通過苗端轉化植物的方法

2023-10-06 08:38:59

專利名稱：通過苗端轉化植物的方法
這是1988年6月1日申請的201568號專利申請的部分連續申請。
本發明涉及一種轉化植物的方法，轉化後的植物具有高水平的快速再生能力及組織培養導致的低遺傳變異率。具體地說，該方法採用苗組織、或完整植物腋芽的分離苗端作轉化的目標組織，並用於植物的再生。
將遺傳工程技術用於植物的主要障礙是不能由主要農作物的植物細胞培養體系進行常規的、可重複的再生。另外，據Larkin和Scowcroft，Theor.Appl.Genet.60，197(1981)報導。當離體隨機地再生植物時存在體細胞克隆變異的傾向。體細胞克隆變異會導致根癌病土壤桿菌(A.tumefaciens)的介導基因傳遞，體細胞克隆變異是在來自愈傷組織的植物中觀察到的遺傳變異，保持轉化植物原始遺傳完整所必須的這種現象是不希望有的。
在用於基因傳遞的共培養體系中，根癌病土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)已成為葉片、表皮片或其它分離塊的優選載體。用茄科的植物已研究了根癌病土壤桿菌，介導基因的傳遞，因為茄科植物在培養時容易操作，並且土壤桿菌屬(Agrobacterium)菌種易浸染茄科植物。儘管已經知道許多雙子葉植物種類是土壤桿菌(Agrobacterium)的合適宿主，但由於缺少再生體系，只有少量植物種類能成功地進行轉化。
由Horsch等，Ann.Rev.PlantPhysiol.38，467(1987)，研製的葉片轉化體系可使大多數外源遺傳物質常規轉移，但只能導入有限種類的植物中。採用茄科植物矮牽牛、菸草和蕃茄(它們比較容易由葉分離塊物質再生)證實了這種典型的體系。葉片技術克服了原生質體轉化體系中存在的許多問題，尤其是延長所需的培養周期，並限制從原生質體再生植物。
然而，該葉片體系是相當有限的，最主要的局限性是沒有幾種植物能從葉組織再生。甚至某些培養的矮牽牛變種也很難由葉片再生。葉片體系的另一個局限性是從表皮和表皮下葉組織隨機地分化出苗分生組織。已研究葉片方法的改進技術，包括使用與體細胞胚胎發生的誘導相關的苗組織以及苗誘導後的愈傷組織。然而，在每一種技術中，由於胚胎和苗分生組織必須隨機地發育，因此存在有體細胞克隆變異。
Trinh等，5Biotechnology，1081(1987)已研究了另一種植物轉化體系。該體系是使用菸草表皮體系，並與土壤桿菌(Agrobacterium)共培養。該體系的優點是八周內直接得到花和籽。然而，對該體系至關重要的是適用該技術的作物種類有限，由於通過不定的器官形成而產生植物，因此仍有體細胞克隆變異的傾向。
本發明採用上述技術，用苗端組織作為易進行基因轉化的組織，解決了存在的障礙。使用這種組織可使植物快速繁殖，同時可保持被轉化植物的獨特克隆和遺傳特性。在實施本發明時，苗分生組織最好包括苗尖培養和腋芽擴增。苗端是用於植物轉化的最好的分離塊，使用這種分離塊，許多草本雙子葉和單子葉植物能再生為整體植物。苗培養物還可直接並快速地發育成為有根植物。在實施本發明時，還能採用除苗端以外的其它非外來的組織如腋芽。
將本發明方法用於苗端時，在合適的培養基中培養從選擇的植物上切下的苗端。切下苗端或培養數天後，將苗端暴露於合適的載體如根癌病土壤桿菌。接種過的苗端再培養數日，培養後將苗端轉移到選擇的培養基中從沒有轉化的植物組織中分離轉化的植物組織。然後再選擇轉化組織，在生根培養基中重新培養。再在普通條件下培養生根後的植物。
該方法可使轉化植物快速再生，如用矮牽牛做實驗在六周內得到結果，由上述方法生成的植物已自體繁殖，得到的籽無苗地發芽。生成的苗其百分之九十具有新的插入基因、新遺傳信息的證實性轉遞。
