使用細菌生產生物能的製作方法

2023-10-25 10:45:37

專利名稱：使用細菌生產生物能的製作方法
技術領域：
本發明涉及生產生物能的組合物和方法。更具體來說，本發明涉及使用奇球菌屬 (Deinococcus)和/或相關屬的細菌進行生物質或生物質衍生物的修飾，以生產生物能產 物和代謝物。
背景技術：
使用微生物進行生物質、主要是植物生物質的修飾，以生產生物能產物例如乙醇， 已為人所知。當前的工業方法只允許在30°C附近的溫度下培養和生長微生物，以發酵和提取乙 醇，這是由於使用的工業微生物(酵母)的脆弱性。它們還必須承擔發酵後濃縮乙醇的主 要生物能成本，因為目前用於這種發酵的酵母不能忍受高於I00g/1的濃度。此外，這些酵 母的發酵在實踐中只能利用葡萄糖類型的C6糖類。處理生物材料、尤其是細菌菌株，以賦予其改進的性質，這一點也已為人所知。例如，S. Del Cardayre等的美國專利No. 6，716，631描述了基於重組和選擇/篩 選的反覆循環的方法，來賦予整個細胞和整個生物體以所需性質。添加的性質是例如對遺 傳重組的增加的誘發適應力，增加的基因組拷貝數，增加的表達和/或分泌蛋白和次級代 謝物的能力。通過採用分子遺傳學手段，作者提出了適當修飾細胞和生物體的基因組，以賦予 其新的、改進的性質的技術。在US 6，716，631中描述的方法使用了不同細胞的群體，將這些細胞進行培養，通 過原生質體融合形成了雜交細胞，然後篩選或選擇朝向獲得所需性質演化的細胞，並重複 這些步驟，直到獲得至少一個具有所需修飾的細胞。這種方法被提出作為基於菌種改良程 序的已知方法的有優勢的替代方案。進行所述融合的原生質體可以源自於原核生物體。在該美國專利中設想的應用之一是例如乙醇的發酵生產，提出使用所述重組方 法，通過所使用的微生物的DNA改組(shuffling)來改進其產率和成本。例如，提到了已知 能夠催化兩相反應的紅球菌(Rhodococcus)的同源重組。國際專利申請No. W001/023526描述了對輻射具有抗性並能夠執行生物治理的細 菌，特別是奇球菌(尤其是耐輻射奇球菌(D. radiodurans)和D. geothermalis)的生產和 使用，它們被修飾以便更有效地代謝、降解或脫毒無機和有機汙染物，例如放射性核素、重 金屬和有機溶劑。推薦應該對這些細菌進行操作，以表達能夠脫毒所述元素的異源酶。細 菌菌株可以被操作，以便將由不同基因編碼的各種不同功能組合在單一宿主中。I. Narumi等在2003年9月18日公布的美國專利申請No. 2003/0175977中，描述 了源自於一株D. radiopugnans的內源質粒pUE30，它可以用作能夠在奇球菌屬的細菌中自 主複製的載體，它還可用於構建也含有能夠在大腸桿菌(E. coli)及其衍生株中自主複製、 並能夠在奇球菌屬和大腸桿菌二者的細菌中都能複製的質粒的穿梭載體。C. B. Fliermans的美國專利No. 7，160, 715描述了用於測量體內發生的DNA鏈斷裂的分布和頻率的方法。這些方法包括使用源自於耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的 PprA 蛋白。以K. Satoh等的名義公布的美國專利申請No. 2004/0224320描述了分離和純化的 革蘭氏陽性細菌(登記號ATCC BAA-149或其突變株)。該分離株能夠降解多種多樣的有機 汙染物，並適合於在存在電離輻射的情況下對各種不同的有機汙染物進行生物治理。此外，最近關於使用微生物菌株進行發酵生產乙醇的專著，在美國能源部(United States Department of Energy)禾口國家可再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory)的資助下，由 J. R. Hettenhaus 以《乙醇發酵菌株》(Ethanol Fermentation Strains)的題目出版(1998年12月16日)。在該文獻中，總結了所涉及領域中由參與方 做出的貢獻，其中指出_僅有的可以在現有設備中使用的微生物菌株應該與已經使用的類似，即酵母 (Saccharomyces)、發酵單胞菌(Zymomonas)禾口大腸桿菌(E. coli)；-在短時期內，增加木糖和阿拉伯糖的發酵可以作為靶目標，但是特別指出增加其 他己糖或寡聚體類型的糖類的轉化效能沒有多少利益；_長遠來說，在較高的操作溫度以及酶生產、糖化和水解步驟的組合方面，可能獲
得利益。因此，對於發酵生物質和獲得乙醇以及任選的其他代謝物的方法，存在著需求，所 述方法能夠在比現有方法明顯更好的操作條件下執行，同時能夠比已知方法更容易中試， 並且能夠產生更廉價和更容易升級的發酵產物。本發明能夠為這些期望帶來解決方案，並提供改進的方法，通過生產替代的生物 能產品從生物質獲取利益，由於化石來源能源的顯著減少，這正變得越來越有必要。

發明內容
本發明涉及生產生物能產物或代謝物的方法和組合物。更具體來說，本發明涉及 使用特定微生物，從生物質或其衍生物生產生物能產物或代謝物。本發明尤其源自於下述 發現，即奇球菌屬的微生物具有出人意料的有利性質來修飾或轉化生物質或生物質衍生 物，以獲得可用於在工業規模上經濟可靠地生產生物能、特別是乙醇的化合物。因此，本發明的目標在於生產生物能產物或代謝物的方法，包括將生物質或生物 質衍生物接觸天然或修飾的、在由脅追造成破壞時具有完全或部分地重新裝配其基因組的 能力的細菌，優選為天然或修飾的奇球菌屬細菌，或其提取物。本發明的另一個目標是將生物質或生物質衍生物轉化成生物能產物或代謝物的 方法，包括在存在奇球菌屬細菌或在由脅迫造成破壞時具有完全或部分地重新裝配其基因 組的能力的細菌，或其提取物的情況下，處理所述生物質或生物質衍生物。在具體方面，本發明涉及的方法包括下列步驟a)在好氧和/或厭氧條件下培養和/或生長所述細菌，b)使用含有所述細菌或其提取物的組合物，將生物質或生物質衍生物修飾成 具有工業重要性的生物能產物或代謝物(例如生物能源例如乙醇，化學構件(chemical building blocks)例如琥珀酸)，以及c)收集從所述生物質或生物質衍生物的修飾產生的至少一種生物能產物或代謝物
