結合血小板生成素受體的肽和化合物的製作方法

2023-10-23 21:09:27 3

專利名稱：結合血小板生成素受體的肽和化合物的製作方法
本申請是申請日為1996年6月7日，申請號為96196142.2，發明名稱為「結合血小板生成素受體的肽和化合物」的發明專利申請的分案申請。
相關申請的交叉參考
本申請是申請日為1995年6月7日的美國專利申請系列號08/485,301和1995年6月7日申請的美國專利申請系列號08/478,128的部分延續，其每篇在本文中以其全文引用以供所有目的的參考。
本發明的背景 本發明提供了結合併激活血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)或否則充當TPO激動劑(agonist)的肽和化合物。本發明應用於生化和藥物化學領域且特別是提供用於治療人類疾病的TPO激動劑。
巨核細胞是來自骨髓的細胞，它負責產生循環血小板。儘管在大多數種類中包括＜0.25％的骨髓細胞，但它們具有＞10倍的典型骨髓細胞的體積。見Kuter等，美國科學院院報9111104-11108(1994)。巨核細胞進行稱為核內有絲分裂的過程，經過該過程它們複製其細胞核但不進行細胞分裂，從而產生多倍體細胞。與血小板數減少反應，核內有絲分裂率增加，形成倍性更高的巨核細胞，巨核細胞數可增加達3倍。見Harker，臨床研究雜誌47458-465(1968)。相反，與血小板數升高反應，核內有絲分裂率減小，形成倍性較低的巨核細胞，巨核細胞數可減少50％。
循環血小板數調節核內有絲分裂速率和骨髓巨核細胞數的精確生理反饋機制還不清楚。現在認為涉及介導該反饋環的循環血小板生成因子是血小板生成素(TPO)。更具體地說，已顯示在涉及血小板減少症的情況中TPO是主要的體液調節物。例如，見Metcalf自然369519-520(1994)。在一些研究中已顯示TPO增加血小板數，增加血小板大小，並增加摻入受體動物血小板的同位素。具體地說，認為TPO以幾種方式影響巨核細胞生成(1)它使巨核細胞大小和數目增加；(2)它使巨核細胞中以多倍性的形式產生DNA含量的增加；(3)它增加巨核細胞的核內有絲分裂；(4)它使巨核細胞突變增加；(5)它使骨髓中以小乙醯膽鹼脂酶陽性細胞形式的前體細胞百分數增加。
由於血小板(血小板細胞)對血液凝集是必需的且當其數目很低時，病人有死於突變性出血的嚴重危險，所以TPO在診斷和治療各種血液學紊亂，如，主要由血小板缺陷引起的疾病中具有潛在的有用應用。用TPO進行的臨床試驗表明TPO可安全地給病人施用。另外，最近的研究提供了在治療血小板減小症，特別是由作為癌症或淋巴瘤治療的化療，放療或骨髓移植引起的血小板減少症中TPO治療的效果設計的基礎。參見，例如，McDonald(1992)，Am.J.Ped.Hematology/Oncology148-21(1992)。
已克隆和鑑定了編碼TPO的基因。見Kuter等，美國科學院學報，9111104-11108(1994)；Barley等，細胞771117-1124(1994)；Kaushansky等，自然369568-571(1994)；Wendling等，自然369571-574(1994)；Sauvage等，自然369533-538(1994)。血小板生成素是具有至少兩種形式的糖蛋白，表觀分子量為25kDa和31kDa，具有共同的N端胺基酸序列。見Bartley等，細胞，771117-1124(1994)。血小板生成素似乎具有由潛在的Arg-Arg裂解位點分開的兩個不同區域。氨基末端區域在人類和小鼠中高度保守，且與促紅細胞生成素和幹擾素-a和幹擾素-b具有一定的同源性。羧基末端區域顯示出廣泛的種類趨異性。
已描述了人類TPO-R(也稱為c-mpl)的DNA序列和編碼的肽序列。見Vigon等，美國科學院學報895640-5644(1992)。TPO-R是血細胞生成素生長因子受體家族的一個成員，該家族的特徵在於有一個細胞外區的共同結構設計，包括在N端部分的4個保守的C殘基和靠近跨膜區的WSXWS基序。見Batan，美國科學院學報；876934-6938(1990)。該受體在造血中發揮功能的證據包括其表達在小鼠中局限於脾，骨髓或胚胎肝臟(見Souyri等，細胞631137-1147(1990))且在人類中局限於巨核細胞，血小板，和CD34+細胞(見Methin等，血液，821395-1401(1993))的觀察結果。而且，CD34+細胞與針對mpl RNA的合成反義寡核苷酸的接觸明顯抑制巨核細胞群體的出現而不影響紅細胞或骨髓細胞集落形成。一些研究者假定該受體作為同型二聚體發揮功能，與G-CSF和促紅細胞生成素的受體的情況相似。
TPO-R克隆基因的獲得有利於尋找該重要受體的激動劑。重組受體蛋白質的獲得允許研究各種隨機和半隨機肽多樣性產生系統中受體-配體的相互作用。這些系統包括在美國專利號5,270,170和5,338,665中描述的「質粒上的肽」系統；1991年6月20日申請的美國專利申請系列號07/718,577及在Cwirla等，美國科學院學報，876378-6382(1990)，中描述的「噬菌體上的肽」系統；1994年9月2日申請的美國專利申請系列號08/300,262(它是以1993年10月29日申請的美國專利申請系列號08/144,775為基礎的部分延續申請)和PCT WO 95/11,992中所述的「多核糖體」系統；1993年11月12日申請的美國專利申請系列號08/146,886，1992年9月16日申請的07/946,239及1991年9月18日申請的07/762,522中所述「編碼的合成文庫」系統和在美國專利號5,143,854；1990年12月13日公開的PCT專利公開號90/15,070；1990年12月6日申請的美國專利申請系列號07/624,120；Fodor等，科學251767-773(2/1991)；DOWer和Fodor Ann.Rep.Med.Chem，26271-180(1991)，1991年12月6日申請的美國專利申請系列號07/805,727中所述的「極大量固著的多體合成」系統；本文引用上述各專利申請和文獻以供參考。
在患有血小板減少症的病人中血小板水平的緩慢恢復是一個嚴重的問題，因此迫切要求尋找能加速血小板再生的血液生長因子激動劑。本發明提供了該激動劑。
本發明的概述 本發明部分涉及一個新的且意想不到的發現限定的低分子量肽和肽模擬物具有與TPO-R的強烈結合特性且能激活TPO-R。因此，該肽和肽模擬物對於治療由TPO介導的症狀(例如，由化療，放療或骨髓輸血引起的血小板減少症)的治療目的及對於研究造血機制的診斷目的和對於巨核細胞和指定的祖先細胞(committed progenitor cell)的體外擴展(expansion)有用。
以下面實施例3所述的結合親和試驗測定的適於治療和/或診斷目的的肽和肽模擬物具有大約2mM或更小的IC50，其中IC50越低相應於與TPO-R的結合親和力越強。為達到藥用目的，肽和肽模擬物優選具有不超過大約100μm的IC50，更優選不超過500nM。在優選的實施方案中，肽或肽模擬物的分子量從大約250到大約8000道爾頓。
當用於診斷目的時，肽和肽模擬物優選用可檢測的標記物標記，因此，沒有該標記的肽和肽模擬物用作標記的肽和肽模擬物的製備的中間產物。
滿足分子量和TPO-R結合親和力限定標準的肽包括9個或更多個胺基酸，其中的胺基酸是天然存在的或合成的(非天然存在的)胺基酸。肽模擬物包括具有一個或多個下列修飾的肽 其中一個或多個肽基[-C(O)NR-]鍵(鍵)被諸如-CH2-氨基甲酸酯鍵[-CH2-OC(O)NR-]，膦酸酯鍵；-CH2-氨磺醯[-CH2S(O)2NR-]鍵；脲[-NHC(O)NH-]鍵；-CH2-仲胺鍵；或烷基化肽鍵[-C(O)NR6-其中R6是低級烷基]的非肽基鍵取代的肽； 其中N端衍變成-NRR1基，-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；-NRS(O)2R基；-NHC(O)NHR基(其中R和R1是氫或低級烷基，前提是R和R1不能同時是氫)；琥珀醯亞胺基；苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)基；或在苯環上具有選自低級烷基，低級烷氧基，氯和溴的1至3個取代的苄氧羰基-NH-基的肽；或 其中C端衍變成-C(O)R2的肽；其中R2選自低級烷氧基和-NR3R4其中R3和R4分別獨立地選自氫和低級烷基。
因此，優選的肽和肽模擬物包含的化合物具有 (1)分子量不超過大約5000道爾頓，和 (2)與TPO-R的結合親和力表達為IC50不超過大約100μm。
其中從0個到全部的肽的-C(O)NH-鍵被選自如下的鍵代替-CH2OC(O)NR-鍵；膦酸酯鍵；-CH2S(O)2NR-鍵；-CH2NR-鍵；-C(O)NR6-鍵；-NHC(O)NH-鍵，其中R是氫或低級烷基，R6是低級烷基。
而且其中所說的肽或肽模擬物的N端是選自-NRR1基；-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；NRS(O)2R基；-NHC(O)NHR基；琥珀醯亞胺基；苄氧羰基-NH-基；和在苯環上具有選自低級烷基，低級烷氧基，氯和溴的1至3個取代的苄氧羰基-NH-基，其中R和R1獨立地選自氫和低級烷基。
另外，其中所說的肽或肽模擬物的C端具有通式-C(O)R2，(其中R2選自羥基，低級烷氧基)和-NR3R4(其中R3和R4獨立地選自氫和低級烷基)且其中-NR3R4基的N原子可任選是肽N端的胺以形成環肽， 及其生理學上可接受的鹽。
在一個優選的實施方案中，本發明涉及標記的肽或肽模擬物，包含具有共價附著於其上的能檢測的標記的上述肽或肽模擬物。
在本發明的有些實施方案中，使用的優選肽包括具有包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7的核心結構的肽，其中X1是C，L，M，P，Q，V；X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
在一個優選的實施方案中，核心肽包含胺基酸序列X8GX1X2X3X4X5WX7，其中X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S，或T；X3是F，L，V或W；X4是A，K，L，M，R，S，V，或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S或T；X7是C，I，K，L，M或V；每個X8殘基獨立地選自20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個，其立體異構體D-胺基酸；和非天然胺基酸。優選的是，各X8殘基獨立地選自20個遺傳編碼的L-胺基酸及其立體異構體D-胺基酸中的任意一個。在一個優選的實施方案中，X1是P，X2是T；X3是L；X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
更優選的是，核心肽包含胺基酸序列X9X8GX1X2X3X4X5WX7 其中，X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V；X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V。更優選的是X9是A或I；X8是D，E或K。
特別優選的肽包括G G C A D G P T L R E W I S F C G G；G N AD G P T L R Q W L E G R R P K N；G G C A D G P T L R E W I S F C G GK；T I K G P T L R Q W L K S R E H T S；S I E G P T L R E W L T S R T PH S；L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T；C A D G P T L R E W I S FC和I E G P T L R Q W L A A R A。
