一種重組豬α-幹擾素及其製備方法與應用的製作方法

2023-10-05 12:05:29

專利名稱：：一種重組豬α-幹擾素及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組豬oc-幹擾素及其製備方法與應用，屬於禽畜藥物生產
技術領域：
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背景技術：
：豬幹擾素(PoIFN-a)是一類具有抗病毒和免疫調節活性的細胞因子，是豬體抵禦病原入侵的重要早期防禦系統之一。應用基因工程的方法表達的重組豬幹擾素具有與天然幹擾素高度相似的抗病毒等生物學活性，因此，重組豬幹擾素可以作為一類高效的抗病毒和免疫調節生物製劑。公開號為CN1611604的中國專利申請，公開了一種利用大腸桿菌進行豬a-幹擾素的基因合成、表達載體構建及產物的製法，屬於用分子生物學方法獲得的基因工程生物製品。它設計合成了大腸桿菌偏嗜密碼子組成的豬a-幹擾素基因，並構建了帶有該基因的高效表達載體，實現了豬a-幹擾素在大腸桿菌中的高效表達。表達量佔菌體總蛋白的26%，雖然該專利文件提供了一整套工程菌誘導表達、包涵體分離和裂解、蛋白復性及純化工藝，但是大腸桿菌表達的PoIFN-a是以包涵體的形式存在，需經過提取、變性、復興和純化後才具有活性，工藝複雜，過程繁雜，並且大腸桿菌等原核表達系統，與真核生物的表達系統有較大差異，導致製得的產品活性不高。
發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種重組豬a-幹擾素及其製備方法與應用。本發明的重組豬a-千擾素是將豬a-幹擾素基因通過表達載體導入畢赤酵母菌，再通過重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵和後提取製得。一種重組豬a-幹擾素的製備方法，包括豬a-幹擾素表達載體的構建、重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵工藝和後提取工藝，其特徵在於，所述的發酵工藝步驟如下(1)種子液的製備將通過表達載體導入豬a-幹擾素基因(PoIFN-a)的重組畢赤酵母菌劃線接種到YPDS+zeocin平板上，283(TC培養90100小時後，挑單菌落接種到YPD液體培養基中，2830'C搖床培養1618小時，得種子液；所述種子液在無菌條件下取樣測OD,值在O.60.8，pH值在5.56.0，鏡檢無雜菌存在；YPDS+zeocin平板可參考本領域常用成分配製，也可按如下成分配製酵母提取物lwt%，蛋白腖2%，葡萄糖2wt%，瓊脂2wt%，Zeocin抗生素100ug/ml，山梨醇lmol/L。YPD液體培養基可參考本領域常用成分配製，也可按如下成分配製2討％蛋白腖、lwt%的酵母提取物、2wty。的葡萄糖，餘量為水。(2)發酵將佔總體積1020%的種子液接種至BMGY/BMMY液體培養基，溫度2830°C，pH5.56.5,攪拌轉速為350400rpm/h，誘導發酵48小時，取發酵液；誘導培養18小時後，開始每小時流加甲醇，甲醇體積佔發酵液體積的0.51.8%。腦GY液體培養基可參考本領域常用成分配製，也可按如下成分配製10g/L酵母提取物，20g/L蛋白腖，10g/L甘油，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素，0.lmol/L磷酸鉀緩衝液。B麗Y液體培養基可參考木領域常用成分配製，也可按如下成分配製10g/L酵母提取物，20g/L蛋白腖，0.lraol/L磷酸鉀緩衝液，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素，5mL/L甲醇。所述的豬a-T擾素表達載體的構建可參考專利200310109M0.6中描述的合成豬a-幹擾素的相關步驟及參考invitrogen公司出售的表達載體pPICZa-A的產品使用說明書，先構建pPICZaA-PoIFN-a後，以pPICZaA-PoIFN-a為模板，利用設計好的引物PCR擴增；再用ife/和Z力o/內切酶雙酶切插入定向位點獲得pPICZaA-PoIFN-a重組載體。