重組穿孔素、其表達和用途的製作方法

2023-10-21 11:53:02

專利名稱：重組穿孔素、其表達和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠在細胞中驅動穿孔素表達的逆轉錄病毒載體和在細胞中表達重組穿孔素的方法。本發明也涉及從其衍生而來的重組穿孔素多肽和核酸分子及其用途。還包括使用該重組穿孔素分子的篩選測定法、由該篩選測定法鑑定的化合物及其用途。
背景穿孔素，由細胞例如細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)分泌的膜破壞性蛋白，是通過顆粒胞吐途徑而被靶向毀滅的被病毒感染或轉化的細胞的死亡所必要的。許多研究已顯示缺少穿孔素的動物或人受到嚴重的免疫抑制。例如，兩個穿孔素等位基因都被靶向破壞的小鼠明顯地對許多病毒和其他細胞內病原體例如單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)易感。在這些動物中也缺乏對許多實驗性腫瘤的排斥，轉移性擴散的可能性也常常提高。此外，超過50％的穿孔素缺乏性動物隨著年齡增長產生出自發性的、高度侵襲性的B淋巴瘤，表明腫瘤免疫監視(tumour immunesurveillance)的喪失。在這些動物中產生的腫瘤可容易地移植入穿孔素缺乏性接受者中，但卻被同系的(syngeneic)具有免疫能力的動物強烈排斥。
在CTL中，穿孔素從具有粒酶的分泌性顆粒(granule)中釋放出來，粒酶屬於具有促細胞凋亡活性(pro-apoptotic activity)的絲氨酸蛋白酶家族。和穿孔素相反，在粒酶中存在相當多的功能豐餘性，儘管其具有明顯不同的蛋白水解特異性。例如，粒酶A和B都有缺陷的小鼠只對選擇的病毒例如脫腳病病毒具有異常的敏感性，但能夠排斥許多在穿孔素缺乏性小鼠中自發產生的實驗性腫瘤和淋巴瘤。總之，可以猜測穿孔素是所有顆粒介導的病毒和腫瘤免疫以及免疫穩態(immune homeostasis)不可缺少的唯一顆粒組分。
在人中，穿孔素缺乏的綜合症狀只有近年來才得以描述，因為已顯示大約30％的表現罕見的常染色體隱性疾病家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis)(FHL)的兒童在其兩個穿孔素等位基因上都攜帶突變。FHL是噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH)的一種亞型，所述HLH還包括各種相關的偶然發生的無已知家族基礎的免疫缺陷疾病。HLH和FHL的特徵一般在於被活化的T淋巴細胞和巨噬細胞(組織細胞)在肝臟、脾臟、淋巴結和中樞神經系統中的大量和逐漸積累，然後導致紅細胞和其他血細胞的吞噬作用。
這些兒童的細胞毒性細胞，特別是CTL，不能提供通過所述顆粒途徑的對靶細胞的致命打擊。因此，有缺陷的淋巴細胞不能清除抗原呈遞細胞，導致巨噬細胞的不受控制的活化和積累以及炎性細胞因子的過量產生，表現為發燒，肝和脾的腫大，以及脾、肝和骨髓中的吞噬血細胞作用的臨床綜合症狀。在組織學上，這些患者中的CTL和NK細胞一般表現出其裂解性顆粒(lytic granules)中的免疫反應性穿孔素的顯著減少，這可以反映穿孔素蛋白的不穩定性，或增加的響應免疫攻擊而引起的穿孔素的轉化。總之，在HLH或FHL中的臨床和病理學發現使人聯想起病毒特異性T細胞和抗原呈遞細胞的增加的擴增，以及在感染了病原體例如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒的穿孔素缺乏性小鼠中見到的不能下調免疫應答。
儘管其明顯的重要性，但在分子和細胞水平上穿孔素的功能仍然很不清楚。由於純化的穿孔素不能誘導凋亡，因此認為其關鍵性作用涉及將粒酶精確地靶向靶細胞的細胞溶膠中，在那裡其蛋白水解活性誘導細胞的凋亡程序。粒酶B，最強的促細胞凋亡的粒酶，通過在特異的天冬氨酸殘基之後切割底物(Asp-ase活性)來模擬胱天蛋白酶的活性。Bid，Bcl-2家族的促細胞凋亡的成員，是粒酶B的特別重要的底物，因為截短的Bid可通過激活內源性細胞凋亡途徑而引起細胞死亡，該途徑集中於線粒體瓦解。粒酶A在鹼性殘基之後進行切割和誘導不依賴於胱天蛋白酶的DNA鏈切刻(nicking)，儘管已顯示小鼠粒酶C可直接破壞線粒體的功能。以高濃度單獨地使用純化的穿孔素也可誘導靶細胞裂解，並且這種形式的細胞死亡也在一些生理相關條件下發生。
在分子水平上，很少了解穿孔素是如何發揮其功能的。據預測，穿孔素的羧基末端和突觸結合蛋白家族的蛋白質的羧基末端非常相似，該家族的一些成員在神經元突觸中參與囊泡運輸(vesiculartrafficking)。一個漂亮的研究已產生了這樣的證據，即在穿孔素的生物合成期間，其在靠近其羧基末端的部位被未知的蛋白酶切割，從而釋放出附著有巨大的N聯聚糖的短肽。預測該短肽使得可在該羧基末端結合鈣和脂質，從而使穿孔素能夠在CTL脫粒後插入靶細胞膜中。在發生鈣依賴性構象變化後，認為殘基210至245形成允許膜插入的兩親性螺旋結構，儘管還不清楚和表皮生長因子受體的富含半胱氨酸的結構域(殘基375至410)相似的另一個區域的功能。對應於氨基末端的合成肽也已顯示具有一些內源的裂解能力。然而，未檢測該觀測結果的生理學相關性。
因此，雖然其在針對病毒和被轉化的細胞的免疫應答中有至關重要的重要性，並且儘管在超過15年以前獨立地克隆了鼠和人cDNA，但在分子和細胞水平上對穿孔素的功能仍然了解不多。該缺乏顯著進展的狀況主要歸因於缺乏用於進一步研究目的的能夠合成和貯存該毒性蛋白的細胞系。
在廣泛的研究學科(research disciplines)中，培養的細胞系的用途已極大地促進了對蛋白功能的研究。穿孔素的固有細胞毒性已產生了這樣的特殊需要，即需要鑑定具備合適的自我保護手段以表達穿孔素而不破壞細胞器的細胞，所述蛋白在該細胞中被合成、運輸和隨後貯存。這樣的細胞系的缺乏已成為穿孔素結構-功能研究的主要障礙。許多嘗試(大多數是不成功的)涉及使用細菌表達系統來合成穿孔素。由於溶解度問題，在杆狀病毒感染的昆蟲細胞中進行穿孔素的表達不可靠，從而該方法未被廣泛使用。因此，穿孔素分子的突變分析從未被描述過。
在查看文獻後，逐漸明了的是，過去少數細胞曾經成功地用於穿孔素的表達。很明顯，CTL和NK細胞是能夠進行穿孔素合成的理想細胞，然而很少有這樣的細胞系進行過培養。淋巴細胞生物學領域內的研究人員已採取使用剛分離的淋巴細胞、培養的淋巴細胞腫瘤或通過導入癌基因而永生化的少數細胞毒性細胞系。在每種情況下，缺點是在這些細胞中存在內源穿孔素，其使穿孔素的結構/功能研究複雜化。以前已顯示，人穿孔素在小鼠CTL細胞系CTLL-R8中的表達幹擾內源穿孔素的功能，這導致被轉染的細胞系的減少的細胞毒性。理想地，結構/功能研究要求缺乏穿孔素表達的細胞系，但在該細胞系中，可能要重新導入穿孔素(野生型或突變的)。
本發明克服了，或至少緩解了一些現有技術的上述問題，並且這樣做之後，提供了更有效和更合適的在細胞中重組地表達穿孔素或其片段或變體的方法。
對於在本說明書中包含的文獻、做法、材料、設備、物品等的討論僅是為了提供本發明的背景。並不暗示或代表這些資料中的任何一種或全部形成現有技術基礎的一部分或者是在與本發明相關的領域內的公知常識，因為其在本申請的每一項權利要求的優先權日之前已在澳大利亞存在。
發明概述逆轉錄病毒載體，該載體能夠驅動穿孔素分子或其片段或變體在用所述載體轉染的宿主細胞中表達。
在本發明的另一方面，提供了能夠產生逆轉錄病毒顆粒的包裝細胞，所述逆轉錄病毒顆粒攜帶能夠驅動穿孔素或其片段或變體在細胞中表達的逆轉錄病毒載體。
在本發明的另一方面，提供了攜帶逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒顆粒，所述逆轉錄病毒載體能夠驅動穿孔素或其片段或變體在細胞中的表達。
在本發明的另一方面，提供了用逆轉錄病毒載體轉染的宿主細胞或細胞系，所述逆轉錄病毒載體能夠驅動穿孔素或其片段或變體在所述細胞中的重組表達。
在本發明的另一方面，提供了在細胞中表達穿孔素或其片段或變體的方法，所述方法包括用能夠驅動所述穿孔素或其片段或變體在所述細胞中表達的逆轉錄病毒載體轉染細胞。
在另一方面，本發明提供了由此處描述的方法產生的重組穿孔素分子或其片段或變體。
鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的表達的化合物的方法，所述方法包括步驟提供用本發明的逆轉錄病毒載體轉染的細胞，所述逆轉錄病毒載體能夠驅動穿孔素或其片段或變體在所述細胞中表達；將所述細胞暴露於受試化合物；和確定所述受試化合物是否調節穿孔素分子或其片段或變體在所述細胞中的表達。
鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的活性的化合物的方法，所述方法包括步驟提供根據此處描述的本發明方法製備的分離的穿孔素分子或其分離的片段或變體；將所述分離的穿孔素分子或其分離的片段或變體暴露於受試化合物和靶細胞；和確定所述受試化合物是否調節穿孔素分子或其片段或變體對靶細胞的活性。
鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的活性的化合物的方法，所述方法包括步驟提供根據此處描述的本發明方法的表達穿孔素分子或其片段或變體的細胞；
將所述細胞暴露於受試化合物和靶細胞；和確定受試化合物是否調節穿孔素分子或其片段或變體對靶細胞的活性。
在本發明的另一方面，提供了通過此處描述的篩選測定法鑑定的化合物。
在本發明的另一個方面，提供了藥物組合物，該藥物組合物包含此處描述的重組穿孔素分子，和/或通過此處描述的篩選測定法鑑定的激動劑或拮抗劑化合物，以及藥學上可接受的媒介物(carrier)、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。
在本發明的另一方面，提供了治療受試者的預防性或治療性方法，所述受試者具有患與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病的風險或對所述疾病易感，或者患有所述疾病。
附1圖解說明了人穿孔素的一級胺基酸序列和cDNA序列，顯示了由在序列下面的彩色圖例所標示的推定的穿孔素功能結構域。右邊的數字表示從Met1起始密碼子開始的核苷酸(小字體)和胺基酸(大字體)的編號。還描述了到目前為止在FHL疾病中鑑定的一些穿孔素基因突變。錯義突變顯示於實心的紅色圓圈中，而移碼突變或無義突變顯示於空心圓圈中。
圖2顯示用於在RBL細胞中表達小鼠穿孔素和證實其細胞毒性功能的方法的簡介。
圖3顯示鼠類幹細胞質粒載體(MSCV)的示意圖。編碼小鼠穿孔素的cDNA被插入至多位點接頭區域的EcoRI和XhoI位點中。該雙順反於質粒包含驅動目的基因、GFP cDNA和IRES表達的兼嗜性MSCV 5′長LTR，IRES允許從一條mRNA轉錄物上翻譯GFP和第二目的蛋白。GFP的自主表達使得能夠快速選擇期望表達目的轉基因的經轉導的細胞。
圖4顯示效應器RBL細胞至EL-4靶細胞的IgE-依賴性交聯的示意圖。通過抗TNP IgE抗體將RBL細胞表面的Fcε受體和TNP標記的EL-4靶細胞膠聯引發RBL細胞胞吐其顆粒內容物。
圖5圖解說明在用MSCV或MSCV-Pfp質粒DNA轉染的293T細胞中，GFP表達水平的流式細胞術分析。將空的MSCV載體(上圖)或包含WT穿孔素cDNA的MSCV(下圖)和兼嗜性輔助質粒一起共轉染入293T包裝細胞中，以產生高滴度的病毒上清液。藍色實線表示單獨用所述輔助質粒轉染的293T細胞的基線螢光。
圖6顯示在用從293T包裝細胞獲得的病毒上清液轉導後，RBL細胞中的GFP表達的流式細胞術分析。A)用編碼MSCV載體或包含穿孔素cDNA的MSCV的病毒上清液轉導RBL細胞，3天後就GFP的表達分析所述細胞。分離少量(0.2至2.0％)表達明顯高於背景(M1 gate)的螢光的細胞，擴增所述細胞，產生下圖中的群體。B)和未轉導的RBL細胞(實線)相比，擴增基於GFP轉基因的高水平表達而分離的RBL細胞以產生這樣的群體，即在該群體中超過90％的細胞正在表達GFP。
圖7顯示通過Western印跡法顯示的穿孔素在RBL細胞中的表達。用大鼠抗小鼠穿孔素單克隆抗體(mAb)，P1-8來探測未轉導的、空載體-轉導的(MSCV)或穿孔素-轉導的(MSCV-Pfp)的RBL細胞的全部細胞裂解產物。左邊的標記表示蛋白大小標誌物的遷移。
圖8圖解說明使用抗TNP IgE的RBL細胞的表面標記的流式細胞術分析。A)用許多不同的稀釋度(1/2、1/20、1/50、1/100)的抗TNPIgE抗體標記RBL細胞以確定用於表面標記的最適宜濃度。通過和第二種生物素-綴合的抗小鼠IgE抗體溫育，然後和鏈黴親和素PerCP溫育，經流式細胞術進行分析，來檢測結合。B)在37℃或4℃下用抗TNP IgE抗體溫育RBL細胞15或60分鐘，以確定對於最大結合的最適宜條件。
圖9顯示在4小時51Cr釋放測定法中檢測到的表達穿孔素的RBL細胞對EL-4靶細胞的細胞毒性功能。用抗TNP IgE抗體標記對於穿孔素表達經重構的RBL細胞，並將所述細胞與用51Cr預載的TNP標記的EL-4細胞綴合。作為負對照，在缺少交聯性IgE抗體或TNP的情況下進行所述測定法。將用空MSCV載體轉導的RBL細胞用作RBL毒性的基礎量度。以一系列效應器細胞靶細胞比率溫育所有細胞。數據點表示以三次重複進行的測定的平均值(+/-標準誤差)。


圖10顯示穿孔素在用MSCV-Pfp轉導的RBL群體中的表達。將4個獨立的、產生高滴度的病毒上清液的293T轉染物用於產生表達MSCV-Pfp的RBL細胞。通過用單克隆抗穿孔素抗體，P1-8進行探測，就穿孔素蛋白的表達對基於GFP轉基因的高水平表達而分離的細胞進行分析。還用作為蛋白上樣(protein loading)的指示劑的抗微管蛋白抗體探測膜。
圖11顯示在4小時51Cr釋放測定法中測量的表達MSCV-Pfp的獨立的RBL細胞系的細胞毒性功能。用裝載有51Cr的EL-4靶細胞以一系列效應器-靶細胞比率溫育4個獨立的表達MSCV-Pfp的RBL群體。通過使用能夠識別靶細胞上的表面TNP的抗TNP IgE抗體引發效應細胞脫粒。為進行測定，將用空MSCV載體轉導的RBL細胞用作RBL毒性的基礎量度。數據點是三次重複測定的平均值+/-標準誤差。該測定代表6個實驗。
圖12顯示小鼠穿孔素蛋白的示意圖。顯示了在FHL中鑑定的許多錯義突變中的兩個突變。將整合了患者5(P5＝G429E)和患者6(P6＝P345L)的胺基酸取代的穿孔素分子的cDNA亞克隆入MSCV載體中。還顯示了推定的兩親性α螺旋、富含半胱氨酸的EGF-樣結構域和C2磷脂結合結構域。數字表示被編號的穿孔素的殘基，包括21個胺基酸的前導序列。
圖13顯示在用P5-Pfp和P6-Pfp cDNA轉染的293T細胞中的GFP表達水平的流式細胞術分析。將編碼P5-Pfp和P6-Pfp cDNAs的MSCVDNA構建體與兼嗜性輔助質粒一起共轉染入239T包裝細胞中，以產生高滴度的病毒上清液。藍色實線表示單獨用輔助質粒轉染的293T細胞的基礎螢光。
圖14顯示用從293T包裝細胞轉染物中獲得的病毒上清液轉導的RBL細胞中的GFP的表達。用編碼P5-Pfp和P6-Pfp cDNAs的MSCV病毒上清液轉導RBL細胞。分離表達高水平的轉基因的細胞，並將其擴增以產生綠色實線標示的群體。用以紫色充填的剖面圖(profile)顯示未轉導的親本RBL細胞的基礎螢光。
圖15顯示通過Western印跡法檢測的RBL細胞中的穿孔素的表達。通過使用單克隆抗小鼠穿孔素抗體進行免疫印跡法，就穿孔素的表達來分析用WT-Pfp、P5-Pfp、P6-Pfp或空MSCV載體轉導的RBL的裂解產物。針對微管蛋白再次檢測膜以確保等量的蛋白上樣。
圖16顯示用於測量表達WT或突變的穿孔素的RBL細胞的功能的4小時51Cr釋放細胞毒性測定法。在4小時51Cr釋放測定法中分析表達WT或突變的穿孔素(P5-Pfp或P6-Pfp)的RBL細胞殺死TNP-標記的EL-4細胞的能力。將用空MSCV載體轉導的RBL細胞在所述測定法中用作負對照。
圖17顯示從RBL細胞分離胞質顆粒。A)通過破裂的表達WT-Pfp、P5-Pfp、P6-Pfp或空載體的RBL細胞的密度梯度分級來分級顆粒。通過使用單克隆抗穿孔素抗體P1-8的Western印跡法，就穿孔素的存在對梯度級分進行分析。B)顯示在A)中顯示的梯度級分中的β-氨基己糖苷酶的活性。
圖18顯示RBL顆粒中的穿孔素的免疫組織化學檢測。使用抗穿孔素mAb，P1-8就它們的穿孔素的含量對表達空載體(MSCV)、WT-Pfp或突變的穿孔素(P5-pfp和P6-Pfp)的RBL細胞進行染色。使用生物素化的二抗、過氧化物酶標記的鏈黴親和素和在抗原部位導致棕色沉澱的底物色素原來檢測該信號。在放大倍率下還觀察到所有被轉導的RBL細胞內的顆粒。表達WT-Pfp的代表性RBL細胞顯示在更高倍數(power)下觀察到的典型染色。染色代表了來自在分開的三天進行的實驗的5個視野。
圖19顯示Jurkat細胞被從RBL細胞分離的顆粒裂解，如在4小時51Cr釋放測定法中所測定的。A)用從WT-Pfp和空MSCV轉導的RBL細胞分離的顆粒溫育Jurkat細胞。所述測定使用系列稀釋的所述顆粒，並在加入或不加入EGTA的情況下進行。B)用從WT-Pfp RBL細胞分離的顆粒溫育Jurkat細胞，並將其與從P5-Pfp和P6-Pfp RBL細胞分離的顆粒的功能進行比較。數據點是三次重複測定的平均值+/-標準誤差。所述測定是3個這樣的實驗的代表。
圖20顯示紅細胞被從RBL細胞分離的顆粒裂解，如通過血紅蛋白釋放所檢測的。將從表達WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp的RBL細胞分離的顆粒和紅細胞溫育30分鐘並測量血紅蛋白的釋放。還在EGTA存在的情況下和用空MSCV轉導的RBL顆粒進行該測定。
圖21顯示通過穿孔素的免疫組織化學染色檢測的RBL細胞的脫粒。用抗TNP IgE抗體標記用WT-Pfp或突變的穿孔素(P5-Pfp和6-Pfp)轉導的RBL細胞，並在TNP-標記的EL-4細胞存在或不存在的情況下溫育所述細胞以刺激所述RBL細胞脫粒。然後就它們的穿孔素的含量，使用抗穿孔素mAb，P1-8對所有細胞進行染色。使用生物素化的二抗、過氧化物酶標記的鏈黴親和素和在抗原部位產生棕色沉澱的底物色素原來檢測該信號。將用空MSCV轉導的RBL細胞用作穿孔素染色的負對照。染色代表來自在分開的三天進行的實驗的5個視野。
圖22顯示在RBL細胞中表達的T224W小鼠穿孔素的減少的細胞毒性活性和其截短。顯示了來自TNP-標記的Jurkat細胞的穿孔素依賴性51Cr釋放，該Jurkat細胞在抗TNP IgE存在的情況下和瞬時轉染的、分選的RBL細胞共溫育4小時。數據點表示三個重複樣品的平均值±SD，其代表三個相似的測定。Western印跡(右邊)顯示，在兩個獨立轉染實驗(T224W-1和T224W-2)中表達的T224W穿孔素的截短(與WT和T224R穿孔素相比)。
圖23顯示T224W和G428E穿孔素在RBL細胞中的不同定位。(A)用抗穿孔素抗體PI-8展示和用曙紅復染的、表達穿孔素的RBL細胞的免疫組織化學。(B)在通過和TNP-標記的靶細胞短暫溫育而誘導脫粒後，如(A)中那樣對未標記或用抗TNP IgE標記的RBL細胞進行染色(放大倍率，400X)。
圖24顯示在RBL細胞中表達的G428E小鼠穿孔素的減少的細胞毒性活性，但其具有正常的表觀分子質量。(A)顯示在穩定轉導的RBL細胞中的穿孔素表達的Western印跡(和IL18/1L-21-激活的小鼠NK細胞以及表達空載體的細胞(GFP)相比較)。(B)來自TNP-標記的Jurkat細胞的穿孔素依賴性51Cr釋放，該Jurkat細胞在抗TNPIgE存在的情況下與穩定表達WT或G428E穿孔素的RBL細胞共溫育了4小時。數據點表示為三個獨立的實驗的平均值±SD。Western印跡(右邊)顯示，G428E和WT穿孔素一起共遷移。GFP是空載體對照。(C)裂解穩定過表達WT或G428E穿孔素或空載體(GFP)的RBL細胞，並在Percoll密度梯度上進行分級。然後通過Western印跡法和其β-氨基己糖苷酶活性就其穿孔素的含量對級分進行分析。