在實施本發明時，土壤桿菌屬細菌是優選的，但也能使用能在植物中進行遺傳轉化的其它載體，包括其它細菌、質粒、病毒、和DNA片段。


圖1表示轉化植物的螢光GUS測試結果，該結果表明GUS活性期為5小時以上，用Kontron螢光分光計定量所產生的甲基繖形酮的量。結果表明用本發明方法可成功地使矮牽牛轉化。
下述的討論和實施例詳述了實施本發明的最好方法，應該知道，該方法的變更可能包括根據目標植物種類和轉遞入目標植物的性狀而採用不同的培養基或不同的載體。下列實施例中，選用矮牽牛、大豆、苜蓿、向日葵、棉花、小麥和玉米作目標植物。然而，下面簡述的方法也可用於能從苗端或腋芽再生的其它植物，這無需實驗證明或不會背離本發明的實質和範圍。
下列的實施例僅僅是為了說明本發明的實質。該方法可用於由苗端再生和能用土壤桿菌轉化的任何雙子葉植物，這對於本領域的普通專業人員來說是顯而易見的。將本發明方法改用於轉化單子葉植物類也不偏離本發明的範圍和實質。
最好選用卡那黴素的抗性，也可採用編碼對其它抗生素(如G418、新黴素、水黴素或氯黴素)或除草劑(如glyphosate)具有抗性的插入基因序列，以及本領域的普通技術人員熟知的其它可選擇的基因。另外，某些添加劑可用來促進苗端的成功浸染。這些添加劑包括乙醯丁香酮和某些冠癭鹼如(但不限於)章魚鹼、胭脂鹼、和亮氨酸冠癭鹼。
實施例Ⅰ分離塊源的萌發從Ball Seed co.，West chicago，IL.得到市售矮牽牛變種「Rose Flash」(Single Grandiflora and Deep Rose的一種F1雜交種)種子。在20%(v/v)市售漂白劑中對種子進行表面滅菌30分鐘，該漂白劑事先已加入潤溼劑如吐溫20或洗盤用洗滌劑。再用無菌水漂洗種子5次。
然後將滅菌後的種子在含30%蔗糖(w/v)的Murashige和Skoog鹽中無菌發芽。Murashige和Skoog鹽的製法如下先製備下列鹽的儲備溶液(以g/l儲備溶液計)(1)硝酸鹽硝酸銨(NH4NO3)，165;硝酸鉀(KNO3)，190;
(2)硫酸鹽硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，37;硫酸錳(MnSO4·H2O)，1.690;硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)，0.860;硫酸銅(CuSO4·5H2O)，0.0025;
(3)滷化物氯化鈣(CaCl2·2H2O)，44;碘化鉀(KI)，0.083;氯化鈷(CoCl2·6H2O4)，0.0025;
(4)PO4、BO3、M0O4磷酸二氫鉀(KH2PO4)，17;硼酸(H3BO3)，0.620;鉬酸鈉(Na2M0O42H2O)0.025;
(5)Na2FeEDTA硫酸鐵(FeSO4·7H2O)，2.784;乙二氨四乙酸二鈉鹽(Na2EDTA)，3.724。
將上述5種儲備溶液各10ml加入1升製備好的培養基中。
苗端的切割和接種發芽一周後，從按上述方法發芽的植物上切取苗端。該苗端尺寸為0.3×0.6mm。由端圓頂和兩個初葉組成。將切割後的苗端放在上述的Murashige和Skoog鹽中培養，該鹽含有下列添加組分0.1mg/lN6-苄基腺嘌呤、30000mg/l蔗糖和2000mg/l凝膠(從KCBiological，kansascity，MO得到)。
培養二天後，經分離的苗端按下述方法用5ul根癌病土壤桿菌懸浮液滴接種。將平板開著放在傳遞通風櫥中，直至液滴乾燥。再封閉帶有苗端的培養平板，於25℃保溫兩天(光照和黑暗周期比為16∶8小時)。