本發明還涉及使用奇球菌屬細菌或其提取物，從生物質或生物質衍生物生產生物 能產物或代謝物。本發明還涉及含有奇球菌屬細菌和生物質或生物質衍生物的組合物。本發明還涉及使用上述方法生產的生物能產物。本發明的方法可以使用各種不同的天然或修飾的奇球菌屬菌種來進行，例如 但不限於 Deinococcus geothermalis，耐福身寸奇球菌(Deinococcus radiodurans)， Deinococcus murrayi 或 Deinococcuscellulosilyticus。本發明顯不，奇球菌屬細菌可以 有效地促進生物燃料例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇、丙二醇，或化學上重要的有機酸 及其鹽例如乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸或酯的生產，特別是在上面提到的 醇與酸之間形成的酯的生產。本發明還出人意料地顯示，奇球菌可以在例如升高的溫度，寬範圍的pH，存在溶 齊U，存在原料底物的條件下操作，適合於從各種不同底物生產大量的生物能產物或代謝物。因此，本發明提供了以非常有效的方式生產生物能產物或代謝物的新方法和組合 物。


圖1 乙醇對處於指數生長期的Deinococcus geothermalisDSM11301的殺細菌劑 效應在指數生長期中，含量高於8. 2%時，乙醇的殺細菌劑潛力明顯。圖2 乙醇對處於靜止期的Deinococcus geothermalis DSM11301的殺細菌劑效 應在靜止期中，含量高於11. 7%時，乙醇的殺細菌劑潛力明顯。圖3 丁醇對處於指數生長期的Deinococcus geothermalisDSM11300的殺細菌劑 效應在指數期中，含量高於1.5%時，丁醇的殺細菌劑潛力明顯。圖4 丁醇對處於靜止期的Deinococcus geothermalis DSM11300的殺細菌劑效 應在靜止期中，含量高於2%時，丁醇的殺細菌劑潛力明顯。圖 5 乙醇對Deinococcus geothermalis DSM11300 生長的影響黑色方塊，0% 乙 醇；白色方塊，0.8%乙醇；黑色圓圈，1.2%乙醇；白色圓圈，2.4%乙醇；黑色三角形，3. 1%乙醇。圖 6A :pH 對 D. geothermalis DSM 113000 (DRH05)生長的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6B :pH 對 D. geothermalis HAMBI 2481 (DRH37)生長的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6C :pH 對 D. geothermalis HAMBI 2480 (DRH38)生長的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖 6D :pH 對 D. geothermalis HAMBI 2411 (DRH39)生長的影響黑色方塊，pH8 ；黑 色圓圈，pH 7 ；白色方塊，pH6 ；白色圓圈，pH5 ；黑色菱形，pH4。圖7 :D. cellulosilyticus在不同液體培養基中的生長。細菌按照實施例9的材 料與方法中的描述生長。黑色圓圈，在豐富培養基中生長；黑色方塊，在含有CM-纖維素的 基本培養基中生長；白色方塊，在缺乏碳源的基本培養基中生長。
發明詳述本發明涉及使用奇球菌屬細菌生產生物能產物或代謝物的方法。本發明確實顯示 了奇球菌屬細菌以非常有效的方式，從生物質生產生物能產物或代謝物。紅在本申請的上下文中，術語「奇球菌屬(Deinococcus)的細菌」包括奇球菌屬的野 生型或天然變異菌株，以及重組菌株，通過DNA改組技術或通過定向進化技術獲得的菌株。「細菌的提取物」是指從細菌獲得的任何級份，例如細胞上清液，細胞碎片，細胞 壁，DNA提取物，酶或酶製備物，或任何通過化學、物理和/或酶法處理從細菌產生的製備 物，它基本上不含活細菌。在本發明的上下文中，術語「生物能」是指源自生物質的可再生能源。更具體來說， 術語「生物能產物」是指「生物燃料」和所有可以用作燃料的生物質或生物質衍生物修飾的 最終產物，例如乙醇。術語「代謝物」是指在將生物質或生物質衍生物修飾成生物能產物的 過程中產生的所有可能的中間分子，包括但不限於幾種工業上重要的化學產物，例如有機 酸和構件。在本發明的上下文中，術語「生物質」是指活的和最近死亡的可以用作燃料或用於 工業生產的生物材料。更通常，生物質是指長成用來發電或生產生物燃料的植物物質，但是 它也包括用於生產纖維、化學物質或熱量的植物或動物物質。生物質也可以包括可以作為 燃料燃燒的可生物降解廢物。術語生物質不包括已經被地質過程轉變成諸如煤或石油的物 質的有機材料。工業生物質可以從大量類型的植物，包括芒屬植物、柳枝黍、大麻、甜菜、小麥、玉 米、楊樹、柳樹、高梁、甘蔗，以及從桉樹到油棕的各種不同樹種生長。本發明的生物質包含原料生物質和/或次級生物質。原料生物質是來自生物物質 的未加工的材料。例子包括林業產品，例如不適合用於木材或造紙的成熟樹木，農業產品， 例如草、作物和動物糞肥，以及水生產品，例如藻類和海草。次級生物質是任何最初源自於 原料生物質，經歷了顯著的化學和物理變化的材料。例子包括紙張、皮革、棉花、麻、天然橡 膠產品、食品加工副產物以及用過的烹調油。本文中使用的術語「生物質衍生物」是指所有源自於上面定義的原料生物質和/ 或次級生物質的分子，特別是任何最初源自於原料生物質、已經經歷了顯著的化學和物理 變化的物質，例如澱粉、纖維素、半纖維素和木質素。本文中使用的「中間產物平臺」是通過生物質衍生物的生理化學或生物化學轉化 獲得的分子，例如糖類、澱粉和生物基合成氣體(合成氣)。