部給藥，所述的纖溶酶原或纖溶酶組合物可以，例如，部分的為一種膠體，洗液，軟膏，糊劑，噴霧劑，粉劑，繃帶，或傷口敷料形式。為了加快鼓膜穿孔的癒合，所述的組合物優選經外耳道給藥，例如，通過噴霧方式傳遞至穿孔部位，或通過滴加纖溶酶原或纖溶酶溶液滴劑的方式。通過噴霧方式輸送組合物的裝置為本領域的已知技術，其詳細描述於，例如，美國專利6027 712中。
纖溶酶原/纖溶酶的給藥方式，例如通過噴霧，以及通過膠體或糊劑，或局部給藥的溶液形式，也可用於治療口腔部位的傷口。為了加速傷口的癒合，纖溶酶原或纖溶酶可以以傷口敷料的形式給藥於傷口處，從而將其傳遞至傷口部位。在其它實施例中，所述的組合包含一種模擬纖溶酶原活性或纖溶酶活性的複合物，例如，纖溶酶原/纖溶酶片段或突變體，或其它具有類似活性的分子。
本發明還提供了一種鑑別用於改善動物模型的傷口癒合的組合物的篩選方法。所述的篩選方法，優選的基於患有鼓膜穿孔的動物模型，該模型為傷口癒合提供了詳細的機能方面的描述，從而能有效的篩選，鑑別，和定性涉及鼓膜穿孔癒合和其它傷口癒合過程的新的化學物質，藥學效果，和新藥的靶位點。因此，可以使野生型或纖溶酶原缺陷型動物產生傷口，然後將測試藥物通過預設的途徑對動物進行給藥。然後可以將動物中的傷口癒合程度和/或傷口部位的纖溶酶原水平與對照值相比較，例如野生型動物或沒有給藥測試藥物的動物中的傷口癒合，從而來評價測試的組合物是否具有提高癒合率或降低壞死組織或疤痕的形成的能力。在一實施例中，所述的動物為缺失了一個或一對纖溶酶原等位基因的缺陷型小鼠。作為對照模型，或為了進一步測試鑑別的藥物，可以採用纖溶酶原活化系統的野生型成分正常表達的模型，或者，可選擇的，採用一種或多種野生型蛋白被相應的人源或非人源同系物(homologs)替代的轉基因動物模型。
定義本說明書中使用的術語在本發明的上下文和每個術語所處的特定上下文中的含義一般為其在本領域的通常含義。對下文，或在本說明書中其它部分出現的特定術語的論述，為本領域的技術人員在描述本發明的組合物和方法，及如何製備和使用方面提供了額外的指導。
在本文中「鼓膜」和「鼓室膜(eardrum)」可以交換使用。
「鼓膜穿孔」是指通常由外傷造成的鼓膜上的開口。這至少存在4種一般的分類擠壓損傷(compression injuries)(最常見的一種，通常是由打耳光引起的)；器械性損傷(第二種常見類型，通常是非故意的，通常由棉籤或小大頭針(bobby pins)造成的)；燒熔性(burn-slag)損傷(通常見於工業上，由機械或焊接產生的熱金屬造成)；和衝擊波損傷(通常見於戰爭或爆炸中)。感染可以導致鼓膜癒合推遲，持續的穿孔通常是咽鼓管鼓膜炎的表現，即咽鼓管和鼓膜腔(中耳)的炎症。
「傷口(wound)」是指包括上皮，結締組織，和肌肉組織的器官或組織由外因造成的破損(break)或斷裂。傷口的例子包括，但不僅限於，皮膚傷口，挫傷，潰瘍，褥瘡，擦傷，撕裂，切割傷，刺傷，牛皮蘚傷，鼓膜穿孔，和燒傷。傷口的一種特別的情況為整形手術過程中產生的結果。
「局部的」和「局部給藥」是指非全身性的，部分的，給予活性成分。因此，局部給藥可以是指將活性成分塗於傷口的外表面。
「纖溶酶原」在這裡包括內源的哺乳動物纖溶酶原，等位纖溶酶原，纖溶酶原的功能保守性衍生物，具有功能活性的纖溶酶原片段，以及哺乳動物纖溶酶原同系物。可選的，一種纖溶酶原組合物可以包含多於一種類型的，纖溶酶原衍生物或同系物。優選的，受治療者所給予的組合物中所含纖溶酶原的類型為受治療者內源的類型。一優選的組合物為生物來源的純化纖溶酶原，例如，人纖溶酶原重組產物，或純化的人纖溶酶原，其可從例如，BiopoolAB(Umea，瑞典)獲得。一種優選的人纖溶酶原具有GenBank，登記號為PLHU(GI625234)(SEQ ID NO1)所示的胺基酸序列。
「纖溶酶」在這裡包括內源的哺乳動物纖溶酶，等位纖溶酶，纖溶酶的功能保守的衍生物，具有功能活性的纖溶酶片段，以及哺乳動物纖溶酶同系物。可選的，一種纖溶酶組合物可以包含多於一種類型的，纖溶酶衍生物或同系物。優選的，受治療者所給予的組合物中所含纖溶酶的類型為受治療者內源的類型。一優選的組合物為生物來源的純化纖溶酶，例如，人纖溶酶重組產物，或純化的人纖溶酶。
「功能保守性變體」是指這樣的蛋白，其胺基酸殘基發生變化，但並不改變該蛋白的整體構象和功能，它包括，但不僅限於，採用相似性質的胺基酸進行替換(例如，舉例來說，酸性，鹼性，疏水性，及其類似的)。具有相似性質的胺基酸為本領域公知的技術。例如，精氨酸，組氨酸和賴氨酸為可以互換的親水性鹼性胺基酸。類似的，疏水性胺基酸，異亮氨酸可以被亮氨酸，甲硫氨酸或纈氨酸所替換。除了上述保守胺基酸外的胺基酸在蛋白或酶中也可以不同，從而基於MEGALIGN算法得到的功能類似的蛋白，在採用對比方案，例如Cluster Method比較時，任意兩個類似功能的蛋白之間的蛋白或胺基酸相似性百分比可能變化，例如，為可以為70％至99％。「功能保守性變體」還包括根據BLAST或FASTA算法確定的具有至少60％胺基酸同一性的多肽或酶，優選至少75％，更優選至少85％，進一步優選至少90％，還優選為95％，這些多肽或酶與天然或親代蛋白或酶比較，具有相同或實質上相同的特性或功能。
「受治療者」在這裡包括人類或非人類的動物。非人類的動物包括，但不僅限於，哺乳動物，實驗動物，例如小鼠，大鼠，兔子，倉鼠，豚鼠等；馴養動物，例如貓和狗；以及農場動物，例如綿羊，山羊，豬，馬，和牛。本發明的非人類動物可以是哺乳動物或非哺乳動物；脊椎動物或無脊椎動物。
