一種纖維糊精酶及其編碼基因與應用的製作方法

2023-10-05 18:42:39

專利名稱：：一種纖維糊精酶及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種纖維糊精酶及其編碼基因與應用。技術背景纖維素主要是植物利用二氧化碳和水在太陽能作用下通過光合作用合成的地球上最豐富的可再生的生物質(bi咖ass)資源。據報導，全球每年通過光合作用產生的纖維素高達1.55X19噸，其中89%尚未被人類利用(DunlapC，ChiangGC.Utilizationandrecycleofagriculturewastesa.ndresidues.ShulerML.BocaRaton，Florida.USA:CRCPressInc.1980.19)。纖維素是多個葡萄糖殘基以P-l，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重複單位為纖維二糖。天然纖維素的基本結構是由原纖維構成的微纖維束集合而成。原纖維是由15-40根有結晶區和非結晶區構成的纖維素分子長鏈所組成。纖維素的結晶部分是由纖維素分子進行非常整齊規則地折迭排列形成。在天然纖維素中，木質素和半纖維素形成牢固結合層，緊密地包圍纖維素。纖維素酶是能將纖維素轉化成葡萄糖的一系列酶的總稱，包括三類酶即內切一e—1，4一葡聚糖酶(endo-1，4-glucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纖維二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和e—葡萄糖苷酶(e-glucosidase,EC3.2.1.21)，這三種酶協同作用能將纖維素轉化成葡萄糖。內切葡聚糖酶作用於纖維素長鏈分子的內部將長纖維切成短纖維，外切葡聚糖酶作用於纖維素分子的一端，以兩個葡萄糖殘基為單位進行切割生成纖維二糖，P—葡萄糖苷酶切割纖維二糖生成葡萄糖(ToraraeP，WarrenRAJ,GilkesNR.1995.Cellulosehydrolysisbybacteriaandfungi.Adv.Microbiol.Physiol.，37:1-81.1995;BhatMK,BhatS.1997.Cellulosedegradingenzymesandtheirpotentialindustrialapplications.BiotechnologyAdvances,15:583-620)。葡萄糖可作為重要的工業原料生產酒精、丙酮等化工產品。纖維素的利用與轉化對於解決世界能源危機、糧食和飼料短缺、環境汙染等問題具有重要意義。纖維素酶可廣泛應用於釀酒、飼料、食品、紡織、造紙等行業。如纖維素酶作為飼料添加劑可增加飼料的可消化性，減少排洩的糞便量。纖維素酶可取代浮石進行牛仔褲的"石洗"處理，也可處理其它含纖維織物以降低粗糙度和增加光亮。纖維素酶可添加到洗滌劑中以提高洗滌劑的清潔能力(BhatMK.2000.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology.BiotechnologyAdvances,18:355-383)。由於纖維素酶的廣泛用途以及針對不同的用途需要使用不同性質的纖維素酶，更由於纖維素酶的效率低、價格高而使以纖維素為原料生產燃料酒精的成本太高以至於無法真正實現產業化，因此，需要新的纖維素酶。纖維素酶屬於糖基水解酶類(glycosylhydrolases)，許多糖基水解酶由一個催化功能域和一個或更多個其它的功能域如碳水化合物結合組件(carbohydrate-bindingmodules,CBMs)組成，根據催化功能域的胺基酸序列相似性，糖基水解酶類被劃分成不同的家族(families)(DaviesG.，HenrissatB.1995.Structuresandmechanismsofglycosylhydrolases.Structure3:853-859;HenrissatB.1991.Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities.Biochem.J.280:309-316;HenrissatB.，BairochA.1993Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788;HenrissatB.,BairochA.1996.Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases.Biochem.J.316:695-696)。根據Cazy伺服器(server)(http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶類的最新清單，目前糖基水解酶類有108個家族，纖維素酶分屬於糖基水解酶類家族l、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。將未知的纖維素酶與已知的纖維素酶做序列同源性比較可對其進行分類。纖維糊精酶(EC3.2.1.74，cellodetrinase)被定義為外切纖維素酶的一種，該酶主要作用於纖維素寡糖，以連續的方式從纖維素寡糖的還原端或非還原端釋放葡萄糖或纖維二糖(LyndLR.，WeimerPJ，vanZylWHandPretoriusIS.Microbialcelluloseutilization:fundamentalsandbiotechnology.2002.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506-577)。纖維糊精酶能水解硝基苯酚纖維二糖苷(p-Nitr叩henyl-P-D-cellobioside，p-NPC)而產生從無色變成黃色的顏色反應，還能水解4，甲基傘形纖維二糖苷(4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside，4-MUC)而產生螢光反應，所以4-MUC經常作為篩選纖維糊精酶的底物，P-NPC作為測定纖維糊精酶酶學特性的底物。人類所克隆的大部分纖維素酶基因都是從純培養的微生物中來的，但並不是自然界中所有微生物都是可以被分離、培養的，一般認為可培養的微生物種類只佔自然界中微生物種類的1%(AmannRI,LudwigW,SchleiferKH.1995.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59:143-169)，那麼剩餘的99%的不可培養的微生物中蘊藏著大量的基因資源。