圖25顯示G428E突變顯著地減少可溶性穿孔素的鈣依賴性膜結合。在1mM CaCl2不存在(-)或存在(+)的情況下就其結合綿羊紅細胞的能力對等量的重組WT和突變體穿孔素進行檢測。在各情況下穿孔素的總輸入量表示為(C)。
圖26顯示在HLH中鑑定的兩個普通的穿孔素多態性(polymorphisms)和錯義突變的定位。用框標示推定的穿孔素的結構域，數字表示各結構域的近似的胺基酸邊界，將前導序列的第一個殘基設為殘基1。預測N末端具有裂解特性；兩個低同源性的區域與其他哺乳動物蛋白質的結構域沒有顯著的相似性；兩親性α-螺旋和補體膜攻擊複合體組分C5b至C9的區域同源；EGF-樣結構域在結構上和遍在的EGF結構域相似，主要是由於高度保守的半胱氨酸殘基導致的；C2結構域是負責穿孔素的膜結合的鈣結合區域。星號標示的殘基A91V和N252S是指猜測的穿孔素多態性。
圖27顯示A91V和共遺傳的取代R232S的減少的表達和功能的部分喪失。顯示了在遺傳了A91V、R232H和雙突變的A91V/R232H穿孔素的異卵雙胞胎中鑑定的PRF1突變的作用。最上面的圖顯示來自RBL細胞的全部細胞提取物的Western印跡，所述RBL細胞表達各自的突變的穿孔素，並通過在材料和方法部分中描述的方法分選。該圖顯示4小時細胞毒性測定法，在該測定法中，以指定的效應器/靶(E/T)比率將瞬時轉染並分選的RBL細胞用作效應細胞而將51Cr標記的Jurkat細胞用作靶細胞。顯示的數據是4-9個獨立實驗的平均值±SE。為了清晰說明，在更大的標繪圖中再次顯示數據的子集(較低的E/T比率)。
圖28顯示在殘基252上具有絲氨酸取代的穿孔素的正常表達和功能。Western免疫印跡顯示D252S、D252N(如在人穿孔素中)和D252E(如在比目魚穿孔素中)在瞬時轉染的RBL細胞中的相對表達。線形圖(中間)顯示在51Cr釋放細胞毒性測定中的D252S穿孔素(等同於人中的N252S)的裂解活性。條形圖(底部)比較了移植到小鼠穿孔素上的在位置252處的穿孔素變體的裂解活性；在比目魚穿孔素中發現D252E，在人穿孔素中發現D252N。顯示的數據是平均值±SD，其代表三個獨立的實驗。
圖29顯示PRF1的錯義突變對於穿孔素的表達和活性的影響的分析。轉染RBL細胞，使其表達攜帶所列的每個錯義突變的穿孔素，然後對所述細胞進行FACS分選，並將其用於Western印跡分析和51Cr釋放細胞毒性測定法。除非另外指出，使用Jurkat T淋巴瘤細胞作為靶細胞，以30∶1、10∶1和2∶1的E/T比率在基於RBL的測定法中檢測每個突變的穿孔素至少3次。根據HLH患者的基因型將突變分類(A)在純合子患者中鑑定的突變，(B)在雙重雜合子中鑑定的突變，其中第二等位基因編碼蛋白質的移碼突變和提前終止突變，(C)於在PRF1的兩個等位基因上都具有錯義突變的雙重雜合子中鑑定的突變。Western免疫印跡顯示，在等量的FACS-分選的RBL細胞中突變的穿孔素的表達的相對水平。每個患者的原始參考以上標形式顯示於第一欄。HLH診斷的年齡以月表示，如在對應的參考中所描述的。斜體字表示之前我們在別處分析的穿孔素突變。胺基酸保守性來源於哺乳動物和比目魚穿孔素的胺基酸序列比對，如在PredictProtein(EMBL-Heidelberg)中的一樣。
圖30顯示在穿孔素的殘基232上的各種取代對RBL-介導的細胞毒性的影響。以E/T比率表明了使用轉染的RBL細胞和Jurkat靶細胞的51Cr釋放細胞毒性測定法，在該測定法中將R232C和R232H(在HLH患者中鑑定的取代)穿孔素的細胞毒性功能與WT和R232S(比目魚)穿孔素的細胞毒性功能進行比較。
圖31顯示V183G穿孔素具有正常的功能，而C279Y取代導致穿孔素功能的喪失。以E/T比率表明了使用轉染的RBL細胞和Jurkat靶細胞的51Cr釋放細胞毒性測定法，在該測定法中將推定的穿孔素突變V183G穿孔素(最上方)和C279Y穿孔素(最下方)與WT穿孔素進行比較。
圖32顯示阻斷穿孔素和粒酶B的增效促細胞凋亡功能的抑制劑化合物46553。以1∶10,000的稀釋度使用穿孔素以獲得通過穿孔素滴定確定的10-20％的殺傷力，如上文中所描述的。以1ug/ml使用粒酶B。
圖例P(穿孔素)，I(抑制劑化合物46553)，d或D(DMSO)和B(粒酶B)。
發明詳述細胞中逆轉錄病毒介導的重組穿孔素表達的方法在本發明的一個方面，提供了在細胞中表達穿孔素或其片段或變體的方法，所述方法包括用能夠在所述細胞中驅動所述穿孔素或其片段或變體重組表達的逆轉錄病毒載體轉染細胞。
與細胞表達的標準方法例如通過CaPO4沉澱、lipofectamine或類似的試劑或者電穿孔相比，本發明特別涉及使用逆轉錄病毒系統表達重組穿孔素。
在整個本說明書和權利要求中，詞「包含」並不表示不包括其他的添加物或組分或整數或步驟。
術語「穿孔素」、「溶細胞素」、「成孔蛋白(pfp)」和「C9-樣蛋白」在此處可交換使用，優選地其包括以各種形式存在的穿孔素多肽和其片段，包括天然發生的或合成的變體。本發明包括的穿孔素的實例包括具有圖1中所示的胺基酸序列的人穿孔素。本發明也包括小鼠和大鼠穿孔素同種型，雖然也考慮了來源於其他物種的穿孔素，包括由低等生物例如細菌產生的穿孔素。
穿孔素基因已被定位在小鼠的第10號染色體(Trapani等人，1990，J Exp Med，171545-557)和人的第17號染色體(Shinkai等人，1989，Immunogenetics，30452-457)上。已發現，外顯示子1編碼非翻譯序列，而完整的蛋白由外顯示子2的部分和外顯子3的全部編碼，該外顯子3也包含3′非翻譯區域。編碼小鼠(Kwon等人，1989，Biochem Biophys Res Commun，1581-10；Lowrey等人，1989，ProcNatl Acad Sci USA，86247-251)、人(Lichtenheld和Podack，1989，J Immunol，1434267-4274)和大鼠(Ishikawa等人，1989，J Immunol，1433069-3073)穿孔素的穿孔素cDNA的克隆表明，在胺基酸水平上人和大鼠穿孔素具有大約68％的同一性，而小鼠和大鼠穿孔素具有大約86％的同一性。人和小鼠蛋白質在長度上都是534個胺基酸，然而人的前導肽序列(21個胺基酸)比小鼠的對應物長1個殘基。穿孔素包含20個半胱氨酸殘基，其在所有三個物種中是完全保守的，據認為這些殘基形成了10個鏈內二硫鍵。
指出由穿孔素的孔和由補體MAC(特別是C9)形成的孔的相似性的早期功能性研究激勵著對所述兩種蛋白之間的結構和功能相似性的尋找。然而，一級序列的分析顯示，所述兩種蛋白只在穿孔素分子的中心附近的300個胺基酸的延展長度上具有20％的同源性(Shinkai等人，1988，Nature，334525-527)，而剩下的部分沒有顯示出絲毫相似性。在該中心部分是兩個具有甚至更高同源性的區域。殘基211-241對應於補體蛋白中的區域，該區域顯示較高的兩親性特徵。已提出，當附著至膜上時，在分子中發生了明顯的構象變化，導致該兩親性α-螺旋區域的暴露，使得能夠插入脂膜。第二個強保守性的結構域是殘基376-409之間的區域，該區域與也在MAC蛋白中發現的表皮生長因子(EGF)-樣重複結構域具有相似性(Shinkai等人，1988，Nature，334525-527)。存在於該區域中的6個保守的半胱氨酸可形成分子內二硫鍵，所述二硫鍵對保持功能上重要的結構作出貢獻，或者它們可以是和其他穿孔素單體聚集形成功能性孔的位點。氨基末端的100個殘基和羧基末端的150個殘基對於穿孔素來說是完全獨特的。在由Ojcius和同事進行的研究(Ojcius等人，1991，Proc Natl Acad SciUSA，88462-4625)中，使用對應於34個N末端殘基的合成的肽表明該區域具有強的膜破壞性特性。
如此處所用的，術語「天然的」優選地是指具有在自然界中發生的胺基酸序列的穿孔素多肽分子(例如，天然的蛋白質)。天然的穿孔素或天然發生的穿孔素，可被鑑定為殺細胞性顆粒的主要組分中的一種，發現在進行還原和SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳時，其以大約66kDa的分子質量遷移，而在非還原性條件下遷移更慢(70-75kDa)，這暗示著在其天然形式中存在緊密的二硫鍵形成的結構。在鈣離子(Ca2+)存在的情況下，穿孔素單體聚集形成了橫跨脂雙層的管狀結構，產生環形的傷口(直徑在6和20nm之間變動)，據認為，通過不斷地招募額外的單體，該傷口直徑逐漸增大。
穿孔素的變體可顯示和天然的穿孔素多肽或其片段具有至少80％的同一性的胺基酸序列。還涉及這樣的實施方案，在該實施方案中，變體包含這樣的胺基酸序列，即該胺基酸序列和天然的穿孔素多肽或其片段具有至少90％的同一性，優選地至少95％的同一性，更優選地至少98％的同一性，更加優選地至少99％的同一性，或最優選地至少99.9％的同一性。可通過目測和數學計算確定同一性百分數。在天然發生的其變體和片段中提供了保持天然生物學活性的天然穿孔素的變體或其基本上相似的等同物。此處也提供了沒有顯著生物學活性的天然發生的變體。這些變體也可來源於已知的HLH或FHL突變，或可以是根據經驗獲得的或推導的變體。
穿孔素的變體優選地包括這樣的多肽，所述多肽基本上和穿孔素的天然形式同源，但因為一個或多個缺失、插入或取代，其具有不同於天然形式的胺基酸序列的胺基酸序列。優選的實施方案包含這樣的多肽，當和天然的序列相比，所述多肽包含1至10個胺基酸殘基的缺失、插入或取代。給定的序列可被例如具有相似的物理化學特性的殘基替代。一個脂肪族殘基對另一個脂肪族殘基的這樣的保守取代的實例是，例如Ile、Val、Leu或Ala相互之間的替代；一個極性殘基對另一個極性殘基的取代，例如Lys和Arg、Glu和Asp、或Gln和Asn之間的取代；或者一個芳香族殘基對另一個芳香族殘基的取代，例如Phe、Trp或Tyr相互之間的取代。其他保守的取代，例如，包括具有相似的親疏水性特徵的整個區域的取代，在本領域是熟知的。也可通過天然穿孔素多肽的截斷來產生變體。本發明包括的其他變體包括，但不限於，去糖基化的穿孔素多肽或其片段，或當和天然的穿孔素相比時表現出增加的糖基化的多肽。也包括具有增加的水合作用的穿孔素多肽變體。「保守性胺基酸取代」是這樣的取代，即在該取代中用具有相似側鏈的胺基酸殘基替代一個胺基酸殘基。在本領域中已定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分枝的側鏈的胺基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，穿孔素多肽的胺基酸殘基優選地用來自相同的側鏈家族的另一種胺基酸的替代。在優選的實施方案中，可通過例如飽和誘變沿著全部或部分穿孔素的編碼序列隨機地引入突變，可就穿孔素的活性篩選所得的突變體以鑑定這樣的變體，該變體和天然的穿孔素相比，表現出相同的、減少的或增加的穿孔素活性。誘變後，可通過此處描述的方法重組地表達被編碼的蛋白質，和測定所述蛋白質的活性。
優選地，穿孔素多肽的變體將用作激動劑(模擬的)或用作拮抗劑。穿孔素的激動劑可提高穿孔素的活性或基本上保持相同的或部分的穿孔素天然發生形式的生物學活性。通過例如競爭性地調節穿孔素介導的活性，穿孔素的拮抗劑可抑制所述多肽的天然發生形式的一種或多種活性。因此，可通過用有限功能的變體進行處理來引發特定的生物學效應。優選地，和用穿孔素的天然發生形式處理受試者相比，用具有穿孔素的天然發生形式的部分生物學活性的變體處理受試者在受試者中產生更小的副作用。
如此處所用的，術語「穿孔素活性」、「穿孔素的生物學活性」等優選地是指穿孔素多肽的細胞裂解活性；即，其結合至靶細胞膜並聚合形成導致細胞裂解的孔-樣跨膜通道的能力。所述活性也包括與其他毒素例如顆粒毒素(granule toxin)和其他分子協同作用誘導凋亡的能力。所述靶細胞可以是能夠被天然的穿孔素裂解的任何細胞。
可由本領域技術人員，通過許多本領域已知的方法來評估穿孔素的生物學活性，所述方法包括，但不限於，靶細胞裂解的測量，粒酶B分子至靶細胞的遞送，靶細胞膜破壞的測量(例如通過離子轉運上的改變)、靶細胞中凋亡的誘導、囊泡運輸的修飾和靶細胞死亡的總體評估。所述靶細胞可以是紅細胞(RBC)，從而測量穿孔素活性的普通方法是通過RBC裂解測試來進行的。其也可以是任何有核的細胞。
在優選的實施方案中，所述變體是穿孔素基因的突變種。更優選地，所述突變種是在患有HLH，更優選(FHL)的個體中鑑定的穿孔素基因。
HLH和更優選地遺傳連鎖的FHL是作為常染色體隱性性狀遺傳的先天性疾病，其屬於一組噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(haemophagocytic lymphohistiocytosis)症候群，其臨床特徵在於發燒、肝脾大和全血細胞減少症。此外，在HLH或FHL期間，一般發生神經受累(neurological involvement)，其表現形式可包括驚厥、腦神經麻痺、共濟失調和在最終階段的昏迷(Haddad等人，1997)。和臨床症狀相關的經常性發生的異常包括高甘油三酯血症、低纖維蛋白原血症和提高的細胞因子(例如IL-1、IL-6、TNF和IFN-Y)水平。在組織學上，存在CD8+T細胞和巨噬細胞的過度擴增，它們滲透至數個器官例如脾臟、肝臟、骨髓(BM)、淋巴結和中樞神經系統。在各種組織(特別是骨髓和肝臟)中通過組織細胞攝取血細胞(特別是紅細胞)(即吞噬血細胞作用)和釋放炎性細胞因子的證據導致大規模的組織壞死、器官衰竭和最終兒童的死亡。臨床(發燒，脾大)、實驗室(細胞減少症、高甘油三酯血症和/或低纖維蛋白原血症)以及形態學上的(吞噬血細胞作用)特徵的結合用作該疾病的診斷標準，然而通常在死後進行所述診斷，這暗示著該疾病診斷的困難性。目前，HLH和更優選地FHL只有化學治療和骨髓移植相結合才能治癒。該治療方案的侵入性和通常使體質衰弱的性質突出了鑑定新的和改善的治療策略的重要性。據認為，HLH或FHL中的臨床圖像(clinical picture)是由於細胞裂解性淋巴細胞不能清除感染性病原體造成的，類似於在用LCMV感染的穿孔素GKO小鼠中觀察到的發病機理，在該小鼠中，病毒特異性T細胞的增加的擴增和不能下調免疫應答是主要的特徵。據認為，在缺少穿孔素依賴性細胞毒性機制的情況下，抗原呈遞細胞(APC)繼續給非功能性淋巴細胞呈遞活化和增殖信號。儘管還未確定該嬰兒疾病的單一成因感染因子，但病毒感染，特別是皰疹類病毒(EB病毒和巨細胞病毒)的感染，已在患有FHL的患者中被檢測到(Imashuku等人，1999)。已發現穿孔素基因的編碼區中的突變佔HLH或FHL病例的大約30％，但這沒有減少缺陷也可能存在於控制穿孔素的表達或活化的調控因子的水平上的可能性。
表1提供了優選的穿孔素突變，其列出了至今在FHL中鑑定的突變中的一些和概述了預計影響所述蛋白的編碼序列和功能的無義突變、錯義突變和移碼突變譜。例如，在Trp374上的導致提前終止密碼子的突變是到目前為止最頻繁報導的突變。該殘基位於富含半胱氨酸的EGF結構域中並且在人、小鼠和大鼠基因中是保守的。大量的錯義突變存在於在所有三種物種之間保守的殘基上，暗示著這些殘基對所述蛋白的功能是至關重要的。在圖1中通過圖的方式提供了在穿孔素分子的特定結構域內發生的突變的位置。特別吸引人的是這樣的錯義突變，即所述錯義突變將會被證明在評價這些至關重要的殘基是如何參與穿孔素的功能方面是無價的。
表1在FHL中鑑定的穿孔素基因的突變
前導序列＝在分子的N末端的信號肽。跨膜＝推定的兩親性α螺旋結構域。
C2結構域＝由Uellner等人(1997，Embo J，167287-7296)通過分子建模鑑定的C2鈣結合結構域。胺基酸和核苷酸編號包括21個胺基酸的前導肽。
穿孔素突變和多態性也在下面的實施例部分進行詳細描述，其包括A91V、N252S、R225W和G429E。
失活性錯義穿孔素突變的目錄，作為經表徵的HLH或FHL突變的結果現已進行彙編，其可能為穿孔素的分子和細胞功能提供了新的見解。假設地，穿孔素功能中的這些缺陷可在許多水平發生，包括mRNA的不穩定性、有缺陷的蛋白摺疊或加工、錯誤地運輸至細胞裂解性顆粒或有缺陷的從CTL中的釋放。缺陷的第二類別應當對應於穿孔素從CTL中的釋放的下遊，和涉及功能例如鈣結合和附著或插入至脂雙層，或導致粒酶B的有缺陷的運輸。
本申請人已對兩個穿孔素點突變的性質進行了描繪並且第一次獲得這樣的驚人發現，即兩個突變的變體都能夠通過顆粒胞吐進行釋放，所述兩個點突變產生單個胺基酸取代，Gly428Glu和Pro344Leu，或保守的穿孔素序列中的等價位置。已推導出，在小鼠序列中突變發生在Gly428和Pro 344，而在人序列中，突變發生在Gly 429和Pro 345上。類似的點突變可在其他物種的穿孔素序列中在所述穿孔素序列中的等價的Gly和/或Pro部分發生.Gly和/或Pro部分發生。這些發現意味著，在具有這些突變的患者的CTL中觀察到的穿孔素的耗損是由於在免疫攻擊期間穿孔素的異常調節的(dysregulated)釋放導致的。
因此，在優選的實施方案中，當和天然的穿孔素相比時，穿孔素多肽變體具有減少的生物學活性。在另一優選的實施方案中，穿孔素多肽變體包含發生在保守的穿孔素多肽序列中的Gly和/或Pro殘基上的錯義突變，所述殘基等同於小鼠穿孔素序列中的G428和/或P344或人穿孔素序列中的Gly429和/或Pro345。在另一優選的實施方案中，穿孔素多肽變體包含錯義突變G428E和/或P344L，所述殘基也是由本申請人發現的在小鼠和大鼠穿孔素多肽中都保守的殘基。在另一優選的實施方案中，穿孔素多肽變體包含錯義突變G429E和/或P345L，所述殘基也是由本申請人發現的在人穿孔素多肽中保守的殘基。
在另一優選的實施方案中，穿孔素變體是包含天然穿孔素多肽或其片段和附著至其上的額外結構域的融合蛋白，其中所述額外的結構域可以是天然發生的或合成的。優選地，本發明的融合蛋白包含許多被加入至穿孔素多肽或其片段或變體的胺基酸，通常加入至所述重組穿孔素多肽的氨基末端。這些融合蛋白可用作這樣的目的，所述目的選自，但不限於1)增加重組穿孔素多肽的表達；增加重組穿孔素多肽的溶解度；和通過用作親和純化中的配體來幫助重組穿孔素多肽的純化。通常，在融合部分與重組穿孔素多肽之間的連接處引入蛋白水解切割位點以使得在融合蛋白純化之後，所述重組穿孔素多肽能夠與融合部分分離。這些酶，和其關連識別序列，包括凝血因子Xa、凝血酶和腸激酶。可通過使用本領域技術人員已知的融合表達載體例如pGEX、pMAL和pRIT5產生典型的融合蛋白，所述載體分別將穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或A蛋白融合至靶重組多肽。
如此處所用的，術語「片段」優選地是指穿孔素多肽或其變體的部分。這樣的片段優選地包含天然的穿孔素多肽或其變體的至少1個胺基酸殘基，更優選地至少5個胺基酸殘基，更加優選地至少10個胺基酸殘基，和更為優選地至少20個胺基酸殘基。
在另一優選的實施方案中，穿孔素多肽的片段可包含免疫原性或抗原性區域。因此片段可包含被免疫球蛋白識別(即，特異性結合)的穿孔素多肽或其變體的部分。
在另一優選的實施方案中，穿孔素多肽的片段可由具有生物學活性的C-末端結構域構成。這樣的片段一般可使用這樣的技術來進行鑑定，所述技術是在鑑定穿孔素活性中本領域技術人員熟知的技術，如在上文中描述的。穿孔素多肽片段也可通過就其與穿孔素特異性抗體和/或抗血清反應的能力篩選片段來進行鑑定。如果抗血清和抗體特異性地結合穿孔素多肽或其變體或片段(即，其在酶聯免疫吸附測定法[ELISA]或其他免疫測定法中和穿孔素反應，並且在可檢測的水平上不和不相關的多肽反應)，那麼其是「穿孔素特異性的」。可以如此處所描述的，使用熟知的技術(參見，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)製備這樣的抗血清和抗體。