「治療」受治療者，或「進行治療」受治療者的疾病或狀況在這裡是指減輕或緩和所述疾病或狀況，例如損傷的或慢性的傷口癒合的臨床症狀。
「促進」，「增強」，或「改善」鼓膜或傷口癒合一般是指提高傷口或穿孔癒合的速度，或者在傷口或穿孔癒合過程中或之後，減少剩餘疤痕或壞死組織的程度。
實驗中的「對照」，「對照值」或「參考值」為用於檢測變化的數值，例如，鼓膜穿孔或皮膚傷口，以及本發明所述的其它實驗的癒合程度。例如，當研究鼓膜穿孔時，藥物的抑制/刺激效果可以通過比較給藥後和對照值的傷口或穿孔的癒合程度來進行評價。所述的對照值或參考值可以是，例如，預先設定的參考值，或實驗確定的參考值。例如，在這種實驗中，對照值或參考值可以是在沒有給藥實驗藥物或活性劑的動物中，或者是給藥了相同的藥物或活性劑，但並不改變傷口癒合能力的動物中，類似傷口或穿孔的癒合程度。
「有效量」或「治療有效量」是指能夠達到增加局部和/或全身纖溶酶原濃度的，和/或促進傷口癒合的量。例如，活性劑有效量可以是其結果為局部(穿孔，傷口，或疤痕部位)或全身纖溶酶原水平超過200微克/ml的量。可選的，活性成分有效量可以是，與不給藥該藥物相比，導致穿孔或傷口癒合加快，或與不給藥該藥物相比，導致疤痕或壞死組織形成減少的量。有效量還可以是指足夠使局部和/或全身纖溶酶原水平與活性劑或藥物給藥前的水平相比增加的量或劑量，例如增加約10％，優選增加50％，更優選增加100％的量或劑量。可選的，纖溶酶原的有效量為相應於每平方釐米傷口面積約5μg至約50mg的纖溶酶原量，優選為約0.05mg至約10mg，更優選為約0.5mg至約5mg。治療有效量能使受治療者改善或呈現明顯的臨床反應，例如，促進鼓膜穿孔或傷口癒合，或疤痕形成減少。可選的，治療有效量是指在臨床上足以明顯改善宿主中傷口癒合或疤痕形成狀況的量。
如此處所述，「大約」或「接近」可以被認為是在給定值或範圍的50％以內，優選20％以內，更優選5％以內波動。
與另一值「實質上不同」的值的含義是指兩個值之間存在統計學上的顯著差異。本領域公知的任何合適的統計方法可以用於評價差異是否顯著。「統計學上的顯著」差異是指顯著性是在至少90％的置信區間內確定的，優選95％的置信區間。
依照本發明，可以應用本領域熟知的分子生物學，微生物學，和DNA重組技術。這些技術在教科書中有完整的解釋。參見，例如Sambrook等(分子克隆-實驗手冊，冷泉港實驗室出版，1989)；Glover(DNA克隆實驗入門，I和II卷，1985)；Hames和Higgins(核酸雜交技術，1985)；Hames和Higgins(轉錄和翻譯，1984)；Freshney(動物細胞培養，1986)；Perbal(分子克隆實用指南，1984)；和Ausubel等(現代分子生物學手冊，John WileySons，Inc.，1994)本說明書採用的縮略語如下uPA＝尿激酶型纖溶酶原激活物；PA＝纖溶酶原激活物；MMP＝基質金屬蛋白酶；
TIMP＝金屬蛋白酶組織抑制物；tPA＝組織型纖溶酶原激活物；Plg＝纖溶酶原ECM＝細胞外基質改善傷口癒合根據本發明，通過提供或增強纖溶酶原的水平能改善傷口的癒合。這可以通過許多不同的方法實現。例如，可以採用有效量的活性劑來治療患病個體，例如，採用藥物，激素，細胞因子，抗體，或其它組合物來上調纖溶酶原的表達；減少纖溶酶原的降解；或增加局部或全身纖溶酶原或纖溶酶原同系物或衍生物的水平。編碼纖溶酶原的核酸也可以以治療為目的進行給藥。
在一優選實施方案中，採用了基本上純的人纖溶酶原製品。纖溶酶原可以購買其純化形式，或通過從人或其它動物中純化該組分而製得，或通過宿主細胞生產重組產物而得到，所述的宿主細胞包括原核宿主細胞，例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)或大腸桿菌，和更優選的，哺乳動物宿主細胞，例如CHO細胞。纖溶酶原可以為人類野生型，哺乳動物同系物，或其修飾或突變產物。特別的，可以使用該組分的片段，該片段保存了全長組分的至少一部分目的活性。
具體應用本發明的方法可以用於加速動物的鼓膜或其它傷口的癒合，所述的動物包括，但不僅限於，脊椎動物，例如人類，和馴養動物，包括，狗，貓和馬。此外，纖溶酶原在臨床上使用可以用於減少疤痕組織和壞死組織在傷口部位的形成，以及加強組織碎屑的去除。
在一實施例中，本發明的方法用於增強人類受治療者的鼓膜穿孔的癒合。所述的人類或非人類受治療者患有或不患有損害的或減緩的鼓膜穿孔癒合病症。
在另一實施例中，本發明的方法提供了一種加速受治療者傷口癒合的方法。受治療者患有或不患有與傷口外觀相關的病症，或影響傷口癒合的病症，例如糖尿病(糖尿病潰瘍瘢痕瘤)，慢性傷口例如潰瘍或褥瘡。
由於本發明的方法不僅增加了傷口的癒合率，而且改善了傷口的癒合質量，即減少了疤痕和壞死組織的出現，因此，至少在傷口部位增加纖溶酶原水平的組合物可以給藥於任何病人，從而減少疤痕的形成。在一特定實施方案中，所述的受治療者為，準備經歷，正在經歷，或已經歷整形手術或皮膚置換過程的個人。在該情況下，含有纖溶酶原的組合物可以在手術前和/或手術後施用或給藥。
此外，纖溶酶原給藥可以重新啟動受損害傷口癒合情況下的正常傷口癒合模式。不受任何特定理論所限，除了纖維蛋白溶解，提高纖溶酶原水平可以導致纖溶酶增加，從而通過激活細胞因子途徑，啟動傷口癒合過程。
組合物和治療方法本發明提供了一種纖溶酶原組合物，當該組合物以有效量給藥時，將導致受治療者傷口部位纖溶酶原水平增加，從而提高鼓膜穿孔或其它傷口的癒合。