近年來從環境樣品未培養微生物提取基因組DNA然後構建混合基因組DNA文庫以分離基因己是成熟技術(LorenzP,SchleperC.2002.Metagenome-achallengingsourceofenzymediscovery.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic19-20:13-19)。目前世界上已克隆得到來源於不同環境的未培養微生物的纖維素酶基因，其中包括Healy等(HealyFG,RayRM，AldrichHC,WilkieAC,IngramLOandShanmugamKT.1995.Directisolationoffunctionalgenesencodingcellulasesfromthemicrobialconsortiainathermophilic,anaerobicdigestermaintainedonlignocellulose.ApplMicrobiolBiotechnol.43:667-674.)報導從厭氧高溫木頭堆裡克隆到了一個纖維素酶基因；Rees等(ReesHC,GrantS，JonesB,GrantWD,HeaphyS.2003.DetectingcellulaseandesteraseenzymeactivitiesencodedbynovelgenespresentinenvironmentalDNAlibraries.Extremophiles.7(5):415-421)報導從湖水和湖床沉積物未培養微生物中克隆到2個纖維素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(VogetS,LeggewieC,UesbeckA，RaaschC,JaegerKE,StreitWR.2003.Prospectingfornovelbiocatalystsinasoilmetagenome.ApplEnvironMicrobiol"69(10》6235-6242;VogetS，SteeleHL,andStreitWR.2006.Characterizationofametagenome-derivedhalotolerantcellulase.J.Biotechnol.126:26-36)報導從土壤未培養微生物中克隆到3個纖維素酶基因gnuB、uvs080和ce/5A;Ferrer等(FerrerM,GolyshinaOV,ChernikovaTN,KhachaneAN，Reyes陽DuarteD,SantosVA,StromplC,ElboroughK,JarvisG，NeefA,YakimovMM,TimmisKN,andGolyshinPN.2005.Novelhydrolasediversityretrievedfromametagenomiclibraryofbovinerumenmicroflora.EnvironMicrobiol.7:1996-2010)從牛瘤胃未培養微生物中鑑定了9個纖維素酶基因。Feng等(FengY,DuanCJ,PangH,MoXC,WuCF,YuY,HuYL,WeiJ,TangJL,andFengJX.2007,Cloningandidentificationofnovelcellulasegenesfromunculturedmicroorganismsinrabbitcecumandcharacterizationoftheexpressedcellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75:319-328)從兔子盲腸未培養微生物中克隆和鑑定了ll個纖維素酶基因。這些來源於未培養微生物宏基因組的纖維素酶基因從序列上來說都是新的，說明宏基因組方法是得到新基因的好方法。反芻動物的瘤胃是自然界中纖維素降解最劇烈的主要場所之一，植物的纖維素類物質是被瘤胃中共生的纖維素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、細菌、原生動物和古細菌。目前研究認為瘤胃中有85%的微生物是未培養的(KrauseDO，DenmanSE，MackieRI,MorrisonM,RaeAL,AttwoodGT,andMcSweeneyCS2003.Opportunitiestoimprovefiberdegradationintherumen:microbiology,ecology,andgenomics.FEMSMicrobiolRev27:663-693)，可以推測這些未培養微生物中一定含有大量的基因資源如纖維素酶基因資源，通過構建水牛瘤胃未培養微生物的宏基因組DNA文庫，極有可能從中篩選得到比目前已知的最好的纖維素酶還要好的酶的基因。
發明內容本發明的目的是提供一種纖維糊精酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的纖維糊精酶，名稱為Umcel5C，來源於水牛瘤胃未培養細菌，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)自序列表中的SEQIDW.2的氨基端第26-332位胺基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQ的氨基端第26-332位胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維糊精酶活性的蛋白質。其中，序列表中的序列2由332個胺基酸殘基組成。自序列2的氨基端的第36—317位胺基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5C同棲瘤胃黃色瘤胃球菌的(i"m/"ococcws"flve/flc/era)的纖維糊精酶(GenBank索引號P16169)的同源性最高，兩者的相似性為70%、相同性為52%。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的Umcel5C便於純化，可在由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的N端或C端連接上如表1所示的標籤。表u際籤的序列tableseeoriginaldocumentpage6上述(b)中的Umcd5C可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的Umcel5C的編碼基因可通過將序列表中SEQIDW2:l的自5'端第231至1229位鹼基所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。