在本發明的進一步的實施方案中，優選的用於本發明的肽包括具有包含下列胺基酸序列的核心結構的肽CX2X3X4X5X6X7其中，X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S或V；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。在更優選的實施方案中，X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。在另一實施方案中，X2是S或T；X3是L或R；X4是R；X5是D，E或G；X6是F，L或W；X7是I，K，L，R或V。特別優選的肽包括GG C T L R E W L H G G F C G G。
在另一實施方案中，優選的用於本發明的肽包括具有包含胺基酸序列X8CX2X3X4X5X6X7的結構的肽，其中X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V；X8是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個。在一些實施方案中，X8優選是G，S，Y或R。
本文所述的化合物對於預防和治療由TPO介導的疾病，特別是對於治療血液學疾病，包括但不限於由化療，放療或骨髓輸血引起的血小板減少症有用。因此，本發明還提供了治療病人的方法，其中，該病人具有對TPO激動劑的治療敏感失調，該病人接受或施用治療上有效劑量或量的本發明的化合物。
本發明還提供了包含一個或多個本文所述的化合物和生理學上可接受的載體的藥用組合物。這些藥用組合物可以是各種形式，包括口服劑量形式，以及可吸入的粉末和溶液和可注射及可輸注的溶液。 附圖的簡要描述 圖1A-B說明了在各種肽存在下的功能性試驗的結果；試驗在實施例2中描述。圖1A是用於本發明選擇的肽的TPO-R轉染的Ba/F3細胞增殖試驗的結果的圖示 ■指G G C A D G P T L R E W I S F C G G K(生物素)的結果； ×指G G C A D G P T L R E W I S F C G G的結果； △指L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T的結果； ○指G N A D G P T L R Q W L E G R R P K N的結果；和 +指T I K G P T L R Q W L K S R E H T S的結果。
圖1B是用相同的肽和親代細胞系的結果的圖示。
圖2A-C顯示了用TPO-R轉染的Ba/F3細胞增殖試驗的肽寡聚化結果。圖2A顯示了對於轉染的和親代細胞系複合生物素標記的肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12285)的試驗結果。圖2B顯示了對於轉染的和親代細胞系游離生物素標記的肽(A12285)的試驗結果。圖2C顯示了對於轉染的和親代細胞系單獨的鏈黴抗生物素蛋白的測定結果。
圖3A-G顯示了一系列對照實驗的結果，顯示了使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系和其相應的親代細胞系或EPO依賴型細胞系時TPO，本發明的肽，EPO，EPO-R結合肽在細胞增殖中的活性。圖3A描繪了使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系和其相應的親代細胞系時TPO在細胞增殖試驗中的結果。圖3B描繪了EPO在使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系和其相應的親代細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3C描繪了在TPO-R轉染的Ba/F3細胞系中複合的生物素標記的肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和複合形式的生物素標記的EPO-R結合肽(具有SA的AF11505)的結果。相應的親代細胞系的結果在圖3D中顯示。圖3E描繪了TPO在使用EPO依賴型細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3F描繪了EPO在使用EPO-依賴型細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3G描繪了複合生物素標記的肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12885)和複合形式的生物素標記的EPO-R結合肽(具有SA的AF11505)在EPO-依賴型細胞系中的結果。
圖4A-C說明了在載體pJS142中在質粒上的肽文庫的構建。同4A顯示了基因的限制性圖譜和位置。文庫質粒包括rrnB轉錄終止子，允許在氨苄青黴素上選擇的bla基因，允許挽救單鏈DNA的M13噬菌體基因內區域(M13IG)，質粒複製起點(ori)，兩個lacO5序列，允許正調節和負調節促使lac融合基因表達的araB啟動子的araC基因。圖4B顯示了在lacI基因3′端克隆區的序列，包括在文庫構建期間使用的sfiI和EagI位點。圖4C顯示了退火文庫寡核苷酸ON-829和ON-830連接到pJS142的SfiI位點以產生一個文庫。序列中的單個間隔表示連接位點。
圖5A-B說明了克隆進pELM3和pELM15MBP載體。圖5A顯示了在malE融合基因的3′端的序列，包括MBP編碼序列，多天冬醯胺連接子，因子Xa蛋白酶裂解位點，和可用的克隆位點。載體的其它部分來自可從New England Biolabs獲得的pMALc2(pELM3)和pMALp2(pELM15)。圖5B顯示了將BspEII-ScaI文庫片段轉移進AgeI-ScaI消化的pELM3/pELM15後的載體序列。轉移的序列包括編碼來自pJS142文庫的GGG肽連接子的序列。
圖6A描繪了用於在載體pCMG14中構建頭狀二聚體文庫(headpiece dimer library)的基因的限制性圖譜和位置。文庫質粒包括rrnB轉錄終止子，允許在氨苄青黴素上選擇的bla基因，允許挽救單鏈DNA的M13噬菌體基因內區域(M13IG)，質粒複製起點(ori)，一個lacOs序列，允許正調節和負調節促使頭狀二聚體融合基因表達的araB啟動子的araC基因。圖6B描繪了在頭狀二聚體基因3′端克隆區域的序列，包括文庫構建中使用的SfiI和EagI位點。圖6C顯示了退火的ON-1679，ON-829和ON-830連接到pCMG14的SfiI位點以產生文庫。序列中的單一間隔表示連接位點。
圖7到9顯示了評價本發明的肽和肽模擬物的活性的進一步試驗的結果。在這些試驗中，小鼠用carboplatin使其血小板減少。圖7描述了在第0天用carboplatin(125mg/kg，腹膜內注射)處理Balb/C小鼠時的典型結果。虛線代表三個實驗中的未處理的動物。實線代表三個實驗中carboplatin處理的組。粗實線代表以前的數據。圖8描繪了carboplatin滴定對用所示量的carboplatin(mg/kg，在第0天腹膜內(ip)注射)處理的小鼠中血小板計數的影響。圖9描繪了以肽AF12513(513)在第10天對carboplatin誘導的血小板減少症的改善。carboplatin(CBP；50-125mg/kg，經腹膜內)在第0天施用。AF12513(1mg/kg，ip)在第1-9天給藥。
具體實施方案的描述 I.定義和一般參數 下面闡述的定義用來說明和限定本文用於描述本發明的各種術語的意義和範圍。
「激動劑」指結合其互補的生物學活性受體並激活後者以引起受體的生物學反應或增強受體已經存在的生物學活性。
「藥用上可接受的鹽」指無毒性的鹼金屬，鹼土金屬和常用於製藥工業的銨鹽，包括鈉，鉀，鋰，鈣，鎂，鋇，銨，和魚精蛋白鋅鹽，它們用本領域熟知的方法製備。該術語也包括無毒性的加酸鹽，一般經過將本發明的化合物與合適的有機或無機酸反應來製備。有代表性的鹽包括鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，乙酸鹽，草酸鹽，戊酸鹽，油酸鹽，月桂酸鹽，_酸鹽，苯甲酸鹽，乳酸鹽，磷酸鹽，苯甲磺酸鹽，檸檬酸鹽，馬來酸鹽，延胡索酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，napsylate等。
「藥用上可接受的加酸鹽」指保留生物學效力和自由基特徵的且與諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等的無機酸和諸如乙酸，丙酸，羥乙酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲烷磺酸，乙烷磺酸，對苯甲磺酸，水楊酸等的有機酸不是生物學或其他方面不合需要的，形成的那些鹽。對於作為前藥描述的藥用上可接受的加酸鹽見Bundgaard H.，出處同上。
「藥用上可接受的酯」所指的那些酯在水解酯鍵時保留生物學效力及羧酸或醇的特性且不是生物學或其他方面不合需要的。對於作為前藥描述的藥用上可接受的酯見Bundgaard H.編輯，前藥的設計，Elsevier科學出版社，Amsterdam(1985)。這些酯典型地從相應的羧酸和醇形成。一般來說，酯形成可經常規合成技術實現。(見，例如，Mach，有機化學進展，第3版，John wiley和Sons，紐約(1985)，p.1157及其中引用的參考文獻，Mark等，化學技術大全，John Wiley & Sons，紐約(1980))。酯的醇組成一般包括(i)C2-C12的脂肪族醇，可含有或不含一個或多個雙鍵且可含有或不含分枝的碳原子，或(ii)，C7-C12芳香族或雜環芳香族醇。本發明也包含使用是本文所述的酯，同時又是其藥用上可接受的加酸鹽的那些組合物。
「藥用上可接受的醯胺」指在水解醯胺鍵時保留生物學效力及羧酸或胺的特性，且不是生物學或其他方面不合需要的。關於作為前藥描述的藥用上可接受的醯胺見Bundgaard，H.編輯，前藥的設計，Elsevier科學出版社，Amsterdam(1985)。這些醯胺典型地從相應的羧酸和胺形成。一般來說，可經過常規合成技術實現醯胺的形成。(見，例如，March.有機化學進展，第三版，John Wiley & Sons，紐約(1985)p.1152和Mark等、化學技術大全，John Wiley & Sons，紐約(1980))。本發明也包含使用的組合物既是本文所述的醯胺，同時又是其藥用上可接受的加酸鹽。
「藥用上或治療上可接受的載體」指不幹擾活性成份的生物學活性效力且對宿主或病人無毒性的載體介質。
「立體異構體」指與另一化合物具有相同分子量，化學組成和結構但具有不同原子排列的化合物。這就是說，某些相同的化學基團在空間上具有不同取向，因此，當純化時，具有旋轉偏振光平面的能力。然而，有些純化的立體異構體具有輕微的旋光性，用目前的儀器不可檢測出來。本發明的化合物可具有一個或更多個不對稱碳原子，因此包括各種立體異構體。所有的立體異構體都包括在本發明的範圍內。
應用於本發明的組合物的「治療上或藥用上有效的量」指足以誘導所需生物學結果的組合物的量。該結果可以是減輕疾病的瘧徵，症狀或病因，或任何其它所需的生物學系統的改變。在本發明中，該結果典型地包含對感染或組織損傷的免疫學和/或炎症反應的減輕。