詳細描述本發明提出了使用奇球菌屬細菌從生物質生產生物能產物或代謝物。本發明確實 顯示出，奇球菌屬細菌表現出出人意料的性質，該性質允許它們在通過發酵生物質或生物 質衍生物生產生物能產物或代謝物中進行協作。奇球菌屬細菌已經顯示出當由脅迫造成破壞時，具有全部或部分地重新裝配它們 的基因組的能力(PCT/EP2006/005826Radman-Zahradka)。正如前面提到的，這些細菌，特別 是耐輻射奇球菌，已被提議用於生物治理。但是，從未公開過或建議過奇球菌屬細菌能夠從 生物質生產生物能產物和代謝物。此外，從未建議過具有所需生物學性質的奇球菌屬細菌可以被分離並培養。現在，本發明第一次顯示了能夠分離或培養具有至少一種下列性質的奇球菌屬細 菌，並且所述細菌能夠生產生物能產物或代謝物-它在高溫下(例如大約40-70°C)是活的或有功能的；-它在從大約3到大約9.5，優選在大約4到大約8之間的pH範圍內是活的或有 功能的；-它在存在毒性劑，特別是有機溶劑例如乙醇的情況下是活的或有功能的；-它能夠轉化C6和C5糖類；-它能夠促進纖維素消化以產生葡萄糖；-它能夠促進半纖維素消化以產生木糖；-它在存在適合碳源的情況下能夠在好氧和/或厭氧條件下生長。此外，奇球菌屬細菌典型地不具有任何病原性，因此可以沒有特定限制地使用。因此，本發明第一次公開了奇球菌屬細菌從生物質製造生物能產物或代謝物的能 力，以及它們出人意料的在適應於這些應用的具體條件下生長和培養的能力。本發明還提 出了使用任何在由脅迫造成破壞時具有全部或部分地重新裝配它們的基因組的能力的細 菌，來生產生物能產物或代謝物。在優選實施方案中，本發明的方法使用了嗜熱的奇球菌屬菌種，優選選自 Deinococcus geothermalis、耐福身寸奇球菌禾口 Deinococcusmurrayi。在本發明的優選實施方案中，方法使用了在存在毒性劑，特別是存在有機溶劑例 如乙醇的情況下可存活的奇球菌屬細菌。本申請的確顯示，奇球菌屬菌株可以在存在高水 平溶劑、例如乙醇或丁醇的情況下生長，允許以更有效的方式生產生物燃料。在本發明的另一個優選實施方案中，方法使用了可以在從大約40到70°C，優選從 50°C到60°C的溫度範圍內生長的細菌。在更優選的實施方案中，方法使用了可以在升高的 溫度(高於40°C )下，也可以在存在上面公開的毒性劑或有機溶劑的情況下生長的細菌。在本發明的另一個具體實施方案中，方法使用了在NaCl或等價的鹽可能達到大 約5%重量/體積的濃度條件下可以存活或有功能的奇球菌屬細菌。在本發明的另一個優選實施方案中，方法使用了在大約3到9. 5、優選在4到8之 間的PH範圍內存活的細菌。確實，本發明人發現，奇球菌屬菌株可以在這種嚴緊條件下維 持，這對於轉化生物質是特別有利的。在優選實施方案中，本發明使用了能夠轉化C6和/或C5糖類，和/或促進纖維素 消化以產生葡萄糖，和/或促進半纖維素消化以產生木糖的奇球菌屬細菌。在具體實施方案中，本發明涉及了方法，其中所述奇球菌屬細菌能夠在存在木聚 糖的情況下生長，並促進木聚糖的消化。這樣的酶活性，與高耐熱性、寬範圍的pH耐受性和毒性劑耐受性相結合，以前從 未報導過，是引人注目的。正如在實施例中顯示的，可以分離、培養具有上述性質的奇球菌 屬細菌，並從生物質生產大量的生物能產物或代謝物。就此而言，本發明的另一個優點在於這樣的方法，其中所述奇球菌屬細菌生長在 含有C6糖、優選為葡萄糖，或更複雜的糖、優選為蔗糖、纖維二糖或澱粉，或C5糖、優選為木 糖，來作為碳源的基本培養基中。本發明的另一個優點在於下述事實，即所述奇球菌屬細菌可以在存在C3碳水化合物，優選為甘油或丙酮酸鈉的情況下生長。適合用於本發明的細菌的具體例子是保藏號為DSM11300、DSM11301、DSM11302、 HAMB12480、HAMB12481 和 HAMBI2411 的 Deinococcus geothermalis 菌株；保藏號 為 DSM11303 和 DSM11305 的 Deinococcus murrayi 菌株；或保藏號為 DSM18568T 的 Deinococcuscellulosilyticus菌株(列於表1中)，或基本上與其類似的菌株或其突變株。表1 奇球菌屬(Deinococcus)菌株列表 所有上表中列出的菌株都能夠在pH7下在PGY類型的培養基中生長。其他適合的 培養基公開在實驗部分中。
應該理解，具有本文證明和發現的性質的其他奇球菌屬菌株，現在可以由專業技 術人員，根據本申請的講述內容，例如通過仿效在實驗部分中描述的指導和試驗，進行篩選 和鑑定。正如上面提到的，在本申請中使用的奇球菌屬菌株可以以天然形式使用，或者可 以被修飾(例如化學或遺傳地)以獲得改進的性質。就此而言，在具體的實施方案中，本發 明使用了通過加速進化，或通過DNA改組技術，或通過插入真核生物、原核生物或合成的非 奇球菌DNA，或通過插入另一種奇球菌菌株DNA而進行修飾的奇球菌細菌，所述修飾影響了 所述細菌的存活力、生長或功能以促進生物質的修飾。在本發明的另一個實施方案中，使用的細菌可以是有利地使用例如在國際專利申 請No. PCT/EP2006/005826中描述的方法重組或修飾的細菌菌株。正如前面討論的，本發明顯示出，在例如D. geothermal i s、耐輻射奇球菌或 D. murrayi中選擇的奇球菌屬細菌或其衍生菌，表現出有利的性質，能夠從各種不同的原料 底物生產生物能產物或代謝物。因此，本發明涉及使用奇球菌屬細菌，從生物質或生物質衍 生物生產生物能產物或代謝物。本發明還涉及通過將所述生物質暴露或培養在存在奇球菌 屬細菌或其提取物的情況下，並回收產生的生物能產物或代謝物，而從生物質或生物質衍 生物生產生物能產物或代謝物的方法。培養或暴露，可以在任何允許生物質或衍生物修飾以產生生物能產物的適合條件 條件或環境下進行。就此而言，方法可以按照需要，在反應器中，在發酵罐中，在戶外，在存 在適合的營養物質或添加劑的情況下進行。方法典型在PH條件，高於40°C的溫度和存在適 合底物的情況下進行。