上述纖維糊精酶編碼基因(Mmce/5C)也屬於本發明的保護範圍。上述纖維糊精酶的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID地l的5'端第306-1226位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDJY2.1的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW.2蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW2.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交並洗膜。其中，序列表中的序列1由1807個脫氧核苷酸組成，自序列1的5'端的第231至1229位核苷酸為湖ce^C的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)，自序列1的5'端的第231—233位核苷酸為^/ce75C基因的起始密碼子ATG，自序列1的5'端的第1227—1229位核苷酸為"歷cW5C基因的終止密碼子TAA。序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2的核苷酸序列。自序列表中序列1的5'端第306-1226位核苷酸序列編碼自序列表中的序列2的氨基端第26-332位胺基酸殘基序列。含有本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。本發明通過構建水牛瘤胃未培養微生物的宏基因組DNA文庫和文庫克隆的纖維糊精酶活性平板檢測篩選法，得到了新的纖維糊精酶基因，該纖維糊精酶基因可在宿主細胞中大量表達該基因以生產該纖維糊精酶，用於纖維素的降解，實驗證明本發明的纖維糊精酶具有很高的纖維糊精酶活性(達42019U/g)，而且該酶適宜的pH值範圍和溫度範圍非常廣。本發明所提供纖維糊精酶及其編碼基因可廣泛應用於纖維素的降解。圖1為從水牛瘤胃內容物樣品中提取的未培養微生物的宏基因組DNA。圖2為水牛瘤胃未培養微生物基因文庫克隆的限制性內切酶B"mHI酶切分析圖。圖3為瘤胃未培養微生物基因文庫中表達MUCase酶(纖維糊精酶)活性克隆的篩選，陽性克隆EPI100/pGXNDMl所在的平板圖。圖4為能降解4-MUC的文庫克隆質粒pGXNDMl的5amHI酶切帶型。圖5為初篩獲得的重組質粒pGXNDMl轉化大腸桿菌後得到的轉化子對4-而C降解水解圈照片。圖6為表達質粒pET-umcel5C重組質粒經fcoRI和^zV7dl1雙酶切後電泳圖。圖7為重組大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-umcd5C和大腸桿菌Rosetta(DE3)/pET-30a羧甲基纖維素降解檢測。圖8臓ce/5C基因的表達、表達產物Umcel5C的純化及活性膠檢測。圖9Umcel5C在不同pH值條件下的酶相對活力曲線。圖10Umcd5C在不同溫度條件下的酶相對活力曲線。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。在本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(^SC力6^/C力^CO^')株系EPI100(購自Epicentre公司);表達菌株Rosetta(DE3)(購自Novagen公司);柯斯質粒載體pWEB::TNC(購自Epicentre公司)；文庫製備試劑盒(購自Epicentre公司，pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931);表達載體pET-30a(購自Novagen公司)；限制性內切酶、修飾酶、對硝基苯酚纖維二糖苷(p-Nitrophenyl-|3-D-cellobioside，p-NPC)及4，甲基傘形纖維二糖苷(6eto-Z)-ce〃o6/oy/c/e，4-MUC)等試劑購自Promega、TAKARA、SIGMA或MBI。實施例l、纖維糊精酶Umcel5C及其編碼基因的獲得一、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組文庫的構建1、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組的提取取50g水牛瘤胃內容物(樣品的來源為南寧市肉聯廠剛屠宰的水牛的瘤胃，採集的樣品立即用液氮保存)，懸浮在200ml的0.18M磷酸鉀緩衝液(pH6.5)中，輕輕震蕩均勻，放置10分鐘，讓瘤胃內容物中的纖維素顆粒自動沉澱，棄上清液，再加入200ml的0.18M磷酸鉀緩衝液(p服.5)洗沉澱塊兩次，最後一次的沉澱塊用直接提取法提取吸附於纖維素顆粒的微生物的宏基因組DNA。在沉澱塊中加入100ml提取緩衝液(lOOmMsodiumphosphatepH8.0;100mMTirs扁HClpH8.0;100mMEDTApH8.0;1.5MNaCl;1%CTAB;2。/。SDS)混合均勻，在液氮和65。C水浴中反覆凍融三次後，加入2ml的溶菌酶(20mg/ml)溶液(溶菌酶終濃度為0.4mg/ml)37'C水浴1小時，期間每IO分鐘顛倒混勻一次，然後加入2ml的蛋白酶K(50mg/ml)溶液(蛋白酶K終濃度為lmg/ml)37。C水浴1小時，期間每10分鐘顛倒混勻一次。加入40mlPVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone)溶液(購自Sigma公司，目錄號P-6755)(PVPP溶液:每100mgPVPP與lml0.18M磷酸鉀緩衝液(pH7.2)混勻)，振蕩30秒，再加入2ml3MCaCl2溶液，振蕩30秒後，在BeckmanCoulterAvantiJ-E離心機(購自BeckmanCoulter公司，目錄號369003)JA-10轉頭用8，000g室溫離心20分鐘，上清液轉移到另一個乾淨的離心管。在沉澱物中再加入100ml提取緩衝液，混合均勻，在65"C放置60分鐘，期間每IO分鐘顛倒混勻一次，8,000g離心20分鐘，合併兩次的上清液。