肽中的胺基酸殘基縮寫如下苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；異亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；纈氨酸是Val或V；絲氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；蘇氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；組氨酸是His或H；穀氨醯胺是Gln或Q；天冬醯胺是Asn或N；賴氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；穀氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；甘氨酸是Gly或G。另外，Bu是丁氧基，B21是苄基，CHA是環已胺，Ac是乙醯基，Me是甲基，Pen是青黴胺，Aib是氨基異丁酸，Nva是正纈氨酸，Abu是氨基丁酸，Thi是噻吩丙氨酸，OBn是鄰苄基，hyp是羥脯氨酸。
除了僅由天然存在的胺基酸組成的肽外，還提供了肽模擬物或肽類似物。常用於製藥工業的肽類似物是具有類似於模板肽的特徵的非肽藥物。這類非肽化合物稱為「肽模擬物」或「肽的模擬物」(Fauchere，藥品研究進展雜誌1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；Evans等，醫用化學雜誌，301229(1987)，本文作為參考文獻引用)。在結構上相似於治療上有用的肽的肽模擬物可用於產生相當的或增強的治療或預防效果。一般來說，肽模擬物在結構上相似於範例多肽(即，具有生物學或藥理活性的多肽)，如天然存在的結合受體的多肽，但任選一個或多個肽鍵被選自-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的鍵經本領域已知的方法取代，它在下列參考文獻中有進一步的描述Spatola.A，F.胺基酸，肽和蛋白質的化學和生物化學，B.Weinstein編輯，MarcelDekker.紐約，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，Vol.1，Issue 3.肽鏈修飾(綜述)；Morley，藥物科學動態(1980)，pp.463-468(綜述)；Hudson.D.等，國際肽，蛋白質研究雜誌，14177-185(1979)(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola等，生命科學381243-1249(1986)(-CH2-S-)；Hann.J.Chem.Soc.PerKin Trans.I307-314(1982)(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist等，醫用化學雜誌，231392-1398(1980)(-COCH2-)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett.232533(1982)(-COCH2-)；Szelke等，European Appln.EP 45665CA(1982)；9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay等，Tetrahedron Lett.244401-4404(1983)(-CH(OH)CH2-)；和Hruby.生命科學，31189-199(1982)(-CH2-S-)；本文引用每一篇作為參考文獻。特別優選的非肽鍵是-CH2NH-。該肽模擬物相對於多肽實施方案具有明顯的優勢，包括，例如生產更經濟，化學穩定性更大，藥理特性增強(半壽期，吸附性，潛力，效力等)，特異性改變(例如，生物學活性的廣譜性)，抗原性減小，和其它。肽模擬物的標記通常涉及將一個或多個標記物直接或通過間隔子(例如，醯胺基)附著到經定量結構活性數據和/或分子模擬推測的肽模擬物的非幹擾位置上。該非幹擾性位置一般是與大分子(例如，免疫球蛋白超家族分子)不形成直接接觸的位置，肽模擬物與該大分子結合後產生治療效力。肽模擬物的衍變(例如，標記)應基本上不幹擾該肽模擬物所需的生物學或藥理學活性。一般來說，結合受體的肽的肽模擬物以高親和力結合受體且具有可檢測的生物學活性(即，是對於一個或更多個受體介導的表型改變的激動劑或拮抗劑)。
用相同類型的D-胺基酸系統取代一個或多個共有序列的胺基酸(例如，用D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用於產生更多穩定的肽。另外，含有共有序列或基本上相同的共有序列變異的限定肽可以本領域已知的方法產生(Rizo和Gierasch生化回顧年鑑，61387(1992)，本文引用作為參考文獻)；例如，經過加入能形成分子內二硫鍵使肽環化的內部半胱氨酸殘基可產生。
合成的或非天然存在的胺基酸指在天然狀態下不存在於體內但可摻入本文所述的肽結構中的胺基酸。優選的合成胺基酸是天然存在的L-α-胺基酸的D-α-胺基酸以及由通式H2NCHR5COOH代表的非天然存在的D-和L-α-胺基酸，其中R5是1)低級烷基，2)從3到7個碳原子的環烷基，3)從3到7個碳原子的雜環且1至2個雜原予選自氧，硫和氮，4)從6到10個碳原子的芳香殘基，任選在芳香核上具有選自羥基，低級烷氧基，氨基，羧基的1到3個取代，5)亞烷基-Y，其中亞烷基是從1到7個碳原子的亞烷基，Y選自(a)羥基，(b)氨基，(c)從3到7個碳原子的環烷基和環亞烷基，(d)從6到10個碳原子的芳基，任選在芳核上具有選自羥基，低級烷氧基，氨基和羧基的1到3個取代，(e)從3到7個碳原子的雜環，且1至2個雜原子選自氧，硫和氮，(f)-C(O)R2，其中R2選自氫，羥基，低級烷基，低級烷氧基，和-NR3R4，其中R3和R4獨立地選自氫和低級烷基，(g)-S(O)nR6，其中n是從1到2的整數，R6是低級烷基，前提是R5不限制天然存在的胺基酸的側鏈。
其它優選的合成胺基酸包括氨基被超過一個的碳原子與羧基分開的胺基酸，如b-氨基丙酸，g-氨基丁酸，等。
作為舉例，特別優選的合成胺基酸包括天然存在的L-胺基酸的D-胺基酸，L-1-萘基-丙氨酸，L-2-萘基丙氨酸，L-環己烷基丙氨酸，L-2-氨基異丁酸，甲硫氨酸的亞碸和碸衍生物)即，HOOC-(H2NCH)CH2CH2-S(O)nR6，其中n和R6限定如上所述，以及甲硫氨酸的低級烷氧衍生物，(即，HOOC-(H2NCH)CH2CH2-OR6，其中R6按上面限定)。
「可檢測的標記」指當共價附著於本發明的肽和肽模擬物上時，允許在已施用該肽或肽模擬物的病人體內檢測該肽和肽模擬物的物質。合適的可檢測的標記是本領域中熟知的且作為舉例，它包括放射性同位素，螢光標記(例如螢光素)等。具體採用的可檢測的標記不是關鍵的，且其選擇涉及所採用的標記物的量以及在所用的該標記物的量下該標記物的毒性。涉及這些因素的標記物的選擇完全在本領域的技術範圍內。
可檢測的標記物共價附著於該肽或肽模擬物上經過本領域熟知的常規方法實現。例如，當125I放射性同位素用作可檢測的標記物時，125I共價附著於肽或肽模擬物上可經過將胺基酸酪氨酸摻入肽或肽模擬物中然後碘化該肽來實現。如果酪氨酸不存在於肽或肽模擬物中，可用熟知的化學法實現將酪氨酸摻入肽或肽類似物的N或C末端。同樣，32P可作為磷酸基團摻入到肽或肽模擬物中，例如，通過使用常規化學法摻入到肽或肽類似物的羥基上。
II.綜述 本發明提供了結合併激活TPO-R或否則作為TPO激動劑發揮作用的化合物。這些化合物包括「榜樣」(lead)肽化合物和「衍生」化合物，後者限定為與榜樣化合物具有相同或相似的分子結構或形狀但與榜樣化合物的區別在於對水解或蛋白裂解的敏感性和/或其它的生物學特徵，如，對受體的親和力增加。本發明也提供了包含有效量的TPO激動劑的組合物，更具體地說是一種對治療血液學紊亂，特別是與化療，放射或骨髓輸血相聯的血小板減少症有用的化合物。
III.TPO-激動劑的鑑定 對TPO-R具有結合親和力的肽以與親和力富集過程偶聯的隨機肽多樣性產生系統能較容易地鑑定。
具體地說，隨機肽多樣性產生系統包括在美國專利號5,270,170和5,338,665中描述的「在質粒上的肽」系統1991年6月20日申請的美國專利申請系列號07/718,577(它是1990年6月20日申請的美國專利申請系列號07/541,108的部分延續)和在Cwirla等，美國科學院學報876378-6382(1980)中描述的「噬菌體上的肽」系統；在1994年9月2日申請的美國專利申請系列號08/300,262(它是以1993年10月29日申請的美國專利申請系列號08/144,775為基礎的部分連續申請)和PCT WO 95/11,992中所述的「多核糖體系統」；1993年11月12日申請的美國專利申請系列號08/146,886(它是1992年9月16日申請的美國專利申請系列號07/946,239的部分連續申請，而後者又是1991年9月18日申請的美國專利申請系列號07/762,522的部分連續申請)中所述的「編碼的合成文庫CESL」系統；及在美國專利號5,143,854；1990年12月13日公開的PCT專利公開號90/15,070；1990年12月6日申請的美國專利申請系列號07/624,120；Fodor等，科學251767-773(2/1991)；Dower和Fodor，Ann.Rep.Med.Chem.26271-180(1991)，1991年12月6日申請的美國專利申請系列號805,727中所述的「極大量固著多聚體合成」系統。
使用上面所述的程序，一般將隨機肽設計成在長度上具有限定數目的胺基酸殘基(例如，12個)。為了產生編碼隨機肽的寡核苷酸集合，使用密碼子基序(NNK)x限定從NNK基序產生的32個可能的密碼子中的任意一個，1代表12個胺基酸中的任意一個，2代表5個胺基酸中的任意一個，3代表3個胺基酸中的任一個，且只有3個終止密碼子中的一個，其中N是核苷酸A，C，G或T(等摩爾，根據所用的方法，可使用其它核苷酸)，K是G或T(等摩爾)，且x是相應於肽中胺基酸數目的整數(例如12)。因此，NNK基序編碼了全部胺基酸，僅編碼一個終止密碼子，且減小了密碼子偏性(codon bias)。
在所用的系統中，隨機肽作為包含噬菌體fd衍生物的pIII或pVIII外膜蛋白的融合蛋白質的一部分存在於噬菌體顆粒的表面(在噬菌體上的肽)或作為與LacI肽融合蛋白質的融合蛋白結合於質粒上(在質粒上的肽)。
包含編碼該肽的DNA的噬菌體或質粒使用固著TPO-R經親和富集過程鑑定並分離。親和富集過程有時稱為「淘選」，包含多輪將噬菌體質粒或多核糖體與固著受體溫育，收集結合於受體上的噬菌體，質粒或多核糖體(以及所伴隨的DNA或RNA)並產生更多所收集的噬菌體或質粒(以及所伴隨的LacI-肽融合蛋白)。TPO-R的細胞外區域(ECD)典型地在淘選期間使用。
經過幾輪親和富集後，經ELISA檢查噬菌體或質粒及所附的肽以確定該肽是否特異性地結合TPO-R。以在親和富集過程中所用的程序相似的程序進行該試驗，除了去掉未結合的噬菌體後，先用兔抗噬菌體抗體，然後用鹼性磷酸酶(AP)連接的羊抗兔抗體典型地處理孔。用標準方法測定各孔中鹼性磷酸酶的量。用於在質粒上的肽系統中的相似的ELISA程序在下面詳細描述。
經過比較試驗孔與對照孔(無受體)，可測定融合蛋白質是否特異性地結合於受體上。使用放射性標記的單價受體在以菌落轉移探測方式篩選所發現的結合於TPO-R上的噬菌體合併液。使用蛋白激酶A磷酸化融合到可溶性受體C末端的肯普肽序列可生產該探針。然後將TPO受體的「改造」形式在宿主細胞，典型地是CHO細胞中進行表達。經PI-PLC收穫該受體後，測驗該受體與TPO或TPO-R特異性的噬菌體克隆的結合。然後用32P將該受體標記成高比活用作使用菌落轉移鑑定高親和力配體的單價探針。
然後作為游離肽(例如、無噬菌體)合成發現特異性地結合受體的肽並在抑制試驗中測試。以與ELISA相似的方式進行抑制試驗，除了在融合蛋白前向孔中加入TPO或參考肽(對照孔有2類(1).無受體；(2).無TPO或參考肽)。與受體的結合受TPO或對照肽抑制的融合蛋白質含有在作為本發明優選的、化合物的隨機肽部分中的肽。