穿孔素分子也包括天然發生的或合成的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列編碼上文中描述的穿孔素多肽或其片段或變體。術語「核酸分子」包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和通過例如使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選地是雙鏈的DNA。
如此處所用的，「天然發生的」核酸分子優選地是指具有在自然界中發生(例如，編碼天然蛋白質)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如此處所用的，術語「基因」和「重組基因」優選地是指這樣的核酸分子，所述核酸分子包含編碼穿孔素多肽的開放閱讀框架，並且還可包含非編碼調控序列，和內含子。
例如，穿孔素核酸分子優選地包含這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列和圖1中所示的核苷酸序列具有至少大約60％、優選地至少65％、更優選地至少70％、更加優選地至少75％、更加優選地至少80％、更加優選地至少85％、更加優選地至少90％、更加優選地至少91％、更加優選地至少92％、更加優選地至少93％、更加優選地至少94％、更加優選地至少95％、更加優選地至少96％、更加優選地至少97％、更加優選地至少98％、最優選地至少99％或更高的同源性。在長度大於或等於參照序列(例如圖1中的序列)的核酸分子的情況下，將其和全長的參照序列進行比較。當分離的核酸分子短於參照序列例如短於圖1中描述的序列時，和相同長度的參照序列的區段(不包括同源性計算所需要的任何環)進行比較。穿孔素核酸分子可來源於任何物種，包括，但不限於，人、大鼠、小鼠、鳥、馬和低等生物例如細菌。
根據本發明，通過本領域技術人員已知的任何手段可用逆轉錄病毒載體轉染(或轉導)細胞。這些手段包括，但不限於，電穿孔、脂質體的使用和CaPO4沉澱。
逆轉錄病毒載體本發明開發了使用逆轉錄病毒載體來「攜帶」編碼穿孔素、其片段或變體的核酸分子，以轉染最終表達穿孔素、其片段或變體的細胞。因此，在本發明的另一個方面，提供了能夠在用所述載體轉染的細胞中驅動穿孔素或其片段或變體表達的逆轉錄病毒載體。
如此處所用的，術語「逆轉錄病毒載體」優選地是指這樣的基因轉移媒介物，其利用逆轉錄病毒複製周期的特性，例如高感染效率和通過病毒傳遞的信息穩定地共線性整合入靶細胞染色體中。
用於本發明的逆轉錄病毒可來源於許多種類的逆轉錄病毒，包括，但不限於，莫洛尼鼠白血病病毒、鼠幹細胞病毒、脾壞死病毒、逆轉錄病毒例如勞斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類造白細胞組織增生病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。在優選的實施方案中，所述逆轉錄病毒質粒載體是鼠幹細胞病毒(MSCV)載體或其衍生物。更優選地，特別是當用於人或小鼠原代細胞的轉染時，所述逆轉錄病毒質粒載體是pLXSN(GenBank目錄號M28248)。
逆轉錄病毒載體優選地包含一個或多個啟動子。可使用的合適的啟動子包括，但不限於，逆轉錄病毒長末端重複(LTR)；SV40啟動子；和人巨細胞病毒(CMV)啟動子(如Miller等人，Biotechniques，第7卷，No.9，980-990(1989))，或任何其他啟動子(例如，細胞啟動子例如真核細胞啟動子，包括，但不限於，組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。可使用的其他病毒啟動子包括，但不限於，腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。根據此處包含的教導，本領域技術人員可容易地選擇合適的啟動子。
編碼穿孔素多肽或其片段或變體的核酸序列，優選地被置於合適的啟動子控制之下。可使用的合適的啟動子包括，但不限於，腺病毒啟動子，例如腺病毒主要後期啟動子；或異源啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子，例如MMT啟動子，即金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，例如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；逆轉錄病毒LTRs；P-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。啟動子也可以是控制編碼穿孔素或其片段或變體的基因的天然啟動子。
在另一優選的實施方案中，本發明的逆轉錄病毒載體還包含合適的標記基因(此處稱為「可選擇的標記」)，這樣可容易地選擇經轉導的細胞。優選地，可選擇的標記是給經轉化的細胞提供抗生素抗性的藥物抗性基因、給經轉化的細胞提供用於其檢測的酶活性的報告基因，或可通過本領域已知的方法在經轉化的細胞中被檢測的惰性蛋白質。例如，可選擇的標記可以是綠色螢光蛋白，該蛋白在經轉化的細胞中表達後，可在紫外光下通過光學顯微鏡顯像來檢測。在另一實施方案中，N2/ZipTKNEO載體(TKNEO，1991，Blood，78310-317)和PM5neo載體(1995，Exp.Hematol，23630-638)都包含新黴素抗性基因(新黴素磷酸轉移酶)作為它們的可選擇的標記。因此，通過它們對抗生素(新黴素，G418，等)的抗性識別用這些載體轉染的細胞，所述抗生素被所述基因產物失活。
包裝細胞在優選的實施方案中，本發明包括將逆轉錄病毒載體轉染入「包裝細胞」中的進一步的步驟。因此，在本發明的另一個方面，提供了用能夠在細胞中驅動穿孔素或其片段或變體重組表達的逆轉錄病毒載體轉染的包裝細胞。優選地，所述包裝細胞能夠產生能夠進一步感染宿主細胞以表達重組穿孔素的感染性顆粒。
因此，在本發明的另一個方面，提供了攜帶這樣的逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒顆粒，所述逆轉錄病毒載體能夠在細胞中驅動穿孔素或其片段或變體的表達。
如此處所用的，術語「包裝細胞」優選地是指包含這樣的元件的細胞，所述元件是通過提供在重組病毒載體中缺少的元件來產生感染性重組病毒所必需的。一般地，這樣的包裝細胞包含一種或多種能夠表達病毒結構蛋白(例如gag、pol和env)的表達盒，但其不包含包裝信號(例如psi)。因此，包裝細胞可通過其自身只形成空毒粒顆粒。在該一般方法中，將逆轉錄病毒導入包裝細胞中，從而產生「生產者細胞」。因此，該生產者細胞生產包含這樣的逆轉錄病毒載體的毒粒顆粒，所述逆轉錄病毒載體包含編碼穿孔素或其片段或變體的多核苷酸序列。
使用包裝細胞可確保不產生具有複製能力的病毒，否者所述病毒可在宿主內部產生不受控制的感染。包裝細胞表達編碼病毒的衣殼(包裹病毒顆粒的核蛋白核心或核酸的蛋白質外殼)的蛋白質，編碼這些蛋白質的基因在包裝細胞的基因組的不同位點上。這可預防較為可能的重組事件，否則該重組事件可使載體DNA獲得產生具有複製能力的逆轉錄病毒所需的基因。優選地，所述包裝細胞系將產生這樣的逆轉錄病毒，該逆轉錄病毒能夠進行感染，但只包含編碼穿孔素或其片段或變體的RNA、其啟動子和可使穿孔素基因能夠正確表達的LTR′s。
可容易地製備具有上述逆轉錄病毒載體構建體的適合使用的包裝細胞(參見，例如，PCT公開號WO 95/30763和WO 92/05266)，並將其用於建立用於重組載體顆粒生產的生產者細胞系(也稱作載體細胞系)。在本發明的特別優選的實施方案中，從人(例如HT1080細胞)或貂親本細胞系產生包裝細胞系，從而允許產生可在人血清中以失活的狀態存活的重組逆轉錄病毒。
包裝細胞的實例包括，但不限於，PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、美國專利號5,278,056中描述的細胞株系、GP+E-86(ATCC CRL-9642)、GP+envAm-12(ATCC CRL-9641)、293T、PE501、PA317.psi.-2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86、GP+envAm12和Miller，Human Gene Therapy，15-14(1990)(以其全文在此引用作為參考)中描述的DNA細胞系。更加優選地，所述包裝細胞來源於HEK 293 101細胞。
逆轉錄病毒載體可通過任何本領域已知的方法轉導所述包裝細胞。這些方法包括，但不限於，電穿孔、脂質體的使用和CaPO4沉澱。
在優選的包裝和生產者細胞中，有毒的包膜蛋白序列和核殼序列都被穩定地整合入細胞中。然而，一個或多個這些序列也可以附加體形式存在，和基因表達可在附加體上發生。
在優選的實施方案中，所述包裝細胞系是第二代包裝細胞系。在另一個優選的實施方案中，所述包裝細胞系是第三代包裝細胞系。
已發現，包含前病毒(其中包裝性信號已被刪除)的簡單的包裝細胞導致不希望的具有複製能力的病毒通過重組快速地產生。為了提高安全性，已產生第二代細胞系，其中前病毒的3′LTR被刪除。在這樣的細胞中，兩次重組是產生野生型病毒所必需的。其他改進包括將gag-pol基因和env基因引導在分開的構建體上，即所謂的第三代包裝細胞系。按順序導入這些構建體以防止在轉染期間發生重組。
在斷裂構建體(split-construct)，第三代細胞系中，通過改變密碼子可獲得重組的進一步減少。基於遺傳密碼子冗餘性的該技術旨在減少分開的構建體之間，例如gag-pol和env開放閱讀框架中交疊區域之間的同源性。
包裝細胞系用於提供封裝所必需的基因產物和提供用於高滴度載體顆粒產生的膜蛋白。所述包裝細胞可以是體外培養的細胞，例如組織培養細胞系。合適的細胞系包括，但不限於，哺乳動物細胞例如來源於鼠成纖維細胞的細胞系或人細胞系。優選地，所述包裝細胞系是人細胞系，例如，HEK 293、HEK 293T、TE671或HT1080。
可選擇地，包裝細胞可以是來源於待治療的個體的細胞，例如單核細胞、巨噬細胞、血細胞或成纖維細胞。可從個體分離所述細胞，並離體地施用包裝和載體組分，然後重新施用自體包裝細胞。
優選地，所述包裝細胞系產生感染性逆轉錄病毒載體顆粒(毒粒)，所述逆轉錄病毒載體顆粒包含編碼上述穿孔素或其片段或變體的多核苷酸序列。然後可將這些逆轉錄病毒載體顆粒用於體外或體內地轉導宿主細胞，以表達編碼穿孔素或其片段或變體的多核苷酸序列。因此，在本發明的另一個方面，提供了攜帶能夠在細胞中驅動穿孔素或其片段或變體表達的逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒顆粒。
宿主細胞在本發明的另一個方面，提供了用逆轉錄病毒載體轉染的宿主細胞或細胞系，所述逆轉錄病毒載體能夠在所述細胞中驅動穿孔素或其片段或變體的表達。
優選地，宿主細胞或細胞系是任何物種的真核細胞或細胞系，其選自胚胎幹細胞、胚胎癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質形成細胞、內皮細胞、支氣管上皮細胞和免疫細胞。宿主細胞也可以是低等生物例如細菌的細胞。優選地，真核細胞是免疫細胞，其選自嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和天然殺傷細胞。更優選地，免疫細胞是嗜鹼性粒細胞，和更加優選地，免疫細胞是大鼠嗜鹼細胞性白血病(RBL)細胞。
細胞組合物在另一個方面，本發明提供了用這樣的逆轉錄病毒載體轉染的細胞的組合物，所述逆轉錄病毒載體能夠驅動此處描述的穿孔素分子、其片段或變體的表達。此處使用的「細胞的組合物」優選地是指分散的細胞的體外製劑。在培養的細胞的情況下，其由至少10％和更優選地50％的受試者的細胞的製劑組成。可選擇地，細胞的組合物可以指從已被施入前面提到的逆轉錄病毒表達載體的受試者中(體內地或離體地)獲得的生物組織。「受試者」，如此處所用的，優選地是指哺乳動物，例如，人，或指非人動物，包括，但不限於，馬、牛、山羊、大鼠或小鼠。
分離的重組穿孔素和其片段、變體或突變形式在另一個方面，本發明提供了由此處描述的方法產生的重組穿孔素分子。在優選的實施方案中，所述重組穿孔素分子是分離的或純化的穿孔素分子，其為此處描述的重組穿孔素多肽或其片段或變體；或者是編碼所述穿孔素的核酸分子。從前述的細胞的組合物中分離重組穿孔素分子是另一優選的實施方案。
優選地，「分離的或純化的」穿孔素分子基本上不含細胞材料或來自產生該蛋白質的細胞或組織來源的其他汙染性蛋白質。術語「基本上不含」優選地是指這樣的穿孔素多肽的製劑，所述製劑具有低於大約30％、20％、10％和更優選地5％(按乾重計算)的非穿孔素分子(在此處也稱為「汙染分子」)。穿孔素多肽優選地還基本上不含培養基，即，培養基佔有低於大約20％、更優選地低於大約10％、和最優選地低於大約5％的所述蛋白質製劑的體積。
術語「分離的或純化的穿孔素分子」也指這樣的穿孔素核酸分子，該核酸分子是從存在於該核酸的天然來源中的其他核酸分子中分離出來的。例如，對於基因組DNA，術語「分離的」包括從與所述基因組DNA天然地相關聯的染色體分離的核酸分子。優選地，「分離的」核酸不含有在基因組DNA中天然地側翼連接該核酸的序列(即，位於該核酸的5′和/或3′末端的序列)，所述基因組DNA是所述核酸所來源的生物的基因組DNA。例如，在各種實施方案中，分離的核酸分子可以包含少於大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在基因組中天然地側翼連接該核酸分子的5′和/或3′核苷酸序列，所述基因組DNA是所述核酸所來源的細胞的基因組DNA。此外，「分離的」核酸分子，例如cDNA分子，當通過重組技術產生時可以基本上不含有其他細胞材料，或培養基，或當通過化學合成時可以基本上不含有化學前體或其他化學藥品。
篩選測定法在本發明的另一個方面，提供了篩選調節穿孔素表達和/或活性的化合物的方法，所述方法包括步驟獲得用逆轉錄病毒載體轉染的宿主細胞或獲得穿孔素的樣品，所述逆轉錄病毒載體驅動重組穿孔素或其片段或變體的表達；將所述細胞或穿孔素暴露於受試化合物；和確定所述受試化合物是否結合所述穿孔素和/或調節所述穿孔素的表達和/或活性。
優選地，篩選測定法包含表達本發明的穿孔素分子的宿主細胞。這樣的宿主細胞優選來源於上文中所描述的哺乳動物、酵母、果蠅(Drosophila)或大腸桿菌(E.coli)。然後將表達穿孔素分子的細胞(或包含表達的穿孔素多肽的細胞級分)暴露於受試化合物以觀察與穿孔素分子的結合，或穿孔素表達和/或活性的調節。
在另一優選的實施方案中，提供了篩選調節穿孔素活性的化合物的方法，所述方法包括步驟獲得用逆轉錄病毒載體轉染的宿主細胞或獲得穿孔素的樣品，所述逆轉錄病毒載體驅動重組穿孔素或其片段或變體的表達；將所述細胞或穿孔素暴露於受試化合物和靶細胞；和確定所述受試化合物是否調節所述穿孔素對所述靶細胞的活性。
可直接將所述靶細胞暴露於宿主細胞和受試化合物的混合物。可選擇地，可在從混合物中除去宿主細胞後，將所述靶細胞暴露於受試化合物和由宿主細胞產生的重組穿孔素的混合物。重組穿孔素的活性的測定不一定需要宿主細胞的持續存在。
篩選測定法也可使用優選地以分離的形式存在的穿孔素樣品來檢測受試化合物對穿孔素的作用。所述化合物可以通過直接作用於穿孔素分子來抑制穿孔素活性，或其可在靶細胞上阻斷穿孔素，從而阻止穿孔素髮揮作用。以兩種方式中的任一方式，靶向穿孔素，從而其直接的活性不能作用於靶細胞。
通過篩選測定法鑑定的化合物優選地結合穿孔素分子或其片段或變體，和激活(激動劑)或抑制(拮抗劑)穿孔素的表達和/或活性。優選地，經鑑定的化合物(例如，天然的或合成的蛋白質或藥物)增加(激動劑)和/或降低(拮抗劑)天然的穿孔素的活性。
在本發明的另一個可選擇的方面，提供了篩選調節穿孔素表達和/或活性的化合物的方法，所述方法包括步驟獲得能夠被穿孔素裂解的靶細胞；獲得穿孔素的樣品；將所述細胞或穿孔素暴露於受試化合物；和確定所述受試化合物是否調節靶細胞從而使穿孔素對靶細胞的活性受到調控。
這一篩選影響穿孔素活性的化合物的可選擇的方法旨在鑑定這樣的化合物，所述化合物可調節靶細胞、靶細胞上的受體或相互作用的分子例如穿孔素被靶向的靶細胞的表面上的配體，從而調節所述細胞，使其對穿孔素的反應變弱或對穿孔素的反應變得更強。該篩選方法鑑定了不改變穿孔素本身，但改變穿孔素作用的靶細胞或受體的化合物。可以以通過任何方法獲得的分離的穿孔素形式提供穿孔素。優選地，以通過此處描述的方法產生的重組穿孔素來提供其。
如此處所用的，術語「穿孔素活性」、「穿孔素的活性」等優選地是指穿孔素多肽的細胞裂解活性；即，其結合靶細胞膜並聚合形成導致細胞裂解的孔-樣跨膜通道的能力。所述靶細胞可以是能夠被天然的穿孔素裂解的任何細胞。在優選的實施方案中，通過所述篩選測定法鑑定的化合物激活或抑制一種或多種上文中描述的穿孔素活性。
如此處所用的，術語「穿孔素的表達」、「穿孔素表達」等優選地是指編碼穿孔素或其片段或變體的多核苷酸的濃度，或可以是指穿孔素多肽或其片段或變體的濃度。
可由本領域技術人員通過許多本領域已知的方法來評估穿孔素的活性，所述方法包括，但不限於，靶細胞裂解的測量、粒酶B分子至靶細胞的遞送、靶細胞膜破壞的測量(例如通過離子轉運上的變化)、靶細胞中凋亡的誘導、囊泡運輸的修飾和靶細胞死亡的總體評估。
可由本領域技術人員通過許多本領域已知的方法來評估穿孔素的表達，所述方法包括，但不限於，編碼穿孔素的信使RNA(mRNA)(優選由宿主細胞表達)的測量，例如通過Northern印跡分析或定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，以及宿主細胞中穿孔素多肽的測量，例如通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、Western印跡法或通過上文中描述的穿孔素活性的間接測定，從而生物樣品中的穿孔素的濃度直接(但不一定線性地)和穿孔素活性的水平成比例。
在另一方面，提供了通過篩選測定法鑑定的調節穿孔素表達和/或活性的化合物。這些化合物包括許多化學種類，儘管它們通常是有機分子，優選地具有高於50和低於大約2,500道爾頓的分子量的小有機化合物。這些化合物可包含對於和蛋白質發生結構相互作用特別是氫鍵所必需的官能團，其一般至少包含胺基、羰基、羥基或羧基，優選地至少兩個官能化學基團。所述化合物也可以包含用一種或多種上述官能團取代的環狀的碳結構或雜環結構和/或芳香或多芳香結構。所述化合物也可包含生物分子，包括但不限於，肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合。然而，本發明不限於這些化合物。
所述化合物可包括，但不限於1)肽，例如可溶性肽，包括以Ig為尾部的融合肽，和隨機肽文庫(參見，例如，Lam等人，1991，Nature35482-84；Houghten等人，1991，Nature 35484-86)和來源於組合化學的由D-和/或L-構型胺基酸構成的分子文庫的成員；2)磷酸肽(例如，隨機和部分簡併、定向的磷酸肽文庫的成員，參見，例如，Songyang等人，1993，Cell 72767-778)；3)抗體(例如，多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨特型抗體、嵌合抗體和單鏈抗體，以及Fab、F(ab′)2、Fab表達文庫片段和抗體的表位結合片段)；和4)小有機和無機分子。