在上清液中加入等量的氯仿，上下顛倒離心管混勻，S,000g離心10分鐘，取上清入另一個離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻後即見DNA絮狀沉澱析出，用滅菌的Tip頭挑出絮狀DNA，用70%乙醇洗兩次，於室溫中晾乾，用5mlTE溶解。2、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組的純化獲得30kb以上的DNA將DNA粗提物加到S印hadexG200(購自Pharmacia公司，目錄號17-0080-01)的層析柱(200mmX10誦，含有2^PVPP(購自Sigma公司，目錄號P-6755)上，用TE緩衝液洗脫，按每組分lml分段收集洗脫液，每一組分加入100nl的3M醋酸鈉溶液(pH5.2)及lml異丙醇沉澱DNA，把沉澱物溶於TE中，合併所得DNA溶液，0.7^瓊脂糖凝膠電泳後切下含30kb以上的DNA的凝膠，用電洗脫法回收純化DNA，回收純化的DNA電泳圖如圖1所示，其中泳道1為入DNA(48.5kb);泳道2為入DNA用EcoRI酶切(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道3為從水牛瘤胃內容物提取的麗A粗提物；泳道4為經過S印hadexG-200凝膠初步純化的DNA;泳道5為經過電洗脫法回收得到的30kb以上的DNA。3、純化獲得30kb以上的末端補平的水牛瘤胃未培養微生物宏基因組為了用上述電洗脫法回收純化的DNA製作基因文庫，首先對這些DNA進行末端補平，以產生平頭末端而和文庫製備試劑盒(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931)中已處理好的同樣具平頭末端的pWEB::TNC載體相連，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入6(ilIOX末端修補緩衝液(330mMTris—醋酸(pH7.8)，660mM醋酸鉀，100mM醋酸鎂，5raMDTT)，6|_il2.5raMdNTP混合物(每種dnNTP2.5mM)，6(il10mMATP，10ug30kb以上的DNA，2(il末端修補酶混合物(T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit，目錄號WEBC931)，加滅菌的去離子水補充到總體積60ul。25。C下放置45分鐘，再轉移到7(TC水浴鍋放置10分鐘以終止酶反應，1.0%低熔點瓊脂糖凝膠電泳後切下含30kb—45kb的DNA的凝膠進行DNA回收。4、末端補平後的水牛瘤胃未培養微生物宏基因組與pWEB::TNC的連接反應將上述末端補平後回收的DNA片段與文庫製備試劑盒中已處理好的具平頭末端的pWEB::TNC載體在T4DNA連接酶的作用下連接起來，具體方法為依次在冰上向一個新的滅過菌的微量離心管中加入12nl無菌水，2^1IO倍快速連接緩衝液(10XFast-LinkLigationBuffer),l|illOraMATP，pWEB::TNC載體(O.5叫)，3|ul低熔點瓊脂糖凝膠回收的30kb—45kb的DNA(0.1iig/pl)，快速連接DNA連接酶(Fast-LinkDNALigase，2單位/pl)(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)，混勻後在25。C下放置2個小時，再在7(TC放置10分鐘以終止酶反應。5、水牛瘤胃未培養微生物宏基因組文庫的獲得及質量檢驗連接反應產物用X包裝蛋白包裝，具體方法為將在冰上剛剛溶化的X包裝提取物(購自Epicentre公司的文庫製備試劑盒pWEB::TNCcosmidcloningkit,目錄號WEBC931)的一個組分，總共50ul/管)25fil立即轉移到一個新的滅過菌的微量離心管中並快速置於冰上，再往其中加入IO)il連接反應產物，充分混勻後置於30°C90分鐘後，再往其中加入另外25pi溶化的人包裝提取物，充分混勻後置於30°C90分鐘，向其中加入500(il噬菌體稀釋緩衝液(10mMTris-HC1(pH8,3)，100mMNaCl，10raMMgCl2)，得到560^1包裝反應產物。再將上述得到的560(il包裝反應產物加入到5.6mL的0D6。Q=1.0的宿主大腸桿菌EPI100培養液(培養基為LB(每升含胰蛋白腖(Oxoid)，lOg;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;pH7.0)+10raMMgS04)中，25。C下放置20分鐘讓上述得到的包裝的X噬菌體吸附和侵染宿主細胞Acoh'EPIIOO，在含氨苄青黴素(終濃度為100ug/mL)和氯黴素(終濃度為12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白腖(0xoid),10g;酵母浸出粉(Difco)，5g;NaCl，5g;瓊脂粉，15g，pH7.0)上篩選轉導子。結果共獲得約15，000個轉導子，任意提取14個克隆的質粒DNA，限制性內切酶酶切後用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，結果所有質粒除都有一個5.8kb的載體片段外，都含有插入片段，且沒有發現有兩個質粒具有相同的酶切帶型，酶切結果如圖2所示，其中泳道1為入DNA用fCORI酶切片段(片段大小從大到小依次為21.2kb，7,4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.Okb，8.0kb，6.Okb，5.Okb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb);其它泳道分別為使用限制性內切酶i^Mn酶切的文庫克隆質粒。結果表明文庫含有非常隨機的插入DNA片段，插入片段最大的為42kb，最小的為22kb，平均大小為35kb。說明文庫的克隆容量也是相當大的，文庫的質量相當好。二、纖維糊精酶及其編碼基因(^7ce7^:)的獲得1、從水牛瘤胃未培養微生物的宏基因組文庫中篩選表達纖維糊精酶活性的克隆用平板影印法將步驟一中在含氨苄青黴素和氯黴素的LA平板上得到的文庫(每平板約200個菌落左右)分別影印到含氨苄青黴素(終溶度lOOiag/mL)和氯黴素(終溶度12ug/ml)的LA平板上，將平板倒置於37'C培養箱培養36小時後，在培養好的LA平板的菌落的上面加入2ml含有質量百分濃度為0.04%4-methylumbelliferylbeta-D-cellobioside(4-MUC)的0.6%的瓊脂糖，繼續在37。