TPO-R及其細胞外區域在重組宿主細胞中產生。TPO-R的一個有用的形式經過使用標準方法在杆狀病毒轉化的宿主細胞中以可溶蛋白質的形式表達該蛋白質來構建；另一個有用的形式以用於蛋白質分泌和用於糖磷脂膜錨著附著的信號肽來構建。該錨著附著的形式稱為「PIG-尾」。見Caras和Wendell，科學，2431196-1198(1989)，Lin等，科學，249677-679(1990)。
使用PIG尾系統，可用磷脂酶C以表達該受體的細胞表面(例如，用細胞分選儀選擇高水平表達受體的轉化的CHO細胞)裂解該受體。裂解的受體仍包含來自用於膜附著的信號蛋白的羧基末端胺基酸序列，稱為「HPAP尾」且無需進一步純化就可固著。重組受體蛋白質可經過用抗-HPAP尾抗體(Ab 179或Mab 179)覆蓋微滴度平板，用PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結合，然後將裂解的重組受體結合到抗體上來固著。使用該程序時，應以不同濃度的受體進行固著反應以確定用於給定製品的最佳量，因為重組蛋白的不同製品常含不同量的所需蛋白質。另外，在親和富集過程中應確保固著抗體完全被封閉(用PTO或一些其它的封閉化合物)。否則，未封閉的抗體在親和富集程序中可結合所需的噬菌體。可使用與固著抗體結合的肽以封閉受體固著後剩餘的未結合位點來避免該問題或可簡單地將受體直接固著於微滴度平板的孔中，無需藉助於固著抗體。見1992年9月18日申請的美國專利申請系列號07/947,339，本文引用作為參考文獻。
當使用允許多價配體-受體相互作用的隨機肽產生系統時，應認識到固著受體的密度在測定能結合固著受體的配體的親和力中是重要因素。受體密度越高(例如，用0.25至0.5mg受體處理每個用抗受體的抗體覆蓋的孔)，與較低的受體密度(例如，用0.5至1ng受體處理每個用抗受體的抗體覆蓋的孔)相比發生多價結合的可能性更大。如果發生多價結合，那麼分離具有相對較低親和力的配體的可能性越大，否則將使用高密度的固著受體來鑑定榜樣化合物並使用較低的受體密度來分離更高親和力的衍生化合物。
為了辨別更高親和力的肽，常使用單價受體探針。使用蛋白激酶A磷酸化融合到可溶性受體C端的肯普肽序列可生產該探針。然後在宿主細胞，典型地是CHO細胞中表達TPO受體的「改造」形式。經PI-PLC收穫受體後，試驗該受體與TPO或TPO-R特異性的噬菌體克隆的結合。然後用32P將該受體標記成高比活以用作單價探針來使用菌落轉移鑑定高親和力的配體。
幫助鑑定結合TPO-R的肽的優選的篩選方法包含首先鑑定結合受體細胞外區域的榜樣肽，然後製備類似於榜樣肽的其它肽。具體地說，使用在噬菌體上的基於pIII或pVIII的肽系統，可篩選隨機文庫以發現存在結合TPO-R的肽的噬菌體。測序噬菌體DNA以確定在噬菌體表面的肽。
從隨機線型10聚體pVIII文庫和隨機環狀10聚體和12聚體pVIII文庫鑑定能特異性結合TPO-R的克隆。這些肽的序列用作構建其它肽文庫的基礎該文庫設計成含高頻率的開始鑑定的肽的衍生物。可合成這些文庫以幫助生產與結合肽僅有幾個殘基區別的肽。這一方案包括合成具有結合肽編碼序列的寡核苷酸，除了在合成中不使用四種核苷三磷酸中的每一種的純製品，而使用四種核苷三磷酸的混合物(即，55％的「正確」核苷酸及其它三種核苷酸各15％是用於該目的的優選的混合物，70％的「正確」核苷酸及其它三種核苷酸各10％是用於該目的的另一種優選的混合物)以產生編碼該結合肽的序列的衍生物。
使用各種方法經過製備「基序誘變」文庫來衍變榜樣肽。這些包括pVIII噬菌粒誘變文庫，該文庫以70:10:10:10頻率誘變的共有序列為基礎，用隨機殘基在各末端延伸以產生包括序列XXXX(C，S，P或R)TLREWL XXXXX X(C或S)的克隆。使用在質粒上的肽系統構建相似的延伸/誘變文庫以產生包括序列XXXXX(C，S，P或R)TLREWLXXXXXXX的克隆。使用多核糖體演示系統構建另一延伸/誘變文庫，XXXX(C，S，P或R)TLREWL XXXXXX(C或S)。用肽洗脫篩選所有這三個文庫並用放射性標記的單價受體探測。
「在質粒上的肽」技術也用於肽篩選和誘變研究並在美國專利號5,338,665中有更詳細的描述，本文引用該文獻作為參考文獻用於各種目的。根據本方法，通過從攜帶融合基因的質粒載體進行表達將隨機肽融合到LacI的C末端。LacI-肽融合物與其編碼的DNA的連接經過在質粒上的LacO序列進行，形成穩定的肽-LacI-質粒複合物，它能在固著受體上經親和純化(淘選)進行篩選。然後以電穿孔將由此分離的質粒重新導入大腸桿菌中以擴增用於另一輪篩選或用於單個克隆檢查的選定群體。
另外，使用修飾的C-端Lac-I演示系統進行篩選和誘變研究，其中演示效價減小(「頭狀二聚體」演示系統)。篩選該文庫，並將所得的DNA插入片段作為一個集合克隆進麥芽糖結合蛋白(MBP)載體中使其作為C端融合蛋白表達。然後按上面所討論的，以ELISA方式分析隨機挑選的單個MBP融合克隆的粗製細胞裂解產物的TPO-R結合。
使用多核糖體顯示系統也進行了肽誘變研究，如在1994年9月2日申請的共同未決申請美國專利申請系列號08/300,262(它是以1993年10月29日申請的美國專利申請系列號08/144,775為基礎的部分連續申請)和PCT WO 95/11,992中所述，本文引用其每一篇作為參考文獻用於各種目的。根據序列XXX X(C，P，R或S)tlrefl XXXXXX(C或S)構建誘變文庫，其中X代表隨機NNH密碼子，小寫字母代表在位置1和2含70:10:10:10誘變，在密碼子位置3是K(G或T)的胺基酸密碼子。用固著在磁珠上的TPO受體淘選該文庫5輪。第5輪後，將PCR擴增庫克隆進pAFF6且測序ELISA陽性克隆。將該序列亞克隆進MBP載體，經MBP ELISA測定其結合親和力。
為了固著用於多核糖體篩選的TPO-R，按廠家所述首先將Ab 179化學連接到甲苯磺醯激活的磁珠(可從Dynal Corporation獲得)。用在0.5M硼酸緩衝液(pH9.5)中的抗體在室溫下保溫磁珠過夜。洗滌磁珠並與含TPO-R的「HPAP」尾結合。將抗體覆蓋的磁珠和受體在4℃培養1小時，在加入多核糖體文庫前再次洗滌磁珠。
按上面所述篩選各文庫產生的TPO受體結合肽在下面表1和2中顯示，其它未在本文中列出。 表1 表2 一些其它有代表性的肽的IC50值在下表中給出。可使用各種方法來評價IC50值。例如，使用MBP-TPO或lacI-肽示蹤物的平衡結合ELISA試驗來測定該肽是否抑制TPO與TPO受體的細胞外區域的結合。典型地是，使用自由肽測定IC50值。使用任選可C端醯胺化或可作為酯或其它羧基醯胺製備的自由肽可測定IC50值。
為了再創造在噬菌體上出現的精確序列，在合成肽的N端和C端胺基酸前常加上一個或兩個甘氨酸殘基。據信這些甘氨酸對結合或活性不是必須的。同樣，為模擬在多核糖體上出現的肽的精確序列，常在合成肽的C端胺基酸之前加上序列MAS。據信該序列對結合或活性也不是必須的。
IC50值用符號「-」，「+」和「++」來表示。例如，顯示IC50值超過200μM的那些肽表示為「-」。IC50值小於或等於200μM的那些肽表示為「+」，產生IC50值為500nm或更小的那些肽表示為「++」。產生的IC50值位於或靠近特定符號的臨界點的那些肽用雜合標記、例如「+/-」表示。IC50值檢測不到的那些肽列為「N.D」。具有結構GGCTLREWLHGGFCGG的肽的IC50值為500nm或更小。(注意在N端和C端胺基酸前加兩個甘氨酸以再產生由噬菌體顯示的精確序列。據信這些甘氨酸對結合或活性不是必須的)。
表3 上述表格，特別是在表3中說明了優選的核心肽包含胺基酸序列X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1是C，L，M，P，Q，V；X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
在優選的實施方案中，核心肽包含胺基酸序列X8GX1X2X3X4X5WX7，其中，X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S或T；X3是F，L，V，或W；X4是A，K，L，M，R，S，V或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S或T；X7是C，I，K，L，M或V；且每個X8殘基獨立地選自20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個，其立體異構體D-胺基酸和非天然胺基酸。優選的是，各X8殘基獨立地選自20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個及其立體異構體D-胺基酸。在一個優選的實施方案中，X1是P，X2是T；X3是L；X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
更優選的是，核心肽包含胺基酸序列X9X8GX1X2X3X4X5WX7，其中X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V；X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V。更優選的是，X9是A或I；X8是D，E或K。
特別優選的肽包括G G C A D G P T L R E W I S F C G G；G N AD G P T L R Q W L E G R R P K N；G G C A D G P T L R E W I S F C G GK；T I K G P T L R Q W L K S R E H T S；S I E G P T L R E W L T S R T PH S；L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T；C A D G P T L R E W I S FC；和I E G P T L R Q W L A A R A。
本發明的另一實施方案中，用於本發明的優選的肽包括具有包含胺基酸序列CX2X3X4X5X6X7的核心結構的肽；其中X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S或V；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。在一個更優選的實施方案中，X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。在另一實施方案中，X2是S或T；X3是L或R；X4是R；X5是D，E或G；X6是F，L，或W；X7是I，K，L，R或V。特別優選的肽包括G G C T L R E W L H GG F C G G。
在另一實施方案中，用於本發明的優選的肽包括具有包含胺基酸序列X8CX2X3X4X5X6X7的結構的肽，其中X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V；X8是20個遺傳編碼的L-胺基酸中的任意一個。在一些實施方案中，X8優選是G，S，Y或R。
具有IC50大於大約100μM的肽和肽模擬物缺乏允許用於本發明的診斷或治療方面的足夠結合力。優選的是，對於診斷目的，肽和肽模擬物IC50大約為2mM或更少，對於藥用目的，肽和肽模擬物IC50為大約100μM或更少。
結合的肽序列也提供了測定本發明的結合TPOR的化合物的最小大小。使用「編碼的合成文庫」(ESL)系統或「極大量固著多聚體合成」系統不僅可測定具有該活性的肽的最小大小，也可製備所有形成與優選的基序(或該基序的最小大小)有一個，2個或多個殘基區別的肽組中的肽。然後可篩選該肽的集合與TPO-受體結合的能力。這些固著多聚體合成系統或其它肽合成方法也可用於合成截短的類似物，缺失類似物，取代類似物及本發明的所有肽化合物的組合。