例如，為了加速鼓膜的癒合，可以將一種含有約5μg至約50mg的，優選約0.05mg至約10mg，更優選約0.5mg至約5mg的包括纖溶酶原同系物或衍生物在內的纖溶酶原的組合物，給藥於鼓膜穿孔周圍的部位。可選的，可以給藥約10-50μl的1mg/ml的纖溶酶原溶液，或分散於另一合適配方中的相應量的纖溶酶原。為了加速傷口癒合，一般的，可以給藥纖溶酶原組合物，從而使每平方釐米(cm2)傷口面積含有的纖溶酶原量為，約5μg至約50mg，優選約0.05mg至約10mg，更優選約0.5mg至約5mg的包括纖溶酶原同系物或衍生物在內的纖溶酶原。
可選的，進行纖溶酶原給藥，從而使受治療者，例如，人類患病個體，的鼓膜穿孔或傷口部位達到局部高濃度的纖溶酶原量。在一優選實施方案中，給藥有效量的活性劑，從而使穿孔或傷口部位的纖溶酶原濃度達到至少約200μg/ml。在另一優選實施方案中，給藥有效量的活性劑，從而使穿孔或傷口部位的纖溶酶原濃度達到至少約200μg/ml。仍然在另一優選實施方案中，給藥有效量的活性劑達到的纖溶酶原濃度為約2μg/ml至約2mg/ml，更優選至少200μg/ml。人類血漿中的纖溶酶原濃度為約200μg/ml。
在纖溶酶組合物的情況下，為了加速鼓膜癒合，可以將一種含有約0.05μg至約5mg，優選約0.5mg至約1mg，更優選約5μg至約0.5mg的包括纖溶酶同系物或衍生物在內的纖溶酶的組合物，給藥於鼓膜穿孔周圍的部位。可選的，可以給藥約10-50μl的1mg/ml的纖溶酶溶液，或分散於另一合適配方中的相應量的纖溶酶。為了加速傷口癒合，一般的，可以給藥纖溶酶組合物，從而使每平方釐米(cm2)傷口面積含有的纖溶酶量為，約0.05μg至約5mg，優選約0.5μg至約1mg，更優選約5μg至約0.5mg的包括纖溶酶同系物或衍生物在內的纖溶酶。
因此，纖溶酶原或纖溶酶可以配製成對受治療者給藥的藥物組合物，該組合物呈一種生物相容形式適合體內給藥，例如局部給藥，注射，或輸液。通過生物相容形式適合體內給藥是指一種可給藥的物質形式，其中治療作用超出了任何毒性作用。本發明中的藥物組合物給藥的治療活性量定義為有效量，即達到理想效果所必需的劑量和時間段。例如，一種物質的治療活性量可以根據多種因素的變化而發生變化，例如個體所處的疾病階段，年齡，性別，和體重。劑量方案(regima)是可以調整的，從而獲得最佳治療效果。例如，每天可以給藥一劑以上，或者根據治療狀況的緊急性按比例減少藥劑的量。
如果需要，在治療穿孔或傷口時，可將其它活性成分與纖溶酶原或纖溶酶聯合給藥。所述的活性成分包括，但不僅限於，哺乳動物PAs，例如人tPA或人uPA，或細菌PAs，例如鏈激酶。
所述的活性物質可以採用一種適當的方式給藥，例如通過注射(皮下，靜脈，等)，吸入，噴霧，局部或透過皮膚給藥，或進行直腸給藥。根據給藥的途徑，可以採用某種材料包裹活性物質，從而保護該化合物，使其免受酶，酸和其它使該化合物失活的天然環境的作用。因此，合適的給藥途徑包括，局部的，靜脈的，肌內的，真皮內的，直腸的，和陰道內的給藥方式。優選的給藥途徑為局部給藥。在鼓膜穿孔的情況下，活性劑可經由外耳道給藥。支持鼓膜的血管終止於該膜的邊緣。因此，血液和血液中的成分，例如，氧氣，營養物質，和纖溶酶原只能通過擴散的方式到達鼓膜。
此處描述的組合物可以通過本質上製備能給藥於受治療者的藥學上可接受的組合物的方法來製備，也就是，將有效量的活性物質與藥學上可接受的載體相混合，合適的載體描述於，例如，Remington′s藥物科學(MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。在此基礎上，所述的組合物包括，雖然不僅僅是，與一種或多種藥學上可接受的載體或稀釋劑相連的所述物質或組合物的溶液，且溶於合適pH值並與生理體液等滲的緩衝溶液中。
可以用於傳送本發明的纖溶酶原或其它組合物的載體的例子包括，但不僅限於，可注射的劑量形式，灌輸液，膠體，糊劑，軟膏，蠟狀物，洗液，皮膚霜，以及各種其它的本領域已知的局部給藥方式。所述的組合物還可以通過粉劑或液體噴霧的形式給藥於傷口部位。可選的本發明的組合物可以存在於給藥於傷口的傷口敷料，墊，繃帶，紗布或其它的方式，從而傳遞至傷口部位。這種裝置還包括緩釋裝置，在一段延長的時間內持續釋放纖溶酶原或其它組合物。至於鼓膜傷口的癒合，採用膠體，噴霧，或滴液方式，經由外耳道進行組合物給藥是一種優選的實施方式。可注射的劑量形式或輸液劑包括溶於藥學上可接受液體的纖溶酶原或纖溶酶溶液，例如，等滲鹽溶液，滅菌水或液體緩衝系統。
在藥物組合物製備後，可將其置於合適的容器中，並作標識註明其治療的適應症。對於本發明組合物的給藥，上述標識可以包括給藥的量，頻率，以及給藥方法。
纖溶酶原的給藥可以被重複至少一次。例如，可以在固定的間隔時間進行纖溶酶原給藥，例如，約每兩天至少給藥一次，約一天一次，或約一天兩次，或加入到可適當更換的傷口敷料或緩釋裝置中。
動物模型提供了篩選或評價改善傷口癒合的候選化合物或治療方法的新方法。由於其簡單的結構和與皮膚組織的高度類似，鼓膜提供了一種研究傷口癒合機制的獨特機會。可以獲得標準大小的穿孔，並可採用各種技術例如耳顯微鏡或光學顯微鏡(Hellstrm et al.，InFidia Research Series，Vol.8，Liviana Press，Padova 1989)觀察傷口癒合模式。因此，採用這種動物模型可以對藥物實驗和篩選增加傷口部位纖溶酶原濃度的化合物，以及給藥劑量和給藥途徑進行有效的研究。本發明的動物模型還提供了一種癒合過程緩慢或被抑制情況下的藥物篩選。