用於接種的根癌病土壤桿菌的製備用於接種苗端的土壤桿菌懸浮液的製法如下一種雙重載體PRGUS2是由TexasAMUniversity的Dr.TerryThomas通過將由PGUS1分離的含β-葡糖苷酸酶(GUS)編碼區的BamHⅠ-SstⅠ限制性片段克隆到PROK2的多銜接位點而獲得;將多銜接物插入PROK1(20)而獲得一個表達載體。將GUS基因放在T-DNA的CaMV35S啟動子和胭脂鹼合成酶聚腺苷作用信號之間。將PRGUS質粒從大腸桿菌(E·Coli)菌株HB101接合到無毒性的根癌病土壤桿菌菌株LBA4404中(如Simpson等，PlantMol.Biol.6∶403-415所述)。結果得到含有卡那黴素抗性和β-葡糖苷酸酶基因的根癌病土壤桿菌菌株。這使轉化組織容易分化和檢測。
將根癌病土壤桿菌LBA4404(PRGUS2)在如下配製的培養基中培養配製100ml鹽溶液，該溶液含3.9g二鹼基磷酸鉀，3H2O;1g單鹼基磷酸鈉，1g NH4Cl和0.15gKCl。將該鹽溶液於121℃，18磅/英寸2高壓滅菌15分鐘，再製備另外一種900ml的培養液，該溶液含有0.5g/l蔗糖、13mg氯化鈣、0.5g/l硫酸鎂、10μl硫酸鐵儲備溶液(250mg/ml FeSO4·7H2O)。在儲備培養基中培養細菌時，在培養液中加入15g瓊脂，而在懸浮液或液體中培養時不需加瓊脂。然後將培養液高壓滅菌25分鐘並冷卻。混合鹽和培養液後再加入50mg卡那黴素，將根癌病土壤桿菌LBA4404(PRGUS2)在3ml培養基上培養二天。按上述方法，將培養基和培養的根癌病土壤桿菌用於接種苗端。
轉化苗端的選擇和克隆接種和保溫後，將苗端轉移到新鮮培養基中培養二天，該新鮮培養基含有上述的Murashige和Skoog鹽以及0.1mg/lN6-苄基腺嘌呤、30000mg/l蔗糖和2000mg/l凝膠物。然後將該苗端在含有上述的Murashige和Skoog鹽、0.1mg/lN6-苄基腺嘌呤、30000mg/l蔗糖、2000mg/l凝膠物、200mg/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素(後者從Sigma，St.Louis，MO得到)的培養基上再次培養。
保溫三周後，所有的分離塊均已生長。在有200mg/l卡那黴素的培養基中，未轉化組織發白，已轉化的苗在發白的葉上呈現綠色區。摘去發白的葉片，將綠色組織在含100mg/l卡那黴素的培養基上再培養。一周後，從分離塊中發育出單一的綠色苗，再轉移到生根培養基中，該培養基含有Murashige和Skoog鹽、3%蔗糖、100ml/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素。所有的分離塊均有根產生。
用如下方法測定生根後植物具有的GUS基因。將約50mg植物組織在帶杵的Eppendorf管中與200ul 50mM Na3PO4，pH7.0，10mM EDTA，0.1%三硝基甲苯(Triton)X-100，(Sigma chemical)0.1% Sarkosyl.(Sigma chemical)10mM β-巰基乙醇混合均勻。將100ul提取液加入100ul溶於相同緩衝液的2mM4-甲基繖形葡糖苷中，於37℃保溫反應5小時，用1ml0.2M Na2CO3終止反應。每隔1小時用Kontron分光螢光計定量分析產生的甲基繖形酮。測定結果如圖1所示。
實施例2-苗端和葉片培養體系的比較已將葉片培養方法和本發明的苗端方法作了比較。
將113個由雜交矮牽牛(Petuniahybrida)栽培品種「RoseFlash」得到的苗端與根癌病土壤桿菌共培養，並在上述的選擇性培養基中培養。分離基部為綠色的苗(表1)，轉移到含100mg卡那黴素/l的培養基中培養一周，再轉移到上述的生根培養基中。