本發明的肽和肽模擬物也在血小板生成素依賴型細胞增殖試驗中進行了評價，如在下面實施例2中進行了更詳細的描述。用本領域已知的技術測量細胞增殖，如與3H-胸苷摻入作細胞增殖指示相關的MTT試驗(見Mossmann，免疫學方法雜誌，6555(1983))。試驗的肽以劑量依賴性方式刺激TPO-R轉染的Ba/F3細胞的增殖，如圖1A所示。這些肽對親代細胞系無影響，如圖1B所示。
圖7至9顯示了評價本發明的肽和肽模擬物的活性的進一步試驗的結果。在該試驗中，用carboplatin製備血小板減少症的小鼠。圖7描繪了在第0天用carboplatin(125mg/kg，腹膜內)處理Balb/C小鼠時的典型結果。虛線代表三個實驗中未處理的動物。實線代表在三個實驗中carboplatin處理的組。粗實線代表以前的數據。圖8描繪了用所示量的carboplatin(mg/kg，在第0天腹膜內(ip)注射)處理的小鼠中carboplatin滴定對血小板計數的影響。圖9描繪了用肽AF12513(513)在第10天對carboplatin誘導的血小板減少症的改善。在第0天施用carboplatin(CBP；50-125mg/kg，腹膜內注射)。在第1-9天施用AF 12513(1mg/kg，ip)。這些結果顯示了本發明的肽能改善小鼠模型中的血小板減少症。
另外，本發明的某些肽可二聚體化或寡聚體化，從而增加該化合物的親和力和/或活性。為了研究肽二聚體化/寡聚化對細胞增殖試驗中TPO模擬潛力的影響，合成了肽G G C A D G P T L R E W I S F C G G的C端生物素化類似物(G G C A D G P T L R E W I S F C G G K(生物素))。用在無血清的HEPES緩衝的RPMI中的鏈黴抗生素蛋白以4∶1的摩爾比預培養該肽。試驗該複合物對TPO-R轉染的Ba/F3細胞的細胞增殖的刺激，如上所述，對游離的生物素標記的肽和未用生物素標記的親本肽進行平行實驗。圖2A顯示了對轉染的和親本細胞系，複合的生物素標記的肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12885)的試驗結果。圖2B顯示了對轉染的和親本細胞系，游離的生物素標記的肽(AF12285)的試驗結果。圖2C顯示了對轉染的和親本細胞系，鏈黴抗生物素蛋白單獨試驗的結果。這些


了預先形成的複合物的效力大約是自由肽的10倍。
經過研究肽對促紅細胞生成素受體(EPO-R)的交叉反應性也檢查了本發明的肽的結合特異性和活性。EPO-R與TPO-R一樣，也是血細胞生成素生長因子受體家族的一個成員。在使用EPO-依賴型細胞系的細胞增殖試驗中檢查了本發明的肽，以及TPO，EPO和已知的EPO結合肽。該試驗利用了FDCP-1，一種生長因子依賴型鼠多潛能原始造血祖先細胞系(見，例如，Dexter等，實驗方法雜誌，1521036-1047(1981))作為親代細胞系。當補充WEHI-3-條件培養基(含IL-3，ATCC號T1B68的培養基)時，該細胞系能增殖，但不能分化。用人或鼠EPO-R轉染親代細胞系以產生FDCP-1-EPO-R細胞系。在人或鼠EPO存在的條件下，這些轉染的細胞系能增殖，但不能分化。
在必需生長因子存在下細胞生長到半靜止期密度。然後將細胞在PBS中洗滌，並在無生長因子的全培養基中飢餓16-24小時。測定細胞的存活力後，製備貯液(在無生長因子的全培養基中)以產生每50微升105個細胞的溶液。在96孔組織培養平板中以每孔50μl的終體積製備待測化合物的系列稀釋液(典型地是，相對於結合相或其它結合或固著肽的游離溶液相肽)。向各孔中加入細胞(50μl)，細胞培養24-48小時，此時陰性對照死亡或休眠。然後用本領域已知的技術，如MTT試驗測量細胞增殖。
圖3A-G顯示了一系列對照實驗的結果；顯示了TPO，本發明的肽，EPO和EPO-R結合肽在使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系及其相應的親代細胞系，或EPO依賴型細胞系及其相應的親代細胞系的細胞增殖試驗中的活性。圖3A描述了TPO在使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系及其相應的親代細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3B描述了EPO在使用TPO-R轉染的Ba/F3細胞系及其相應的親代細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3C描述了複合的生物素標記的肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和生物素標記的EPO-R結合的肽的複合形式(具有SA的AF11505)在TPO-R轉染的Ba/F3細胞系中的結果。相應的親代細胞系的結果在圖3D中顯示。圖3E描述了TPO在使用EPO依賴型細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3F描述了EPO在使用EPO依賴性細胞系的細胞增殖試驗中的結果。圖3G描述了複合的生物素標記的俄肽(具有鏈黴抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和生物素標記的EPO-R結合肽的複合形式(具有SA的AF11505)在EPO-依賴性細胞系中的結果。這些結果表明本發明的肽以高度特異性結合併激活TPO-R。
IV.肽和肽模擬物的製備 A.固相合成 本發明的肽可用本領域已知的經典方法，例如，經過使用標準固相技術來製備。標準方法包括專一固相合成，部分固相合成方法，片段濃縮，經典溶液合成，甚至使用重組DNA技術。見，例如，Merrifield，美國化學學會雜誌，852149(1963)，本文作為參考文獻引用。在固相上，使用α-氨基保護的樹脂典型地從肽的C末端開始合成。可製備合適的起始物質，例如，經過將所需的α-氨基附著到氯甲基化的樹脂，羥甲基樹脂或二苯甲基胺樹脂上。一種這類氯甲基化樹脂是由Bio Rad實驗室，Richmond，CA以商品名BIO-BEAPS SX-1提供的固體，羥甲基樹脂的製備由Bodonszky等，Chem.Ind.(倫敦)381597(1966)所述。二苯甲基胺(BHA)樹脂由Pietta和Marshall Chem.Commn.650(1970)描述且可從Beckman Instrument，Inc.，Palo Alto，CA以鹽酸形式買到。
因此，根據Gisin Helv.Chim.Acta561467(1973)所述的方法藉助於，例如碳酸氫銫催化劑將α-氨基保護的胺基酸偶聯到氯甲基化樹脂上可製備本發明的化合物。開始偶聯後，經過選擇在有機溶劑中的包括三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)溶液的試劑在室溫下去掉α-氨基保護的基團。
α氨基保護基團是已知在肽的合成步驟領域中有用的那些基團。包括醯基類保護基團(例如，甲醯基，三氟乙醯基，乙醯基)，芳香族尿烷類保護基團(例如，苄氧羧基(cbz)和取代的cbz)，脂肪族尿烷保護基團(例如，t-丁烷氧基羰基(Boc)，異丙烷氧基羰基，環己烷氧基羰基)和烷基型保護基團(例如，苄基，三苯基甲基)。Boc和Fmoc是優選的保護基團。側鏈保護基團在偶聯期間保持完整，且在氨基末端保護基團去保護期間或偶聯期間不被裂解。在完成最終肽合成時，在不改變靶肽的反應條件下側鏈保護基團應可去掉。
Tyr的側鏈保護基團包括四氫吡喃基，叔丁基，三苯甲遊基，苄基，Cbz，Z-Br-Cbz，和2，5-二氯苄基。Asp的側鏈保護基團包括苄基2，6-二氯苄基，甲基，乙基和環己烷基。Thr和Ser的側鏈保護基團包括乙醯基，苯甲醯基，三苯甲遊基，四氫吡喃基，苄基，2，6-二氯苄基和Cbz。Thr和Ser的側鏈保護基團是苄基。Arg的側鏈保護基團包括硝基，甲苯磺醯基(Tos)，Cbz，金剛烷氧基羰基，菜醯磺醯基(Mts)或Boc。Lys的側鏈保護基包括Cbz，2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Cbz)，2-溴苄氧基羰基(2-BrCbz)，Tos或Boc。
去掉α-氨基保護基後，剩餘的保護氨基以所需的順序分步偶聯。過量的各種保護的胺基酸一般在溶液，例如，在二氯甲烷(CH2Cl2)，二甲基甲醯胺(DMF)的混合物中與合適的羧基激活劑，如二環己烷基碳化二亞胺(DCC)使用。
完成所需的胺基酸序列後，經過用諸如三氟乙酸或氟化氫(HF)的試劑處理從樹脂支持物上裂解下所需的肽，所用的試劑不僅從樹脂上裂解下肽，而且還裂解所有剩餘的側鏈保護基團。當使用氯甲基化的樹脂時，氟化氫處理導致形成游離的肽酸。當使用二苯甲基胺樹脂時，氟化氫處理直接產生游離的肽醯胺。另外，當使用氟甲基化樹脂是，經過用氯處理肽樹脂可裂解側鏈保護的肽以產生所需側鏈保護的醯胺或用烷基胺處理產生側鏈保護的烷基醯胺或二烷基醯胺。然後經過用氟化氫處理以通常的方式去掉側鏈保護以產生自由醯胺，烷基醯胺或二烷基醯胺。
這些固相肽合成程序在本領域中是熟知的且在Stewart的固相肽合成(Freeman和Co.，San Francisco，(1969))中有進一步的描述。
使用在1990年3月7日申請的美國專利申請系列號07/492,462；1990年12月6日申請的07/624,120；和1991年12月6日申請的07/805,727中描述的「編碼的合成文庫」或極大量固著多聚體合成」系統；不僅可測定具有該活性的肽的最小大小，還能製備形成與優選的基序(或該基序的最小大小)具有一個，二個或多個殘基區別的肽組的所有肽。然後可篩選該肽的集合中結合TPO-R的能力。也可使用固著多聚體合成系統或其它的肽合成方法以合成本發明的所有肽化合物的截短類似物，缺失類似物和截短及缺失組合的類似物。
B.合成的胺基酸 也可使用這些程序合成這樣一類肽，其中在本發明的任一化合物的一個，二個或多個位置被不同於20個天然存在的，遺傳編碼的胺基酸的其它胺基酸取代。例如，萘基丙氨酸可取代色氨酸，有利於合成。可取代進本發明的肽中的其它合成胺基酸包括L-羥丙基，L-3，4-二羥基苯丙氨醯基，d胺基酸，如L-d-羥基賴氨醯基和D-d-甲基丙氨醯基，L-α-甲基丙氨醯基，b胺基酸和異喹啉基。D胺基酸和非天然存在的合成胺基酸也可摻入本發明的肽中。
可用其它側鏈取代20種遺傳編碼的胺基酸(或D胺基酸)的天然存在的側鏈，例如，所用的基團有烷基，低級烷基，環狀4-，5-，6-至7數的烷基，醯胺，醯胺低級烷基，醯胺二(低級烷基)，低級烷氧基，羥基，羧基及其低級酯衍生物，和具有4-，5-，6-，到7個原子數的雜環。特別是可使用脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基的環大小從5個變成4，6或7個原子數。環狀基團可以是飽和的或不飽和的，且如果是不飽和的，可以是芳香族或非芳香族的。
環狀基團可以是飽和的或非飽和的，且如果是非飽和的，可以是芳香族的或非芳香族的。雜環基團優選含有一個或多個氮，氧和/或硫雜原子。該基團的例子包括furazanyl，呋喃基，咪唑烷基，咪唑基，咪唑啉基，異噻唑基，異_唑基，嗎啉基(例如，嗎啉代)，_唑基，哌嗪基(例如，1-哌嗪基)，哌啶基(例如，1-哌啶基，哌啶子基)，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡啶啉基，吡唑基，噠嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)，吡咯啉基，吡咯基，噻二唑基，噻唑基，噻吩基，硫嗎啉基(例如，硫嗎啉代)，和三唑基。這些雜環基團可以是取代的或未取代的。如果該基團是取代的，取代基可以是烷基，烷氧基，滷素，氧或取代的或未取代的苯基。
經磷酸化也可較容易地修飾本發明的肽，製備本發明的化合物的肽衍生物的其它方法在Hruby等中描述。因此，本發明的肽化合物也用作製備具有相似生物學活性的肽模擬物的基礎。