本發明的具體目標在於包括下列步驟的方法a)在好氧和/或厭氧條件下培養和/或生長所述細菌，b)使用含有所述細菌或其提取物的組合物，將生物質或生物質衍生物修飾(例如 轉化或處理)成生物能產物或代謝物，以及c)收集從所述生物質或生物質衍生物的修飾產生的至少一種生物能產物或代謝 物。本發明的另一個目標在於使用至少一種例如上面描述的細菌或細菌提取物或例 如上面描述的組合物，轉化生物質或生物質衍生物的方法，包括下列組合 在適合的生長和發育條件下將所述細菌菌株或所述細菌菌株提取物進行培養和 發育的至少一種操作， 在適合量的所述細菌菌株或所述細菌菌株提取物的作用下，在適合於所述生物 質或生物質衍生物轉化的條件下，轉化生物質或生物質衍生物的至少一種操作，以及 收集至少一種源自於所述生物質或生物質衍生物轉化的生物能產物或代謝物， 特別是收集由此產生的乙醇。在上述方法中，培養和/或生長所述細菌的第一個步驟，和使用含有所述細菌或 其提取物的組合物將生物質或生物質衍生物修飾成生物能產物或代謝物的第二個步驟，可 以同時或相繼地進行；收集生物能產物或代謝物的第三個步驟，可以與第一和/或第二個 步驟同時、或相繼地進行。就此而言，生物質可以與細菌在允許所述細菌擴增的適合條件下 相接觸，從而增加工藝效率。可選地，細菌菌株可以在適合的培養條件下單獨擴增，然後添加到生物質中。應該理解，為了將生物質有效轉化成大量生物能產物或代謝物所最初使用 的細菌的準確量，可以由專業技術人員根據細菌的類型、生物質或衍生物的類型以及培養 條件進行調整。在本發明的方法的具體實施方案中，奇球菌屬細菌獨立於生物質轉化進行生長。在另一個具體實施方案中，方法使用的組合物包含奇球菌屬細菌或其提取物，以 及至少一種適合的添加劑或賦形劑，優選為選自消泡劑和營養劑的至少一種劑。適合的消 泡劑特別是分散劑、去汙劑和表面活性劑，更通常為兩親性化合物。在具體實施方案中，本發明的方法在轉化生物質的反應器中進行。「反應器」是指 常規的發酵罐或任何特別設計用以執行本發明的生物質轉化裝置或系統，因此具體來說包 括生物反應器，生物過濾器，旋轉式生物接觸器，和其他用於處理生物質或生物質衍生物的 氣相和/或液相生物反應器。可用於本發明的裝置可以以連續或分批裝料的方式使用。在反應器中，為了執行本發明的方法，使用了至少一種細菌或細菌提取物，和/或 至少一種例如上面定義的組合物，與此同時，所述反應器的安排和提供使得生理化學條件 在其中建立並維持，使得所述細菌針對所考慮的應用進行工作，並任選使得細菌在其中可 能生長並優選促進生長。在本發明的方法的另一個實施方案中，細菌在轉化生物質或生物質衍生物的過程 中在反應器中生長，同時建立並維持使這種細菌可能生長、優選促進生長的適合生理化學 條件。例如，可以使用500ml錐形瓶(Erlenmeyer)，其中有50°C溫度的100ml 167 Thermus 培養基或下面描述的基本培養基。在本發明的可選實施方案中，生物質或生物質衍生物的轉化在好氧、厭氧或微需 氧條件下進行。根據另一方面，本發明的目標是使用例如上面定義的奇球菌屬細菌或細菌提取 物，或例如上面定義的組合物，用於轉化生物質或生物質衍生物的反應器。本發明的方法可用於從各種不同類型的生物質生產生物能。在優選實施方案中， 生物質包括木材和木材殘餘料，林業殘餘料，製造廠殘餘料，農業作物，農業殘餘料，可食用 和/或不可食用植物或其部分，稻草，園藝殘餘料，水生植物，動物廢料，家畜經營殘餘料， 糞肥，有機城市廢料和/或工業有機廢料。生物質也可包括可生物降解廢物。在具體實施方案中，本發明涉及將生物質或生物質衍生物或中間產物平臺修飾成 生物能產物或代謝物的方法，其中生物質衍生物優選為木質素、纖維素、半纖維素、澱粉，其 中中間產物平臺優選為碳水化合物例如木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘 露聚糖、木葡聚糖、澱粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李 糖、半乳糖和/或果糖。本發明的具體目標在於生產生物燃料的方法。在本發明的環境中，術語「生物燃 料」是指源自於剩餘的或最近死亡的生物碳源的燃料。生物燃料可以從可再生資源，特別是 植物或動物生物質，或從城市和工業廢物生產。本發明的生物燃料包括「第一代生物燃料」 和/或「第二代生物燃料」。第一代生物燃料從植物或動物有機材料，優選從糖、澱粉、植物油或動物脂肪獲 得。用於生產第一代生物燃料的主要來源是可食用植物或其部分。第一代生物燃料包括植 物油、生物柴油、生物醇類、生物氣、合成氣和固體生物燃料。生物醇類包括乙醇、丙醇和丁醇。更優選，本發明的方法用於生產乙醇、丙醇和丁醇。最優選的生物燃料是乙醇。第二代生物燃料優選從不可食用植物或植物的不可食用部分生產。它們包括非糧 食作物，生物質廢物，小麥、玉米的莖稈和木材。優選，本發明的生物燃料包括纖維素生物燃 料。根據起始生物質，生物能產物或代謝物例如生物燃料的生產需要兩個連續的步 驟水解步驟，由酶、優選為纖維素酶或漆酶催化，將長的、複雜的碳水化合物鏈例如纖維素 或木質素分別分解成較小的可發酵糖；以及發酵步驟，該步驟將有機化合物例如糖類進一 步分解成醇類。應該指出，本發明的奇球菌屬菌株可用於任何一個或兩個所述反應。本發 明的確顯示，奇球菌能夠水解長的碳水化合物鏈(例如木聚糖或纖維素)，也能夠從C3、C5 或C6糖產生代謝物(例如乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇，以及乙酸、丙酸、丙酮酸和丁酸)。但 是，應該指出，如果需要，奇球菌屬菌株可以與任何其他細菌菌株組合使用。給出下面的實施例進行說明，而不是限制。
實施例實施例1 詵擇試騎為了確定微生物是否具有本發明所需的性質，必須進行特定的試驗以便確定屬、 種和/或細菌菌株是否能夠具有所需性質，並在轉化生物質或生物質衍生物的方法中發揮 作用，並確定可以由此獲得哪些顯著改進。本發明的這些特定試驗在下述條件下進行培養基D. geothermaliS(D.G.)在50°C和攪拌下培養在好氧培養基中。167培養基用於 維持菌株。基本培養基用於發酵實驗，特別是用於代謝物的表徵。在這種情況下，在用5ml D. G.合生培養物接種後，將500ml培養基在攪拌下在1L錐形瓶中溫育1到7天。167 Thermus 培養基