根據本發明，野生型或纖溶酶原-缺陷型小鼠可用於篩選提高傷口癒合和/或減少疤痕形成的化合物。採用本模型已經鑑別和驗證了用於治療傷口和與ECM降解相關的疾病和病症的化合物。但是，在本模型的背景中，也可以採用野生型動物和其它基因缺陷型動物。
本方法中使用的動物可以是本領域傳統採用的野生型實驗動物，或基因修飾的動物，或「轉基因」動物。可以採用任何方法製備轉基因哺乳動物，所述的方法包括，但不僅限於，胚胎幹細胞(ES)的修飾和對胚胎細胞的異源核注射(heteronuclear injection)。特別優選的動物模型包括純合體或雜合體的纖溶酶原-缺陷型小鼠(參見，例如Ploplis et al.Circulation 92，2585-2593(1995))。作為實例，纖溶酶原被認為是一種如實施例所述的提高傷口癒合和減少瘢痕形成的化合物。
例如，「基因敲除(knockout)的哺乳動物」是指其基因組中的特定基因被基因靶向方法失活的哺乳動物(例如，小鼠)(參見，例如美國專利5777195和5616491)。基因敲除的哺乳動物既包括雜合體的基因敲除(也就是，一缺陷型等位基因和一野生型等位基因)，又包括純合體的突變體。製備基因敲除的哺乳動物首先需要將用於抑制特定基因表達的核酸構建體導入一種未分化的細胞類型-胚胎幹細胞中。然後將該細胞注入哺乳動物胚胎中。然後將攜帶整合細胞的哺乳動物胚胎植入代孕母體內孕育。Zhou等(Genes andDevelopment 92623-34(1995))描述了一種PPCA基因敲除的小鼠，本文中的實施例描述了一種一個或一對纖溶酶原等位基因被敲除的動物。
「基因敲入(knock-in)」的哺乳動物是指其內源基因被異源基因所取代(Roemer et al.，New Biol.3331-5(1991))。優選的，所述的異源基因被「敲入(knocked-in)」感興趣的位點評價受試者的表達情況(在該情況下所述的基因為報告基因；參見Elegant et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9511897(1998))或同源基因的功能，從而將異源基因的表達與自合適啟動子的轉錄相連。這可通過同源重組，轉座子(Westphal and Leder，Curr Biol 7530(1997))，採用重組位點突變(Araki et al.，Nucleic Acids Res 25868(1997))或PCR技術(Zhang and Henderson，Biotechniques 25784(1998))獲得。在本發明的上下文中，人纖溶酶原可以被「敲入」從而取代CIA小鼠相應的基因，進而研究直接針對任一藥物目標的藥物的效果。
在其它一系列的實施方案中，可以製備如下類型的轉基因動物(i)人纖溶酶原基因穩定插入其基因組的轉基因動物；和/或(ii)使內源相應的基因失活，並採用其人源的對應物替代(參見，例如，Coffman，Semin.Nephrol.17404(1997)；Esther et al.，Lab.Invest.74953(1996)；and Murakami et al.，BloodPress.Suppl.236(1996))。可以採用侯選化合物治療上述動物，並監測傷口癒合或纖溶酶原或纖溶酶的水平/活性。
可以製備基於鼓膜穿孔的轉基因動物，從而用來研究傷口癒合新藥的靶位點，或用來評價潛在藥物影響傷口癒合的能力。這種動物為篩選或測試候選藥物提供了非常好的模型。如實施例所描述的那樣，可以製備人纖溶酶原活性「敲除」動物用於鑑別新藥的靶位點，同時可製備「基因敲入」的哺乳動物用於評價藥物對纖溶酶原活化系統的人源對應物的影響。上述的技術都能允許在細胞基因組的天然位置操縱單個遺傳信息單元，同時在終末分化的有機體背景下研究所述操縱的結果。
由於其簡單的結構和與皮膚組織高度類似，鼓膜穿孔提供了一種研究傷口癒合的一般機制的獨特機會。由於其精確和明確的組成，因而鼓膜是一種能嚴格定義傷口的非常標準的模型。鼓膜具有3層結構，其中的一層為5-6個角質細胞厚；中間層為結締組織層，由一層非常薄的膠原II組成，黏膜內層是由上皮細胞組成的。因此，傷口癒合可以在細胞水平上進行研究。與之相比較，在皮膚傷口的情況下，則很難評價和使傷口的深度標準化。
篩選方法在鼓膜癒合模型中，野生型，纖溶酶原缺陷型或其它基因缺陷型的動物可以用作模型來篩選對傷口癒合有效的化合物，並允許監測炎症的階段(可在穿孔後持續約3天)，和隨後組織的形成和改造階段。這種動物模型對篩選能加速傷口癒合或減少疤痕形成的活性劑特別有效。如實施例中描述的那樣，向纖溶酶原缺陷型小鼠中添加纖溶酶原可以產生鼓膜癒合和減少疤痕形成的效果，然而在不添加纖溶酶原時將導致鼓膜不癒合或緩慢癒合，並有疤痕形成。
採用野生型小鼠時，當進行穿孔後，可以同時給藥不同的化合物，且可通過耳顯微鏡對癒合模式進行形態學分析。其中鼓膜的一邊給藥化合物，而另一邊給藥鹽水作為對照。如果採用具有傷口癒合缺陷的不同基因缺陷型小鼠，例如纖溶酶原缺陷型小鼠，則可以發現可替代基因缺失產物的不同化合物。在缺乏該基因產物時，將這種化合物給藥於小鼠則能導致小鼠癒合。那樣，就可發現那些影響下遊步驟的化合物。