對重組體進行線性化後電擊轉化於畢赤氏巴斯德酵母(簡稱畢氏酵母)屍ic力ispastor^受體菌X-33感受態細胞中獲得Zeozin「"抗性克隆，從中篩選Mut+菌落，即為重組中赤酵母菌。所述的重組畢赤酵母菌的誘導表達採用如下步驟實現將篩選的重組畢赤酵母菌接種於BMGY培養液，283(TC震蕩培養1620h(0"。。約為4.0-6.0),28003500卬ra離心5min收集重組酵母菌，用BMMY培養液重懸重組畢赤酵母菌並調節濃度至ODe。。值為0.81.2，283(TC震蕩培養24h，補加甲醇至B國Y培養液，使培養液的甲醇體積濃度為0.51.8%，連續培養3天，保留的酵母菌即為通過表達載體導入豬a-幹擾素基因的重組畢赤酵母菌，取培養液並檢測PoIFN-a的表達；優選的，採用如下方法檢測PoIFN-a的表達將培養液10000rpm離心8min,取上清，用0.45um的濾膜過濾後，用PBS緩衝液透析2472時間，再以PEG20000反透析濃縮2448時間，用0.22ym的濾膜過濾除菌後，進行SDS-PAGE鑑定。所述的後提取工藝採用步驟如下將經重組畢赤酵母菌發酵後的發酵液離心處理，離心溫度41(TC，轉速為1000012000rpm;經0.22um的板框過濾後，用10萬分子量的膜包超濾，取清液，再經過6千分子量的膜包超濾收集濃縮液，最後採用0.22um孔徑的微濾，在無菌條件下收集得到豬oc-幹擾素原液。經後提取工藝處理後的豬a-幹擾素效價和發酵液中的粗製豬oc-幹擾素效價基本一致，有生物活性的豬a-千擾素收率達到104.07%左右，高於直接經發酵工藝獲得的有生物活性的豬cc-幹擾素的量，因為豬(X-幹擾素只有線性結構，才檢測出生物活性，表達出的幹擾素有一部分是其他空間構象，在後提取過程中，這部分蛋白在震蕩和微熱的條件下可能轉變為線性結構，使得收益率高於未經後提取工藝處理的原野。同時去除了大部分的無機鹽和粗製蛋白保證了幹擾素成品的純度，經檢測，純度可達85%以上。上述培養基成分可採用本領域常用成份配製，所述濾膜等實驗用品均為市售產品。由上述製備方法製得的重組豬a-幹擾素在製備重組豬a-幹擾素注射劑方面的應用，採用如下配比，均為重量百分數重組豬a-幹擾素原液8y。10"/i，藥學上可接受的穩定劑1%5%，藥學上可接受的蛋白保護劑0.1%0.5%，藥學上可接受的防腐劑0.1%。0.5%。，餘量注射用水，pH5.06.0。優選的，所述藥學上可接受的穩定劑為黃芪多糖，藥學上可接受的蛋白保護劑為白蛋白，藥學上可接受的防腐劑為苯甲酸，藥學上可接受的緩衝液為磷酸緩衝液。本發明有益效果如下本發明將豬a-幹擾素(PoIFN-a)基因克隆入畢赤酵母分泌性表達載體pPICZaA使之整合到畢赤酵母染色體中，實現了PolFN-cc重組蛋白在畢赤酵母中的分泌表達，並通過控制培養工藝條件，使得PoIFN-a重組蛋白在畢赤酵母大量分泌具有高抗病毒活性的重組豬cc-幹擾素生物製品。由於畢赤酵母具有完整的蛋白表達、加工和修飾功能，與杆狀病毒、哺乳動物細胞相比，有具有培養成本低、產量高及便於產物分離純化等優點，通過酵母表達的PoIFN-oc直接以有活性的幹擾素形式分泌到發酵上清液中，無需複雜的變復性等後續處理工藝，且發酵上清液屮雜蛋白含量低，易於進行大規模的生產。圖1是豬a-幹擾素酵母表達載體構建示意圖2是豬oc-下擾素酵母表達載體酶切鑑定MDL15000，1、PoIFN-aPCR產物ZpPICZa-poIFN-a酶切產物；圖3是PCR鑑定酵母中的PoIFN-a成熟蛋白基因，1、MarkerDL1500Q2pPTCZaA-PoTFN-a轉化入酵母的PCR產物，3、pPICZaA轉化入酵母的PCR產物，《PoIFN-a，5、MarkerDL2000;圖4是表達產物SDS-PAGE鑑定；圖5是幹擾素稀釋濃度為106處理的MBDK細胞；圖6是陽性對照孔的水皰性口炎病毒的嚴重病變。具體實施例方式本發明通過以下實施例做進一歩詳細說明，但並不限制本發明的範圍。