可從廣泛的來源(例如，但不限於合成的或天然的化合物的文庫)獲得所述化合物。合成的化合物文庫可從例如Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)、和Microsource(New Milford，Conn.)商購獲得。罕見的化學文庫可從Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee，Wis.)獲得。包含細菌、真菌、植物或動物提取物的天然化合物文庫可從例如Pan Laboratories(Bothell，Wash.)獲得。此外，可獲得許多用於隨機和定向合成許多種類的有機化合物和生物分子的方法，包括隨機寡核苷酸的表達。
可選擇地，可產生以細菌、真菌、植物和動物提取物形式存在的天然化合物的文庫。可容易地獲得用於合成分子文庫的方法(參見，例如，DeWitt等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.372678；Cho等人，1993，Science2611303；Carell等人，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等人，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等人，1994，J.Med.Chem.371233)。此外，可通過常規的化學、物理和生物化學方法(參見，例如，Blondelle等人，1996，Trends inBiotech.1460)容易地修飾天然的或合成的化合物文庫和化合物，和可將它們用於產生組合文庫。在另一個方法中，先前鑑定的藥物試劑可接受定向或隨機的化學修飾，例如乙醯化、烷基化、酯化、醯胺化，並可就調節穿孔素的活性來篩選類似物。
用於產生組合文庫的許多方法在本領域是已知的，包括涉及生物學文庫的那些方法；在空間上可定址的(addressable)平行固相或溶液相文庫；需要去褶合(deconvolution)的合成文庫法；『一珠一化合物』文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫法。所述生物學文庫法限定於多肽或肽文庫，而其他四種方法可用於多肽、肽、非肽寡聚物、或化合物的小分子文庫(K.S.Lam，1997，Anticancer DrugDes.12145)。
可通過本領域公知的方法就確定化合物是否競爭性地結合在共同結合位點處來在溶液中篩選文庫。這些方法可包括在溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques 13412-421)，或在珠上(Lam，1991，Nature 35482-84)，在晶片上(Fodor，1993，Nature 364555-556)，在細菌或孢子中(Ladner，美國專利號5,223,409)，在質粒中(Cull等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)，或在噬菌體上(Scott和Smith，1990，Science 249386-390；Devlin，1990，Science 249404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.USA976378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222301-310和Ladner，專利號5,223,409)篩選文庫。
篩選測定法中包含各種其他試劑。這些包括試劑如鹽、中性蛋白質(例如，白蛋白、去汙劑等)，所述試劑用於促進最佳的蛋白質-蛋白質結合和/或減少非特異性或背景相互作用。可使用提高測定法的功效的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物試劑等。以任何順序加入產生所需的結合的組分。在有利於最佳活性的任何溫度(一般在4℃和40℃之間)下進行溫育。優選地就最佳活性選擇溫育時間，但也可最優化所述溫育時間以有利於快速高通量的篩選。一般地，0.1至1小時就足夠了。優選地，以不同的受試試劑濃度平行進行多個測定混合物的測定以獲得對這些濃度的不同反應。一般地，這些濃度中的一個用作負對照，即，0濃度或低於檢測水平的濃度。
針對已知的藥物活性化合物的模擬物的設計也是開發基於「先導」化合物的藥物的已知方法。當所述活性化合物難以合成或合成成本昂貴時或當其不適合用於特定的施用方法(例如，肽一般是不適合於口服組合物的活性試劑，因為其易於被消化道中的蛋白酶快速降解)時，這可以是希望的。模擬物設計、合成和檢測一般用於避免對於靶性質的大規模的分子篩選。
當設計模擬物時，首選想要確定在決定靶性質中是至關重要和/或重要的化合物的特殊區域。在肽的情況下，可通過系統性地改變肽中的胺基酸殘基(例如，通過依次替換各殘基)來進行該確定。這些構成化合物的活性區域的部分或殘基被稱作其的「藥效團」。
一旦發現藥效團，就根據其物理性質(例如，立體化學、鍵、大小和/或電荷)，使用來自一系列來源的數據(例如光譜技術、X射線衍射數據和NMR)建立其結構模型。可將計算機分析、相似性作圖(其模仿藥效團的電荷和/或體積而不是原子之間的鍵)和其他技術用於該建模過程。
在該方法的變化形式中，建立化合物和其結合配偶體的三維結構的模型。當所述化合物和/或結合配偶體在結合後改變構象時，這樣做可以特別有用，在模擬物的設計中其可使模型考慮到這一構象變化。
然後選擇模板分子，和可將模擬藥效團的化學基團移植至模板上。可方便地選擇模板分子和移植至其上的化學基團，從而可容易地合成模擬物，所述模擬物可能是藥學上可接受的，其在體內不降解並保持先導化合物的生物學活性。然後篩選已建立的模擬物以確定其展現靶性質的的程度，或確定其抑制靶性質至何種程度。然後可進行進一步的最優化或修飾以獲得一個或多個用於體內或臨床檢測的終模擬物。
藥物組合物在本發明的另一個方面，提供了這樣的藥物組合物，該藥物組合物包含此處描述的重組穿孔素分子，和/或通過此處描述的篩選測定法鑑定的激動劑或拮抗劑化合物(此處也稱作「活性化合物」)以及藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。
可單獨地使用本發明的藥物組合物或可和其他化合物例如治療性化合物一起使用。
這樣的組合物一般包括用能夠驅動重組穿孔素、穿孔素多肽或其片段或變體表達的逆轉錄病毒載體轉染的細胞或生物組織、編碼所述穿孔素的核酸分子、或穿孔素特異性抗體以及藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。如此處所用的，術語「藥學上可接受的媒介物」優選地包括與藥物施用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。也可將補充的活性化合物整合入組合物中。
配製藥物組合物，使其和其想要的施用途徑相容。施用途徑的實例包括腸胃外，例如，靜脈內、皮內、皮下、經口(例如，吸入)、透皮(局部)、透黏膜和直腸施用。用於腸胃外、皮內或皮下施用的溶液或懸浮液可包括下列組分無菌稀釋劑例如用於注射的水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗細菌劑例如苯甲醇或羥苯甲酸甲脂；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩衝物例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用於調節滲透壓的試劑例如氯化鈉或右旋糖。可以用酸或鹼例如鹽酸或氫氧化鈉來調節pH。腸胃外製劑可封裝在由玻璃或塑料製造的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
適合注射使用的藥物組合物包括無菌水性溶液(當為水溶性時)或用於無菌可注射溶液或分散體的即時製劑的分散體和無菌粉末。對於靜脈內施用，合適的媒介物包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的並且其流動性應當達到容易注射的程度。在生產和貯存條件下其應當是穩定的，並且其必須是防腐的，能夠抵抗微生物例如細菌和真菌的汙染作用。所述媒介物可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇或液體聚乙二醇等)和其合適的混合物的溶劑或分散介質。可通過例如使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過保持所要求的顆粒大小，或者通過使用表面活性劑，來保持適當的流動性。可通過加入各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)來防止微生物的作用。在許多情況下，優選地在組合物中包含等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、或氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠可導致可注射組合物的長時吸收。
可通過將活性化合物以所需的量整合入合適的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液，所述溶劑按要求具有上面例舉的一種成分或成分的組合。一般地，通過將活性物質整合入無菌媒介物中來製備分散體，所述媒介物包含基本分散介質和所需要的來自上面例舉的成分中的其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法是真空乾燥法和冷凍乾燥法，所述方法產生活性成分和來自其前面無菌過濾的溶液的任何額外的想要的成分。
口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用的媒介物。為了口服治療性施用，可將活性化合物與賦形劑整合，並以片劑、錠劑或膠囊劑(例如，明膠膠囊)的形式使用。也可通過使用用作嗽口劑的流體媒介物製備口服組合物。可將藥物相容性粘合劑和/或佐劑材料作為組合物的部分包含在組合物中。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含下列成分中的任何成分、或性質相似的化合物粘合劑例如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑例如澱粉或乳糖，崩解劑例如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑例如膠體二氧化矽；甜味劑例如蔗糖或糖精；或矯味劑例如薄荷、水楊酸甲酯或橙矯味劑(orange flavouring)。
對於通過吸入的施用，以噴霧劑的形式從含有合適的推進劑例如氣體如二氧化碳的加壓容器或分配器中，或噴霧器中遞送化合物。
全身性施用也可以是通過透黏膜或透皮方式的施用。對於透黏膜或透皮施用，在製劑中使用適合於要滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在本領域是公知的，其包括，例如，對於透黏膜施用，去汙劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。可用鼻部噴霧劑或栓劑來實現透黏膜施用。可以以栓劑(例如，用常規的栓劑基體例如可可脂和其他甘油酯)的形式或用於直腸遞送的滯留型灌腸劑的形式製備化合物。
對於透皮施用，可將活性化合物配製成本領域公知的油膏、軟膏、凝膠或乳膏。
在一個實施方案中，活性化合物用將會防止所述化合物從身體中快速清除的媒介物進行製備，例如受控釋放製劑，包括植入物和微囊化的遞送系統。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。用於製備這些製劑的方法對於本領域技術人員來說是顯而易見的。也可通過商購從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.獲得所述材料。也可將脂質體混懸劑(包括用針對病毒抗原的單克隆抗體靶向經感染的細胞的脂質體)用作藥學上可接受的媒介物。可根據本領域技術人員已知的方法，例如，美國專利號4,522,811中描述的方法製備這些材料。
以劑量單位形式配製口服或腸胃外組合物對於施用的容易性和劑量的統一是有利的。此處使用的「劑量單位形式」優選地是指物理上分開的單位，該單位適合作為用於待治療的受試者的單位劑量；每個單位包含預先確定量的活性化合物和所需要的藥物媒介物，該量經計算可產生想要的治療效果。
可通過標準的藥學方法在細胞培養物或實驗動物中測定這些化合物的毒性和治療效果，例如，測定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(對群體的50％有治療效果的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數，其可表示為比例LD50/ED50。表現出高治療指數的化合物是優選的。儘管可使用表現出毒副作用的化合物，但應當小心地設計將這些化合物靶向受影響的組織位點的遞送系統，以便使對未感染的細胞的潛在損害降至最低，從而減少副作用。
獲自細胞培養測定法和動物研究的數據可用於配製一系列用於人的劑量。所述劑量優選地在包括具有很少毒性或無毒性的ED50的循環濃度的範圍之內。依賴於所使用的劑型和所採用的施用途徑，所述劑量可在該範圍內變化。對於用於本發明的方法的任何化合物，最初可根據細胞培養測定法估計治療有效劑量。可在動物模型中配製達到包含在細胞培養中測定的IC50(即，獲得症狀的半最大抑制的受試化合物的濃度)的循環血漿濃度範圍的劑量。這些信息可用於更準確地確定人中的有用劑量。可通過例如高效液相色譜來測量血漿中的水平。
確定個體的有效劑量的另一個實例是能夠直接測定受試者血清中的「游離的」和「結合的」化合物的水平。這些測定法可使用通過分子印記技術建立的抗體模擬物和/或「生物傳感器」。將能夠調節穿孔素活性的化合物用作模板或「印記分子」，以使在它們用催化劑進行聚合之前在空間上對可聚合的單體進行組織。隨後除去被印記的分子，留下聚合物基質，該基質包含所述化合物的重複的「負像」並且能夠在生物測定條件下選擇性地重新結合所述分子。該技術的詳細綜述可參見Ansell，R.J.等人(1996)Current Opinion inBiotechnology 789-94和Shea，K.J.(1994)Trends in PolymerScience 2166-173。這些「被印劑的」親和基質適合於配體結合測定法，其中固定的單克隆抗體組分被經適當地印記的基質替代。在該方法中這些基質的使用的實例可參見Vlatakis，G.等人(1993)Nature361645-647。通過使用同位素標記，可容易地監控調節穿孔素的表達或活性的化合物的「游離」濃度，所述濃度用於IC50的計算。也可設計這些「被印記的」親和基質，使其包含這樣的螢光基團，在靶化合物的局部和選擇性結合後，所述螢光基團的光子發射特性產生可測量的變化。使用合適的光纖設備可容易地實時檢測這些變化，反過來使得可基於其個體的IC50快速地最優化受試者中的劑量。在Kriz，D.等人(1995)Analytical Chemistry 672142-2144中討論了這樣的「生物傳感器」的初步實例。
如此處所定義的，重組穿孔素分子的治療有效量(即，有效劑量)優選地在大約0.001至30mg/kg體重、更優選地大約0.01至25mg/kg體重、更加優選地大約0.1至20mg/kg體重、和更為優選地大約1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg、或5至6mg/kg體重的範圍內變化。可在大約1至10周之間、優選地2至8周之間、更優選地3至7周之間和更加優選地大約4、5或6周之內每周一次地施用組合物。本領域技術人員會認識到，某些因素可影響有效地治療受試者所需的劑量和時間安排，所述因素包括使用的特定化合物的活性，受試者的年齡、體重、一般健康狀態、性別和飲食，施藥的時間，施藥的途徑，排洩速率，任何藥物組合，表達或活性被調控的程度，疾病或病症的嚴重度，以前的治療和其他疾病的存在。
對於抗體，優選的劑量一般是10mg/kg至20mg/kg。然而，如果抗體要在腦中起作用，那麼50mg/kg至100mg/kg的劑量通常是合適的。一般地，部分人抗體和完全人抗體在人體內具有比其他抗體更長的半壽期。因此，通常可能施用更低的劑量和施用更少的次數。可使用修飾例如脂化(lipidation)來穩定抗體和增強吸收和組織滲透(例如，進入腦)。Cruikshank等人((1997)J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirology 14193)描述了用於抗體的脂化的方法。
可將此處描述的本發明的核酸分子插入載體和用作基因治療載體。優選地，將所述核酸分子插入逆轉錄病毒載體，最優選地插入逆轉錄病毒載體pLXSN。通過例如靜脈內注射、局部施用(參見，美國專利號5,328,470)或通過趨實體性注射(stereotactic injection)(參見，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)可將基因治療載體遞送給受試者。基因治療載體的藥物製劑可包含在可接受的稀釋劑中的所述基因治療載體，或可包含將基因遞送媒介包埋在其中的緩釋基質。可選擇地，當可從重組細胞中完整地產生完全的基因遞送載體，例如逆轉錄病毒載體時，藥物製劑可包含一種或多種產生所述基因遞送系統的細胞。
可將藥物組合物和用於施用的說明書一起裝入容器、包裝或分配器中。
治療方法在本發明的另一個方面，提供了治療受試者的預防性或治療性方法，該受試者處於易患與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病的風險中或患有所述疾病。
在優選的實施方案中，所述預防性或治療性方法包括給受試者施用治療劑以治療、治癒、緩解、減輕、改變、醫治、改善、改良或影響疾病、疾病的症狀或對疾病易感的體質的步驟，所述受試者具有與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病、所述疾病的症狀或對所述疾病易感的體質，如上文所描述的。
在另一優選的實施方案中，所述預防性或治療性方法包括這樣的步驟，即給從受試者獲得的分離的組織或細胞施用治療劑，並將所述組織或細胞重新導入受試者以治療、治癒、緩解、減輕、改變、醫治、改善、改良或影響疾病、疾病的症狀或對疾病易感的體質，所述受試者具有與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病、所述疾病的症狀或對所述疾病易感的體質，如上文所描述的。
「治療劑」包括，但不限於，此處描述的小分子、肽、抗體、核酶和反義寡核苷酸。對於治療的預防性和治療性方法，可基於獲自藥物基因組學領域的知識，特異地改造或修飾這些治療法。「藥物基因組學(pharmacogenomics)」，如此處所用的，優選地是指將基因組技術例如基因測序、統計遺傳學和基因表達分析應用於臨床開發中的和市售的藥物。更優選地，所述術語是指患者的基因如何決定其對藥物的響應(例如，患者的「藥物響應表型」或「藥物響應基因型」)的研究。因此，本發明的另一個方面提供了根據個體的藥物響應基因型改造該個體的預防性或治療性治療法的方法，所述治療法使用本發明的穿孔素分子或調節穿孔素表達和/或活性的試劑(例如通過此處描述的篩選測定法鑑定的那些試劑)。藥物基因組學可使臨床醫師或內科醫師將預防性或治療性治療法靶向可從所述治療法獲得最多利益的患者和避免對將遭受和藥物相關的毒性副作用的患者進行該治療。