如果採用野生型小鼠，則可採用鼓膜穿孔模型開發加速傷口癒合的藥物。可以將待測試的藥物給藥於小鼠，並監測鼓膜穿孔的癒合與對照組的比較。優選，所述的藥物或活性劑與纖溶酶原活化途徑的組分相作用從而使傷口部位的纖溶酶原水平升高。一種對傷口癒合有效的篩選得到的化合物的非限制性的實例為生長因子。
可選的，可以使用具有異常傷口癒合的纖溶酶原缺陷型小鼠，並通過製造標準大小的傷口來研究傷口癒合。小鼠同時也可使用待測試的潛在化合物。如果該小鼠能發展至適當的傷口癒合，則說明該測試的化合物能干擾或靶向某些對傷口癒合很重要的組分。在一優選實施方案中，所述的藥物為纖溶酶原或纖溶酶原衍生物(變體，片段，等)。在另一實施方案中，所述的藥物能補償纖溶酶原的缺失，從而增強傷口癒合。
在另一實施方案中，所述的小鼠缺失纖溶酶原活化系統的至少一種其它組分，或者是一種或多種MMP′s。基於該目的，如此處所述，可以製備tPA，uPA，uPA受體，PAI-1，MMP-9，溶基質素-3缺陷型小鼠。
本發明還提供了一種轉基因非人動物的實驗系統，該系統提供了一種測試藥物的模型系統，所述藥物通過活化藥物靶向目標如纖溶酶或纖溶酶原的表達或活性，從而加速傷口的適當癒合。上述系統包括(a)製造傷口，優選鼓膜穿孔；(b)將測試藥物給藥於選擇的野生型或轉基因的非人類動物(該藥物也可在製造傷口前給藥)；(c)與步驟(a)中未給藥藥物的野生型或轉基因的非人類動物相比，確定在野生型或轉基因的非人類動物中給藥的所述藥物是否增強傷口癒合和/或減少疤痕形成。
可以採用此處所述的任何合適的給藥方式將藥物給藥於動物，例如，局部給藥和靜脈注射。可以基於本領域對合適的給藥時間和給藥量的公知常識，或根據在未有過度實驗的情況下，評價在一定範圍內變化的給藥時間和給藥量的實驗結果，來確定個體需要給藥的時間和劑量。
如果給藥的藥物能減少傷口癒合的時間和/或減少疤痕的形成，則根據本發明的方法，該藥物可用於增強傷口癒合。如此處所述，該藥物還可用於製成藥物組合物。
與對照值或參考值相比較，本發明方法中所採用的藥物優選的通過增強纖溶酶原或纖溶酶水平或活性，從而增強傷口癒合。所述的對照值或參考值可以是，例如，預先設定的值或實驗評價的值。所述的藥物可以與這些組分中的任意一種結合或相互作用。在一基於細胞基礎的實驗中，其中表達重組纖溶酶原的宿主細胞在含有潛在調節作用的藥物組分的培養基中培養，所述的對照或參考可以是，例如，與對藥物靶向蛋白的表達或活性有已知影響的藥物共培養的宿主細胞，在不含任何藥物的相同培養基中培養的宿主細胞，轉染了「假(mock)」載體，並不表達任何藥物靶向蛋白的宿主細胞，或其它任何合適的對照或參考。在無細胞的實驗中，所述的藥物靶向蛋白或片段在含有潛在調節作用的藥物組分的培養基中培養，所述的對照或參考可以是，例如，不含藥物靶向成分的培養基，不含任何藥物的培養基，含有參考多肽或藥物的培養基，或其它任何合適的對照或參考。
實施例下述實施例用於進一步描述本發明。但是，這些實施例僅用於說明本發明，其並不能用於限定本發明的範圍和含義。實質上，本領域的普通技術人員在閱讀本說明書後，在不脫離本發明的主旨和範圍的情況下，可以清楚的預見本發明的許多改進和變化。
實施例1:野生型和纖深酶原缺陷型小鼠中的穿孔鼓膜的癒合本實施例表明，與野生型同胞(siblings)對照相比，纖溶酶原缺陷型小鼠呈現傷口癒合推遲或異常情況。對於纖溶酶原缺陷型和野生型對照小鼠的短期研究表明，早在穿孔發生後的6小時，纖溶酶原缺陷型小鼠就表現出更高的炎症反應，這表明纖溶酶原早在傷口癒合的炎症階段就開始發生作用了。
方法小鼠通過顯色活性實驗(chromogenic activity assay)來鑑別纖溶酶原基因缺陷型成年雄性小鼠及野生型同胞小鼠(C57BL/6J，8-12周)基因型，從而確定了小鼠血漿中的纖溶酶原水平(Ny et al.，Endocrinology.140(11)5030-5(1999))，並通過PCR技術證實。首先將小鼠麻醉，並在耳顯微鏡下採用鼓膜切開刀將小鼠鼓膜穿孔。穿孔的位置位於鼓膜上部的後四分之一處。
通過PCR技術，鑑定動物基因型從小鼠尾部頂端分離基因組DNA，並通過PCR技術確定其基因型。PCR反應中採用的引物對序列如下neo5′ATG ATT GAA CAA GAT GGA TTG CAC G 3′(SEQ ID NO2)5′TTC GTC CAG ATC ATC CTG ATC GAC 3′(SEQ ID NO3)plg5′TCA GCA GGG CAA TGT CAC GG 3′ (SEQ ID NO4)5′CTC TCT GTC TGC CTT CCA TGG 3′ (SEQ ID NO5)「Neo」是指新黴素，為一構建基因缺陷型小鼠的抗性標記。neo基因作為「子彈(bullet)」加入基因組中，使基因失活。因此，獲得的基因缺陷型細胞缺失了完整(intact)基因，並作為替代有neo基因插入。
採用標準的方法進行PCR反應。簡要的，首先在94℃變性3分鐘；然後進行30個循環的反應93℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最終，72℃延伸5分鐘。