C培養1小時，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光。結果如圖3所示，箭頭所指的菌落為周圍有螢光的克隆。結果表明篩選到l個菌落周圍有水螢光的克隆(EPI100/pGXNDMl)，進一步提取該克隆的質粒DNA並將其命名為pGXNDMl,用限制性內切酶^3/zffl完全酶切pGXNDMl後，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖4所示，結果表明pGXNDMl除有一個5.8kb的載體片段外，還有另夕卜11條&慮酶切片段，大小分別為7.0kb，3.5kb，3.lkb，3kb，2.7kb，2.5kb，1.6kb，1.3kb，1.2kb，lkb和O.5kb。其中1.6kb，1.3kb分別是兩個片段的重疊，結果表明pGXNDMl含有31.8kb的插入片段。其中，圖4中，泳道1為人用fcoRI酶切後的片段(片段大小從大到小依次為21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb);泳道2為lkbladder(片段大小從大到小依次為:10.0kb，8.0kb，6.Okb，5.Okb，4.Okb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，lkb，750bp，500bp);泳道3為pGX匪l的fe蘊酶切產物(從上至下分別為7,Okb,3.5kb，3.lkb,3kb，2.7kb，2.5kb，1.6kb，1.3kb，1.2kb，lkb和O.5kb)。為了證實pGXNDMl的插入片段確實含有纖維糊精酶基因，用pGXNDMl質粒DNA和空載體pWEB::TNC分別轉化AcWiEPI100，在含氨苄青黴素(100yg/mL)的LA平板上篩選轉化子，隨機挑取由每個質粒轉化得到的10個轉化子點接到LA平板上，37。C培養24小時後，在培養好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04%4-MUC的0.6%的瓊脂糖，繼續在37X:培養1小時，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光，結果表明所有10個由空載體pWEB::TNC轉化得到的轉化子周圍都沒有螢光，所有10個由pGXNDMl轉化得到的轉化子周圍都有螢光，其中一個轉化子的檢測結果如圖5所示。結果表明重組質粒pGXNDMl的插入片段上確實含有纖維素酶基因。圖5中，右邊的菌落為初篩獲得的重組質粒pGXNDMl轉化大腸桿菌後得到的轉化子(降解4-MUC)，左邊的菌落為空載體pWEB::TNC轉化大腸桿菌後得到的轉化子(不能降解4-MUC)。2、纖維糊精酶及其編碼基因(鵬ce75C)的獲得為了測定重組質粒pGXNDMl上纖維糊精酶基因的DNA序列，採用亞克隆的方法對該基因進行定位。使用限制性內切酶/^fl對重組質粒pGXNDMl進行了亞克隆。亞克隆的步驟取質粒pGXNDMl用屍Wl完全酶切後加入連接酶在25t:連接一個小時(在pGXNDMl完全酶切後，該重組質粒含有的載體pWEB::TNC的5.0kb的部分可以利用來克隆各個外源屍WI片斷)。連接產物用化學法轉化大腸桿菌XL1-Blue，塗布在含氯黴素(終濃度34ug/ml)的LA平板上。在培養好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04%4-而〔的0.6%的瓊脂糖，繼續在37。C培養1小時，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光。任意挑選24個有螢光反應的轉化子，提取質粒做屍WI酶切分析，其中一個重組質粒只有一條1.7kb的外源片段，將此質粒命名為pGXNDMl-17。將1.7kb片段回收與經屍stl酶切的pGEM3zf(+)連接，連接產物用化學法轉化大腸桿菌XL1-Blue，塗布在含氨苄青黴素(終濃度100ug/ml)的LA平板上。在培養好的LA平板的菌落的上面加入含有0.04%4-MUC的0.6%的瓊脂糖，繼續在37'C培養1小時，然後在紫外燈下檢測菌落周圍有無螢光，任意挑選24個有螢光反應的轉化子，提取質粒做屍"I酶切分析，所有有螢光活性的轉化子的重組質粒都有1.7kb的外源片段，最後將目的基因定位在1.7kb的片斷上，將含有該1.7kb片段的重組質粒命名為pGXNP17。將該重組質粒pGXNP17寄送大連寶生物工程公司採用雙脫氧核苷酸法對該亞克隆進行雙向雙鏈測序。測序結果用軟體DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的軟體對DNA序列進行分析，如Blast(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，得到纖維糊精酶的編碼基因，該基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名為"/z/ceJ^7。序列表中的序列1由1807個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端的第231至1229位核苷酸為w歷cW5C的開放閱讀框(OpenReadingFrame,0RF)，由999個核苷酸組成，自序列1的5'端的第231—233位核苷酸為湖ce^5C基因的起始密碼子ATG,自序列1的5'端的1227一1229位核苷酸為咖ce75C基因的終止密碼子TAA。。纖維糊精酶基因^ce^5C編碼一個含332個胺基酸的蛋白質Umcel5C，具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列，用DNAStar軟體預測該蛋白質的理論分子量大小為38376.23道爾頓，等電點pl為4.9。用簡單組件結構研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool,SMART,http://smart,embl-heidelberg.de)分析纖維糊精酶Umcel5C的組件結構，結果是自序列2的氨基端的第36—317位胺基酸為家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域。Umcel5C與黃色瘤胃球菌的(Ruminococcusflavefaciens)的纖維二糖苷酶(GenBank索引號P16169)的同源性最高，兩者的相似性為70%、相同性為52%。