如果穿孔素的表達和/或活性過剩，那麼可獲得幾種治療方法。在一個優選的方法中，給受試者施用的治療劑是以對抑制穿孔素表達和/或活性有效的量存在的、上文中描述的、與藥學上可接受的媒介物一起的抑制劑化合物(拮抗劑)，從而其可治療、治癒、緩解、減輕、改變、醫治、改善、改良或影響所述疾病、所述疾病的症狀或對所述疾病易感的體質。例如，可施用能夠和內源穿孔素競爭結合的穿孔素分子的可溶形式。這些競爭者的優選的實施方案包含穿孔素多肽的片段，所述片段能夠結合天然的穿孔素，從而抑制其生物學活性，但不具有它們自身的固有的穿孔素活性。穿孔素拮抗劑也可包括抗體或其抗原結合片段(包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體，和FAb、F(ab′)2和FAb表達文庫片段、scFV分子和其表位結合片段)、寡核苷酸或穿孔素片段或結合天然穿孔素多肽並抑制所述天然穿孔素的生物學活性的其他小分子。
所述拮抗劑也可採用這樣的化合物的形式，即所述化合物影響靶細胞，從而可修飾靶細胞，使之不再對穿孔素作出反應或對穿孔素的反應減少。此處，治療不是直接針對穿孔素自身，而是針對靶細胞。這使得能夠更精確地靶向被穿孔素靶向的細胞，從而保護這些細胞免受進一步的攻擊。
通過本領域已知的任何診斷或預後測定法或其組合，本領域技術人員可鑑定穿孔素表達和/或活性過度的病狀和想要減少所述表達和/或活性的地方。例如，如在上文中描述的，可就穿孔素的表達和/或活性分析從受試者獲得的生物學樣品(例如，血液、血清、血漿、尿液、唾液和/或來源於其的細胞)。這樣的病狀包括，但不限於，青少年糖尿病(I型或胰島素依賴型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同種異體移植排斥和任何其他與細胞毒性T淋巴細胞或天然殺傷細胞介導的免疫病理學相關的病狀。
因此，在優選的實施方案中，本發明的預防性和治療性治療方法可用於治療和/或預防免疫介導的病狀，例如，但不限於青少年糖尿病(I型或胰島素依賴型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同種異體移植排斥和與細胞毒性T淋巴細胞或天然殺傷細胞介導的免疫病理學相關的病狀。
對於治療其中想要增加穿孔素表達和/或活性的病狀，也可獲得幾種方法。在一個優選的方法中，給受試者施用的治療劑是和藥學上可接受的媒介物組合的重組穿孔素多肽或通過前述的篩選測定法鑑定的化合物，其激活內源穿孔素的表達和/或活性，即上述的激動劑，從而可治療、治癒、緩解、減輕、改變、醫治、改善、改良或影響所述疾病、所述疾病的症狀或對所述疾病易感的體質。這樣的激動劑的優選的實施方案包括能夠結合天然的穿孔素以增加其生物學活性的穿孔素多肽的片段、和其片段和變體。穿孔素的激動劑還可包括抗體或其抗原結合片段(包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體，和FAb、F(ab′)2和FAb表達文庫片段、scFV分子和其表位結合片段)，或者結合天然的穿孔素多肽並增強所述天然穿孔素的生物學活性的其他小分子。
相反地，至於拮抗劑，本發明也提供了這樣的化合物，所述化合物是可修飾靶細胞以使所述細胞變得對穿孔素更具有反應性的激動劑。該化合物有助於修飾可被靶向以被穿孔素清除的細胞。可將用於本方法的化合物附著於鑑定部分(例如抗體)，以使所述部分鑑定需要清除的細胞。
優選地將激動劑用於病狀(其中想要增加穿孔素的活性)的治療性和預防性目的，所述病狀包括，但不限於，與病毒感染相關的疾病(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和C型肝炎)、各種癌症(例如淋巴瘤)和結核病。優選地，將激動劑用於治療其中希望增強細胞裂解性T淋巴細胞活性的病狀。也可將激動劑用於與穿孔素缺乏(例如HLH和更優選地FHL)的治療性和預防性目的。
因此，在優選的實施方案中，本發明的預防性和治療性治療方法可用於治療和/或預防病毒感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和C型肝炎)、各種癌症(例如淋巴瘤)、結核病、其中通常希望增強細胞裂解性T淋巴細胞活性的病狀和與穿孔素缺乏相關的病狀例如HLH和更優選地FHL。
可選擇地，可將基因療法用於影響需要該治療的受試者的細胞對穿孔素的內源表達，所述受試者包括，但不限於，大鼠、小鼠、狗、貓、牛、馬、兔子、猴子和最優選地人。例如，包含驅動穿孔素或其生物學活性片段表達的逆轉錄病毒載體的生產者細胞(如在上文中所描述的)可被施用給受試者以在體內改造細胞，使所述細胞在體內表達重組穿孔素多肽。對於基因療法的綜述，參見例如，第20章，GeneTherapy and other Molecular Genetic-based TherapeuticApproaches，(和此處引用的參考文獻)，Human Molecular Genetics，Strachan T.和Read A.P.，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
此外，根據本發明，還可以使用抑制靶基因表達的反義分子和核酶分子以降低靶基因表達的水平。此外，可將三股螺旋分子用於降低靶基因表達的水平。
如此處所用的，術語「反義」優選地是指與編碼上文中描述的穿孔素或其片段或變體的核酸互補，例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與編碼穿孔素或其片段或變體的mRNA序列互補的核苷酸序列。反義核酸優選地與整個穿孔素編碼鏈互補，或只與其部分互補。在另一實施方案中，反義核酸分子與編碼穿孔素或其片段或變體的核苷酸序列的編碼鏈的「非編碼區」(例如，5′和3′非翻譯區)反義。
可這樣設計反義核酸以使其與穿孔素的整個編碼區互補，但更優選地其是這樣的寡核苷酸，即該寡核苷酸只是與穿孔素mRNA的編碼或非編碼區的部分反義。例如，反義寡核苷酸可與圍繞穿孔素mRNA的翻譯起始位點的區域互補。反義寡核苷酸在長度上可以是，例如，大約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多個核苷酸。
可通過使用本領域已知的方法，使用化學合成和酶促連接反應來構建本發明的反義核酸。例如，可使用天然發生的核苷酸或經各種修飾的核苷酸通過化學的方法合成反義核酸(例如，反義寡核苷酸)，所述經各種修飾的核苷酸被設計用來增加所述分子的生物學穩定性或增加反義和有義核酸之間形成的雙螺旋的物理穩定性，例如，可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。也可使用這樣的表達載體通過生物學的方法來產生反義核酸，在所述表達載體中，以反義的方向亞克隆了核酸(即，從插入的核酸轉錄的RNA對於目的靶核酸來說具有反義方向)。
在本發明的另一實施方案中，根據本發明，還可使用抑制靶基因表達的穿孔素短幹擾性核酸分子(siRNA)以降低靶基因表達的水平。
術語「穿孔素短幹擾性核酸(perforin short interferingnucleic acid)」、「穿孔素siNA」、「穿孔素短幹擾性RNA」、「穿孔素siRNA」、「穿孔素短幹擾性核酸分子」、「穿孔素短幹擾性寡核苷酸分子」、或「化學修飾的穿孔素短幹擾性核酸分子」，如此處所用的，優選地是指能夠抑制或下調穿孔素基因表達的任何核酸分子，例如通過以序列特異性的方式介導RNA幹擾(「RNAi」)或基因沉默。化學修飾也可用於本發明的任何siNA序列。例如，siNA可以是包含自我互補的有義和反義區域的雙鏈多核苷酸分子，其中所述反義區域包含和編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而有義區域具有對應於編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。可從兩個分開的寡核苷酸來裝配siNA，其中一條鏈是有義鏈，而另一條鏈是反義鏈，其中所述反義和有義鏈是自我互補的(即，每條鏈包含與另一條鏈中的核苷酸序列互補的核苷酸序列；例如在反義鏈和有義鏈形成雙螺旋或雙鏈結構的地方，例如其中雙鏈區為大約19個鹼基對)；反義鏈包含與編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而有義鏈包含對應於編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。可選擇地，從單個寡核苷酸裝配siNA，其中siNA的自我互補的有義和反義區域通過基於核酸或基於非核酸的連接體連接。siNA可以是具有髮夾二級結構的多核苷酸，該髮夾結構具有自我互補的有義和反義區域，其中反義區域包含與在分開的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互補的核苷酸序列，而有義區域具有對應於編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。siNA可以是具有兩個或多個環結構的環狀單鏈多核苷酸，莖部包含自我互補的有義和反義區域，其中反義區域包含與編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列，而有義區域具有對應於編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，其中可在體內或體外加工環狀多核苷酸以產生能夠介導RNAi的活性siNA分子。siNA也可包含這樣的單鏈多核苷酸，所述單鏈多核苷酸具有與編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列(例如，當這些siNA分子不要求對應於編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列存在於siNA分子中時)，其中單鏈多核苷酸可進一步包含末端磷酸基團，例如5』-磷酸或5』，3』-二磷酸。在優選的實施方案中，本發明的siNA分子包含分開的有義和反義序列或區域，其中所述有義和反義區域通過本領域已知的核苷酸或非核苷酸連接體分子共價連接，或可選擇地通過離子相互作用、氫鍵、範德華相互作用、疏水相互作用和/或堆垛(stacking)相互作用而非共價地連接。在另一實施方案中，本發明的siNA分子包含與編碼穿孔素或其部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發明的siNA分子以導致抑制穿孔素基因表達的方式與編碼穿孔素的核苷酸序列相互作用。如此處所用的，siNA分子不必被限定於只含有RNA的分子，相反地還可包括含有經化學修飾的核苷酸的分子或與非核苷酸組合的分子。在某些優選的實施方案中，本發明的siNA分子缺少含有2′-羥基(2′-OH)的核苷酸。然而，這樣的siNA分子可具有含有一個或多個具有2′-OH基團的核苷酸的附著的連接體或其他附著的或結合的基團、部分或鏈，所述siNA分子不要求核糖核苷酸存在於siNA分子中以支持RNAi。任選地，本發明的siNA分子在大約5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置上可包含核糖核苷酸。經修飾的本發明的siNA分子也可稱為短幹擾性經修飾的寡核苷酸「siMON」。如此處所用的，術語siNA優選地表示等同於用於描述能夠介導序列特異性RNAi的核酸分子的其他術語，例如短幹擾性RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、短幹擾性寡核苷酸、短幹擾性核酸、短幹擾性經修飾的寡核苷酸、經化學修飾的siRNA、轉錄後基因沉默RNA(ptgsRNA)、翻譯沉默等。此外，如此處所用的，術語RNAi優選地表示等同於用於描述序列特異性RNA幹擾的其他術語，例如轉錄後基因沉默或實驗胚胎學(epigenetics)。例如，本發明的siNA分子可用於在實驗胚胎學上於轉錄後水平或轉錄前水平來沉默基因。在非限制性的實例中，通過本發明的siNA分子的穿孔素基因表達的實驗胚胎學調控可以是由siNA介導的染色質結構的修飾從而改變穿孔素基因表達而造成的。
一般給受試者施用(例如，通過在組織位點直接注射)本發明的反義和短幹擾性RNA分子，或在原位產生所述分子，以使其和編碼穿孔素的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結合，從而抑制所述穿孔素的表達，例如通過抑制轉錄和/或翻譯。可選擇地，可修飾所述分子以使其靶向選擇的細胞，然後進行全身性施用。對於全身性施用，可這樣修飾反義分子或siRNA分子，即使其特異性地結合表達在選擇的細胞表面上的受體或抗原，例如通過將所述分子連接至和細胞表面受體或抗原結合的肽或抗體。也可使用載體或通過病毒機制(例如逆轉錄病毒或腺病毒感染遞送)將所述分子遞送至細胞。為獲得足夠的所述分子的細胞內濃度，使用其中將所述分子置於合適的啟動子控制之下的載體構建體。
在另一個實施方案中，本發明的反義核酸分子是α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子和互補RNA形成特殊的雙鏈雜交物，在所述雙鏈中，和一般的α-單位相反，鏈相互之間平行排列(Gaultier等人，(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。反義核酸分子也可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合型RNA-DNA類似物(Inoue等人，(1987)FEBSLett.215327-330)。
在另一個實施方案中，本發明的反義核酸是核酶。對於編碼穿孔素的核酸分子具有特異性的核酶可包含一個或多個與此處公開的穿孔素cDNA的核苷酸序列互補的序列，和具有已知的負責mRNA切割的催化序列的序列(參見美國專利號5,093,246，或Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591)。例如，可構建四膜蟲L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與在編碼穿孔素的mRNA中待切割的核苷酸序列互補(參見，例如，Cech等人，美國專利號4,987,071；和Cech等人，美國專利號5,116,742)。可選擇地，穿孔素mRNA可用於從RNA分子庫中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA(參見，例如，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418)。
在另一實施方案中，可通過將與穿孔素的調控區(例如，穿孔素啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列靶向該調控區以形成三股螺旋結構來抑制穿孔素的表達，所述三股螺旋結構阻止了穿孔素基因在靶細胞中的轉錄(一般參見，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15)。可通過產生所謂的「曲折(switchback)」核酸分子來增加可被靶向形成三股螺旋的潛在序列。以交替的5′-3′、3′-5′方式合成曲折分子，這樣可使其和雙螺旋的第一條鏈鹼基配對，接著和另一條鏈鹼基配對，從而消除了對在雙螺旋的一條鏈上要存在相當大的嘌呤或嘧啶段落的需要。
也可在鹼基部分、糖部分或磷酸主鏈上對反義分子進行修飾，從而改善例如所述分子的穩定性、雜交性或溶解度。例如，可對核酸分子的脫氧核糖磷酸主鏈進行修飾以產生肽核酸(參見Hyrup B.等人(1996)Bioorganic Medicinal Chemistry 4(1)5-23)。此處所用的術語「肽核酸」或「PNA」是指核酸模擬物，例如，DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸主鏈被假肽主鏈替代，只保留4個天然的核鹼基。PNA的中性主鏈可使其在低離子強度下與DNA和RNA進行特異性雜交。可使用在Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe等人Proc.Natl.Acad.Sci.9314670-675中描述的標準固相肽合成方案進行PNA寡聚物的合成。
穿孔素核酸分子的PNAs可用於治療性和診斷性應用。例如，PNAs可用作反義或反基因試劑，以用於序列特異性地調控基因表達，例如通過誘導轉錄或翻譯阻礙或者抑制複製。穿孔素核酸分子的PNAs也可用於分析基因中的單個鹼基對突變(例如，通過PNA指導的PCR鎖止技術(PCR clamping))；當和其他酶(例如，S1核酸酶(Hyrup B.(1996)同上))一起使用時用作人造限制性酶；或用作DNA測序或雜交的探針或引物(Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe同上)。
在其他實施方案中，反義分子可包含其他附著的基團例如肽(例如，用於在體內靶向宿主細胞受體)，或幫助轉運穿過細胞膜(參見，例如，Letsinger等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；PCT公開號WO88/09810)或血腦屏障(參見，例如，PCT公開號WO89/10134)的試劑。此外，可用雜交觸發的切割試劑(參見，例如，Krol等人(1988)BioTechniques 6958-976)或嵌入劑(參見，例如，Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)來修飾反義分子。所以，可將寡核苷酸綴合至另一個分子(例如，肽、雜交觸發的交聯劑、轉運劑或雜交觸發的切割試劑)。
可能的是，使用反義分子、siRNA、核酶和/或三股螺旋分子以減少或抑制突變基因表達也可以減少或抑制由正常靶基因等位基因產生的mRNA的轉錄(三股螺旋)和/或翻譯(反義分子、核酶)，這樣存在的正常靶基因產物的濃度可以低於正常表型所需的濃度。在這樣的情況下，可通過基因療法的方法將編碼和表達表現正常靶基因活性的靶基因多肽的核酸導入細胞。
另一種可將核酸分子用於治療或預防特徵在於不希望的穿孔素表達和/或活性的疾病的方法是通過使用對於穿孔素具有特異性的適體(aptamer)分子。適體是具有使其能夠特異性地結合蛋白質配體的三級結構的核酸分子(參見，例如，Osborne等人(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1(1)5-9；和Patel，D.J.(June 1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1(1)32-46)。因為在許多情況下核酸分子可能比治療性蛋白質分子更方便地被導入靶細胞中，因此適體提供了這樣的方法，通過該方法，可在不導入可能具有多能性效果的藥物或其他分子的情況下特異性地降低穿孔素的活性。
和與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病或病狀的治療一起，也可考慮藥物基因組學(即，個體的基因型和該個體對外源化合物或藥物的反應之間的關係的研究)。在治療劑的機制上的差異可通過改變藥物活性藥物的劑量和血液濃度之間的關係而導致嚴重的毒性或治療失敗。因此，內科醫師或臨床醫師可考慮應用在相關藥物基因組學研究中獲得的知識來確定是否施用治療劑以調節穿孔素的表達和/或活性，以及改變這樣的治療的劑量和/或治療方案。
藥物基因組學涉及在對藥物的反應方面臨床上顯著的遺傳變異，該變異是由於受影響的人中的改變了的藥物處置和異常作用造成的。參見，例如，Eichelbaum，M.等人(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)983-985和Linder，M.W.等人(1997)Clin.Chem.43(2)254-266。一般地，可區分兩種類型的藥物基因組學狀況。作為改變藥物對身體的作用方式(改變的藥物作用)的單因子進行遺傳的遺傳狀況，或作為改變身體對藥物的作用方式(改變的藥物代謝)的單因子進行遺傳的遺傳狀況。這些藥物基因組學狀況可作為罕見的遺傳缺陷或作為天然發生的多態性發生。