通過顯色實驗鑑定動物基因型為了確定小鼠血漿中的纖溶酶原水平，加入尿激酶(ukidan)，並確定產生纖溶酶的量。通過比較不同血漿樣品中產生的纖溶酶的量，從而確定小鼠的基因型。簡要的，從小鼠尾頂端收集血樣並置於0.04M檸檬酸溶液中。3000rpm，離心10分鐘，收集血漿，並置於-20℃保存直至實驗使用。將小鼠血漿稀釋1000倍，並與65nM尿激酶，10mM賴氨酸和溶於PBS的80uM生色底物S-2251(PBS中)一起置於有孔板(96孔)中，37℃溫育，其中總體積為200μl/孔。當蛋白酶酶切時，S-2251開始顯色。為了彌補血漿樣品造成的顏色差，設置了單個樣品空白，該樣品空白與測試樣品一致，僅除去了其中的尿激酶。採用微量滴定(microtitertek)讀板儀，在405nm處，2小時內每隔30分鐘測量一次吸光度。然後計算每隻小鼠隨時間變化的吸光度平均增長。可以基於吸光度隨時間變化的3種不同水平的平均增長，區別3種不同的基因型，分為高(plg+/+)，中(plg+/-)和低(plg-/-)。
傷口癒合的臨床評價和組織學製品。分別在穿孔後的第4，8，36，72，和144天，採用耳顯微鏡，評價傷口癒合的外觀。在每個時間點，將小鼠斷頭，並從軟組織中分離出鼓膜皰(bullas)，切開並置於2％戊二醛，在二甲砷酸鹽緩衝液中過夜。剪切鼓膜，包括緊張部和鬆弛部，漂洗，並置於四氧化鋨中後固定。在丙酮中脫水後，將樣品在環氧樹脂中包埋。將塑性包埋的鼓膜在穿孔的四分之一處平行於錘骨柄切片。經甲苯胺藍染色，將0.5微米厚的切片在光學顯微鏡下觀察。700nm後的超薄切片，在經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛復染後，置於電鏡下觀察。
結果組織學和形態學檢查表明，纖溶酶原缺陷型小鼠的鼓膜癒合受到損害(見表2)。表2顯示了穿孔後耳顯微鏡下觀察到的鼓膜穿孔外觀的評價隨時間變化的函數結果。相對於所檢查的總數，該表給出了明顯閉合的鼓膜的數目。形態學分析表明野生型小鼠完全癒合，但與野生型相比，所有纖溶酶原缺陷型小鼠中的穿孔都有完全破裂的癒合模式。
表2在纖溶酶原缺陷型小鼠中鼓膜癒合的長久受損本表顯示了在每個時間點，每組中明顯覆蓋的鼓膜的分數。
此外，對纖溶酶原基因為雜合體的小鼠的癒合資料進行了評估。與野生型小鼠相比，這些小鼠體液中的纖溶酶原含量只有50％，且表現癒合延遲的現象。這表明癒合過程為劑量依賴型，從而對野生型小鼠和人類給藥纖溶酶原能加速傷口的癒合。
實施例2用纖溶酶原重建的纖溶酶原缺陷型小鼠中的鼓膜癒合本實施例顯示了，通過全身給藥，使纖溶酶原缺陷型小鼠獲得纖溶酶原的重建(reconstitution)，則小鼠的表型完全轉換，回復到正常的傷口癒合。
方法本實驗除了將纖溶酶原給藥於一組動物外，其它與實施例1類似。
纖溶酶原缺陷型小鼠中的纖溶酶原重建通過反覆靜脈注射溶於100μl磷酸緩衝鹽溶液(PBS)的1.5mg纖溶酶原，進行纖溶酶原缺陷型小鼠的纖溶酶原重建。在鼓膜穿孔前12小時，進行首次劑量給藥。隨後，在整個實驗期間，每隔24小時進行一次纖溶酶原給藥。
結果在纖溶酶原缺陷型小鼠中，通過靜脈注射方式進行的纖溶酶原缺陷型小鼠的纖溶酶原重建，使纖溶酶原缺陷型小鼠回復了正常的傷口癒合過程。表3顯示了癒合後耳顯微鏡下觀察到的鼓膜外觀評價結果。相對於所檢查的總數，該表給出了癒合的鼓膜的數目。
表3在給藥Plg後，Plg缺陷型小鼠的鼓膜癒合本表顯示了在每個時間點，每組中癒合鼓膜的分數。
因此，雖然在纖溶酶原缺陷型小鼠中鼓膜傷口癒合異常，但是，當對纖溶酶原缺陷型小鼠給藥纖溶酶原時，鼓膜癒合回復。此外，在144天後，沒有一個纖溶酶原缺陷型小鼠具有正常癒合的鼓膜，癒合模式完全異常，其中鼓膜增厚，且不透明，且傷口部位覆蓋有白色鵝卵石狀的組織。形態學分析顯示，填充傷口部位的組織為纖維蛋白樣結構，這表明細胞遷移被阻斷。在第16天及向前的時間(onwards)，有壞死組織出現。
實施例3在tPA-缺陷型小鼠中鼓膜穿孔的癒合在第0天對tPA-缺陷型小鼠(tPA-/-)和野生型小鼠實施鼓膜穿孔，並如上文所述在耳顯微鏡下觀察其癒合模式。結果示於表4中。與C57B1/6遺傳背景的小鼠反交6次的tPA-缺陷小鼠與DBA1/J遺傳背景的小鼠正交一次。其雜合體後代用於繁殖。繁殖得到的野生型(tPA+/+)和純合體(tPA-/-)後代用於傷口癒合實驗。
表4tPA-缺陷型小鼠中鼓膜的癒合本表顯示了在每個時間點，每組中癒合鼓膜的分數。
tPA-/-小鼠中TM穿孔的癒合模式與野生型對照小鼠中的一致，並且tPA-/-小鼠中的TM組織癒合質量也與野生型對照相一致，因為在傷口部位沒有觀察到「鵝卵石狀」組織或纖維蛋白沉積。因此，與野生型對照相比，在tPA-缺陷小鼠的鼓膜癒合中沒有觀察到數量或質量上的明顯不同，從而表明，在鼓膜癒合中，tPA起了極小作用(如果的確起作用的話)。
實施例4在uPA-缺陷型小鼠中的鼓膜癒合在第0天對uPA-缺陷型小鼠(uPA-/-)和野生型小鼠實施鼓膜穿孔，並如上文所述在耳顯微鏡下觀察其癒合模式。結果示於表5中。與C57B1/6遺傳背景的小鼠反交6次的uPA-缺陷小鼠與DBA1/J遺傳背景的小鼠正交一次。其雜合體後代用於繁殖。繁殖得到的野生型(uPA+/+)和純合體(uPA-/-)後代用於傷口癒合實驗。
表5uPA-缺陷型小鼠中鼓膜的癒合本表顯示了在每個時間點，每組中癒合鼓膜的分數。
本實驗結果顯示，與野生型對照相比，uPA-缺陷型小鼠中的鼓膜穿孔癒合顯示一定程度的推遲，同時在癒合後的穿孔部位可以觀察到白色和鵝卵石狀的組織，有纖維蛋白沉積。這些資料表明，雖然其程度次於纖溶酶原，但uPA在鼓膜傷口癒合過程中扮演了某種角色，潛在影響著纖維蛋白沉積的清除。
實施例5「晚期」給藥纖溶酶原本實施例表明，在實施鼓膜穿孔幾周後給藥纖溶酶原，能回復被損害了的癒合過程。