葉片也取自雜交矮牽牛栽培品種RoseFlash，按Horsch等，Science227，1229(1985)所述的方法進行轉化，選擇的培養基由MS培養液組成，它含有1.0mg/lN6-苄基腺嘌呤，0.1萘乙酸，100mg/l、200mg/l或300mg/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素。得到的結果如表1所示。
表1卡那黴素濃度mg/l100葉片300苗尖200愈傷組織產物 13/28a25/25 3/113(46%)(100%)(3%)苗產物13/280/257/113(46%)(0%)(6%)根苗2/13-5/7(15%)(71%)GUS陽性植物2/2-5/5(100%)(100%)a原始分離塊數在100和300mg卡那黴素/l中，由葉片分離塊產生的愈傷組織比率是較高的(46%和100%)，而從苗端分離塊產生的愈傷組織則相當有限(3%)。在卡那黴素中培養的從苗端分離塊產生苗(6%)與從葉片產生苗(46%)相比是低的。但是，從苗端分離塊形成的苗(71%)要比從葉片分離塊形成的苗(15%)更容易轉化。
由此可見，這二種技術的主要差別在於從苗端發育的植物幾乎都能再生。用側芽分離塊也可取得相同的結果。
為了測定用苗端分離塊方法能否生成嵌合植物，對GUS陽性植物不同部位的葉、花瓣、子房和胚珠組織進行上述的GUS測定，所有測定的組織均有GUS基因表達。
實施例3-摻入的穩定性植物轉化的重要結果是摻入性狀在種系中和在子代中表達的穩定性，假定穩定，就無需關心原始轉化體嵌合特性的問題。
為了測定實施例2中的性狀是否成功地傳到下一代，將GUS陽性植物的花進行自體繁殖，將4株不同的GUS陽性植物的20個花上307個種子進行發芽(如上所述)，對苗進行GUS活性測定，如表2所示，約90%的苗是GUS陽性的。
表2植物種子表達%(GUS+置信度(95%) 花數 GUS+GUS-/總數)111514193.3(73-100)21514193.3(73-100)31514193.3(73-100)41513286.7(60-98)515150100.0(78-100)總數75705×＝93.3211514193.3(73-100)21513287.0(60-100)32320387.0(65-100)
41614287.5(61-100)51312192.0(58-100)總數82739X＝89311513286.7(58-98)215150100.0(78-100)31514193.3(73-100)41514193.3(73-100)51513286.7(60-98)總數75696X＝92411510566.6(37-88)21512380(52-97)31511473(43-93)41512380(52-97)51512380(52-97)總數755718X＝76X＝平均值參照表3，計算一株植物後代中GUS基因表達的X平方值，結果表明單子雜交株有3∶1分離現象，這說明只在一個染色體中有插入。對3株植物的X2值計算表明雙重顯性雙因子雜交分離的15∶1的分離類型，這說明在兩個不相關的染色體上有拷貝插入。
表3分離比例(3∶1)(15∶1)2a2XPXP植物113.44＜0.0010.03＞0.80植物29.84＜0.013.12＞0.05植物311.56＜0.0010.39＞0.5植物40.04＞0.840.32＜0.01於95%的置信度內，用df＝1計算的數據。
實施例4用上述的苗端方法，轉化其它二個矮牽牛栽培品種來自T·Gerats的V23xR51和「White Flash」(F1hybrid Grandiflora X Pure White Ball Seed，Co.，chicago，Illinois)。如表4中所示，這些品系得到的轉化結果類似於表1的結果。這表明該方法也能成功地用於其它植物變種。
將轉化的雜交矮牽牛株V23xR51進行自體繁殖，收集種子並培育，如表5所示，後代的70%至90%顯示了GUS活性，這表明該基因已成功地傳遞到下一代中。