用naoh調整到ph 7. 2，在121 °c高溫高壓滅菌15分鐘。將 磷酸鹽緩衝液單獨高溫高壓滅菌，添加到培養基中。 磷酸鹽緩衝液 微量元素溶液 基本培養基MOPS 緩衝液
這些儲存溶液為10X濃縮狀態，臨用時稀釋。細菌漆酶活性的檢測原理丁香醛連氮+02——> 氧化的丁香醛連氮+2H20漆酶試劑A. lOOmM磷酸鉀緩衝液，在30°C下pH 6. 5B. 0. 216mM丁香醛連氮(在無水乙醇中配製3ml，丁香醛連氮從Sigma Prod.獲得， No. S-7896)C.酶 在530nm處記錄光密度的增加。
在這些條件下，一單位酶在pH 6. 5和30°C下每分鐘產生0. 001的光密度增加。細菌纖維素酶活件檢測原理測試是基於在纖維素降解過程中跟蹤NAD向NADH的轉化。然後按照供應商的說明書，在340nm處監測吸光度的增加，說明書可以在下列英特網連結上獲得(http://www. sigmaaldrich. com/img/assets/18160/Cellulase. pdf)乙醇牛產的檢測乙醇使用兩種方法進行定量。酶法 該方法基於在存在乙醇和乙醇脫氫酶的情況下跟蹤NAD向NADH的轉化。該反應翻譯成340nm處吸光度的增加。對於該測量來說，按照製造商的說明書使 用了 Sigma N7160試劑盒，說明書可以在下列英特網連結上獲得(http://www. sigmaaldrich. com/sigma/bulletin/N7160BUL. pdf).通過反相高效液相餼譜法測量條件HPLC =Gilson,帶有自動進樣器，通過折射計檢測，柱Phenomenex Rezex R0A, 3OOmmx7. 8mm柱溫65°C流動相0·005Ν硫酸流速0. 600ml/min首先，通過將含有已知濃度乙醇的培養基注入柱子，製作了校正曲線。測量了在 22. 26min處洗脫的對應於乙醇的峰面積。將校正曲線作圖。接下來，通過將培養上清液注射到柱子中測量了由細菌生產的乙醇的量。測量了 在22. 26min處洗脫並對應於乙醇的峰面積。通過與校正曲線的比較推導出上清液中存在 的乙醇的濃度。按照常規的分析和評估方法，可以對可能以不同比例產生的其他代謝物進行檢測 禾口定量。細菌是單倍體生物，通過二分裂繁殖，以環境中提供的礦物質和有機物質為食。它們的氣體、特別是對於氧氣的需求是可變的，使用的培養和發酵技術必須根據 根據它們是嚴格好氧、嚴格厭氧還是兼性好氧_厭氧微生物而進行調整。本發明有利地需要的纖維素酶活性，參與纖維素的降解，同時漆酶活性允許或促 進了木質素的降解。從生物質發酵生產生物能產物例如特別是乙醇和/或其它代謝物，按照操作條件 進行，這些操作條件隨後被調整以適應於反覆測試本發明的條件和技術參數，它們具體來 說是細菌培養基的量，溫度和/或壓力操作條件，以及好氧、厭氧或微需氧發酵的選擇。在上面描述的特定測試和分析後，按照本發明的方法實施選擇的天然或遺傳修飾菌株。實施例2 在存在Deinococcus geothermalis的情況下生產乙醇在含有IOOml處於50°C的基本培養基的500ml錐形瓶中，在50°C下加入IOiq個 D. geothermalis (DG)的接種物。將培養物置於攪拌下以促進通氣。
然後準備該培養物用於常規的生物質發酵罐中，其中在最佳條件下，可以在55°C 下以出色的產率獲得乙醇和其他代謝物。在有待處理生物質的反應器中1到7天後，通過HPLC定量上面提到的乙醇和代謝 物的存在(按照前面描述的方案)。觀察到了葡萄糖的消失和伴隨的乙醇的產生，其濃度通 過分析加以估計。檢測到了其他關注的代謝物。在培養基中用木糖取代葡萄糖也允許細菌 生長和乙醇生產。在本實施例的實施方案的一個變體中，通過在相同的罐中同時進行細菌培養和發 酵，可以獲得類似的結果。實施例3 乙醇和丁醇對Deinococcus geothermalis的殺細菌劑效應材料和方法本方法可以評估有機溶劑對生長或靜止期中的細菌的殺細菌劑效應。測試的溶劑 是乙醇和丁醇。測試的細菌屬於奇球菌屬-在40到70V之間生長-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線，由乾燥，由酶的作用，由超聲或由化學脅迫造成。試驗在測試的菌株的最適生長溫度下進行。從富集培養基中處於靜止期的預培養 物，以ν/ν接種IOml富集培養基。富集培養基含有蛋白腖2g/l，酵母提取物5g/l和 葡萄糖10g/l ；將溶液通過高溫高壓(120°C，20分鐘)進行滅菌。向該溶液中添加下列溶 液M0PS 緩衝液(IOX) pH7 [酸 MOPS 400mM, NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl2 5. 28mM]；微量營養物質(10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 20mM中；K2HPO4 lg/1 ；將溶液過濾(45 μ m)除菌。將200μ 1培養物分配在96孔微孔板上。為了避免任何溶劑蒸發現象，將微孔板
用不透性無菌薄膜覆蓋。一旦達到指數生長期(600nm處光密度為0.5)後或一旦達到靜止期(平臺)後， 加入溶劑。測試的含量是乙醇0到31%，丁醇0到2.5%。然後將培養物在攪拌下溫育1 小時。計數在溫育結束時，對於每種溶劑濃度，將20 μ 1培養物轉移到另一個微孔板 上，並連續稀釋(以1/10連續稀釋9個孔)。稀釋培養基是富集培養基。將5 μ 1每種稀釋 液的三份平行樣鋪設在PGY瓊脂培養基上。蛋白腖5g/l，酵母提取物2. 5g/l，葡萄糖0. 5g/ 1，瓊脂14g/l ；培養基通過在120°C高溫高壓滅菌20分鐘進行滅菌。一旦允許其生長後，對 於被測溶劑的各百分數進行計數，以評估有機溶劑對菌株的影響。MM被我們視為細菌存活力喪失時的溶劑濃度，對應於我們觀察到相對於對照來說損失一個對數時的最低溶劑濃度。從在發酵罐中的工業應用前景來看，測試的菌株(圖1到4)表現出令人滿意的溶 劑耐受性。實施例4 細菌在存在C3、C5和C6碳源情況下的生長