方法採用上述方法製備纖溶酶原缺陷型(plg-/-)小鼠。在第0天進行鼓膜穿孔。在第36天及向前的(onwards)7天內，對一組小鼠每天注射溶於150μl溶液中的1.5mg的人纖溶酶原。
結果可以通過耳顯微鏡觀察到由於給藥纖溶酶原引起的胞外基質異常堆積減少的現象。特別的，在每天給藥人纖溶酶原的纖溶酶原缺陷型小鼠中，在首次給藥藥物後的兩天內開始了炎症反應，它引起堆積物質從鼓膜部位滲出。在7天的注射期內，這些小鼠顯示出異常堆積的胞外基質(主要由纖維蛋白和壞死組織組成)的厚度明顯減少。在最初的7天注射期之後，一些鼓膜的癒合模式顯示出類似正常的癒合狀況。這些結果表明，纖溶酶原是纖維蛋白清除和壞死組織除去中所必須的。
在一類似的纖溶酶原回復實驗中，在穿孔後的第0-3天，第4-7天，或第8-11天中的任一時段，將纖溶酶原給藥於纖溶酶原缺陷型小鼠。該實驗顯示，在傷口癒合的全部3個階段，即炎症期，組織形成期和組織改造期，纖溶酶原都十分重要。
實驗6將纖溶酶原局部給藥於野生型大鼠的穿孔鼓膜上本實驗表明在野生型大鼠中局部給藥纖溶酶原有助於促進鼓膜穿孔的癒合。
方法將每個研究組中的動物鼓膜進行穿孔。將50μlPBS(對照)或濃度為1mg/ml或10mg/ml的人纖溶酶原直接給藥於鼓膜穿孔處。然後每隔24小時重複給藥附加的纖溶酶原或對照，隨後在不同的時間點監測其炎症反應和癒合模式。特別的，在鼓膜穿孔後的最初108小時內，記錄中耳室的鼓室上隱窩部位的炎症液體的聚集，以及TM穿孔的回縮。
結果記錄了每組中的平均癒合時間，並如下圖6所示。該表顯示了每組中鼓膜穿孔癒合的平均時間周期。
表6通過給藥纖溶酶原改善野生型大鼠中的鼓膜穿孔癒合
結果顯示，給藥10mg/ml纖溶酶原的大鼠在中耳的鼓膜上隱窩部位具有最強的炎症反應，而給藥1mg/ml纖溶酶原的大鼠則顯示出與對照組幾乎類似的炎症反應。雖然與對照組相比，在最初的108小時內所有給藥纖溶酶原的實驗組都顯示出穿孔回縮提高，但是在10mg/ml的實驗組中觀察到最快的鼓膜癒合。
實施例7纖溶酶原缺陷型小鼠中組織改造和細胞遷移狀況的特性為了描述纖溶酶原缺陷型小鼠(plg-/-)中的異常組織細胞改造和細胞遷移狀況的特性，在穿孔後第4，8，16，36，72和144天的野生型和plg-/-缺陷型小鼠的癒合中/癒合後的鼓膜上，對角蛋白，纖維蛋白和嗜中性白細胞進行連續免疫染色。嗜中性白細胞-反應性抗體來源於Cedarlane(加拿大)，抗角蛋白抗體來源於ICN藥品有限公司，而纖維蛋白原/纖維蛋白-反應性抗體來自Nordic Immunology。
結果在穿孔後第36天及向前的時間(onwards)，與野生型小鼠相比，纖溶酶原缺陷型小鼠出現異常的胞外基質組合物。在纖溶酶原缺陷型小鼠中，穿孔部位存在替代角蛋白的增加量的纖維蛋白，然而角蛋白則「保持」於穿孔的邊緣。在耳顯微鏡下，這些纖維蛋白沉積物呈一種白色的，「鵝卵石狀」的硬殼(crust)組織。大量的嗜中性白細胞也滲入傷口部位。此外，在穿孔後第16天及向前的時間，纖溶酶原缺陷型小鼠中出現了壞死組織。野生型小鼠顯示出的癒合傷口面積與正常野生型小鼠對照一致。
這些資料表明，纖溶酶原，無論是直接作用還是通過形成纖溶酶，對防止或減少纖維蛋白沉積，促進角蛋白層形成，以及壞死組織的去除都十分重要。
***本發明要求保護的範圍不受本處所描述的特定實施例的限制。實質上，本領域的普通技術人員根據前面的描述及其相應的附圖，很容易預見到本發明描述所附加的各種修改。這種修改被認為屬於附加的權利要求範圍之內。
這種修改被進一步理解為與本發明主旨接近，且得到說明書的支持。
本發明說明書中引用並討論了眾多的參考文獻，包括授權專利，專利申請，圖表，參考資料庫，和各種出版物。所有的這些參考資料作為整體納入作為參考，且與每篇文獻單獨併入作參考的程度相一致。
序列表110奧姆尼奧公司120改善傷口癒合的方法1303810/2J759-WO0140US 60/317,6431412001-09-061605170PatentIn version 3.22101211810212PRT213人(Homo sapiens)4001Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser1 5 10 15Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser20 25 30Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu35 40 45Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe50 55 60Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg65 70 75 80Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys85 90 95Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg100 105 110Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser115 120 125Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser130 135 140Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln145 150 155 160