包括太模擬物的本發明的肽化合物可共價修飾到一個或多個各種非蛋白質類多聚體上，例如，聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧鏈烯烴上，修飾方式在美國專利號4,640,835；美國專利號4,496,689；美國專利號4,301,144；美國專利號4,670,417；美國專利號4,791,192，或美國專利號4,179,337中闡述，本文以參考文獻引用這些文獻的全文。
C.末端修飾 本領域的技術人員認識到可獲得各種技術用於構建與相應的肽化合物具有相同或相似的所需生物學活性但在可溶性，穩定性和對水解及蛋白裂解的敏感性方面具有更合適的活性的肽模擬物。例如，見Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med Chem.24243-252(1989)。下面描述了用於製備在N端氨基，C端羧基修飾的，和/或將肽中的一個或多個醯胺鍵改變成非醯胺鍵的肽模擬物的方法。應明白2個或多個這類修飾可偶聯於一個肽模擬結構中(例如，在C端羧基的修飾且包含在該肽的兩個胺基酸之間有一個-CH2-氨基甲酸酯鍵。
1.N端修飾 典型地是，以游離酸的形式合成肽，但如上所述以醯胺或酯的形式也能較容易地製備肽。也可修飾本發明的肽化合物的氨基和/或羧基末端以生產本發明的其它化合物。氨基末端修飾包括甲基化(即，-NHCH3或-NH(CH3)2。乙醯基化，加入苄氧羧基，或用含RCOO-限定的羧基化官能團的封閉基團封閉氨基末端，其中R選自萘基，吖啶基，甾族基和相似基團。羧基末端修飾包括用羧醯胺基取代游離酸或在羧基末端形成環內醯胺以導入結構限制。
氨基末端修飾如上所述且包括烷基化，乙醯基化，加上苄氧羰基，形成琥珀醯亞胺等。具體地說，N-端氨基可按如下反應 (a).為了形式通式RC(O)NH-的醯胺基，其中R限定如上，經過與醯基滷[例如，RC(O)Cl]或酸酐進行反應。典型的是，經過將大約等摩爾或過量(例如，大約5當量)的酸酐與惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的肽接觸進行反應，優選含過量(例如，大約10當量)的叔胺，如二異丙基乙胺以清除反應期間產生的酸。另外，反應條件是常規的(例如，室溫30分鐘)。將末端氨基烷基化以提供低級烷基N-取代，接著與上面所述的酸酐反應，以提供通式RC(O)NR-的N-烷基醯胺基。
(b).與琥珀酸酐反應形成琥珀醯亞胺。與前面一樣，可使用大約等摩爾量或過量的琥珀酸酐(例如，大約5當量)，用本領域熟知的方法將氨基轉變成琥珀醯亞胺，包括使用過量(如，10當量)的叔胺，如在合適的惰性溶劑(例如，二氯甲烷)中的二異丙基乙胺。例如，見Wollenberg等，美國專利號4,612,132，本文引用其全文作為參考文獻。應明白可用例如，以常規方式製備的C2-C6烷或-SR取代基取代琥珀酸基以提供在肽的N端的取代的琥珀醯亞胺。以Wollenberg等，出處同上，所述的方式經過將低級烯烴(C2-C6)與馬來酸酐反應製備該烷基取代，經過將RSH與馬來酸酐反應製備-SR取代基，其中R限定如上； (c).經過與存在於合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的大約等當量或過量的CBZ-Cl(即苄氧羰基氯)或取代的CBZ-Cl反應形成苄氧羰基-NH-或取代的苄氧羰基-NH-，優選含有叔胺以清除反應中產生的酸； (d).經過與在合適的惰性稀釋劑(二氯甲烷)中的等量或過量(例如，5當量)的R-S(O)2Cl反應形成氨磺醯基，將末端胺轉變成氨磺醯，其中R如上面所限定。優選的是，惰性稀釋劑含過量叔胺(例如，10當量)如二異丙基乙胺以清除反應期間產生的酸。另外，反應條件是常規的(例如，室溫下30分鐘)； (e).經過與在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的等量或過量(例如，5當量)的R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC6H4-P-NO2反應形成氨基甲酸酯，將末端胺轉變成氨基甲酸酯，其中R限定如上。優選的是，惰性稀釋劑含過量(例如，大約10當量)叔胺，如二異丙基乙胺，以清除反應過程中產生的酸。另外，反應條件是常規的(例如，室溫30分鐘)； (f).經過與在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的等量或過量(例如，5當量)的R-N＝C＝O反應形成脲基，將末端胺轉變成脲(即，RNHC(O)NH-)基，其中R限定如上。優選的是，惰性稀釋劑含過量(例如，大約10當量)的叔胺，如二異丙基乙胺。另外，反應條件是常規的(例如，室溫下大約30分鐘)。
2.C端修飾 在製備C端羧基被酯(即-C(O)OR，其中R限定如上)取代的肽模擬物時，採用用於製備肽酸的樹脂，側鏈保護的肽用鹼和合適的醇，如甲醇裂解。然後經過用氟化氫處理以常規方式去掉側鏈保護的基團以獲得所需的酯。
在製備C端羧基被醯胺-C(O)NR3R4取代的肽模擬物時，使用二苯甲基胺樹脂作為肽合成的固相支持物，合成完成時，氟化氫處理從支持物上釋放該肽直接產生游離的肽醯胺(即，C端是-C(O)NH2)。另外，在肽合成過程中使用氯甲基化的樹脂，結合與氨反應以便從支持物上裂解下側鏈受保護的肽產生游離肽醯胺，與烷基胺或二烷基胺反應產生側鏈受保護的烷基醯胺或二烷基醯胺(即，C端是-C(O)NRR1，其中R和R1限定如上)。然後經過用氟化氫處理以常規方式去掉側鏈保護以產生游離醯胺，烷基醯胺或二烷基醯胺。
在另一任選的實施方案中，經過分別用N端氨基內部取代羧基或酯上的-Oh或酯(-OR)誘導C端羧基或C端酯環化形成環狀肽。例如，合成並裂解產生肽酸後，用合適的羧基激活物，如在二氯甲烷(CH2Cl2)，二甲基醯胺(DMF)混合物的溶液中的二環己烷基碳化二亞胺(DCC)將游離酸轉變成激活的酯。然後經過用N端胺內部取代激活的酸形成環狀肽。與聚合相反，經過使用極稀的溶液可增強內部環化。該方法在本領域中是熟知的。
也可環化本發明的肽或在肽末端摻入脫氨基或脫羧基的殘基，以便沒有末端氨基或羧基，以減小對蛋白酶的敏感性或限制該肽的構象。本發明的化合物的C端官能團包括醯胺，醯胺低級烷基，醯胺二(低級烷基)，低級烷氧基，羥基和羧基，及其低級酯衍生物和其藥用上可接受的鹽。
D.主鏈修飾 製備本發明的化合物的肽衍生物的其它方法在Hruby等，生化雜誌，268(2)249-262(1990)中描述，本文引用作為參考文獻。因此，本發明的肽化合物也用作具有相似生物學活性的非肽類化合物的結構模型。本領域的技術人員認識到可使用各種技術來構建與榜樣肽化合物具有相同或相似的所需生物學活性但在可溶性，穩定性和對水解和蛋白裂解的敏感性方面比榜樣肽具有更合適的活性的化合物。見Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.24243-252(1989)，本文以參考文獻引用。這些技術包括用由磷酸化物，醯胺化物，氨基甲酸酯，氨磺醯，仲胺，和N-甲基胺基酸。
一個或多個肽基鍵[-C(O)NH-]被諸如-CH2-氨基甲酸酯鍵，磷酸酯鍵，-CH2-氨磺醯鍵，脲鍵，仲胺(-CH2NH-)鍵和烷基化肽醯鍵[-C(O)NR6-其中R6是低級烷基]的鍵取代的肽模擬物在常規肽合成期間製備，這經過在合成期間的適當時間點僅僅用適當保護的胺基酸類似物取代胺基酸試劑。
合適的試劑包括，例如，胺基酸類似物，其中胺基酸的羧基用適於形成一個上述鍵的基團取代。例如，如果需要用-CH2-氨基甲酸酯鍵(-CH2OC(O)NR-)取代肽中的-C(O)NR-鍵，那麼將適當保護的胺基酸的羧基(-COOH)首先還原成-CH2OH基，然後用常規方法轉變成-OC(O)Cl官能團或對-硝基羰基-OC(O)O-C6H4-P-NO2官能團。將任一這類官能團與在固相支持物上發現的部分裝配的肽N端的游離胺或烷基化胺反應導致形成-CH2OC(O)NR-鍵。對該-CH2-氨基甲酸酯鍵形成的更詳細的描述見Cho等，科學，2611303-1305(1993)。
同樣，以膦酸酯鍵取代肽中的氨基鍵可用在美國專利申請系列號07/943,805，08/081,577和08/119,700(本文以參考文獻引用其說明書的全文)中所述的方式實現。
用-CH2-氨磺醯鍵取代肽中的醯胺鍵可經過將適當保護的胺基酸的羧基(-COOH)還原成-CH2OH基，然後用常規方法將羥基轉變成諸如甲苯磺醯基的合適的離去基團來實現。甲苯磺醯化的衍生物與諸如硫代乙酸反應後水解並經氯化來氧化可提供取代其它適當保護的胺基酸的羧基的-CH2-S-(O)2Cl官能團。肽合成中該適當保護的胺基酸類似物的使用提供了包含取代肽中醯胺鍵的-CH2S(O)2NR-鍵，從而提供了一種肽模擬物。關於胺基酸的羧基轉變成-CH2S(O)2Cl基的更完全的描述見例如，Weinstein，Boris，胺基酸，肽和蛋白質的化學和生物化學，Vol.7，pp.267-357，Marcel Dekker，Inc.，紐約(1983)，本文以參考文獻引用。
用脲鍵取代肽中的醯胺鍵可以美國專利申請系列號No.08/147,805中描述的方式(本文以參考文獻引用該申請的全文)實現。
其中-CH2NH-鍵取代肽中的醯胺鍵的仲胺鍵可經過採用，例如，合適的保護的二肽類似物來製備，其中醯胺鍵的羰基鍵用常規方法還原成CH2基。例如，如果是二甘氨酸，去保護H2NCH2CH2NHCH2COOH後，產生醯胺還原成胺，然後在下一步偶聯反應中以N-保護形式使用。經過還原二肽中醯胺鍵的羰基來製備該類似物在本領域中是熟知的。
適當保護的胺基酸類似物按與相應的胺基酸相同的方式在常規肽合成申使用。例如，典型地是大約3當量的保護的胺基酸類似物用於該反應。使用諸如二氯甲烷或DMF的惰性有機稀釋劑，當酸作為反應副產物產生時，反應溶劑典型地含有過量的叔胺以清除反應期間產生的酸。一個特別優選的叔胺是二異丙基乙胺，它典型地以大約過量10倍使用。反應導致將具有非肽醯鍵的胺基酸類似物摻入肽模擬物中。該取代可按需要進行重複，使肽中從0個到全部的醯胺鍵被非醯胺鍵取代。
也可環化本發明的肽，或在肽末端摻入脫氨基或脫羧基的殘基，使沒有末端氨基或羧基以減小對蛋白酶的敏感性或限制肽構象。本發明的化合物的C端官能團包括醯胺，醯胺低級烷基，醯胺二(低級烷基)，低級烷氧基，羥基，和羧基，及其低級酯衍生物和其藥用上可接受的鹽。環化化合物的例子在表4，5，6，8和9中提供。
E.二硫鍵形成 本發明的化合物可以在半胱氨酸的硫醇基之間具有分子內二硫鍵的環化形式存在。另外，可產生半胱氨酸的硫醇基之間的分子間二硫鍵以產生二聚體(或更高寡聚體)化合物。也可用高半胱氨酸取代一個或多個半胱氨酸殘基。這些分子內或分子間二硫鍵衍生物可用如下所示的圖解來代表
其中m和n獨立地是1或2。
本發明的其它實施方案提供了這些二硫鍵衍生物的類似物，其中一個硫被CH2基團或硫的其它同型空間配位體取代。這些類似物使用下面所示的本領域已知的方法經分子內或分子間取代來製備
其中p是1或2。本領域的技術人員將容易預料到使用上面所示的α-氨基-g-丁酸衍生物的其它類似物和高半胱氨酸也能進行取代。
另外，可用α-取代的乙酸在該肽的氨基末端加上一個帽，其中α取代基是離去基團，如α-滷代乙酸，例如α-氯乙酸，α-溴乙醚、或α-碘乙酸。本發明的化合物也可經過用半胱氨酸或高半胱氨酸殘基的硫取代離去基團來環化或二聚體化。例如，見Barker等，化學方法雜誌，352040-2048(1992)和Or等，有機化學雜誌，563146-3149(1991)，本文引用其每一篇作為參考文獻。二聚體化化合物的例子在表7，9和10中提供。
V.應用 本發明的化合物在體外用作了解TPO生物學作用的專一性工具，包括評價認為影響TPO生產和受體結合過程的及受其影響的許多因子。該化合物也在形成結合併激活TPO-R的其它化合物中有用，因為該化合物提供了應利於其形成的關於結構和活性間關係的重要信息。