材料與方法預培養在含有蛋白腖(2g/l)、酵母提取物(5g/l)、葡萄糖(10g/l)的培養基A中 或在PGY培養基中進行。在將培養基離心後，將細菌沉澱用基本培養基A洗滌兩次，以消除 所有接種物中的營養物源。用該接種物接種(1/66)含有(w/v)下列碳源之一的培養基 A(200 μ 1) :D(+)葡萄糖，D⑴纖維二糖，蔗糖，澱粉，D⑴木糖，來自樺木的木聚糖，甘油， 丙酮酸鈉。在菌株DRH07、DRH39、DRH08和DRHlO的情況下，將穀氨酸(IOmM)添加到培養基 中。細菌生長在45°C下，在96孔微孔板上，在攪拌下進行，然後使用分光光度計(Chameleon 多標記物檢測平臺板，ScienceTec)在544nm處，或使用spectrostar OMEGA微孔板讀板器 (BMG Labtech)在600nm處測量光密度。使用的碳源參比物來自樺木的木聚糖(95588，Fluka)，纖維二糖(22150， Fluka)，D (+)木糖(95730，Fluka)，葡萄糖(G8270-1KG，Sigma)，蔗糖(S9378-1KG，Sigma)， 澱粉(S9765-500G, Sigma)，甘油(453752，CarloErba)，丙酮酸鈉(Sigma)。培養基的組成和製備PGY培養基蛋白腖(10g/l)，葡萄糖(lg/Ι)，酵母提取物(5g/l)，將混合物在 120°C高溫高壓滅菌20分鐘。培養基A 用於製備培養基A的各種不同溶液從過濾除菌的儲液製備-溶液(pH7)，含有酸MOPS 緩衝液 40mM，NH4Cl 20mM, KOH 1 OmM, NaOH IOmMjCaCl2 0· 5 μ M，Na2SO4 0. 276mM, MgCl2O. 528mM。-微量營養物溶液(pH5): (NH4)6(MO7)O24 3nM，H3BO3 400nM, CoCl2 30nM, CuSO4 IOnM,MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM0-維生素溶液，pH4，(每種lyg/l):D-生物素，煙酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl， 維生素B12。-磷酸源=K2HPO45. 7mM。-FeCl3 20 μ M (製備在檸檬酸鈉溶液中，然後過濾)。MM表2 (下文)中列出的細菌能夠在含有C6糖類例如葡萄糖、蔗糖、纖維二糖和澱粉 作為唯一碳源的基本培養基(培養基Α)中繁殖。應該指出，菌株DRH37和DRH06也能夠在 存在甘油和丙酮酸鈉(C3碳水化合物)的情況下生長。表3中列出的細菌也能夠在含有C5糖類(木糖或木聚糖)作為唯一碳源的基本 培養基中繁殖；例外是菌株DRH06和DRH07，它們分別不能在存在木聚糖和木糖的情況下生 長。表2 在各種不同的D. geothermalis和D.murrayi菌種上進行的各種不同C6和C3 碳源的同化試驗-ΔΟ 0. 4 ；+++0. 4 彡 Δ OD 彡 0. 5 ； ++++ Δ OD彡0. 6。Δ OD對應於在生長起始時間TO和時間Τ196小時(大約8天)544nm處 OD值之間的差值。
D. geothermalisD. murrayi1% (w/v)碳源 DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39 DRH08 DRHlO單一 C6碳水化合物D_(+)_ 葡萄糖 +++ + ++ ++ +++ +++ + +D_(+)_ 纖維二糖 ++ - +++ +++ ++ +++ ++ -蔴糖+++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ -澱粉+++ ++ ++ ++ +++ - ++ -單一 C3碳水化合物甘油- --++----丙酮酸鈉_+______表3 在各種不同的D. geothermalis菌種上進行的各種不同C5和C6碳源的 同化試驗-Δ OD 0. 4 ；+++0. 4 ^ Δ OD ^ 0. 5 ； ++++ Δ OD彡0. 6。Δ OD對應於在生長起始時間TO和時間Τ64小時(大約2. 5天)600nm處 OD值之間的差值。1% (w/v)碳源 DRH05 DRH06 DRH07 DRH37 DRH38 DRH39D_(+)_ 葡萄糖 +++ ++ + ++++ +++ +++木聚糖+++ -+++++ ++++ ++++木糖+++ +++ -++++ +++ +實施例5 細菌在高乙醇濃度中的生長材料與方法本方法能夠評估微生物在存在高濃度乙醇的情況下生長的能力。測試的細菌屬於 Deinococcus geothermalis 菌禾中-在40到70V之間生長-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線，由乾燥，由酶的作用，由超聲或由化學脅迫造成。試驗在測試的菌株的最適生長溫度下進行。對於每種待測試的乙醇含量，從富集 培養基中處於靜止期的預培養物，以ν/ν接種20ml富集培養基。富集培養基含有蛋 白腖2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l ；將溶液通過高溫高壓(120°C，20分鐘)進 行滅菌。向該溶液中添加下列溶液=MOPS緩衝液(10X)pH7[酸MOPS緩衝液400mM，NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2S042. 76mM, MgCl2 5. 