實施例l1、引物的設計與合成設計一對引物用於克隆和改造豬a-幹擾素成熟蛋白編碼基因，引物序列為Pl:5'-ATACTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGAC-3'(J力o/)P2:5'-GATTCTAGAGGTGTCTGTCACTCCTTCTTCCTGA-3(J6a/)另設計一對醇氧化酶(AOXI)基因特異引物用於檢測外源基因是否插入酵母基因組，引物序列為P3:5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3';P4:5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3，。2、PCR擴增PCK反應中模板為含豬oc-幹擾素全基因的質粒pGEM-T-PoIFN-a,，總體積為50ul，其中IOX緩衝液5uL，25mmol/LMgCl2溶液3uL，2.5腿ol/Ld,4uL，20pmol/uL引物Pl、P2各lul，模板2uL。反應條件94。C、5rn丄n,94°C、ltn丄n'54°C、lmin，72°C、90s,30個循環；72°C、10min。3、pPICZaA-PoIFN-a載體的構建將改造的Po工FN-a成熟蛋白基因和表達載體pPICZaA用￡bo//內切酶和屈sJ內切酶進行雙酶切，回收酶切片段。PoIFN-a基因和pPICZaA載體按3:l的摩爾比4'C過夜連接。轉化氯化鈣法製備DH5a感受態大腸桿菌。挑取低鹽LB平板上的zeocin抗性菌落，提質粒用/內切酶和/內切酶進行雙酶切鑑定。將獲得的陽性重組載體命名為pPICZocA-PoIFN-a。4、酵母細胞的轉化及鑑定製備畢氏酵母菌株X-33的感受態細胞，並將^c/單酶切的線性化重組質粒pPICZaA-PoIFN-a經電轉化導入感受態細胞。將電轉化後的細胞塗平板於含100ug/mlZeozin，的YPDs平板，2830'C培養3d。挑選Zeozir^抗性克隆複製到畫平板和MD平板，2830'C培養3d後篩選出在兩種培養基上都能正常生長良好的Mut+菌落。將這些菌落進一步複製到100ug/mlZeozin的YPDS平板篩選出多拷貝整合的酵母克隆。挑選單個酵母克隆接種於含100ug/mlZeozin的的YPD培養液，取少量發酵菌體按煮沸凍溶法提取酵母基因組，應用PoIFN-a基因特異引物P1和P2進行PCR鑑定其基因是否整入酵母基因組結果見圖用基因特異引物及醇氧化酶(AOXI)基因特異引物PCR鑑定豬oc-幹擾素基因是否插入AOXI啟動子部位，結果見圖3。5、重組畢赤酵母菌的誘導表達將篩選的多個酵母克隆接種於BMGY培養液，28-3(TC震蕩培養1620h(OD,約為4.06.0)。28003500rpm離心5min收集細胞，用B麗Y培養液重懸並調節濃度至OD,約為1.0，2830'C震蕩培養24h補加甲醇至終體積濃度為0.51.8%，連續培養3天。6、表達產物純化與的抗病毒活性測定將發酵液10000rpm離心8min，取上清用0.45um的濾膜過濾後，PBS緩衝液(NaCl8g/L，KC10.2g/L，Na2HP042.9g/L，KH2P040.24g/L，pH7.2)充分透析，再以用天津市科密歐化學試劑開發中心生產的PEG20000反透析濃縮。用0.22nm的濾膜過濾除菌後，進行SDS-PAGE鑑定，由圖4可見分子量約為19kDa的條帶。用微量細胞病變抑制法檢測幹擾素抗病毒活性，採用豬腎細胞一一VSV(水泡性口炎病毒)系統。將抑制50%細胞病變出現孔最大稀釋度的幹擾素定義為1個幹擾素活性單位(U)。測得其生物活性為5.0X107U/ml，結果見圖5、6。實施例2發酵工藝1、種子液的製備將酵母克隆劃線接種到YPDS+zeocin平板上283(TC培養96小時後，挑單菌落接種到YPD液體培養基中2830'C搖床培養1618小時，在無菌條件下取樣測OD咖在0.60.8之間，ra值在5.56.0之間，鏡檢無雜菌存在即可作為發酵使用的菌種。發酵使用種子液保存在04。C，保存時間不超過48小時。2、發酵條件發酵培養基為BMGY/BMMY培養基，培養溫度為283CTC，誘導時間48小時，18小時流加甲醇體積量為佔培養液總體積的0.51.8%，發酵pH5.56.5，接種量為佔培養基總體積1020%，攪拌轉速為350400rpm。