表4實施例1中使用葉片和苗端體系時雜交矮牽牛栽培品種「V23XR51」和「WhiteFlash」轉化的比較葉片苗端卡那黴素mg/l100300200V23×R51分離塊號263418產生的愈傷組織 Xa14 0產生的苗-148生根苗-98GUS陽性植物-52WhiteElash分離塊號3033102產生的愈傷組織30120產生的苗01110生根苗-114GUS陽性植物-114ax＝苗數目相當大並不可計數表5如實施例2中栽培品種「V23×R51」的自我授粉的後代中的GUS基因分離植物種子數GUS(+)GUS(-)表達%140281270.024036490.0
這個數據，加上實施例3中的數據，明顯說明了本發明方法的主要特徵一目標植物的生殖細胞和體細胞的轉化使新的性狀在以後的繁殖中得以遺傳。其它人所用的方法導致不育植物，不能轉化生殖細胞或轉化生殖細胞的轉化百分比相當低，從而只能得到極少能表達所需性狀的後代。
已轉化的「V23xR51」植物後代的GUS基因表達的X2值表明一個單子雜交的3∶1分離，它表明插入了單染色體。其它植物的X2值顯示出雙重顯性雙因子分離的15∶1分離類型，它表明GUS基因的拷貝插入了兩個獨立的染色體中。
表6栽培品種「V23xR51」的轉化植物後代中GUS表達的分離類型的估價分離比率(3∶1)(15∶2)植物 X2aP X2P10.533＞0.3038.5＜0.0124.8＜0.050.96＞0.30於95%置信度，df＝1計算的數據。
實施例5通過苗端進行轉化的方法已用於棉花，尤其是多毛棉(Gossypiumhirsutum)變種Coker312.TamcotCAB-CS.和刺毛棉(Gossypiumbarbadense)變種Pima5-6。所用的方法步驟與上述基本相同，但作如下變更。
消毒種子時，先用蒸餾水衝洗10分鐘，再在加1滴吐溫20的20%的市售漂白劑中浸泡15分鐘，再用無菌水衝洗種子三次。
消毒後，將種子轉移到無菌Petri平板上(合點端向下)。每板上放5粒種子。該平板裝有含MS滷化物的一種溶液，並用0.8%瓊脂固化。將平板於30℃不封閉地在暗處保溫4天，在分離前，一天進行16小時的光照。
為了確保在相似的發育階段從植物上切取苗端，使用苗的最一致的種群，除去發芽較慢的或汙染的苗。
藉助於解剖顯微鏡從生長5天的苗上分離苗端，在某些情況下，將無菌皮下針(22和27號)裝在塑料注射器上以用於完成解剖。
首先在基部去除兩個子葉中的一個，切割苗端。再從苗上去除苗區，剪掉苗區的基部以暴露苗端分生組織的下部表面。該技術的改進還可用於去除最大的葉和暴露深層組織的端區分生組織的側面和下面。
從生長3至4天的苗上分離的苗端由分生組織圓頂和兩個初葉組成。該苗再大些時(生長5至7天)，其苗端通常還含有另外兩個初葉。
於28-30℃下，在16小時光照周期的條件下，將分離後的苗端在沒有激素的MS基本培養基(如下所述)中培養，於50μE/m2。秒的強度連續提供Gro-LUX和冷螢光的光，再將苗端在新鮮培養基中培養。
包括MS基本鹽配方的培養基〔按Murashige和Skoog(OP.Cit.Murachige Skoog，1962)所述]含有下列添加物蔗糖15000mg/l，維生素B16.4mg/l，TC瓊脂8000mg/l。在使用前，用普通高壓滅菌方法對培養基進行滅菌，分散到無菌Petri平板上。
切割後二天內，用根癌病土壤桿菌接種苗端。從培養平板上刮下細菌，用皮下針或一牙籤將刮下的細菌塗在苗端的切面上，從而完成接種。
用根癌病土壤桿菌的兩菌株之一種接種苗端。第一種是上述的菌株LBA4404「GUS2」，第二菌株是菌株EHAI，它包含一個相似的Ti質粒作為GUS2。將該質粒插入EHAI菌株，TexasAMUniversity的Dr.T.Mcknight將其命名為「GUS3」。菌株EHAI含有一個超毒性區域，該區域增加了根癌病土壤桿菌的宿主範圍。