鑑定預知藥物反應的基因的一個藥物基因組學方法，稱作「全基因組關聯分析法(genome-wide association)」，主要基於由已知的基因相關標記物構成的人基因組的高解析度圖譜(例如，由60,000-100,000個人基因組上的多態性或可變位點構成的「雙等位(bi-allelic)」基因標記物圖譜，其中每個位點具有兩個變體)。可將這樣的高解析度遺傳圖譜和統計學上顯著數目的患者中的每一位患者的基因組圖譜進行比較，以鑑定與特定的觀察到的藥物反應或副作用相關的標記物，所述患者參加了II/III期藥物試驗。可選擇地，可從人基因組中大約1千萬個已知的單核苷酸多態性(SNPs)的組合產生這樣的高解析度圖譜。如此處所用的，「SNP」是發生在一段DNA中的單個核苷酸鹼基中的一般改變。例如，SNP可在每1000個DNA的鹼基中發生一次。SNP可能涉及疾病的進展，然而，絕大部分SNP可能與疾病無關。如果遺傳圖譜基於這樣的SNPs的發生，則依賴於其個體基因組中的SNPs的特定模式，可將個體分類成不同的遺傳類別。以這樣的方式，考慮到在這些遺傳上相似的個體中共同存在的性狀，可修改治療方案使之適合遺傳相似的個體的群體。
可選擇地，可使用稱為「候選基因方法」的方法鑑定預知藥物反應的基因。根據該方法，如果已知編碼藥物的靶(例如，穿孔素)的基因，那麼在群體中可相當容易地鑑定該基因的所有共同變體，並且可確定相對於另一個基因版本具有一個基因版本是否和特定的藥物反應相關。
可選擇地，可使用稱為「基因表達特性作圖(gene expressionprofilling)」的方法鑑定預知藥物反應的基因。例如，被施予藥物(例如，根據本發明的穿孔素分子或穿孔素表達的調節劑)的動物的基因表達可提供表明與毒性相關的基因途徑是否已經打開的指示。
從超過一個的上述藥物基因組學方法產生的信息可用於確定個體的預防性或治療性治療的合適的劑量和治療方案。該知識，當用於按劑量給藥或藥物選擇時，可避免不利的反應或治療失敗，從而在用前述治療劑治療受試者時，增強了治療或預防功效。
可在臨床試驗中監控試劑(例如，藥物)對穿孔素的表達和/或活性的影響。例如，可在表現出減少的穿孔素表達和/或活性的受試者的臨床試驗中，監控通過此處描述的篩選測定法鑑定的化合物對於增加穿孔素表達和/或活性的有效性。可選擇地，在表現出增加的穿孔素表達和/或活性的受試者的臨床試驗中，監控通過篩選測定法確定的試劑對於降低穿孔素表達和/或活性的有效性。在這些臨床試驗中，穿孔素的表達和/或活性，和優選地涉及例如與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的病狀的其他基因(即，代用標記(surrogate markers))可用作特定細胞的表型的「讀出器(read out)」或標記。
本領域技術人員也會充分認識到上述的治療方法可以以許多相互之間的組合方式或者與目前在本領域中使用的其他治療方案組合的方式使用。
現在將更全面地描述用於本發明的方法的實例。然而，應當理解，下列描述僅僅是舉例說明性的，並且無論如何不應當被當作對上述的發明概要的限制。
實施例實施例1野生型小鼠穿孔素在RBL細胞中的表達A.穿孔素的表達下列描述包括用於野生型小鼠穿孔素的重組表達、分析和評估的材料和方法。
i)細胞培養將細胞系RBL-2H3(美國模式培養物保藏所-ATCC)、293T(人胚胎腎)和EL-4(小鼠胸腺瘤)培養在Dulbecco′s改良的Eagle′s(DME)培養基中，該培養基補充有10％胎牛血清(FCS)、2mM穀氨醯胺(Commonwealth Serum Laboratories，Parkville，Melbourne，Australia(CSL))和各100μg/ml的鏈黴素和青黴素(Gibco，GrandIsland，New York)。將細胞系在37℃下、10％的CO2中培養在加溼的培養箱中。為了收穫RBL-2H3和293T細胞，用PBS洗滌細胞一次，加入胰蛋白酶-EDTA溶液(CSL，Australia)以將細胞從組織培養瓶上分離下來。在使用前用PBS洗滌細胞一次。
(ii)編碼野生型小鼠穿孔素的質粒載體的產生在圖2中描述了使用逆轉錄病毒轉導進行在RBL細胞中的野生型小鼠穿孔素(Pfp)的表達的總體策略。該策略以概述的形式提供了下面概括的實驗方案。
iii)Pfp cDNA亞克隆入MSCV為了將Pfp cDNA亞克隆入鼠幹細胞逆轉錄病毒載體，MSCV(由Prof.Steve Jane，Royal Melbourne Hospital，Melbourne友好地提供)中，使用在5』整合了EcoRI和XhoI位點的寡核苷酸(Geneworks，Australia)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出1.8kb的DNA片段。
有義5′CTCGAATTCGCATCATGGCCACGTGC 3′；反義5′CTATCTCGAGTTACCACACAGCCCCACTG 3′。
用於該反應的模板DNA是含有穿孔素cDNA的pEF-PGKpuroA構建體，所述穿孔素cDNA是先前使用RT-PCR從來自小鼠淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞系，IMS-II的RNA擴增出的。在50μl體積中進行PCR，在Pfu聚合酶緩衝液中包含5ng模板DNA、2.5個單位的Pfu聚合酶(Promega，NSW，Australia)、50uM dNTP混合物和12.5pmol的每種引物。在PTC-200 Peltier Thermal cycler(MJ Research Inc.Massachusettes)中進行反應，所述反應由下列循環構成1個循環，在94℃下進行2分鐘(變性)；然後25個循環，在94℃下進行30秒，60℃下進行30秒(退火)，72℃下進行4.5分鐘(合成)，和最後1個循環，在72℃下進行7分鐘。通過在1％(w/v)的瓊脂糖/TBE(89mM Tris-硼酸鹽pH8.0，89mM硼酸，2mM EDTA)凝膠上進行電泳來分離PCR產物，並通過加入1μl溴化乙錠(10mg/ml)來顯現產物。從膠上將DNA條帶切割下來，並根據廠商說明書使用Jetsorb DNA Gelextraction kit(Genomed，Inc.USA)進行純化。
通過用EcoRI和XhoI(Promega，NSW，Australia)進行消化來製備用於亞克隆的純化的PCR產物。反應體系含有EcoRI和XhoI(各1U)、100ng DNA、適合於各酶的限制性酶緩衝液，將其在37℃下溫育過夜。在14℃下，使用T4DNA連接酶(Promega，Australia)(1U)將經消化的cDNA(60μg)與先前用EcoRI和XhoI消化的MSCV DNA(50ng)在連接酶緩衝液中連接過夜。
(iv)感受態細菌的轉化將大腸桿菌菌株Top 10F細菌(100μl)和4μl MSCV-Pfp連接混合物(上述)混合併在冰上溫育30分鐘。將細菌加熱至42℃並維持45秒，然後置於室溫下5分鐘。加入Luria-Bertani液體培養基(LB-液體培養基)(900μI)，並將混合物在37℃下搖動培養1小時。然後將轉化反應體系塗板在補充有氨苄青黴素和四環素(各10μg/mL)的LB培養基板上，並在37℃培養過夜。隨機挑揀轉化子，並將其在2ml補充有10μg/mL氨苄青黴素和四環素的LB-液體培養基中於37℃下培養過夜以進行進一步分析。
(v)質粒DNA的小規模製備按照廠商說明書使用miniprep plasmid purification kit(MoBio Lab Inc.USA)從細菌細胞中分離來自所述過夜培養物的質粒DNA。通過用EcoRI和XhoI進行限制性酶消化和進行瓊脂糖凝膠電泳來確認質粒的同一性。對含有cDNA插入的Miniprep克隆進行全長測序以證實沒有引入PCR相關的突變。使用自動Big Dye Terminator反應方案(按照廠商說明書)進行測序，並在University of New SouthWales(Australia)的自動DNA分析裝置上進行分析。
(vi)質粒DNA的大規模製備經測序的Pfp DNA的大規模製備通過「鹼裂解」法獲得，並在CsCl-溴化乙錠梯度上進行純化。通過在4000rpm下在RC-C Sorval離心機(Sorval Instruments，Du Pont)中離心10分鐘從500ml於LB-液體培養基中的過夜培養物之中沉澱出細菌，所述LB-液體培養基補充有氨苄青黴素和四環素(50μg/ml)。將沉澱重懸浮在10ml溶液1(50mM葡萄糖，25mM TrisCl，pH8，10mM EDTA，pH8)中，在冰上於20ml溶液2(0.2M NaOH，1％SDS)中裂解10分鐘，並在冰上於15ml溶液3(3M醋酸鉀，pH4.8)中中和pH值10分鐘。通過在4000rpm下離心10分鐘除去細胞碎片，並將含有質粒DNA的上清液通過粗棉布(cheesecloth)進行過濾。在冰上通過加入35ml異丙醇使DNA沉澱15分鐘，並在4℃下以12,000rpm沉澱15分鐘。用70％的乙醇洗滌沉澱，然後再用無水乙醇洗滌沉澱，在室溫下乾燥並重懸浮在10ml ddH2O中。通過向質粒DNA中加入10.7g CsCl和500μl溴化乙錠溶液(10mg/ml)來建立CsCl梯度。在3200rpm下對沉澱碎片離心5分鐘後，將樣品加載至Beckman Polyllomor Bell-top Quick-seal離心管(Beckman Instruments Inc.，CA，USA)中，並在Beckman TL-100超速離心機(Beckman Instruments Inc.)中於20℃下以55,000rpm離心過夜。用26號針回收DNA條帶，通過用等體積的異戊醇洗滌樣品3次來提取溴化乙錠，在4℃下用2.5倍體積的無水乙醇沉澱DNA過夜。在4℃下以13,000rpm沉澱樣品15分鐘，在70％的乙醇中洗滌DNA，乾燥，並重懸浮在TE緩衝液pH7.4中。通過在1％的瓊脂糖凝膠上顯現和在260nm處測量吸光度來對DNA進行定量。
(vii)使用逆轉錄病毒表達系統的Pfp的表達使用逆轉錄病毒表達系統的穿孔素的表達利用了MSCV載體(圖3)的幾個特性。該雙順反子質粒包含數個使得能夠選擇經轉導的細胞的特性1)兼嗜性MSCV 5′長末端重複(LTR)；2)綠色螢光蛋白(GFP)的cDNA；3)腦心肌炎內部核糖體進入位點(IRES)；和4)細菌複製起始位點和氨苄青黴素抗性基因。IRES允許兩個基因在同一條mRNA鏈上被轉錄，因此可將標記置於要轉錄的主基因的下遊，所述兩個基因將被分開翻譯。使細胞在紫外光下發螢光的GFP的表達，用作穿孔素的代用標記，並且使得可以選擇表達高水平轉基因的細胞。
(viii)用於Pfp表達的重組病毒的產生將編碼穿孔素基因的MSCV DNA(MSCV-Pfp)瞬時轉染入293T包裝細胞系中，該包裝細胞系將病毒顆粒分泌至以後用於感染RBL細胞的培養物上清液中。兼嗜性輔助質粒的共轉染提供了具有病毒包膜蛋白的逆轉錄病毒DNA，所述包膜蛋白被大量哺乳動物細胞上的兼嗜性受體識別，從而促進外源基因的遞送。首先，將293T細胞(5×105)塗板在100mm的皮氏培養皿中過夜，在轉染前3小時，用新配製的完全DMEM替換所述培養基。按照廠商說明書通過磷酸鈣沉澱法(Gibco)用MSCV載體DNA或MSCV-Pfp DNA轉染細胞。在轉染的當天，通過將25μl 2M CaCl2、10μg質粒DNA(10mM Tris-Cl，pH7.5中)、10μg編碼gag和pol基因的輔助質粒和水混合，產生200μl的終體積，來製備DNA-CaCl2溶液。還製備由100μl 500mM HEPES-NaOH(pH7.1)、125μl 2M NaCl、10μl 150mM NaHPO4-NaH2PO4(pH7.0)和水組成的終體積為1ml的沉澱緩衝液。向200μl沉澱緩衝液中逐滴加入200μl DNA-CaCl2溶液並不斷地攪拌該混合物。將所述混合物在室溫下保持30分鐘，將所得的細沉澱加入至293T包裝細胞的培養皿中。將細胞暴露於所述DNA沉澱24小時，然後用新配製的完全DMEM替換培養基。48小時後，收穫細胞並就GFP的表達對細胞進行分析。通過使用FACScan(Becton Dickinson，San Hose，CA)的流式細胞術測量的GFP的表達確定了轉染效率，所述轉染效率是上清液中的病毒滴度的指徵。收集來自效率最高的轉染(＞30％表達GFP的細胞)的培養物上清液，並以1.5ml的等分試樣貯存以用於RBL細胞的轉導(參見下面)。
(ix)使用富含病毒的上清液的RBL細胞的轉導為進行使用逆轉錄病毒的轉導，將RBL細胞以(1ml完全DME-M中2×105)置於6孔板中。在4μg/ml polybrene存在的情況下，將細胞和逆轉錄病毒上清液以12小時的間隔混合6次，讓其恢復72小時，然後在FACStar細胞分選器上通過流式細胞術分析GFP的表達。選擇具有最大GFP表達(高達5％的細胞)的群體中的細胞用於進一步的擴增，並就穿孔素表達和功能分析進行篩選。
B.Pfp表達的分析(i)細胞裂解物的製備通過Western印跡法來分析用MSCV-Pfp轉導的RBL細胞的裂解物以就蛋白質表達進行篩選。收穫細胞並將其在NP-40裂解緩衝液(25mM Hepes緩衝液，pH7，0.25mM NaCl，2.5mM EDTA，0.1％Nonidet-P40(NP-40)，0.5mM DTT，和蛋白酶抑制劑的混合物(Roche，Germany))中重懸浮(2×107/ml)。將細胞在冰上溫育20分鐘，然後在13000rpm下沉澱以除去細胞碎片。在等體積的含有還原劑的2X樣品緩衝液(1.52g Tris鹼，20ml甘油，2g SDS，2ml 2-巰基乙醇，1mg溴酚藍，pH6.8，用水加至100ml)中稀釋收集的上清液，在95℃下煮沸5分鐘，並加載到10％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠上。
(ii)蛋白質的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和免疫檢測按照Mini-Protean II Electrophoresis Cell(Bio-Rad，USA)說明書裝配聚丙烯醯胺凝膠。通過4.5％積層膠(0.8ml 30％丙烯醯胺/雙，2.95ml ddH2O、1.25積層緩衝液，50μl 10％APS，10μl TEMED)和10％分離膠(2.75ml 30％丙烯醯胺/雙，3.25ml ddH2O、2ml分離緩衝液、50μl 10％APS，10μl TEMED)解析蛋白質樣品。在160V下在走樣緩衝液(0.1％SDS，25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸)中進行電泳。使用Trans-Blot SD Semi Dry Transfer Cell(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)將通過SDS-PAGE分離的蛋白質轉移至Western轉移緩衝液(48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇，pH9.2)中的硝酸纖維素『Immobilon』膜(Millipore Bedford，MA)上。在14V、0.5A下進行轉移30分鐘。在5％脫脂奶粉/PBS中封閉蛋白質與膜的非特異性結合1小時，然後用初級大鼠抗小鼠穿孔素抗體，PI-8(母液濃度1.7mg/ml；由Dr H.Yagita，Juntendo University School of Medicine，Tokyo，Japan友好地提供)進行探測，所述抗體在5％的脫脂牛奶緩衝液中作1/1000的稀釋。在0.05％/Tween PBS中洗滌膜(3×8分鐘)，然後用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的第二山羊抗大鼠抗體(1/10000稀釋度)在室溫下溫育1小時來檢測結合的大鼠Ig。如前面一樣洗滌膜，通過使用Enhanced Chemiluminescence(ECL)Detection System(Amersham International，UK)並暴露於X-OMAT AR Imaging膠片(Eastman Kodack company，Rochester，NY，USA)來顯現結合的抗體。也可用抗微管蛋白抗體(Sigma)(1/3000)來探測在該Western印跡法中使用的膜以確保相等的蛋白質上樣。
(iii)使用抗TNP IgE抗體標記RBL細胞標記條件的最優化如在下文中描述的，在4小時51Cr釋放測定法(參見2.5節)中評估表達MSCV-Pfp的RBL細胞殺死小鼠胸腺瘤EL-4靶細胞的能力。所述測定法(以前由Shiver等人，1991進行過描述)包括使用抗三硝基苯基(TNP)IgE抗體，該抗體將RBL細胞上的Fcε受體與TNP-標記的靶細胞交聯，從而刺激顆粒分泌(圖4)。為確定對於抗TNP IgE結合的最佳濃度，在各種條件下標記RBL細胞，並通過流式細胞術檢測表面結合。用不同稀釋度的含有抗TNP IgE抗體(母液濃度2μg/ml)的雜交瘤培養物上清液(由Prof M.Hogarth，Austin ResearchInstitute，Melbourne，Australia友好地提供)標記1×106個細胞。在PBS中建立1/2、1/10、1/50或1/100的抗體稀釋度，並在37℃下溫育1小時。洗滌細胞3次，然後用1.25μg/ml的生物素綴合的抗小鼠IgE抗體(PharMingen)溫育細胞1小時。在加入0.5μg/ml的鏈黴親和素-PerCP以進行通過流式細胞術的分析之前洗滌細胞3次。為確定抗體結合的最佳條件，在1/2稀釋度的抗TNP IgE雜交瘤上清液中溫育細胞，在37℃下溫育15或60分鐘，在4℃下溫育15或60分鐘。為進行表面標記的檢測，如上所述溫育細胞並通過流式細胞術進行分析。
C.Pfp細胞裂解功能的評估(i)使用51Cr和TNP對EL-4靶細胞進行雙重標記EL-4細胞用51Cr加載和用TNP半抗原進行標記以將該細胞用作下面概述的細胞的細胞毒性測定法中的靶細胞。用簡單的DME培養基洗滌細胞2次，在100μl相同的培養基中重懸浮細胞。在37℃下用100μCi51Cr標記細胞1小時，並用簡單的培養基洗滌3次以除去51Cr。然後用TNP標記所述細胞，通過在37℃下將細胞以5×106/ml重懸浮在1mM TNBS(Fluka)溶液(pH7.4)中進行該標記過程。在PBS中洗滌細胞3次，然後以1×106/ml懸浮在1％牛血清白蛋白(BSA)/DME培養基中以用於細胞毒性測定法。
(ii)使用IgE抗體標記RBL細胞通過將RBL細胞以5×106/ml重懸浮在含有抗體的PBS中，用抗TNP IgE抗體標記該細胞。在37℃下溫育細胞1小時，然後在PBS中洗滌細胞3次，並以1×107/ml重懸浮在含有1％BSA(CSL，Australia)的DME-M中以用於細胞毒性測定法。
(iii)51鉻釋放細胞毒性測定法通過將IgE-標記的效應細胞和51Cr/TNP標記的靶細胞以一系列效應細胞靶細胞的比率在200μl含有1％BSA的培養基中混合來在51Cr釋放測定法中評估細胞死亡。在96孔V形底微量滴定板中進行實驗。通過僅使用培養基溫育靶細胞來確定51Cr的自發釋放，和通過加入HCl至1M的終濃度來確定最大釋放。作為負對照，向反應體系中加入EGTA(最終為2mM)。4小時後，將板在1500rpm下離心，收穫100ul上清液，並通過Wizard 1470 Gamma計數器測量釋放的放射性。
細胞毒性表示為減去自發釋放後的特異性51Cr釋放百分數。如下計算特異性裂解百分數100×[(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)]。