將發酵除菌後的幹擾素樣品"微量細胞病變抑制法"檢測其生物活性。結果得出重組酵母豬oc-幹擾素的生物學活性為5.0X107U/ml，活性較搖床發酵並未見降低。實施例3後提取工藝取按實施例二方法製得的發酵液，按如下歩驟進行提取先採用1000012000轉/分鐘離心除菌；0。22微米板框過濾除雜和進一步除菌；再通過IO萬分子量的膜包超濾取清液，除去大分子的蛋白質和雜質；再用6千分子量的膜包超濾收集濃縮液，除去'些醛、醇類和小分了量的無機鹽等雜質；最後再一次除菌，得到豬(x-幹擾素原液。採用"微量細胞病變抑制法"檢測提取後的十擾素生物活性，結果如下tableseeoriginaldocumentpage7取60升發酵液，效價測定為5.0X107U/ml，平行二次進行後提取工藝處理，測量體積並測定效價。實施例4:豬a-幹擾素對仔豬傳染性胃腸炎病毒感染的防治試驗8頭R齡人工奶飼餵的仔豬隨機分為5組，每組2頭，用紙箱分隔試養。第一組和第二組分別肌注和口服重組豬oc-幹擾素原液lml(2.0X106U);第三組為空白對照組，第四組為攻毒對照組。給藥2h後，第3組仔豬口服滅菌生理鹽水lml，其他各組口服接種IO倍最低發病劑量的TGEV(豬傳染性胃腸炎病毒)，觀察30小時，臨床表現見表l。表1接毒後各組仔豬的臨床表現tableseeoriginaldocumentpage7注"-":正常；"+":黃色糊樣腹瀉"++":嚴重腹瀉，糞便稀薄帶氣泡接種TGEV發生腹瀉的1頭仔豬用每頭份10萬U豬a-幹擾素進行肌注治療3次，在治療的第2、3天停止腹瀉。第4組的仔豬作為發病的未處理對照，分別於接毒後的第3天和第4天死亡。實施例5:製備一天給藥一次的豬a-幹擾素2000萬活力單位(U)1000支豬a-幹擾素原液1000ml苯甲酸l-5g白蛋白12-17g(選5國藥集團化學試劑有限公司生產的型號為69003431的白蛋白或Bovin公司的型號為lO-Bll的白蛋白)黃芘多糖200-700g(購自四川海鑫植物原料有限公司生產的針用70°/。含量的)100niM磷酸緩衝液適量注射用水補加至總體積為10000ml製備將上述重量的黃芪多糖、苯甲酸、白蛋白混勻，溶於適量注射用水，經高壓滅菌處理後，與豬a-幹擾素原液1000ml混合，補加注射用水，同時以lOOmM磷酸鹽緩衝溶液調節pH至6.07.0，最終體積為10000ml。在無菌條件下，將幹擾素製品分裝為每瓶10ml的成品幹擾素，並軋蓋封存於04'C冰箱中。隨機抽取2瓶成品幹擾素，以"微量細胞病變抑制法"測其效價，以不低於2000萬活力單位(U)為合格。實施例6豬a-幹擾素對病毒的預防及治療應用仔豬在3、7、21日齡時各注射一次(用量為100-500萬單位/頭)，配合長效土黴素、氟苯尼考、頭孢等藥物使用，可提高仔豬免疫力、減輕仔豬先天性免疫缺陷的危害、預防各種病毒病的發生；13周和18周前後豬處於免疫空檔期，可注射豬a-幹擾素(用量為200-1000萬單位/頭)，連用2天，以防治無名高熱、流感、圓環病毒等各種病毒病。母豬於產後當天和第二天注射豬a-幹擾素(用量為4001000萬單位/頭)兩次，可實現產後兩針保健的效果。治療仔豬傳染性胃腸炎，用量為200500萬單位/頭，連用兩天，配以卡那黴素或氟苯尼考使用，後海穴注射；治療無名高熱病，用量為為200500萬單位/頭，連用兩天，配以阿司匹林使用；治療其他病毒病，用量為2001000萬單位/頭，連用兩天，根據臨床症狀配以其他對症治療藥。SEQUENCELISTING山東華辰生物科技有限公司G20〉一種重組豬a-幹擾素及其製備方法與應用4〈170>Patentlnversion3.51〈211>34腿〈213>人工合成1gattctagaggtgtctgtcactccttcttcctga34234DNA人工合成<德2gattctagaggtgtctgtcactccttcttcctga34〈210〉321<212〉DNA人工合成〈400〉3gactggttccaattgacaagc21〈210〉421<212〉DNA<213〉人工合成4gcaaatggcattctgacatcc2權利要求1、重組豬α-幹擾素，其特徵是將豬α-幹擾素基因通過表達載體導入畢赤酵母菌，再通過重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵和後提取製得。