28mM]；微量營養物質 (10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3BO3 4mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 2OmM 中；K2HPO4 lg/1 ；將溶液過濾(45 μ m)除菌。在TO時加入乙醇，含量在0到31%之間不等。對於每種測試的乙醇含量進行生長 的跟蹤。使用分光光度計(uv Light XS5,SEC0MAM)在600nm處讀取0D。在下列時間取出 Iml 等份培養物:T0, Τ0+1Η, Τ0+3Η, Τ0+18Η, Τ0+20Η, Τ0+22Η, Τ0+24Η。當必須讀數時，將培養物在富集培養基中稀釋十倍。對於每種測試的乙醇含量可以畫出生長曲線。在溫育期結束時，對於每種測試的乙醇含量，進行計數以評估乙醇對菌株 的影響。結果測試的某些菌株，例如Deinococcus geothermalis DSM11300，能夠在含有乙 醇的 培養基中生長(參見圖5)。某些菌株，例如Deinococcusgeothermalis DSM11300，在具有 高乙醇含量的培養基中顯示出抗性(參見圖6A)。實施例6 通過Deinococcus murrayi生產目的代謝物材料與方法本方法能夠評價微生物從生物質或生物質衍生物生產重要代謝物(由甘油，丁二 醇，丙二醇和乙酸，丙酸，丙酮酸和丁酸組成)的能力。IH式的細菌屬於 Deinococcus geothermalis 菌禾中-在40到70V之間生長-在pH3到pH9.5之間工作-能夠全部或部分地重新裝配它們的基因組裂口，這些裂口由脅迫、尤其是輻射、 特別是UV或、射線，由乾燥，由酶的作用，由超聲或由化學脅迫造成。試驗在測試的菌株的最適生長溫度下進行。從在富集培養基中製備的預培養物 (處於靜止期)，接種20ml富集培養基以1 % ν/ν接種。富集培養基含有蛋白腖2g/l，酵母提取物5g/l和葡萄糖10g/l ；將溶液通過 高溫高壓(120°C，20分鐘)進行滅菌。向該溶液中添加下列溶液MOPS緩衝液(IOX) pH7 [酸 MOPS 400mM, NH4Cl 200mM, NaOH IOOOmM, KOH IOOmM, CaCl2 5 μ Μ, Na2SO4 2. 76mM, MgCl25. 28mM]；微量營養物質(10000X) [ (NH4) 6 (Mo7) O24 300mM, H3B034mM, CoCl2 0. 3mM, CuSO4 0. ImM, MnCl2 2. 5mM, ZnSO4 0. ImM] ；FeCl3 (100X) 20mM，在 C6H5Na3O7 2OmM 中；K2HP04 lg/1 ； 將溶液過濾(45 μ m)除菌。將培養物在45°C下，在攪拌下留在培養箱中，直到它達到其靜止期。一旦靜止期達 到後，將培養物以4000rpm離心10分鐘。將上清液倒入另一個管中，置於-80°C下。HPLC UV分析和折射計(離子交換柱(H+) Biorad,流動相H2S045mM，流動相流速0. 6ml/min,等強 度狀態)能夠鑑定目的代謝物。MM測試的某些菌株產生了某些尋找的目的代謝物(表4)。表4 由 Deinococcus murrayi DSMl 1305 產生的代謝物(以 g/Ι 表示) 材料與方法菌株在不同pH下的PGY培養基中在45°C下培養。pH使用NH3 10% (ν/ν)或HCl ION調整。通過使用spectrostar微孔板讀板器0MEGA，BMG Labtech，在600nm處測量光密 度，來追蹤生長。MM
四株菌株(D. geothermalis)能夠在5到8之間的pH範圍內繁殖(參見圖6A、6B、 6C 禾口 6D)。實施例8 從自然環境分離UV抗性嗜熱細菌熱水樣品的處理將熱水樣品通過經0. 22 μ m硝酸纖維素濾器(Millipore，France)過濾來進行濃 縮，然後懸浮在IOml無菌水中。然後將過濾過的溶液超聲大約60秒，以重新懸浮細菌。木材和卵石樣品的處理將木材和卵石樣品浸泡在無菌水中，然後渦旋並超聲大約60秒。石頭、苔蘚、地衣、泥、沉積物、生物膜、土壤和動物排洩物樣品的處理將苔蘚、地衣、泥、土壤和動物排洩物樣品在無菌水中懸浮(V/V)，然後渦旋。然後 將樣品超聲大約60秒。分離UV抗性嗜熱細菌在超聲後，將500 μ 1到2ml之間的懸液鋪於高溫高壓滅菌(120°C20分鐘)的固體 PGY瓊脂富集培養基上，培養基含有葡萄糖(Sigma-Aldrich，France)lg/l，蛋白腖(Fluka， France) 10g/l和酵母提取物(Fluka，France) 5g/L·然後將接種的培養基使用4mJ/cm2的 BLX-E254 biolink(Vilber-Lourmat, France)進行3次UV處理，每次進行的時間間隔為4 小時。在45°C溫育3到4天後，可以看見目的嗜熱菌落。實施例9通過 Deinococcus cellulosilyticus消化纖維素材料與方法D. cellulosilyticus菌株的預培養在富集培養基(組成參見下文)中進行。該預 培養物用於將IOml富集培養基接種(1% ν/ν)到含有羧甲基纖維素(CM-纖維素)的基本 培養基，或不含碳源的該同樣的培養基中。細菌的生長在30°C下，在50ml Falcon管中，在攪拌下(IlOrpm)進行，通過使用分 光光度計(WPA Biowave，細胞密度計)在600nm處測量光密度來跟蹤。富集培養基蛋白腖2g/l ；酵母提取物5g/l ；葡萄糖10g/l ；含有下列物質的溶液 (pH7)酸 MOPS 40mM, NH4Cl 20mM, KOH IOmM, NaOH IOmM, CaCl2 0. 5 μ Μ, Na2SO4 0. 276mM, MgCl2 0. 528mM ；微量營養物溶液(pH5) (NH4) 6 (Mo7) O24 3nM, H3BO3 400nM, CoCl230nM, CuSO4 10nM，MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM ；維生素溶液，pH4(各 1 μ g/1) :D-生物素，煙酸，吡哆 醛-HCl，硫胺素-HCl，維生素 B12 ；磷酸源=K2HPO4 5. 