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Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr405 410 415Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp420 425 430Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr435 440 445Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro450 455 460Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp465 470 475 480Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr485 490 495Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg500 505 510His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys515 520 525Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr530 535 540Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys545 550 555 560Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys565 570 575Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp580 585 590Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly595 600 605Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu610 615 620Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His625 630 635 640
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223PCR引物4005ctctctgtct gccttccatg g 2權利要求
1.一種減少正在癒合的傷口疤痕形成的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原的組合物，用於減少疤痕形成。
2.權利要求1所述的方法，所述的纖溶酶原減少纖維蛋白的沉積。
3.權利要求1所述的方法，所述的受治療者為人，且所述的纖溶酶原為人纖溶酶原。
4.權利要求1所述的方法，所述的給藥為局部給藥，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原。
5.一種加速傷口癒合的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原的組合物，用於促進傷口的癒合。
6.權利要求5所述的方法，所述的傷口為慢性傷口。
7.權利要求5所述的方法，所述的受治療者為人，且所述的纖溶酶原為人纖溶酶原。
8.權利要求5所述的方法，所述的給藥為局部給藥，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原。
9.一種加速傷口癒合的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶的組合物，用於促進傷口的癒合。
10.權利要求9所述的方法，所述的傷口為慢性傷口。
11.權利要求9所述的方法，所述的受治療者為人，且所述的纖溶酶為人纖溶酶。
12.權利要求9所述的方法，所述的給藥為局部給藥，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約5μg至約0.5mg的纖溶酶。
13.一種減少正在癒合的傷口中壞死組織形成的方法，其包括向需要這種治療的受治療者給藥一種包含有效量的纖溶酶原的組合物，用於減少壞死組織形成。
14.權利要求13所述的方法，所述的纖溶酶原減少纖維蛋白的沉積。
15.權利要求13所述的方法，所述的受治療者為人，且所述的纖溶酶原為人纖溶酶原。
16.權利要求13所述的方法，所述的給藥為局部給藥，且所述的組合物包括每平方釐米傷口面積約0.5mg至約5mg的纖溶酶原。
全文摘要
本發明涉及纖溶酶原和纖溶酶作為藥物增強鼓膜穿孔或其它傷口的癒合，以及減少傷口癒合期的疤痕或壞死組織形成的應用。本發明還涉及一種篩選增強傷口癒合的化合物的方法，其通過評價動物模型中的鼓膜穿孔癒合來實現。
文檔編號A61P17/02GK1961958SQ20061013180
公開日2007年5月16日 申請日期2002年9月6日 優先權日2001年9月6日
發明者託爾·尼, 李季男, 斯滕·赫爾斯特龍, 珀-奧洛夫·埃裡克森 申請人:奧姆尼奧公司