A.使用逆轉錄病毒表達系統在RBL細胞中表達穿孔素使用基於MSCV載體的逆轉錄病毒介導的方法在RBL細胞中獲得了穿孔素的表達。使用MSCV-Pfp構建體進行的293T包裝細胞的轉染產生了富含用於轉導RBL細胞的逆轉錄病毒的培養基。轉染後3天，就GFP的表達對293T細胞進行流式細胞術分析，將其評估為轉染效率的估計。以面已在大量的實驗中顯示，在超過30％的293T細胞中的GFP表達是培養物上清液中存在高達1.5×107pfu/ml感染性病毒的病毒滴度的可靠指徵(Dr.S Jane，Royal Melbourne Hospital，私人通訊)。因此一般不進行正式的病毒噬斑測定法。如圖5中所示，轉染後3天，超過50％的用MSCV-Pfp質粒轉染的293T細胞具有強螢光，表明GFP表達。這和在使用空MSCV載體DNA的情況下看到的GFP的表達水平相當。如所預期的，單獨用輔助質粒(藍色實線)轉染的293T細胞不表達GFP。
然後，用來源於293T細胞轉染的病毒上清液轉導RBL細胞。然後以相似的方式，使用GFP作為表達穿孔素的RBL細胞的標記，進行流式細胞術分析。圖6A中的柱狀圖揭示出表達高水平的GFP的小群體(一般在0.1和5％之間)，該小群體被描述為M1門控區域(M1 gatedregion)。分離和擴增空MSCV-和MSCV-Pfp-感染的細胞，從而產生其中超過95％的細胞表達代用標記的群體(圖6B)。連續的分析顯示GFP在連續培養超過8周的細胞中穩定表達。
然後就蛋白質的表達通過Western印跡法對經轉導而表達MSCV-Pfp的RBL細胞進行分析。如圖7所示，在用MSCV-Pfp轉導的RBL細胞中鑑定了對應於穿孔素的67kDa免疫反應性條帶，但在親本RBL細胞中或用未修飾的空載體轉導的RBL細胞中都未顯示任何的穿孔素表達。
B.使用IgE抗體的RBL細胞的最佳標記條件作為細胞毒性測定法的前奏，用抗TNP IgE抗體標記RBL細胞以確定IgE結合(作為溫度、時間和抗體濃度的函數)的最佳條件。用各種抗體濃度溫育的RBL細胞的流式細胞術分析顯示，1/2或1/10的釋放度獲得飽和的結合水平(圖8A)。為標記RBL細胞以進行細胞毒性測定法(參見下一節)，選擇1/2的稀釋度。圖8B顯示當溫度和溫育時間變化時的抗體結合的水平。在37℃下溫育1小時發生最高水平的結合，在4℃下溫育1小時產生幾乎等同的結合。溫育15分鐘導致稍微較低的結合。為製備RBL細胞以進行細胞毒性測定法，推斷在37℃下以1/2的抗體稀釋度溫育細胞1小時。
C.表達MSCV-Pfp的RBL細胞獲得強細胞毒性為測試表達MSCV-Pfp的RBL細胞的裂解潛能，用抗TNP IgE抗體標記這些細胞，並將其用作殺死TNP-標記的靶細胞的效應細胞。在4小時51Cr釋放測定法中評估靶細胞的死亡。如圖9所示，表達穿孔素的細胞表現強的抵抗TNP-標記的EL-4細胞的細胞毒性。在40∶1這一最高的E∶T比率處，RBL細胞能夠誘導大約60％的特異性51Cr釋放，隨著效應細胞靶細胞比率下降，該細胞死亡水平逐漸降低。如所預期的，用空MSCV載體轉導的RBL細胞不能裂解靶細胞，表明當該非細胞毒性細胞系表達穿孔素時，其被賦予了強細胞毒性。在缺少抗TNP IgE抗體的情況下，用RBL細胞沒有觀察到裂解活性，表明與靶細胞的有效結合和脫粒是裂解所必需的。類似地，未用TNP標記的EL-4靶細胞不能被效應細胞識別或殺死。還以時間-進程測定法(time-courseassay)重複了細胞毒性實驗，以確定靶細胞的最大裂解發生的時間。在6小時時，觀察到最大51Cr釋放，超過該時間點直至24小時觀察到51Cr釋放的穩定態。因而決定標準的細胞毒性測定法應當進行4小時，因為該時間點產生和在6小時後觀察到的裂解水平相似的裂解水平。
D.穿孔素表達的重複性表達MSCV-Pfp的獨立的RBL細胞系的產生為了評估該方法的重複性，產生多個表達MSCV-Pfp的獨立的RBL細胞系。重複本章通篇描述的方案通過用MSCV-Pfp構建體轉染293T細胞產生4個另外的獨立的病毒上清液，然後用所述病毒上清液轉導RBL細胞，從而產生稱為MSCV-Pfp#2-5的RBL群體。Western印跡法揭示出，4個RBL群體都表達幾乎相同水平的穿孔素蛋白質，然而MSCV-Pfp#5，當和微管蛋白上樣對照相比時，表達稍微更高的水平(圖10)。然後將這些群體用於標準的51Cr測定法以確定通過MSCV-Pfp獲得的裂解的正常範圍(圖11)。在效應器靶的比率為40∶1時，對於4個表達穿孔素的群體，發現裂解在40％至60％的範圍內。如所預期的，使用早先在圖8中所討論的負對照RBL細胞未觀察到顯著的裂解。為評估在不同的天時通過RBL細胞觀察到的細胞毒性上的變化，對所有4個群體重複多次(n＝6)該測定法，在效應器靶的比率為40∶1時，計算出56％+/-3％的51Cr釋放的平均值。以這種方式，可將在以後章節中要調查的突變體的功能與該標準化的殺傷水平相比較。
實施例2通過RBL細胞中的逆轉錄病毒表達而進行的兩個錯義穿孔素突變(G429E和P345L)的功能分析A.突變的小鼠穿孔素cDNAs的構建將在患者5(G429E)和患者6(P345L)中鑑定的突變(圖12)引入用於在RBL細胞中表達的重組穿孔素cDNA之中。編碼突變的穿孔素cDNA的MSCV質粒分別被稱作P5-Pfp和P6-Pfp。使用被插入MSCV的野生型穿孔素cDNA(WT-Pfp)作為模板(參見實施例1)，使用定點誘變PCR反應和下列引物導入突變對於P5(G429E)突變的導入有義5′AGAACATCTGTGGGAAGACTACACCACAG 3′；反義5′CTGTGGTGTAGTCTTCCCACAGATG 3′；
對於P6(P345L)突變的導入有義5′CTACAGCCTGGAGCTCCTGCACACATTAC 3′；反義5′GTAATGTGTGCAGGAGCTCCAGGCTGTAG 3′。
按照Quickchange Site Directed mutagenesis kit說明書(Stratagene，CA)中的廠商說明書建立PCR，在Pfu聚合酶緩衝液中包含50ng模板DNA(WT-Pfp MSCV質粒)、2.5個單位的Pfu聚合酶、50uM dNTP混合物、125ng的每種引物。PCR由下列循環組成1個循環，在95℃下進行30秒；14個循環，在95℃下進行30秒，在55℃下進行1分鐘和在68℃下進行5分鐘(2分鐘/Kb質粒長度)。完成後，在37℃下用10U的DpnI酶消化PCR混合物1小時以消化掉親本DNA模板，同時讓新合成的突變的DNA保持完整。使用靶向甲基化和半甲基化的DNA的DpnI內切核酸酶選擇性地消化親本DNA。然後用來源於PCR的整合了想要的突變的DNA轉化XL-10 Gold超感受態細胞。為進行轉化，將1μl的經消化的DNA加入至100μl的XL-10Gold感受態細胞中，並置於冰上30分鐘。在42℃下熱激細胞45秒，置於冰上2分鐘，並在塗板於Amp LB瓊脂板上之前，用200μl LB-液體培養基在37℃下溫育細胞30分鐘。
按照實施例1中概述的方法進行小量和大規模的DNA製備。對cDNA克隆進行測序以確定只有想要的突變已被導入(測序方案參見實施例1)。然後將P5-Pfp和P6-Pfp插入物亞克隆入用EcoRI-XhoI消化的MSCV載體DNA中。
B.突變的穿孔素蛋白在RBL細胞中的表達使用實施例1中最優化的方案獲得P5-Pfp和P6-Pfp在RBL細胞中的表達。簡而言之，該方案包括轉染293T細胞以產生富含病毒的上清液，轉導RBL細胞和進行細胞分選以分離表達高水平GFP標記的RBL細胞。如上文中在實施例1中所描述的，就蛋白質的表達對全部的細胞裂解物進行分析。
C.P5和P6突變的Pfp的功能與WT-Pfp的細胞裂解功能的比較在前面(實施例1)概述的4小時51Cr釋放細胞毒性測定法中分析表達P5-Pfp或P6-Pfp的RBL細胞對抗EL-4靶細胞的細胞裂解功能。使用實施例1中描述的表達WTPfp的RBL細胞作為穿孔素功能的正對照，使用用空MSCV載體轉導的RBL細胞作為負對照。
D.從RBL細胞分離溶酶體顆粒通過Davis等人(J Immunol Methods.2003，276(1-2)59-68)所描述的對細胞內容物進行氮氣空泡形成(nitrogen cavitation)和percoll密度分級來從RBL顆粒分離WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp。在PBS中洗滌RBL細胞(1×109)三次，然後以1×108/ml重懸浮於鬆弛緩衝液(relaxation buffer)(100mM KCl，3.5mM MgCl2，1mM PIPES pH6.8，1.25mM EGTA)中，在旋轉平臺上於4℃下在氮氣空泡形成裝置中在450psi下裂解所述細胞20分鐘。在突然減壓後收集細胞裂解物，通過在4℃下以2000rpm離心10分鐘來除去細胞核。用1ml松馳緩衝液洗滌細胞核2次，並將上清液和來自第一次洗滌的上清液匯集在一起。在2000rpm下再離心匯集的上清液5分鐘以除去所有細胞碎片。然後通過將8ml經調節的percoll(45ml percoll和5ml 10x鬆弛緩衝液)和12ml含有1mM ATP的鬆弛緩衝液混合來形成40％的percoll密度梯度。將5ml細胞裂解物加載至每個梯度上，並在4℃下以20,000rpm離心35分鐘。遷移至梯度的稠密區域的細胞毒性顆粒通過使用連接至注射器的長脊椎穿刺針從該梯度的底部收穫1ml級分來進行收集。在超速離心機(Beckman Coulter)中在4℃下以100,000rpm濃縮(單個地)所述級分3小時，並通過將顆粒洗入小體積的重懸浮緩衝液中而從沉澱的percoll表面獲得顆粒。為了釋放穿孔素，通過在等體積的2M NaCl中重懸浮和三個在液氮中冷凍與在37℃的水浴中解凍的循環來破裂顆粒。
(i)β-氨基己糖苷酶測定法向30ul 8mM在水中的對硝基苯基N-乙醯基-β-D氨基葡糖苷(Sigma)和10ul 0.5M醋酸鈉溶液(pH5.0)中加入50ul凍融的顆粒提取物。在室溫下30分鐘後通過加入150ul 50mM NaOH來終止反應，並在405nm下測量樣品的光密度。
(ii)通過顆粒提取物的Jurkat細胞的裂解在37℃下在100ul不含補充物的RPMI培養基中用50μCi51鉻標記Jurkat細胞1小時。然後在含有或不含有2mM EGTA的HBSS緩衝液(CSL Ltd.)中重懸浮51Cr-標記的細胞。為進行測定，將在Hank′s緩衝鹽溶液(HBSS)中重懸浮的2×104個細胞加入96孔V形底平板的小孔中。將顆粒級分#8(通過Western分析測定含有最高穿孔素含量)在HE緩衝液中進行系列稀釋，並將其和靶細胞以200μl的終體積在37℃下溫育4小時。通過僅用HE緩衝液溫育靶細胞來確定51Cr的自發釋放，和通過加入HCl至1M的終濃度來確定最大釋放。4小時後，在1500rpm下將板進行離心，收穫100μl上清液，在Wizard 1470 Gamma計數器中測量釋放的放射性。細胞毒性表示為減去自發釋放後的特異性51Cr釋放百分數。如下計算特異性裂解百分數100×[(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)]。
(iii)紅細胞裂解測定法洗滌綿羊紅細胞(sRBC)3次，然後以108/mL在150mM NaCl中重懸浮。為進行測定，在v-形底96孔板中，在2mM CaCl2存在的情況下，於37℃將50ul凍/融的顆粒提取物[級分#8(參見上面)]和20μl sRBC懸浮液一起溫育30分鐘。對於最大的血紅蛋白釋放，用水裂解紅細胞。將板在1500rpm下離心5分鐘，並通過測量405nm處的光密度來估計釋放入上清液中的血紅蛋白。細胞裂解表示為最大血紅蛋白釋放的百分數。
(iv)RBL細胞中的穿孔素的免疫過氧化物酶染色在進行染色步驟前一天，將大約1×105個細胞播種在8孔細胞培養玻片(chamber slide)的每一個孔中。在室溫下將細胞在固定緩衝液(3.7％的在PMED中的低聚甲醛)中固定10分鐘，然後在PBS中洗滌3次。然後加入透化緩衝液(Permeabilisation buffer)(0.1％Triton-X，0.5％BSA)並保持5分鐘，和如前所述洗滌細胞。在室溫下用高碘酸(0.5％)處理細胞10分鐘，漂洗細胞，通過和0.3％H2O2溫育15分鐘來淬滅內源過氧化物。向小孔中加入封閉緩衝液(1％BSA/1％脫脂奶粉/PBS)並保持30分鐘，和如前所述洗滌細胞2次。然後加入單克隆抗小鼠穿孔素抗體，P1-8(1/1000稀釋度或2μg/ml)。在PBS中洗滌3次後，加入生物素-綴合的驢抗大鼠IgG抗體(JacksonImmunoResearch，USA)(1/600的稀釋度)，和如前所述洗滌細胞。在室溫下將鏈黴親和素-HRP(Dako)和細胞溫育10分鐘，洗滌3次，和通過加入色原DAB(Dako)並再溫育10分鐘來檢測HRP信號。用曙紅對細胞進行對染以顯現細胞核。
(v)RBL細胞的脫粒誘發RBL細胞胞吐其顆粒內容物以評估穿孔素的釋放。如前面所描述的，將空MSCV轉導的RBL細胞，或表達WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp的細胞(1×105)播種在小孔中，並用抗TNP IgE抗體(PBS中1/2的稀釋度)在37℃下標記30分鐘。在PBS中洗滌細胞3次，然後向效應細胞中加入1×106個TNP-標記的EL-4細胞(參見實施例1)並在37℃下溫育30分鐘。然後用PBS洗滌細胞3次以除去EL-4細胞。為了比較脫粒前和脫粒後的其穿孔素含量，如前面所描述的對RBL細胞進行免疫染色。
A.使用逆轉錄病毒表達系統在RBL細胞中表達穿孔素本研究的目的是使用RBL表達系統來表徵兩個在FHL患者中表達的穿孔素的突變形式(P5和P6)的生物合成和功能。因此，使用實施例1中最優化的用於表達WT小鼠穿孔素的方法學，將等同於人P5和P6突變的突變導入用於在RBL細胞中表達的小鼠穿孔素之中。所考慮的殘基(G429和P345)在人、小鼠和大鼠穿孔素中是不變的，暗示著功能的保守。
兩步驟逆轉錄病毒轉導過程再一次涉及首先用質粒DNA轉染293T細胞，產生對於轉導RBL細胞所需的富含病毒的上清液。在用P5-Pfp和P6-Pfp表達構建體轉染後，對293T細胞的分析表明超過50％的細胞表達GFP，暗示著在培養物上清液中具有高病毒滴度(圖13)。螢光水平與在用WT-Pfp和空MSCV構建體轉染的293T細胞中觀察到的螢光相當(參見實施例1和圖5)。在逆轉錄病毒轉導後，再次分選表達GFP標記的RBL細胞小群體，並將其通過培養進行再擴增以產生具有一致高的GFP轉基因表達的細胞群體。擴增的群體的分析確認了表達GFP的細胞的選擇，因為超過90％的用編碼P5-Pfp和P6-Pfp的病毒轉導的細胞現在具有很強的螢光(圖14)。總之，這些表達特性表明，突變的穿孔素的表達以和WT-Pfp(關於WT-Pfp的表達，參見實施例1)相似的方式發生。
對擴增的RBL群體的Wester印跡分析(使用P1-8mAb檢測穿孔素)顯示，具有67kDa的表觀分子量的穿孔素蛋白存在於每個經轉導而表達P5-Pfp和P6-Pfp穿孔素的細胞群體中，而不存在於用空載體轉導的細胞中(圖15)。當和微管蛋白上樣對照相比較時，突變的穿孔素蛋白和WT-Pfp的表達水平相似，這暗示著將各個FHL突變導入穿孔素中不影響該蛋白質在RBL細胞中的穩定性。
B.由表達WT和突變的Pfp的RBL細胞介導的細胞毒性為了檢驗導入的突變對穿孔素功能的影響，在使用TNP-標記的EL-4細胞作為靶細胞的4小時51Cr釋放測定法中，將表達P5-Pfp或P6-Pfp的RBL細胞的細胞裂解能力和表達WT-Pfp的細胞進行比較(圖16)。和用表達WT-Pfp的RBL細胞所觀察到的強細胞毒性明顯地相反，作為對於表達突變的穿孔素的RBL群體的響應從靶細胞中釋放的51Cr大大降低。該結果在數個實驗中和以多個E∶T比率進行重複。觀察到的細胞毒性的缺乏不是由於所述蛋白質的表達水平上的差異而造成的，如前面通過Western印跡法所顯示的。
C.WT和突變的穿孔素被定位於RBL的細胞質顆粒中研究穿孔素在RBL細胞中的亞細胞分布以檢測和WT-Pfp相比，P5或P6突變體穿孔素在運輸至溶酶體顆粒方面的任何差異。通過Percoll-分級的RBL細胞裂解物的Western印跡法顯示，穿孔素定位在級分#6-10中，峰值穿孔素含量存在於級分#8中(圖17A)。峰值穿孔素表達也和最大β-氨基己葡糖苷酶(β-hexo-glucosaminidase)活性一致(圖17B)，該酶是溶酶體顆粒的酶標記(Schwartz和Austen，1980；J Invest Dermatol.1980，74(5)349-53)。這表明WT和突變的穿孔素定位在分泌性顆粒和溶酶體內。這些發現也和前面的數據一致，在所述數據中，級分6-8被鑑定為RBL細胞的富含顆粒的級分。
通過免疫組織化學染色進一步確定穿孔素至分泌性顆粒的亞細胞定位。如圖18中所示，表達WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp的RBL細胞關於穿孔素的染色很強，而空載體轉導的RBL細胞未顯示任何染色。事實上，關於穿孔素，100％的細胞被染色，這和早前對GFP表達的流式細胞術分析一致，在超過95％的RBL細胞中發現GFP的表達(圖15)。在高放大倍數下，觀察到點狀細胞質染色，這和穿孔素的溶酶體定位一致。對於突變的P5-Pfp和P6-Pfp，在高放大倍數下也觀察到類似的點狀染色。
D.研究P5-Pfp和P6-Pfp的脫粒功能通過顆粒內容物的有核和去核靶細胞的裂解上面提供的結果暗示，P5-Pfp和P6-Pfp都正常地被生物合成、運輸和貯存於細胞質顆粒中，每種突變的形式不能誘導靶細胞死亡。然而，這兩種突變的穿孔素也可能都不能通過胞吐作用從RBL細胞釋放。通過純化裂解顆粒並將其直接作用於靶細胞來檢驗該可能性。因此，將P5-Pfp和P6-Pfp從其細胞內區室中解離出來，避開脫粒方面的潛在的缺陷。然後就其裂解有核的Jurkat細胞和無核的sRBC的能力來檢驗WT和突變的穿孔素。如圖19A所示，WT-Pfp導致Jurkat細胞大量裂解，隨著顆粒被稀釋，顯現出清楚的劑量依賴性效應。在受試顆粒的最高濃度上，觀察到稍微較低的細胞毒性水平，可能歸因於一些抑制性顆粒組分的存在，所述組分可能充當鈣離子的清除劑。通過稀釋顆粒至1/32，觀察到大約65％的特異性裂解。通過加入乙二醇四乙酸(ethyleneglycotetraacetic acid)(EGTA)(鈣離子的螯合劑)完全抑制了該裂解功能，表明裂解是通過穿孔素介導的機制進行的。來源於空MSCV轉導的RBL細胞的顆粒不誘導Jurkat細胞的裂解。明顯地和WT穿孔素相反，在Ca2+存在的情況下，包含P5-Pfp和P6-Pfp的顆粒不能導致靶細胞的任何損害(圖19B)。
在相似的實驗中，將破裂的顆粒和無核的並對穿孔素介導的膜損害更敏感的sRBC混合(Shiver和Henkart，Cell.1991，64(6)1175-81)。如通過在1/8的稀釋度下的血紅蛋白釋放所檢測到的，WT-Pfp導致幾乎完全的RBC裂解，並直至稀釋度達到1/64時觀察到顯著的裂解(圖19C)。溶血是在測定中加入的顆粒材料的量的函數，其被EGTA抑制，當用Jurkat細胞靶時。包含P5-Pfp或P6-Pfp的顆粒都不能導致sRBC的裂解。
E.研究P5-Pfp和P6-Pfp的脫粒功能脫粒前和粒後細胞質顆粒中的穿孔素含量的顯現使用免疫組織化學直接檢查WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp從RBL細胞釋放的能力。通過用抗TNP IgE抗體標記RBL細胞，並將其和TNP-標記的EL-4細胞一起溫育，來刺激RBL細胞以使之釋放其顆粒。未受刺激的RBL細胞表達幾乎相同數量的WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp(圖20)。在和TNP-標記的EL-4細胞一起溫育後，RBL細胞中染色的水平顯著降低，表明穿孔素胞吐。無論WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp表達與否，該染色上的減少是相似的。這暗示著，P5和P6穿孔素同樣能夠從顆粒中被胞吐，觀察到的細胞毒性的缺乏是由於在靶細胞水平上的穿孔素功能障礙造成的。