除了使用根癌病土壤桿菌菌株EHAI外，可採用下列添加劑以促進成功的感染乙醯丁香酮，10-30μM;和胭脂鹼，10-100μM(Veluthambi等提出)。
與根癌病土壤桿菌接觸二天後，將分離塊轉移到含500mg/l羧苄青黴素的培養基中培養一周。再將分離塊轉移到含7.5mg/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素的培養基中培養一周，最後，將分離塊轉移到含有羧苄青黴素500mg/l。周的培養基中培養。
當苗含有4個或更多個葉片時，將苗基部浸入無菌根酮，再轉移到3英寸陶土罐的無菌蛭石中並加蓋。
用上述方法測定分離塊和胚的GUS基因，結果為GUS陽性。
實施例6使向日葵，Heleanthusannus，變種Triumph560的種子萌發，分離苗並用上述用於棉花的方法(作如下修改)用根癌病土壤桿菌EHAI、乙醯丁香酮和胭脂酮(1)進行培育，在苗分離前將種子培養2-3天。在用於棉花的基礎培養基中補充了1mg/lIAA(吲哚乙酸)。
四株向日葵開花並結籽，這些種子萌發後，許多子代苗為GUS陽性。
實施例6使大豆，Glycinemax，變種DowlingBragg的無菌種子發芽一天，然後切取胚芽，按上述方法培養。由在水中浸泡1小時的種子還可得到苗端。
使用的培養基與用於棉花的相同，所不同的是用於苗培養的培養基中加入了0.1mg/l激動素以促進苗端的生長，加入1.0mg/l激動素可促進隨機的苗產生。
與根癌病土壤桿菌EHAI，胭脂鹼和乙醯丁香酮的共培養與上述用於棉花的相同。
與土壤桿菌共培養二天後，將分離塊轉移到含25或50mg/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素的培養基中培養一周。將分離塊再轉移到沒有激素而含有500mg/l羧苄青黴素的培養基中。
生長在含羧苄青黴素培養基上的許多分離塊可自發生根。將沒生根的分離塊浸入無菌生根酮。再將植物無苗地轉移到3英寸罐的無菌蛭石中並加蓋。
在培養基中生長的大部分苗為GUS陽性。生存下來的苗轉移到土壤中，所有的苗均為GUS陽性。
實施例7使苜蓿，MedicagoSativa變種SouthernSpecial的種子萌發，採用上述用於棉花的方法分離苗。將組織與根癌病土壤桿菌EHAI、乙醯丁香酮和胭脂鹼共培養。
在離體中有幾個GUS陽性組織，在罐中培植了10株植物，其中至少4株為GUS陽性。
實施例8用蒸餾水衝洗玉米(變種Funks6-90)和小麥(變種ChineseSpring)10分鐘，在20%市售漂白劑(其中含有一滴吐溫20)中浸泡15分鐘，用無菌水衝洗三次。將消毒過的種子轉移到含MS滷化物和硫酸鹽的培養基中並用0.8%瓊脂固化。將種子的胚胎區域與瓊脂接觸，將不封閉的平板於30℃的暗處培養一天。
藉助於解剖顯微鏡分離苗端，切割葉和深層組織，暴露苗端分生組織側面，並暴露其下面。
將分離的苗端在沒有激素的MS基本培養基中培養，每周將該組織向新鮮培養基上轉移一次以進行再培養。培養基包括MS基本鹽配方(Murashige Skoog，1962)和下列成分(mg/l)蔗糖15000;維生素B10.4;TC瓊脂8000。在常規條件下，對培養基進行高壓滅菌並倒入無菌塑料Petri盤中。使用Gro-Lux和冷白色螢光，50UE/m2·秒，將培養物於28-30℃保持16小時。
在分離的當天或分離後的一天和二天，接種苗端分離塊。採用由Dr.TOmMcknight研製的含「GUS3」的根癌病土壤桿菌菌株EHAI。該菌株可能含有一個超毒性區域，該區域增加了該菌株的感染(和轉化)物種的範圍(TomMcknight，PersonalCommunication)。從融合平板上刮下土壤桿菌，該平板事先已在含合適生長培養基和抗生素上接種2-3天。用無菌皮下針或無菌牙籤將土壤桿菌接種到苗端的切割面上。