實施例2、^ceZ5^在大腸桿菌中的表達1、可表達鵬cey5C的重組載體(pET-咖ce75W的構建帶有編碼信號肽的基因在體內表達後很有可能將表達產物分泌到細胞外。為避免表達產物分泌到細胞外，只需要人工合成序列1的自5'端第306位至1226位鹼基(即柳ce25C基因中除編碼序列2的氨基端前25位胺基酸和終止密碼子外的DNA序列，主要是防止前25位胺基酸形成信號肽)，921bp，預計其編碼蛋白的分子量為35.39691KDa，等電點pl為4.65。人工合成咖c^^7基因除了編碼序列2的氨基端前25位胺基酸和終止密碼子以外的全部序列(即自序列1的5'端第306-1226位核苷酸序列)，合成咖cW5C基因兩端帶有fcoRI和氾"dl1酶切位點，將合成後並測序表明正確的娜ce^^基因片段用fcoRI和歷7^rn酶切後，插入載體pET-30a(+)(購自Novagen公司)的fcoRI和忠'/K/tlI位點間，得到重組表達載體，將該重組載體進行酶切和測序鑑定，將酶切和測序表明含有咖ce^^基因編碼序列的正確的重組載體命名為pET-柳ceJ5C。起始密碼子和終止密碼子由表達載體pET30a(+)提供。表達產物的N端有一個由表達載體提供的His標籤(6XHisTag)。其中，pET-柳ce^5C重組質粒的酶切電泳圖譜如圖6所示，圖6中可以看到重組質粒經fcoRI和歷'/2^n雙酶切後釋放出一條5.3kb的載體帶和一條與人工合成咖ceJ5C基因經fcoRI和歷V7rf[11酶切後同樣大小的921bp外源插入片段。圖6中，泳道1為lkbladder(片段大小從大到小依次為10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb，2.0kb,1.5kb);泳道2為重組質粒經fcoRI和歷'/7^ni雙酶切後結果。2、wmce/5C基因在￡.co//RosettaTM(DE3)中的表達把pET-咖ce75C轉化至￡coh'RosettaTM(DE3)中得到含有pET-咖ceJ5C的轉化子RosettaTM(DE3)/pET-咖ce^G挑取RosettaTM(DE3)/pET-鵬ceJ5C單菌落於LA平板上(含氯黴素34ug/mL，卡那黴素25ug/ml，IPTG1.0mmol/L)，同時用RosettaTM(DE3)/pET-30a(轉入pET-30a的RosettaTM(DE3))作為空白對照，37。C培養24小時。菌體經氯仿破壁後用含0.04%4-MUC的0.6%瓊脂糖覆蓋再培養1小時，在紫外燈下觀察菌落周圍有無螢光。結果如圖7所示，結果表明重組菌RosettaTM(DE3)/pET-鵬ce^C周圍有螢光，而空白對照RosettaTM(DE3)/pET-30a周圍無螢光，說明耙基因wmce/5C在￡cohRosettaTM(DE3)中已經高效表達出了有纖維素(4-MUC)降解活性的蛋白質產物。圖7中右邊的菌落為重組大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C(能降解4-MUC)，左邊的菌落為含有空載體的大腸桿菌RosettaTM(DE3)/pET-30a(不能降解4-MUC)。3、Umcel5C的表達和純化1)RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C菌體發酵接種RosettaTM(DE3)/pET-umcel5C到10ral含有34ug/ml氯黴素(CAM)與25yg/ral卡那黴素LB培養液中，37°C200rpm培養過夜。取5ml過夜培養物到100ml含有34ug/ral氯黴素(CAM)與25ug/ml卡那黴素的LB培養液中，在37"C培養200rpm培養至0D6。。為0.6。加入IPTG至終濃度為l慮，繼續培養5個小時，5，000g離心收集菌體。共作2瓶樣品，收集200ml的培養液的菌體。2)Umcel5C的提取與純化在步驟l)收集獲得的菌體中，按每克菌體重量加入5ml的裂解緩衝液(50mMNaH2P04,3OOmMNaCl，10mMimidazole(咪唑)，lmMPMSF(苯甲基磺醯氟)，pH8.0)，懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，置冰上30分鐘。用超聲波破碎細胞，400w作用20次，每次作用時間IOs，每次作用間隔12s。12，000g離心20分鐘，收集上清得到Umcel5C粗酶液。取5ul用SDS-PAGE檢測蛋白質的純度。Umcel5C的純化使用Qiagen公司的TheQIAexpressionistkit試劑盒(方法參照試劑盒說明書)。按每4ml上述獲得的裂解上清液加入lml質量百分含量為50%的NI-NTA膠體，在4。C用200rpm搖60分鐘，混合物灌注到TheQIAexpressionistkit試劑盒附帶的柱子。加4ml洗滌緩衝液(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，20mMimidazole,lmMPMSF,pH8.0)到柱子裡，緩慢攪拌，重複衝洗6次。加入0.5ml的洗脫緩衝液(50mMNaH2PO4,300mMNaCl,250mMimidazole,ImMPMSF,pH8.0)，收集流出物，重複洗脫8次。合併8管蛋白質，即為鎳柱純化後的Umcel5C，取5ul用SDS-PAGE檢測蛋白質的純度。結果如圖8所示，結果顯示umcel5C基因在大腸桿菌中得到了高效表達，表達產物Umcel5C分子量為40kDa左右，與預計的分子量基本一致，粗酶液經鎳柱純化後，已去掉絕大部分雜蛋白，SDS-PAGE顯示還有一條雜蛋白。選擇SephadexG-100對Umcel5C進行進一步的純化，取5gSephadexG-100於100ml去離子水中，室溫放置72小時或沸水煮沸5小時，備用；取一長為40cm，內徑為lcm的層析柱，洗淨，柱子下端用具有濾過功能的海綿球堵住，向柱內裝入1/4體積的pH為6.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液，然後將溶脹好的S印hadexG-100裝入柱內。用pH為6.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液平衡柱內S印hadexG-100;取lml經鎳柱純化的Umcel5C沿管壁加在膠面上，用pH為6.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩衝液洗脫，按0.5ml每管收集洗脫液即得到分子篩純化後的Umcel5C。每管洗脫液取5ul檢測蛋白質純度。