該化合物也在篩選新TPO受體激動劑的試驗中用作競爭性結合劑。在該試驗實施方案中，本發明的化合物可不經修飾被使用或可用各種方式進行修飾；例如，經過標記，如共價或非共價連接到直接或間接提供可檢測信號的基團上。在任一這類試驗中，該物質可直接或間接標記。直接標記的可能性包括的標記基團有例如，諸如125I的放射性標記，諸如過氧化物酶和鹼性磷酸酶的酶(美國專利3,645,090)，能監測螢光強度，波長變化或螢光極化改變的螢光標記(美國專利號3940475)。間接標記的可能性包括對一種結構進行的生物素標記，然後結合偶聯有一個上述標記基團的抗生物素蛋白上。如果化合物附著於固相支持物上，該化合物也可包括間隔子或連接子。
而且，基於其結合TPO受體的能力，本發明的肽可用作在活細胞，固定細胞，生物學液體，組織勻漿，純化的，天然生物學物質等中檢測TPO受體的試劑。例如，經過標記該肽，可鑑定其表面具有TPO-R的細胞。另外，基於其結合TPO受體的能力，本發明的肽可用於原位染色，FACS(螢光激活的細胞分選)，Western印跡，ELISA等。另外，基於其結合TPO受體的能力，本發明的肽可用於受體純化，或純化在細胞表面(或內部透化的細胞)上表達TPO受體的細胞。
本發明的化合物也可用作各種醫學研究和診斷用途的商用試劑。該用途包括但不限於(1)在各種功能性試驗中用作定量候選TPO激動劑的活性的校準標準品；(2)用於維持TPO-依賴性細胞系的增殖和生長；(3)用於通過共同結晶對TPO受體進行結構分析；(4)用於研究TPO信號轉導/受體激活的機制；(5)優選TPO-受體被激活或該激活對已知量的TPO激動劑等進行常規校準的其它研究和診斷應用。
本發明的化合物可用於與其它細胞因子結合或獨自在體外擴展巨核細胞及其指定的祖先細胞。例如，見GiGiusto等，PCT公開號，95/05843，本文作為參考文獻引用。化療和放療經殺死快速分裂，更成熟的巨核細胞群體而引起血小板減少症。然而，這些治療處理也減少了未成熟的，分裂活性較小的巨核細胞前體細胞的數目和活力。因此，由TPO或本發明的化合物對血小板減少症的改善可在化療或放療後用體外培養富集巨核細胞和未成熟前體細胞的其自身細胞的群體輸注病人來促進。
本發明的化合物也可施用給溫血動物，包括人類以激活體內的TPO-R，因此，本發明包含治療處理TPO相關性疾病的方法，包含施用足以模擬體內TPO對TPO-R的效力的量的本發明的化合物。例如，可施用本發明的肽和化合物以治療各種血液學疾病，包括但不限於血小板疾病和血小板減少症，特別是與骨髓輸血，放療和化療相關的疾病。
在本發明的一些實施方案中，優選首先給進行化療或放療的病人施用TPO拮抗劑，隨後施用本發明的TPO激動劑。
本發明的化合物的活性在McDonald.美國兒科血液學/癌症學雜誌148-21(1992)(本文以參考文獻引用)所述的眾多模型的一個中在體外或體內進行評價。
根據一個實施方案，本發明的組合物對於治療與骨髓輸血，放療或化療相聯的血小板減少症有用。典型地是在化療，放療或骨髓移植前或其後以預防性施用該化合物。
因此，本發明也提供了藥用組合物，包含作為一種活性成分的至少一種本發明的肽或肽模擬物與一種藥用載體或稀釋劑相聯。本發明的化合物可經口服，肺內，腸胃外(肌肉內，腹膜內，靜脈內(IV)或皮下注射)，吸入(以細粉末組合物)，經皮膚，鼻內，陰道，直腸或舌下途徑用藥，且可配製成適於各種用藥途徑的劑量形式。例如，見Bernstein等，PCT專利公開號WO93/25221；Pitt等，PCT專利公開號WO94/17784；和Pitt等，歐洲專利申請613,683，本文引用其中每一篇作為參考文獻。
口服的固體劑量形式包括膠囊，片劑，藥丸，粉末，和顆粒體。在這類固體劑量形式中，活性化合物與至少一種惰性藥用上可接受的載體，如蔗糖，乳糖或澱粉混合。該劑量形式與正常實踐一樣也可包含非惰性稀釋劑的其它物質，例如，諸如硬脂酸鎂的潤滑劑。如果是膠囊，片劑和藥丸，劑量形式也可包含緩衝劑。另外片劑和藥丸可腸衣製備。
用於口服的液體劑量形式包括具有含常用於本領域的惰性稀釋劑如水的配劑的藥用上可接受的乳劑，溶液，懸液，糖漿。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包括佐劑，如加溼劑，乳化劑和懸浮劑，增甜，調味和加香劑。
用於腸胃外用藥的根據本發明的製品包括無菌含水或不含水的溶液，懸液或乳劑。不含水的溶劑或載體的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄欖油和玉米油，明膠和可注射的有機酯，如油酸乙酯。這些劑量形式還可含有佐劑，如保護劑，加溼劑，乳化劑和分散劑。它們可經過例如，通過滯留細菌的濾器過濾，經過向組合物中摻入滅菌劑，經過輻射組合物，或經過加熱組合物來滅菌。它們也可使用無菌水或一些其它的無菌可注射介質在用前立即生產。
用於直腸或陰道用藥的組合物優選是栓劑，除活性物質外，它可含有賦形劑，如椰子油或栓劑蠟。用於鼻內或舌下用藥的組合物也可用本領域熟知的標準賦形式來製備。
含有該化合物的組合物可用於預防性和/或治療性處理而用藥。在治療應用中，按上面所述給已患有疾病的病人施用足以治癒或至少部分控制該疾病及其併發症的症狀的量的化合物。足以達到該目的量定義為「治療上有效的劑量」。對該用途有效的量取決於該疾病的嚴重性和病人的體重和一般狀態。
本發明的組合物也可用例如Tice和Bibi的方法(關於控制藥物傳遞的論文，A.Kydonieus，Marcel Dekker.N.Y.(1992)，pp.315-339)進行微粒包裝。
在預防應用中，含有本發明的化合物的組合物施用給對特定疾病敏感或有感染該疾病危險的病人。這樣一種量定義為「預防上有效的劑量」。在該用途中，準確的量也取決於病人的健康狀態和體重。
有效治療所必需的TPO激動劑的量取決於許多不同的因素，包括用藥方式，靶位點，病人的生理狀態，和施用的其它藥物。因此，治療劑量應定量以優選安全和有效。典型地是，用於體外的劑量可對於體內施用這些試劑有用的量提供有用的指導。用於治療特定疾病的有效劑量的動物試驗可為人類劑量提供進一步的預示。諸多方面的考慮在下列文獻中進行了描述例如，在Gilman等(編輯)，Goodman和Gilman’s治療的藥理學基礎，第8版，Pergamon出版社(1990)；和Remington的藥品科學，第7版，Mack出版公司，Easton，Penn.(1985)；本文引用各篇作為參考文獻。
本發明的肽和肽模擬物以每天大約0.001mg至大約10mg/kg體重的劑量範圍用藥時在治療TPO介導的症狀中有效。使用的具體劑量受所治療的具體症狀，用藥途經及臨床醫師根據諸如症狀嚴重性，病人的年齡和一般狀況等的因素作出的判斷來調節。
僅管上文只具體描述了本發明的優選的實施方案，但可預料到在不背離本發明的實質和所要求的範圍的前提下對本發明作出修改或變化是可能的。實施例1 固相肽合成 使用Merrifield固相合成技術(見Steward和Young，固相肽合成，第二版，Pierce Chemical，Rockford，IL(1984)和Merrifield，美國化學學會雜誌，852149(1963))在Milligen/Bio search 9600自動儀器或應用生物系統公司431A型肽合成儀合成本發明的各種肽。使用應用生物系統公司系統軟體1.01版的標準方法裝配該肽。每次偶聯用BOP(苯並三唑基N-oxtris二甲基胺膦六氟磷酸酯)和HOBt(1-羥苯並三唑)進行1-2小時。
使用的樹脂是HMP樹脂或PAL(Millgen/Bioserch)，它是以5-(4′-Fmoc-氨甲基-3，5′-二甲氧基苯氧基)戊酸作銜接物的交聯的聚苯乙烯。使用PAL樹脂導致從樹脂上裂解肽時產生羧基端醯胺官能團。裂解時，HMP樹脂在終產物的C端產生羧酸基團。大多數試劑，樹脂和保護的胺基酸(游離的或在樹脂上的)從Millipore或應用生物系統公司購買。
在偶聯程序中Fmoc基團用於氨基保護。胺基酸的伯胺保護用Fmoc實現，側鏈保護基團對於絲氨酸，酪氨酸，天冬醯胺，穀氨酸和蘇氨酸是t-丁基，對於穀氨醯胺是三苯甲基；對於精氨酸是Pmc(2，2，5，7，8-pentamethylchroma sulfonate)；對於色氨酸是N-t-丁氧基羰基；對於組氨酸和穀氨醯胺是N-三苯甲基，對於半胱氨酸是S-三苯甲基。
用試劑K或對其略作修飾進行處理實現從樹脂上取下肽並同時對側鏈官能團去保護。另外，在這些肽的合成中，用90％三氟乙酸，5％的乙二硫醇，和5％的水的混合物起始4℃並逐漸增加到室溫裂解具有醯胺化羧基末端的完全裝配的肽。用二乙基醚沉澱去保護的肽。在所有情況下，在C18結合的矽膠柱中用在0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度經預製，反相，高效液相色譜進行純化。以快速原子轟擊質譜儀或電子噴射質譜儀及胺基酸分析(如果可能的話)鑑定勻質肽。
實施例2 生物學試驗 使用血小板生成素依賴型細胞增殖試驗可測量該肽的生物活性。用全長的人TPO-R轉染鼠IL-3依賴性Ba/F3細胞。缺乏IL-3時(WEHI-3條件培養基)，這些細胞的增殖依賴於TPO。親代末轉染的細胞系不與人TPO反應，但保持IL-3依賴性。
使用來自文庫篩選的合成肽對上述兩種細胞系進行生物測定。在含10％WEHI-3條件培養基的完全RPMI-10培養基中生長細胞，然後在PBS中洗滌2次，並以2×104個細胞/孔加入含肽或TPO稀釋液的孔中。細胞在加溼的5％CO2空氣中37℃培養48小時，經過將MTT還原成甲_，在ELISA平板閱讀器上測量570nm下的吸光率測定代謝活性。試驗的肽以劑量依賴性方式刺激TPO-R轉染的Ba/F3細胞的增殖。這些肽對親代細胞系無影響。
實施例3 結合親和力 在競爭結合試驗中測定了化學合成的肽對TPO-R的結合親和力。微滴度平板的孔用1mg鏈黴抗生物素蛋白覆蓋，用PBS/1％BSA封閉，接著加入50ng生物素標記的抗-受體固著抗體(Ab179)。然後用1∶10稀釋的可溶性TPO-R產物處理各孔。將各種濃度的肽或肽類似物與恆量的融合到麥芽糖結合蛋白上的由殘基1-156組成的TPO的截短形式(MBP-TPO156)混合。將肽MBP-TPO156混合物加入TPO-R覆蓋的孔中，4℃培養2小時，然後用PBS洗滌。經過加入針對MBP的兔抗血清，接著加入鹼性磷酸酶連接的羊抗兔IgG測量平衡時結合的MBP-TPO156的量。然後使用標準方法測定各孔中鹼性磷酸酶的量。
在一定範圍的肽濃度內進行該試驗，對結果繪圖，y軸代表結合的MBP-TPO156的量，x軸代表肽或肽模擬物的濃度。可測量肽或肽模擬物減少結合於固著TPO-R上的MBP-TPO15650％(IC50)的量時的濃度。肽的解離常數(kd)應相似於使用上述試驗條件測定的IC50。
實施例4 在質粒上的肽 pJS142載體用於文庫構建且在圖4中顯示。構建文庫需要3個寡核苷酸序列ON-829(5′ACC ACC TCC GG)；ON-830(5′TTA CTT AGTTA)和感興趣的文庫特異性寡核苷酸(5′GA GGT GGT{NNK}nTAACTA AGT AAA GC)，其中{NNK}n代表所需長度和序列的隨機區域。在合成期間或用多核苷酸激酶純化後可將寡核苷酸的5′端經化學法磷酸化。然後將它們以1∶1∶1的摩爾比退火併連接到載體上。
優選用於淘選的大腸桿菌菌株具有基因型Δ(srl-recA)endA1 nupGlon-11 sulA1 hsdR17Δ(ompT-fepC)266ΔclpA319∷kan ΔlacI lac ZU118，它可從具有基因型lon-11 sulA1的來自耶魯大學大腸桿菌遺傳保藏中心的大腸桿菌菌株(E.coli b/r，保藏中心登記號CGSC6573)製備。除了10％的甘油用於所有洗滌步驟外，按Dower等，核酸研究，166127(1988)所述製備上述大腸桿菌用於電穿孔。使用1pg Bluescript質粒(Stratagene)試驗該細胞的效力。將這些細胞用於生成原始文庫和用於每輪淘選後擴增富集的群體。
經過使用溶菌酶輕微消化細胞壁從細胞釋放質粒上的肽用於淘選。沉澱細胞碎片後，可直接在大多數受體上使用粗製裂解產物。如果需要對質粒複合物進行一些其它的純化，可使用凝膠過濾柱去掉粗製裂解產物中的許多低分子量汙染物。