除了使用根癌病土壤桿菌的超毒性「GUS3」菌株以外，在接種前還將胭脂鹼和乙醯丁香酮與土壤桿菌混合以增加毒性並觸發與成功地感染相關的其它反應。
與土壤桿菌接觸二天後，將分離塊轉移到含500mg/l羧苄青黴素的培養基中培養一周，然後再轉移到含7.5mg/l卡那黴素和500mg/l羧苄青黴素的培養基中培養一周;最後每隔一周將其轉移到含500mg/l羧苄青黴素的新鮮培養基中。
二周或三周後，發育的玉米和小麥苗自發地生根。
如Ulian等，1988年所述，玉米和其它單子葉植物顯然含有一種裂解GUS底物的酶，從而產生一種弱的陽性反應。所以單子葉植物中的弱GUS陽性反應不表示轉化的成功，強GUS陽性反應(如在某些玉米和小麥組織中看到的)可能表示轉化的成功。
按Rogers和Bendich(1985，plant Molec.Biol.5∶69-76)的方法提取DNA，根據製造者的說明可用HindⅢ(Boehringer Mannheim Inc)加以限制和用電泳分離過夜。使用Reed和Mann(1985，Nucleic Acid Res.13∶7207-7221)鹼性轉化改進方法，根據Southern(1975，J.Molec.Biol.98∶503)的原理將DNA從凝膠轉移到尼龍濾膜中。用32P標記的GUS探針雜交分析DNA，該探針包括35S啟動子、GUS序列和聚腺苷作用編碼區域(如前所述)。玉米的Southern分析證實了轉化成功。
權利要求
1.一種轉化植物組織的方法包括(a)將切下的苗分生組織在合適的生長培養基中培養；和(b)用能轉化所述組織的一個合適載體接種所述的苗分生組織。
2.根據權利要求1的方法，其特徵在於所述的組織是從植物上切下的苗端。
3.根據權利要求2的方法，其特徵在於所述苗端包括從植物上切下的端頂和兩個或更多個初葉。
4.根據權利要求1的方法，其特徵在於所述組織是腋芽。
5.根據權利要求1的方法，其特徵在於所述載體是根癌病土壤桿菌。
6.根據權利要求1的方法，其特徵在於所述的載體含有選擇或表現性狀的遺傳編碼。
7.根據權利要求6的方法，其特徵在於所述的選擇性狀是抗生素抗性。
8.根據權利要求5的方法，其特徵在於所述的根癌病土壤桿菌是菌株LBA 4404(PRGUS2)。
9.根據權利要求5的方法，其特徵在於所述的根癌病土壤桿菌是菌株EHA1(PRGUS3)。
10.根據權利要求5的方法，其特徵在於轉化步驟中增加了加入乙醯丁香酮和一種冠癭鹼的步驟。
11.根據權利要求10的方法，其特徵在於所述冠癭鹼是胭脂鹼。
12.根據權利要求1的方法，其特徵在於它進一步包括(a)選擇轉化的植物組織;和(b)培養轉化的植物組織誘導根的生長。
13.一種轉化植物組織的方法包括(a)將切下的苗端組織在一種適合生長的培養基中培養;(b)用根癌病土壤桿菌接種所述的苗端組織，以轉化所述的組織;(c)選擇轉化的植物組織;和(d)培養轉化的植物組織以誘導根的生長。
14.根據權利要求13的方法，其特徵在於在轉化步驟中增加了加入乙醯丁香酮和一種冠癭鹼的步驟。
15.根據權利要求13的方法，其特徵在於所述的土壤桿菌是菌株LBA4404(PRGUS2)或菌株EHA1(PRGUS3)。
全文摘要
本發明涉及一種轉化和快速再生植物組織的新方法，該方法採用的目標組織是苗端，從而擴大了轉化物種的範圍，並減少了體細胞克隆變異。
文檔編號C12N15/82GK1042638SQ8910471
公開日1990年6月6日 申請日期1989年5月31日 優先權日1988年6月1日
發明者羅伯塔·H·史密夫, 吉恩·H·吉爾德, 尤吉尼奧·C·烏利安 申請人:德克薩斯農業及機械綜合大學