2、一種重組豬a-幹擾素的製備方法，包括豬a-幹擾素表達載體的構建、重組畢赤酵母菌的誘導表達、發酵和後提取，其特徵在於，所述的發酵步驟如下(1)種子液的製備將含有豬oc-幹擾素基因的重組畢赤酵母菌劃線接種到YPDS+zeocin平板上2830'C培養90100小時後，挑單菌落接種到YPD液體培養基中，283(TC搖床培養1618小時，得種子液；所得種子液在無菌條件下取樣測0D63。值在0.60.8，pH值在5.56.0，鏡檢無雜菌存在；(2)發酵將佔總體積1020%的種子液接種至BMGY/B醒Y液體培養基，溫度2830°C，pH5.56.5，攪拌轉速為350400rpm/h，誘導發酵48小時，取發酵液。3、如權利要求2所述的重組豬a-幹擾素的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中誘導發酵過程中，誘導發酵18小時後，開始每小時流加甲醇，甲醇體積佔發酵液體積的0.51.8%。4、如權利要求2所述的重組豬oc-幹擾素的製備方法，其特徵在於，所述的後提取步驟為將經重組畢赤酵母菌發酵後的發酵液離心處理，離心溫度41(TC，轉速為1000012000rpm;經0.22um的板框過濾後，用10萬分子量的膜包超濾，取清液，再經過6千分子量的膜包超濾收集濃縮液，最後採用0.22um孔徑的微濾，在無菌條件下收集得到豬a-幹擾素原液。5、如權利要求2所述的重組豬a-幹擾素的製備方法，其特徵在於，所述的重組畢赤酵母菌的誘導表達採用如下步驟將篩選的重組畢赤酵母菌接種於BMGY培養液，2830。C震蕩培養1620h,0"。。為4.0-6.0，28003500rpm離心5min收集重組畢赤酵母菌，用BMMY培養液重懸重組畢赤酵母菌並調節濃度至OD,值為0.81.2，283(TC震蕩培養24h，補加甲醇至BMMY培養液，使培養液的甲醇體積濃度為0.51.8%，連續培養.3天，保留的酵母菌即為通過表達載體導入豬a-幹擾素基因的重組畢赤酵母菌，取培養液檢測PoIFN-oc的表達。6、如權利要求5所述的重組豬a-幹擾素的製備方法，其特徵在於，採用如下方法檢測PoIFN-a的表達將培養液10000rpm離心8min，取上清，用0.45um的濾膜過濾後，用PBS透析2472h時間，再以PEG20000反透析濃縮2448時間，用0.22um的濾膜過濾除菌後，進行SDS-PAGE鑑定。7、一種權利要求l所述的重組豬a-幹擾素的應用，用於製備重組豬a-幹擾素注射劑，重量百分比組分如下重組豬a-幹擾素原液8%10%，藥學上可接受的穩定劑1%5%，藥學上可接受的蛋白保護劑0.1%0.5%，藥學上可接受的防腐劑0.1%。0.5%。，餘量注射用水，pH5.06.0。8、如權利要求7所述的重組豬a-幹擾素的應用，其特徵在於，所述藥學上可接受的穩定劑為黃芪多糖。9、如權利要求7所述的重組豬a-幹擾素的應用，其特徵在於，藥學上可接受的蛋白保護劑為白蛋白。10、如權利要求7所述的重組豬a-幹擾素的應用，其特徵在於，藥學上可接受的防腐劑為苯甲酸，藥學上可接受的緩衝液為磷酸緩衝液。全文摘要本發明涉及一種重組豬α-幹擾素的製備方法及其應用，重組豬α-幹擾素的製備方法包括豬α-幹擾素表達載體的構建、重組酵母菌的誘導表達、發酵工藝和後提取工藝。本發明具有培養成本低、產量高及便於產物分離純化等優點，通過酵母表達的PoIFN-α直接以有活性的幹擾素形式分泌到發酵上清液中，無需複雜的變復性等後續處理工藝，並且發酵上清液中雜蛋白含量低，易於進行大規模的生產。文檔編號C07K14/56GK101475635SQ200810249818公開日2009年7月8日申請日期2008年12月29日優先權日2008年12月29日發明者剛劉,劉璐璐,姜正軍,孫麗紅,崔麗萍,柳少傑,王茂超,蘇曉明,陳溥言申請人:山東華辰生物科技有限公司