結果如圖8所示，結果表明經分子篩(SephadexG-100)純化後，Umcel5C已達到SDS-PAGE單條純。為了檢測純化的Umcel5C是否還有纖維糊精酶活性，用活性膠染色法進行了檢測，過程如下。首先Umcel5C在聚丙烯醯胺變性膠上進行蛋白質電泳(SDS-PAGE)，然後對電泳後在變性膠中已變性的Umcel5C進行復性處理。復性處理把電泳後的變性膠浸入在50ml的復性緩衝液中(復性緩衝液的配製Tris3.025g，0.5MEDTA(pH8.0)5ml，P-巰基乙醇0.173ml，加水至總體積500ml)，4。C下浸泡30分鐘，更換復性緩衝液，重複三次，前兩次在復性緩衝液中添加0.5ml的異丙醇。再用10mMpH7.0的磷酸鉀緩衝液洗膠兩次。把處理好的復性膠置於乾淨的培養皿上，滴加lml濃度為1.25mM的pNPC溶液，用玻璃棒塗均勻，用塑膠袋包裹平板，在37'C保溫1小時。直接在膠上觀察水解帶。可以見到在復性膠的Umcel5C的位置有一條黃色的帶，活性膠檢測表明該目標帶具有纖維糊精酶活性，說明Umcel5C是按正確的閱讀框架表達的。圖8中M為分子量標準(marker);1為uracel5C基因的表達的粗酶液2為鎳柱純化後Umcel5C;3為SephadexG100柱純化的Umcel5C;4為Umcel5C的活性膠檢測4、Umcel5C酶學特性的研究纖維糊精酶的酶活測定，具體操作如下(1)對硝基苯酚(p-NP)濃度標準曲線的製作①用去離子水配製10mM的p-NP標準液。②在試管中按表1加入溶液。tableseeoriginaldocumentpage15③取各濃度標準溶液140^d加入1.5ml的離心管，分別加入70ul0.4M的Na2C03溶液，用移液槍小心吸打混勻，避免出現氣泡。④取200inl溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測410nm下的吸光值，繪製標準曲線，保存在測定程序中。(2)纖維糊精酶活力測定①配製25mM的p-NPC水溶液作為底物，用小管分裝，管外用鋁箔包裹避光，保存於-2(TC冰箱。②取特定pH值(pH為6.0)的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩衝液116^1，加入14pl步驟①製備的底物，置於45"溫度的水浴鍋中預熱2分鐘，加入10pl步驟3中的步驟2)中獲得的Umcel5C酶液(Umcel5C終濃度為0.777ug/ml)，同預熱溫度一致保溫反應15分鐘。③反應結束後，立即加入70pl0.4M的Na2CO3溶液，終止反應。取200^1溶液加入96孔酶標板，用酶標儀測410nm下的吸光值，根據步驟(1)繪製的p-NP標準曲線計算反應體系中產生的p-NP濃度。按照下述酶活力和比活力定義計算Umcel5C的活力和比活力。酶活力單位(U)定義1U為每分鐘催化產生1uraolp-NP所需的酶量。比酶活的定義每g蛋白質所含的酶活力(U/g)。結果表明，Uracel5C在最適pH(pH為6.0)和最適溫度(45°C)的條件下的酶比活為42019U/g。(3)酶的最適pH值的測定分別取pH值為37.5(梯度為0.5)的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩衝液116^1，分別加入14pl底物(25mM的p-NPC水溶液)，置於溫度為37"的水浴鍋中預熱2分鐘，加入10pl步驟3中的步驟2)中獲得的Uracel5C酶液(Umcel5C終濃度為0.777ug/ml)，37。C保溫反應15分鐘。反應結束後，立即加入70pl0.4M的Na2C03溶液，終止反應。按照步驟(2)的方法計算酶活力和比活力，在37'C的反應條件下，Umcel5C在pH6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝溶液中的比活力最高，以此為100%，換算各pH值下的相對酶活力。結果如圖9所示，結果表明Umcel5C的最適pH為6.0。(4)酶的最適溫度的測定在Umcel5C的最適pH6.0條件下測定不同溫度下(3(TC6(TC)的酶活。具體方法為取pH值為6.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩衝液116ixl，分別加入14pl底物(25mM的p-NPC水溶液)，共配製6份，分別置於溫度為3(TC6(TC的水浴鍋中預熱2分鐘，加入10^步驟3中的步驟2)中獲得的Umcel5C酶液(Umcel5C終濃度為0.777ug/ml)，分別於30。C、35°C、40°C、45°C、50°C、55。C或60。C保溫反應15分鐘。反應結束後，立即分別加入70^10.4M的Na2C03溶液，終止反應。按照步驟(2)的方法計算酶活力和比活力。在pH值為6.0的0.1M檸檬酸一0.2M磷酸氫二鈉緩衝液中反應條件下，Umcel5C在45。C時比活力最高，以此為100%，換算各溫度下的相對酶活力。結果如10所示，結果表明Umcel5C對pNPC的最適溫度為45r。序列表<160〉2<210〉1〈211〉1807<212〉DNA〈213〉未知〈220〉〈223〉<400〉1ctgcag犯tttggtccggtt.gcgccccaggtttcatgttcatggaag3accaaacgg8ttggg卿ccgaggggg"gg3tcgaccgcgt.acctgcacaaacagcgcggsgctccctgtatggCgELCCtg卿cgtggat鄉tgccggacccacc已gggcgtccggcgcgg鄉織ggaggacaccctgctgcgcctgtgCggg3tg3cgcccgaacatxacccgcgcagggccttttagtcatccagacaacatcgtccgccgccgctc已cgg'acgattcggccgtccggcca,gtggcggaatcatggcat'ctcgacccatgtgcgcggacgaggcggaccgccggcctaccaggagtgaggacgtggaaccgcatccctcttcggccgacgagcggcgcctactgggscggagga'gccgctccctggcgctggtacgagcta^aggctg3tcaaggcgccggagaaaagtccttccgcccgcgga,gcggtggacggggacatgtggg卿鄉cgctgatttcccccctgtacaaaatgaaccg'gcgcggcgtgaaccttcatccctccccgtcgatcggctggtttctccttcgcagttctacagccttcgagcgccgtcgagtggctacgacaatcatcctcagtgccgtggctatttcgaggtactgcggcgcgcgccat.ccgccatggactctgct,gtgacg織ggg已cgctttttttcgacgatcccgaccatcctcagacgtggacgcgaggacaccgggcggcccgc卿gcgcggg已ccgacagacacctcggcggggg叫gagga已ctatg已cgtgccgcaagaaacgccggcgagcctctgggatcctcaacgagcstccggcgacaacgcgccacctccactgtcaaccgcgagcattttccaagtacggcgtacgccgtctttcggcctcggcgcgggctgag肌ccgccccg"ttcttgtgaaaaaagcgagcgattattccaggcgatcctcgaggccacc60cggaggggatcgcggaggac120tcccgaaagggggcgggtcc180atgtgttatcatggaagcac240g犯肌ggaga卿gctatgg300stggctttcccagtgcagcg360catcgcccggatcgcctcct420cctggcgcgcgacgacggct■cggcctgaagctggtcctgg540saacgagagcggcttcttcg600gcggctggccgcccgcttcg660ggtgacggattaccgctaca720catccggcccatcgccccgc780ttacgccgtgcccaccctcg840ctacatgcccgtggagttca■ggaccgcgtctcctacgagg960cccggcggtgttctgcgcgt1020catcgacatcgcctccccgg1080cgagcgccacggcatcgccc1140cgatccccggatggacggcg1200gggtgtccgccgcggcggat1260gtcgaggaaggatttgcgct1320taggattatcctgcgggcgg1380ggaacaggcatgaacagctc1440caggggcggctcatcgaccg1500formulaseeoriginaldocumentpage19PheAspAlaGlyGluAsnGluSerGlyPhePheAspSerAlaAsp115GinGinGlu130SerLeu145TyrArgArglieAspAsnTyrTyrArgAsn195liePheGluMetTyrAspSerSer120TrpGluArgLeuLeu135AlaPheGluLeuSer125AlaArgPheVal150ThrTrpAsnArgAla140AsnGluValThrAla165lieAlaProGinLeu155AlaValGluCysPro180AlaProTyrAlalie170TrplieLeuPheThr185ProThrLeuGluGluArg210HisGinGlyAlaTyr225SerTyrGluAlalieLeuAsnLeu215ValVal200HisProTrpLeuGly190Prolie175GlyAspTrp230GlyAlaThrGluCysTyrMetTrpPro220ArgGluSer245PheCysAlaTrpHisProAlaVal260GlyVallieAspAsn235GluTyrPheGlu250ThrGlyArgSerGlyGluTyr275ArgAlalieHis265AlaSerProGluTrpTyr290CysAla305MetAspTrpSerTyrGlyValArg325Ala295Alalie280ValPheGluArgAsp285GlyAspGlyLeu270ThrlieTyrGlyAsp160ArgTyrAspVal205ValGluPheThrArglie255TyrVal240PheLeuMetLys310AspGluLeuAspliePheLys330Gly315LeuHis300LeuGlyAspLeuCysArgAlaArgProArg320權利要求1、一種纖維糊精酶，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)自序列表中的SEQID№.2的氨基端第26-332位胺基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQID№.2的氨基端第26-332位胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維糊精酶活性的蛋白質。2、根據權利要求1所述的纖維糊精酶，其特徵在於所述纖維糊精酶具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。3、權利要求1或2所述的纖維糊精酶的編碼基因。4、根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於所述纖維糊精酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID地1的5'端第306-1226位核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW2:2蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權利要求3或4所述的纖維糊精酶編碼基因的重組表達載體。6、含有權利要求3或4所述的纖維糊精酶編碼基因的轉基因細胞系。7、含有權利要求3或4所述的纖維糊精酶編碼基因的宿主菌。8、權利要求1或2所述的纖維糊精酶在纖維素降解中的應用。9、權利要求3或4所述的纖維糊精酶編碼基因在纖維素降解中的應用。全文摘要本發明公開了一種纖維糊精酶及其編碼基因與應用。本發明提供的一種纖維糊精酶，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№2；2)將序列表中SEQID№2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維糊精酶活性的蛋白質。實驗證明本發明的纖維糊精酶具有很高的纖維糊精酶活性(達42019U/g)，而且該酶適宜的pH值範圍和溫度範圍非常廣。本發明所提供纖維糊精酶及其編碼基因可廣泛應用於纖維素的降解。文檔編號C12N9/42GK101220354SQ200810056690公開日2008年7月16日申請日期2008年1月23日優先權日2008年1月23日發明者馮家勳,唐紀良,楊偉松,段承傑申請人:廣西大學