7mM ；FeCl3 20 μ M0基本培養基含有下列物質的溶液(PH7) :M0PS酸40mM，MjCl 2OmM，KOH IOmM, NaOH IOmM, CaCl2 0. 5 μ Μ, Na2SO4 0. 276mM, MgCl2 0. 528mM ；微量營養物溶液(pH5) (NH4) 6 (Mo7) O24 3nM，H3BO3 400nM, CoCl2 30nM, CuSO4 IOnM, MnCl2 250nM, ZnSO4 IOnM ；維生 素溶液，pH4(各lyg/l) :D-生物素，煙酸，吡哆醛-HCl，硫胺素-HCl，維生素B12 ；磷酸源 K2HPO4 5. 7mM ；FeCl3 20 μ Μ。結果證明7 DSMZ 引用號為 DSM 18568T (ffeon 等，2007)的 D. cellulosilyticus 菌 株具有 CM-纖維素活性(Weon 等，2007，international journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,57,1685-1688.)。如圖7中所示，D. cellulosilyticus能夠在含有CM-纖維素作為唯一碳源的培養基中繁殖；在該培養基中生長10 天后，eoonm處光密度的變化(ADO6tltlnm = O. 5)與 對照培養物(不含碳源的培養基；(ADO6tltlnm = O. 18))相比是顯著的。該結果表明， D. cellulosilyticus不僅能夠降解(解聚)CM-纖維素，而且能夠同化從該降解產生的產物 (纖維二糖和葡萄糖)。
權利要求
生產生物能產物或代謝物的方法，包括將生物質或生物質衍生物接觸奇球菌屬(Deinococcus)細菌或在由脅迫造成破壞時具有完全或部分地重新裝配其基因組的能力的細菌，或其提取物。
2.權利要求1的方法，包括下列步驟a)在好氧和/或厭氧條件下培養和/或生長所述細菌，b)使用含有所述細菌或其提取物的組合物，將生物質或生物質衍生物修飾成生物能產 物或代謝物，以及c)收集從所述生物質或生物質衍生物的修飾產生的至少一種生物能產物或代謝物。
3.權利要求2的方法，其中步驟a)、b)和c)同時或相繼進行。
4.前述權利要求任一項的方法，其中細菌是奇球菌屬細菌。
5.前述權利要求任一項的方法，其中生物質是有機物質，優選為木材和木材殘餘料，林 業殘餘料，製造廠殘餘料，農業作物，農業殘餘料，可食用和/或不可食用植物或其部分，稻 草，園藝廢料，水生植物，動物廢料，家畜經營殘餘料，糞肥，有機城市廢料和/或工業有機 廢料。
6.前述權利要求任一項的方法，其中生物質衍生物是植物性生物質衍生物，優選為木 質素、纖維素、半纖維素、木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚 糖、澱粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和/ 或果糖。
7.前述權利要求任一項的方法，其中所述細菌在存在毒性劑，特別是存在有機溶劑例 如乙醇的情況下是可存活的。
8.前述權利要求任一項的方法，其中所述細菌在從大約40到70°C，優選從50°C到 60°C的溫度範圍內生長。
9.前述權利要求任一項的方法，其中所述細菌在大約3到9.5，優選4到8之間的pH 範圍內是能存活的或使用。
10.前述權利要求任一項的方法，其中所述奇球菌屬細菌能夠轉化C6和/或C5糖類， 和/或促進纖維素的消化以產生葡萄糖，和/或促進半纖維素的消化以產生木糖。
11.前述權利要求任一項的方法，其中所述細菌選自奇球菌屬菌種，優選自 Deinococcus geothermalis、耐福身寸奇球菌(Deinococcusradiodurans)、Deinococcus murrayi 禾口 Deinococcus cellulosilyticus。
12.權利要求11的方法，其中所述細菌選自保藏號為DSM11300、DSM11301、 DSM11302、HAMBI2480、HAMBI2481、HAMBI2411 的 Deinococcus geothermalis 菌株，或 保藏號為 DSM11303、DSM11305 的 Deinococcus murrayi 菌株，或保藏號為 DSM185681 的 Deinococcuscellulosilyticus菌株，或基本上與其相似的菌株或其突變株。
13.權利要求2-12的方法，其中所述組合物還包含一種或多種消泡劑和/或營養劑。
14.前述權利要求任一項的方法，其中所述細菌通過加速進化，或通過DNA改組技術， 或通過插入真核生物、原核生物或合成的非奇球菌DNA，或通過插入另一種奇球菌菌株DNA 而進行修飾，所述修飾影響所述細菌的存活力、生長或功能，以便促進生物質的修飾。
15.前述權利要求任一項的方法，其中使用轉化生物質的反應器。
16.前述權利要求任一項的方法，用於生產生物燃料，例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇或丙二醇。
17.權利要求1到15任一項的方法，用於生產化學上重要的有機酸，例如乙酸、丙酸、丙 酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸。
18.奇球菌屬的細菌或其提取物在從生物質或生物質衍生物生產生物能產物或代謝物 中的應用。
全文摘要
本發明涉及生產生物能的組合物和方法。更具體來說，本發明涉及使用奇球菌屬(Deinococcus)和/或相關屬的細菌進行生物質或生物質衍生物修飾，以生產生物能產物和代謝物。
文檔編號C12N1/00GK101861395SQ200880116274
公開日2010年10月13日 申請日期2008年11月14日 優先權日2007年11月14日
發明者伊萬·馬蒂科, 讓-保羅·萊奧內蒂 申請人:德諾芙公司;法國國家科學研究中心