在鹽濃度比大多數生理緩衝液更低的緩衝液(HEKL)中進行淘選。可在具有固著於非封閉性單克隆抗體(MAb)上的受體的微滴度孔中進行淘選或經過在珠或柱上進行淘選。更具體地說，在首輪淘選中，可使用分別用受體覆蓋的24孔。在第二輪中，典型地使用用受體(PAN樣品)覆蓋的6個孔和無受體(NC樣品)的6個孔。比較這兩個樣品中的質粒數可得到是否經淘選富集了受體特異性克隆的徵兆。「富集」定義為PAN轉化子對從NC樣品中所回收的克隆的比率。富集10倍通常表示存在受體特異性克隆。
在隨後輪的淘選中，減小加入孔中的裂解產物對於降低質粒複合物的非特異性背景結合是有用的。在第2輪中，通常使用每孔100μl的裂解產物。在第3輪中，使用在HEKL/BSA中以1/10稀釋的每孔100μl的裂解產物。對於隨後各輪的淘選，典型地使用超過所估計的殘餘多樣性至少1000倍的質粒轉化單位的加入量。
典型地是，經過3，4或5輪淘選後，根據獲得的富集倍數檢查由單個克隆所編碼的肽的結合特徵。典型地使用檢測LacI肽融合蛋白的受體特異性結合的ELISA。正常情況下，LacI是四聚體，最小功能性DNA結合種類是二聚體。因此，該肽在融合蛋白上表現為多價。假定在孔中固著了足夠密度的受體，融合到LacI上的肽以協同的多價方式結合到表面。這一協同結合允許檢測低內部親和力的結合事件。該試驗的靈敏性的優點在於易於鑑定低親和力的起始靶。缺點在於ELISA中的信號與肽的內部親和力不相關。如下所述融合到麥芽糖結合蛋白(MBP)上的肽允許以ELISA方式進行檢測，其中信號強度與親和力較好地相關。見圖5A-B。
使用任意標準小量製備程序以雙鏈形式製備來自感興趣的克隆的DNA。感興趣的單個克隆或克隆群體的編碼序列可轉移到載體上，該載體將這些序列與編碼MBP(在溶液中一般以單體出現的一種蛋白質)的基因融合到框架中。文庫克隆進pJS142在靠近該文庫隨機編碼區域的起始處產生一個BspEI限制性位點。用BspEI和ScaI消化允許純化一個～900bp的DNA片段，該片段可亞克隆進兩個載體，pELM3(細胞質的)或PELM15(固質的)中的一個中，這兩個載體分別是對從新英格蘭生物實驗室買到的pMALc2和pMALp2載體的簡單修飾。見圖5A-B。用AgeI和ScaI消化pELM3和pELM15允許從pJS142文庫有效地克隆BspEI-ScaI片段。BspEI和AgeI末端適合於連接。另外，ScaI位點的正確連接對於再創造功能性bla(Amp抗性)基因，從而降低來自不需要的連接事件的背景克隆的水平是必需的。然後可用IPTG誘導tac啟動子控制的MBP肽融合物的表達。
經過使用溶菌酶裂解細胞並經離心去掉不溶性細胞碎片從單個克隆製備用於LacI或MBP ELISA的裂解產物。然後將溶膠產物加入含固著的受體板孔中及加入不含受體的對照孔中。經過與針對LacI或MBP的兔多克隆抗血清培養，然後與鹼性磷酸酶標記的羊抗兔第二抗體培養檢測LacI或MBP肽融合物的結合。用對硝基苯磷酸酯生色底物檢測結合的鹼性磷酸酶。
實施例5 「頭狀二聚體」系統 在質粒上的LacI肽技術的一個變化利用稱為「頭狀二聚體」的DNA結合蛋白質。由大腸桿菌lac阻遏物進行的DNA結合受大約60個胺基酸的「頭狀」區域的介導。結合lac操縱子的頭狀區域的二聚體正常情況下經過與更大型的大約300個胺基酸的C-端區域相聯形成。「頭狀二聚體」系統利用含有經短肽銜接子連接的兩個頭狀塊的頭狀二聚體分子。這些蛋白質以足夠的穩定性結合DNA以允許在頭狀二聚體C端出現的肽抗原決定基與編碼該肽的質粒相聯。
隨機肽融合到頭狀二聚體的C端，該二聚體結合編碼它的質粒，以製備能經淘選篩選的肽-頭狀二聚體-質粒複合物。在質粒上的頭狀二聚體肽系統允許對高親和力的配體具有比LacI系統更大的選擇性。因此，頭狀二聚體系統對於製備基於起始低親和力的靶的誘變文庫並選擇這些起始序列的更高親和力的變異體有用。
與在質粒上的肽一樣使用頭狀二聚體載體pCMG14構建文庫(見圖6A-C)。lac操縱子的存在不是頭狀二聚體蛋白結合質粒所需要的。將該文庫導入包含大腸桿菌(lon-11 sulA1 hsd R17(ompT-fepc)ΔclpA319∷KanΔlacI lac ZU118Δ(Srl-recA)306∷Tn10)的細菌菌株中並在基礎(A)啟動子誘導條件下進行擴增。除了使用HEK緩衝液代替HEKL緩衝液，用含水酚代替IPTG從孔中洗脫質粒外，按與lacI文庫所用相似的方法進行頭狀二聚體文庫的淘選。頭狀二聚體淘選的序列常在轉移進MBP載體中後進行鑑定以使它們能在親和敏感性MBP ELISA中進行檢測且也使克隆群體能用標記的受體經集落轉移進行篩選。
實施例6 在本實施例中，對環狀化合物進行三個試驗。首先，按上面所述獲得IC50值。另外，按上面所述進行MTT細胞增殖試驗以計算EC50值最後，進行顯微生理測量儀(分子裝置公司)試驗。基本上，在這一試驗中測定了與本發明的化合物刺激的TPO受體反應的細胞外介質酸化率。EC50的範圍以上述IC50所示的符號表示。結果在表4中概括。
表4


實施例7 在本實施例中按上面所述測定了在環狀化合物

中D，E，I，S或F位置胺基酸取代的EC50和IC50值。顯微生理測量結果在括號中給出。結果在下面表5中概括。 表5

實施例8 在本實施例中，評價了在化合物
中D，S，或F位置的胺基酸取代，如下表6所示。EC50和IC50值按上面所述計算。顯微生理測量結果在括號中表示。
表6
實施例9 在本實施例中，對下面表7所裂的二聚體化合物按上面所述計算EC50和IC50值。包括作為比較的環狀單體。

在所測試的最大濃度10μM時表8的化合物無活性。
在表9中，比較了按上面所述測定的IEGPTLRQWLAARA的環化和二聚體化的變異體的EC50和IC50。
在表10中，比較了二聚體
的載短形式。EC50和IC50值按上面所述計算。顯微生理測量結果在括號中給出。
表7

表8

表9
表10

實施例10 在本實施例中，在環狀化合物
的G，P和W位置導入各種取代。
表11列出了顯示TPO激動劑活性的取代化合物的例子。表中縮寫的取代如下表11 脯氨酸取代
L-六氫吡啶羧酸 D-六氫吡啶羧酸L-三甲叉亞胺甲酸
色氨酸取代
L-(苯並噻吩)丙氨酸DL-5-Mc-TrpDL-1-Mc-Trp
甘氨酸取代
甘氨酸 肌氨酸
β-丙氨酸 γ-氨基丁酸
N-戊基甘氨酸 N-環丙烷基甘氨酸 實施例11 為了評價小鼠作為方便的試驗種類的可行性，進行了一些體外實驗，設計測量試驗化合物對小鼠受體的活性。首先從8至9周齡Balb/C小鼠股骨收集的骨髓細胞在液體培養基中用rhu TPO或各種濃度的試驗肽培養。在培養期間末期，用Cytospin濃縮培養物，染色乙醯膽鹼酯酶(AChE，小鼠巨核細胞的鑑定劑)並以顯微鏡分析計數。1nM的rhu TPO產生過度生長的非常大(＞40μm)的染色了AChE的非貼壁細胞。這些細胞似乎是成熟的巨核細胞。從起始接種的106個總骨髓細胞/ml(在50ml培養物中)中，估計形成了1到2×106個巨核細胞。這種對TPO的反應指定為「最大」。含有未加入生長因子的對照培養物產生非常少的AChE-陽性細胞。在該實驗中以高濃度測定了一些肽化合物，結果在表12中概括。10μM的肽產生最大的小鼠骨髓應答。這些發現是該肽家族對鼠受體具有活性的首要證據。在第二個實驗中，收穫骨髓細胞並在含有無生長因子，1nM rhu TPO或10μM肽A的半固態培養基(甲基纖維素)中培養。培養7天後，計數大型細胞(假定是巨核細胞)的集落並分組成小集落(3-5個細胞)或大集落(大於6個細胞)。結果在表13中顯示。TPO和試驗肽都產生比陰性對照培養物基本上更多的兩種大小的集落。這表明該肽模擬TPO刺激Mk前體細胞群體伸展的能力。
為了獲得試驗化合物對鼠和人受體活性更定量的比較，克隆於muTPO受體並轉染進BaF3細胞。分離TPO依賴型細胞群體。表12 *與生物素標記的肽複合的鏈黴抗生物素蛋白-推斷1∶4複合物的濃度 **與重組人TPO相比。
***在Cytopspin上有25-30％染色ACE的細胞。無因子培養物-ca，5％染色AChE的細胞(較低的細胞形成之) 表13 在本申請說明書中的所有論文和參考文獻，包括專利文獻在本文中以參考文獻引用其全文用於各種目的。
權利要求
1.一種結合血小板生成素受體的肽化合物，所述化合物具有
小於大約8000道爾頓的分子量，
與血小板生成素受體的結合親和力表達為IC50不超過大約100μm；以及
以下胺基酸序列
X1X2X3X4X5X6X7
其中X1是P；X2是T；X3是L；X4是R；X5是Q；X6是W或其藥用衍生物；X7是L。
2.權利要求1的化合物，其中所述胺基酸序列是環化的。
3.權利要求1的化合物，其中所述胺基酸序列是二聚體化的。
4.權利要求1的化合物，其中所述化合物包含以下胺基酸序列
X8GX1X2X3X4X5X6X7
其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7如上定義；X8是E。
5.權利要求4的化合物，其中所述化合物包含以下胺基酸序列
X9X8GX1X2X3X4X5X6X7
其中X9是I；X1至X8如上定義。
6.權利要求5的化合物，其中所述化合物是IEGPTLRQX6L，其中X6如上定義。
7.權利要求6的化合物，其中X6選自W(Trp)、L-Trp、D-Trp、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal、D-2-Nal、L-(苯並噻吩)丙氨酸、DL-5-Me-Trp、DL-1-Me-Trp、DL-6-F-Trp、DL-5-F-Trp、DL-5-Br-Trp和L-Tic。
8.權利要求7的化合物，其中X6選自Trp、L-Trp、D-Trp、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal和D-2-Nal。
9.權利要求8的化合物，其中X6選自L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal和D-2-Nal。
10.權利要求9的化合物，其中X6是L-2-Nal。
11.權利要求9的化合物，其中X6是D-2-Nal。
12.上述權利要求中任一項的化合物，其進一步包含聚合物。
13.權利要求12的化合物，其中所述聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚羥基乙酸。
14.權利要求13的化合物，其中聚合物是聚乙二醇。
15.權利要求14的化合物，其中聚乙二醇具有大約500至40000道爾頓的分子量。
16.權利要求15的化合物，其中聚乙二醇具有大約5000至20000道爾頓的平均分子量。
17.權利要求16的化合物，其中聚乙二醇具有大約20000道爾頓的平均分子量。
18.一種肽化合物，所述化合物具有胺基酸序列IEGPTLRQWLAARA或其二聚體。
19.一種肽化合物，所述化合物具有胺基酸序列IEGPTLRQWLAAR或其二聚體。
20.一種肽化合物，所述化合物具有胺基酸序列IEGPTLRQWLAA或其二聚體。
21.一種肽化合物，所述化合物具有胺基酸序列EGPTLRQW或其二聚體。
22.權利要求3、18-21中任一項的化合物，其中二聚體的各序列通過賴氨酸(K)連接。
23.一種藥物組合物，其包含上述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物與藥用載體結合。
全文摘要
本發明的受體是結合併激活血小板生成素的受體的肽和肽模擬物。該肽和肽模擬物在用於治療血液學紊亂，特別是由化療，放療或骨髓輸血引起的血小板減少症的方法以及採用標記的肽和肽模擬物的診斷方法中有用。
文檔編號C07K14/52GK1966520SQ20061015407
公開日2007年5月23日 申請日期1996年6月7日 優先權日1995年6月7日
發明者W·J·道爾, R·W·巴蕾特, S·E·維爾拉, D·J·杜芬, C·M·加特斯, S·S·哈瑟登, L·C·馬特基斯, P·J·斯查茨, C·R·瓦斯特羅姆, N·C·賴頓 申請人:葛蘭素集團有限公司