實施例3兩個與家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症相關的推定的多態性(R225W和G429E)的功能分析。
本研究闡明了在噬血細胞性淋巴組織細胞增多症中穿孔素功能障礙的細胞基礎，和證明了本發明的方面作為研究穿孔素的「結構-功能」相互關係的手段的用途。
A.細胞培養在加溼的培養箱中，在37℃下，在DMEM培養基中培養細胞系RBL-2H3細胞(大鼠嗜鹼性粒細胞白血病；美國模式培養物保藏所)(在本說明書中其被稱為RBL)和293T(人胚胎腎)，所述培養基補充有10％FCS、2mM穀氨醯胺和各為100μg/ml的鏈黴素和青黴素。將JurkatT細胞培養在含有上述補充物的RPMI-1640培養基中。在37℃下使用胰蛋白酶-EDTA溶液(CSL Ltd.)使RBL和293T細胞脫離培養瓶。
B.RBL細胞的瞬時轉染成熟的人和小鼠穿孔素各具有534個胺基酸。然而，人穿孔素的前導序列比小鼠的長1個胺基酸。這導致常規胺基酸編號上的差異，這樣在HLH患者#5中在位點225和429上突變的胺基酸(如Stepp，S.E.等人，1999，Science，2861957-1959所描述的)對應於小鼠蛋白質中的殘基224和428，如在下面的實驗中指出的。重要的是，精氨酸225是非保守性殘基，在小鼠穿孔素中存在的是蘇氨酸。為證明精氨酸和蘇氨酸在該位點的等價性，我們產生了T224R變體，然後，產生了T224W突變體，其對應於患者#5(11)中的R225W。按照廠商說明書使用Transformer(Stratagene)定點誘變系統導入突變。將所得的和WT cDNA克隆入pIRES2-EGFP表達載體(CLONTECHLaboratories，Inc.)。將表達Fcε受體的RBL細胞在175cm2的瓶中培養至接近匯合，收穫細胞，洗滌細胞兩次，並將其以107個細胞/ml重懸浮於不含血清的DMEM中。將200μl所述細胞懸浮液和20μg含有WT或突變的穿孔素cDNA或者只含有載體DNA的pIRES2-EGFP混合，在室溫下溫育10分鐘，並在4mm的電穿孔小杯和Bio-RadLaboratories脈衝發生器中，在500μF和0.25V下進行電穿孔。在室溫下10分鐘後，將細胞轉移至完全DMEM中。18-20小時後收穫細胞，並通過流式細胞術(FACStar；Beckton Dickinson)分選表達GFP的細胞。
C.RBL細胞中的重組逆轉錄病毒的產生和穿孔素的穩定表達按照廠商說明書使用Quick-Change定點誘變系統(Stratagene)產生對應於人G429E(在患者#5中的另一個穿孔素等位基因中鑑定的)的錯義穿孔素突變，G428E。將編碼小鼠WT和G428E穿孔素的cDNAs亞克隆入逆轉錄病毒表達載體MSCV中，所述表達載體包含用於GFP表達的內部核糖體進入位點。為進行RBL細胞的逆轉錄病毒轉導，通過磷酸鈣沉澱法通過將MSCV質粒和兼嗜性包裝質粒一起共轉染入293T細胞來產生病毒上清液。
48小時後，收穫病毒上清液，並在3天內每12小時將其加入至RBL細胞。然後通過流式細胞術純化具有最大GFP表達的細胞群體(高達總細胞的5％)，並就穿孔素的表達對所述細胞進行分析。
D.評估轉染的RBL細胞的細胞毒性如上所述，在4小時51Cr釋放測定法中使用Jurkat T細胞分析RBL細胞的細胞毒性能力。簡而言之，在37℃下用1mM PBS(pH7.4)中的三硝基苯磺酸溶液來衍生51Cr-標記的Jurkat細胞的表面15分鐘，用不含補充物的DMEM洗滌細胞3次。收集經轉染的RBL細胞，並在37℃下將其和抗三硝基苯酚IgE mAb(2μg/ml)一起溫育15分鐘，用不含補充物的DMEM洗滌細胞3次。在96孔板中，在37℃下在200μl不含血清的DMEM(補充有1％BSA)中，以各種效應器對靶(E∶T)的比率共溫育RBL和Jurkat細胞4小時。然後收穫上清液，並在gamma計數器中測量釋放的51Cr。使用經5％Triton X-100裂解的細胞來估計Jurkat細胞的總51Cr含量。百分比特異性鉻釋放計算為100×([實驗釋放×自發釋放]/[總釋放-自發釋放])，其顯示為平均值±SD。
E.從RBL細胞中分離溶酶體顆粒通過氮氣空泡形成和Percoll密度分級從109個穩定表達性RBL細胞中分離穿孔素。為了區分富含顆粒的級分和其他亞細胞級分，如下測量RBL顆粒標記酶，β-氨基己糖苷酶的活性。在室溫下，將50μL的每個級分與30μL 8mM的對硝基苯基N-乙醯基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma-Aldrich)和10μL 0.5M醋酸鈉(pH5.0)混合30分鐘。通過加入150μL 50mM NaOH來終止反應，並在405nm處測量吸光度。
F.重組穿孔素的表達和膜結合測定法根據廠商說明書，使用Bac-to-Bac試劑盒(Invitrogen)將穿孔素cDNA克隆入pFastBac載體中並在培養於SF900-II SFM培養基中的Sf-21細胞中過表達，和純化穿孔素。獲得少量重組WT和G428E穿孔素突變蛋白。
為研究穿孔素的鈣依賴性膜結合，將2×106個綿羊RBCs重懸浮於200μL補充有1mM CaCl2的20mM Hepes-150mM NaCl緩衝液(pH7.4)中。向所述細胞懸浮液中加入純化的穿孔素的等分試樣，在冰上放置5分鐘。在16,000g下沉澱細胞10秒，立即取出上清液，將細胞在冰冷的水中進行裂解。在4℃下，在16,000g下將裂解物離心20分鐘。再次洗滌沉澱，將其溶解在SDS-PAGE上樣緩衝液中，並通過Western印跡法進行分析。
G.免疫過氧化物酶染色在染色前的1天，在8孔細胞培養玻片的每一個小孔中播種大約1,000個RBL細胞，並培養過夜。在一些實驗中，通過用TNP-標記的腫瘤靶細胞短暫溫育來誘導細胞進行脫粒。在室溫下將RBL細胞在3.7％的低聚甲醛中固定10分鐘，在PBS中清洗3次，在0.1％TritonX-100、0.5％BSA中透化5分鐘，然後如前所述洗滌細胞。用高碘酸(0.5％)處理細胞10分鐘，並用0.3％H2O2淬滅內源過氧化物酶活性15分鐘。在加入小鼠抗穿孔素mAb P1-8之前，加入封閉緩衝液(PBS中的1％BSA/1％脫脂奶粉)並保持30分鐘。通過用生物素化的驢抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、鏈黴親和素-HRP(Dako)溫育10分鐘和用色原二氨基聯苯胺(Dako)來檢測結合的Ig。最後，用曙紅對細胞進行對染並通過光學顯微鏡觀察。
H.Western印跡法在10％SDS-PAGE(Tris-甘氨酸)凝膠上解析來自穩定的或瞬時轉染的RBL細胞的細胞裂解物或顆粒提取物，將其轉移至PVDF膜上，使用大鼠抗穿孔素mAb PI-8和抗大鼠HRP-綴合的Ig就穿孔素的含量進行分析。採用化學發光(Amersham Biosciences)檢測信號。
G.結果電穿孔的效率高達40％，每次電穿孔獲得高達106個表達GFP的細胞。儘管G429在人、小鼠和大鼠穿孔素中是保守的，但R225是不是不變的並且對應於小鼠穿孔素中的T224。為確認在該位置上精氨酸和蘇氨酸的功能等同性，我們產生了表達T224R小鼠穿孔素的RBL細胞，並且發現其在51Cr釋放測定法中和轉染了WT穿孔素的細胞一樣有效。然而，表達在相同位置具有色氨酸的穿孔素(T224W)導致細胞裂解功能的完全喪失(圖22)。如所預期的，WT蛋白具有67kD的表觀分子質量；然而，色氨酸的導入導致截短的(～45kD)穿孔素的出現(圖22)，這暗示著所述突變有助於穿孔素的蛋白水解切割/加工。此外，經轉染的細胞的免疫組織化學分析顯示T224W的錯誤定位，這可能是由於丟失推定的信號基元造成的。WT穿孔素產生了和包裝在分泌性顆粒中一致的點狀外觀，而T224W穿孔素產生了遍布RBL細胞的細胞質的彌散染色(圖23A)。當我們類似地分析通過患者#5共遺傳的G428E(在人中為G429E)突變的效果時，我們觀察到和表達WT穿孔素的RBL細胞相比，51Cr釋放水平減少(數據未顯示)。為精確地定量該減少的活性，我們產生了穩定地表達WT和G428E穿孔素的細胞系。在流式細胞儀上分析經逆轉錄病毒轉導的RBL細胞，分選出發最強螢光的細胞(總群體的0.2-5％)，並通過培養進行擴增，在數天後產生～93％的GFP陽性細胞。這些細胞以和IL-18/IL-21-激活的小鼠原代NK細胞等同的水平表達穿孔素(圖24A)。穿孔素表達和細胞毒性功能在許多周的連續培養的過程中保持穩定(未描述)。和我們的瞬時轉染實驗一致，表達WT穿孔素的RBL細胞在廣泛的E∶T比率範圍內有效地裂解Jurkat靶細胞(圖24B)。為確定WT和G428E穿孔素之間在細胞裂解活性上的差異，比較了產生等同的51Cr釋放水平所需的E∶T比率。我們發現，表達相似水平的G428E的RBL細胞誘導鉻釋放的效率要低3至4倍(圖24B)。
然後我們繼續研究G428E穿孔素的細胞毒性降低的原因。如通過免疫印跡法所證實的(圖24B)，這不是因為蛋白質的切割或降解而造成的。為排除不正確的至分泌性顆粒的運輸，我們檢查了WT和G482E穿孔素在穩定轉導的RBL細胞中的細胞內定位。發現顆粒中存在正常數量的突變的穿孔素，這進一步排除了基因轉錄、mRNA穩定性或翻譯或者蛋白質摺疊上的顯著缺陷。當在Percoll梯度上對表達WT或G428E穿孔素的RBL細胞的裂解物進行分級和通過Western印跡進行分析時，穿孔素一致地位於含有最大β-己糖醯胺酶(β-hexosamidase)活性的級分中(圖24C)，該酶是溶酶體-樣分泌性顆粒的標記。還通過免疫組織化學染色確認了穿孔素的正確靶向，因為WT和G428E穿孔素均顯示不可區分的點狀細胞質染色(圖23A)。G428E穿孔素也通過胞吐作用釋放，其效率和RBL Fcε受體交聯時的WT穿孔素一樣(圖23B)。因為G428E穿孔素以和WT穿孔素等同的水平表達並且被正確地靶向顆粒和從顆粒釋放(圖23和圖24，B和C)，因此所述突變可能影響穿孔素的突觸後(postsynaptic)功能。為檢驗該可能性，我們使用杆狀病毒表達系統產生並純化了重組WT和G428E穿孔素，並測試了其以鈣依賴性方式結合綿羊RBC膜的能力。WT穿孔素顯示了強的鈣依賴性血漿膜結合，基本上所有加入的穿孔素都結合，而G428E穿孔素的結合顯著減少(圖25)。和該發現一致，重組G428E突變體的細胞裂解活性是WT穿孔素的～5％(未描述)。儘管許多年來RBL細胞被用作穿孔素功能的讀出器，但該模型的明顯缺點是穿孔素在不存在粒酶B的情況下會發揮其細胞裂解作用。將靶細胞暴露於重組G428E穿孔素和粒酶B不能拯救穿孔素表型(未描述)。因此，我們的發現強烈地暗示著，G428E穿孔素的活性降低是由於減少的靶細胞膜結合造成的，而不是缺少粒酶造成的。
這是第一次成功地確定天然發生的穿孔素突變的功能基礎的研究，當所述突變共遺傳時，導致在HLH中觀察到的災難性的免疫抑制。令人驚奇的是，我們證實穿孔素功能的部分喪失可能足以產生致命的疾病。T224W突變(對應於人中的R225W)導致蛋白質的不穩定性和RBL細胞毒性功能的完全喪失，而G428E(人中為G429E)只是部分失活，因為RBL細胞保持～25-30％的WT裂解活性。基於我們的RBL測定法的結果，可以預測表達等量的T224W穿孔素和G428E穿孔素的CTL將具有一些殘留的但顯著減少的細胞毒性活性。事實上，患者#5的NK細胞確實表現出對照樣品的～15％的裂解活性。我們的數據和在該情況下的臨床發現一致，這提供了這樣的證據，即我們的實驗方法將會為理解在HLH中鑑定的其他穿孔素突變提供堅實的基礎。
實施例4與家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症相關的兩個推定的多態性(A91V和N252S)和22個錯義穿孔素突變的功能分析A.突變的穿孔素cDNAs的構建按照廠商說明書(Stratagene)使用Transformer或QuickChange試劑盒對在pKS(+)Bluescript中克隆的小鼠穿孔素cDNA進行突變(需要時提供寡核苷酸引物序列)。為避免在和臨床病例比較時發生混淆，在本研究的整個過程中，我們使用人穿孔素的胺基酸編號。在穿孔素的人和小鼠形式中，突變的殘基的相對位置是一樣的。將WT或突變的穿孔素P39H、G45E、V50M、D70Y、C73R、A91V、W95R、G149S、F157V、V183G、G220S、T221I、H222R、H222Q、I223D、R232C、R232H、N252S、E261K、C279Y、R299C、D313V、R361W和Q481P克隆入pIRES2-EGFP表達質粒(BD Biosciences Clontech)中。比目魚中發現的兩個等位基因取代，R232S和Q481E，表達水平相似。對每個穿孔素cDNA的兩條鏈都進行全長測序以檢查定點誘變的保真度。使用Qiagen Maxi試劑盒純化所得的表達質粒。
B.RBL細胞的瞬時轉染培養表達Fcε的RBL細胞，並如上面實施例3B中所描述的那樣瞬時轉染所述細胞。18-20個小時後，使用流式細胞術(FACStar，Beckton-Dickinson)收集表達BGFP的細胞。許多報導表明，在HLH患者的NK細胞中缺少穿孔素的表達，暗示著突變的蛋白質的遺傳不穩定性。為了解釋該問題，並在給出大量的分析的樣品情況下，我們必須能夠可靠地比較穿孔素變體的表達水平。因此，在分選轉染的細胞之前，使用CalibRITE FITC-標記的螢光珠(Beckton-Dickinson)對FACStar流式細胞儀進行校準。我們發現，在每目的基礎上，該方法為我們提供了可重複的WT穿孔素表達和可比較的細胞毒性的水平。
在上面實施例3中描述的4小時51Cr釋放測定法中使用Jurkat T細胞作為靶細胞對RBL細胞的細胞毒性進行分析。在10％SDS-PAGE(Tris-甘氨酸)凝膠上解析來自瞬時轉染的RBL細胞的細胞裂解物，然後通過免疫印跡法就穿孔素或微管蛋白的表達進行分析，所述免疫印跡法使用P1-8抗穿孔素抗體或抗微管蛋白抗體，接著用第二種偶聯了HRP的抗大鼠或抗小鼠免疫球蛋白。通過化學發光(Amersham-Pharmacia)來檢測信號。
C.結果在本實驗中，我們進行了22個懷疑導致HLH的PRF1的錯義突變的功能分析，所述突變定位在各種不同的穿孔素結構域，如圖26中所示。為了在與其他基因座中的潛在缺陷隔離的情況下分析所述突變對穿孔素功能的影響，我們如前面實施例3中所描述的在RBL細胞中表達WT或突變的穿孔素，然後確定其裂解它們所綴合的Jurkat靶細胞的能力。使用該方法，我們能夠區分各種穿孔素分子的可能突觸前(pre-synaptic)和突觸後(post-synaptic)的功能障礙。我們也進行了穿孔素序列的兩個改變(A91V和N252S)的詳細分析，所述兩個改變至今一直被認為是PRE1的多態性。
(i)懷疑的穿孔素多態性，A91V的功能分析基於為獲得給定水平的靶細胞死亡需要大約2倍的RBL細胞，A91V穿孔素的細胞毒性活性和WT相比相應地下降了大約50％(圖27)。按照相同的標準，R232H穿孔素的活性比A91V稍微下降一些，其產生了大約30％的WT穿孔素活性。重要的是，雙突變A91V/R232H蛋白質完全失活。通過Western印跡對於蛋白質表達水平的分析揭示出，和WT蛋白質相比，A91V、R232H的表達減少，而A91V/R232H穿孔素減少的程度更大。這些觀察數據暗示著，兩種突變都影響穿孔素的摺疊和穩定，都可能在RBL測定法中對其細胞毒性產生負面影響。我們還如上面實施例3F中所描述的，使用杆狀病毒表達系統產生了重組人A91V和WT穿孔素。我們發現A91V的裂解活性減少至WT穿孔素的＜10％(此處未顯示數據)。此外，純化的A91V的功能不穩定，因為在4℃下貯存48小時後，其裂解活性快速地降低至不可檢測的水平。作為比較，WT在這些貯存條件下可穩定數月。基於該基礎，我們提出，A91V取代導致蛋白質錯誤摺疊，該錯誤摺疊最可能是導致其在RBL細胞中的穩定性降低的原因。該不穩定性在從用杆狀病毒感染的昆蟲細胞中純化出的穿孔素的情況下增加，可能是由於昆蟲細胞內缺乏合適的細胞內陪伴分子和/或改變的氧化還原環境造成的。總之，上述測定表明A91V取代是一種不尋常類型的PRF1多態性，因為其具有高等位基因頻率，但明顯地導致減少的穩定性，從而導致穿孔素裂解活性的部分喪失。我們認為A91V的細胞毒性活性的水平通常可能基本上足以預防HLH，如果第二個等位基因是WT，或甚至當所述突變以純合狀態遺傳亦如此，因為健康群體的1-4％是該情況。
(ii)懷疑的穿孔素多態性，N252S的功能分析為闡明N252S取代對穿孔素功能的影響，我們產生了幾種穿孔素突變，即D252N、D252E和D252S，並分析它們在RBL細胞毒性測定法中的活性，其結果顯示於圖28中。我們發現所有這些取代保持WT穿孔素的活性。假定是共顯性表達，這些觀察數據暗示，攜帶N252S等位基因和失活突變(存在於他們的其他PRF1等位基因28中)的個體將具有～50％的正常穿孔素活性，這與其他人在HLH患者中觀察到的CTL活性的水平一致。綜合起來，我們的數據和流行病學研究9表明，單獨的N252S取代不能是產生疾病的原因，而是另外的基因缺陷可能是導致疾病的原因。因此，我們得出結論，N252S可能代表真正的PRF1多態性。
(iii)和HLH相關的錯義突變的功能分析在本研究中，我們根據在各種HLH患者中報導的等位基因的組合將穿孔素突變分組。圖29A顯示在純合子患者中發現的等位基因的結果的概括；圖29B顯示和穿孔素的無效突變(null mutation)(通常為截短)共表達的等位基因的對應數據；而圖29C涉及只在複合的雜合子患者(其在兩個等位基因上都具有錯義突變)中鑑定的等位基因。選擇該方法，因而無論可能與否，我們的發現可能能夠用於解釋相應的臨床報導。我們通過調查給定的突變是否導致突觸前或突觸後功能障礙來開始我們對錯義突變的分析。RBL細胞中的表達水平的分析揭示出，大部分穿孔素突變導致不穩定的/未摺疊的蛋白質。因此，根據Western印跡分析，和WT相比，具有突變P39H、G45E、G45R、V50M、D70Y、W95R、G149S、G220S、T221I、H222R、R232C、R232H、E261K、C279Y、R299C、R361W或Q481P的穿孔素在RBL細胞中不能被檢測到或大大減少。突變的蛋白的突觸前缺陷可能涉及其錯誤摺疊或異常運輸，從而導致降解。在基於RBL細胞的51Cr釋放測定法中，所有不穩定的穿孔素變體具有最小的可檢測的細胞毒性活性(圖29A-C)。我們還通過基因工程改造了胺基酸取代R232S(圖30)和Q481E(圖29B)，以反映在比目魚穿孔素中對應的位置上發現的殘基。和R232H(也參見，圖27)不同，R232S具有正常的活性，而R232C(在一個HLH患者中報導的)14也具有嚴重減少的功能(圖30)。比目魚Q481E穿孔素也具有WT表達水平(圖29B)和活性(數據未顯示)。此處分析的另一組穿孔素突變的表達與上述那些突變相當不同。和顯示低的表達的臨床報導相反，V183G(圖31)和H222Q穿孔素以和WT(圖29B)等同的水平在RBL細胞中進行表達(圖29B)，C73R、F157V和D313V穿孔素的表達水平僅僅稍微地減少(圖30B)。隨後，我們使用51Cr釋放細胞毒性測定法分析這些突變的穿孔素的細胞毒性性質。我們驚奇地發現，曾被認為和HLH相關的V183G穿孔素的裂解活性不能和WT蛋白質的活性區分(圖31)。我們得出結論，V183G突變不可能導致患者V(圖29C)的HLH，即使第二個等位基因具有失活性的C219Y取代。根據我們的實驗觀察數據和胺基酸保守性的缺乏，我們推測V183G取代是真正的PRF1的多態性，而在相應的患者中的HLH可能是由一些其他不依賴於穿孔素的機制產生的。此外，穿孔素突變沒有表現出對WT穿孔素的功能具有明顯的『佔優勢性的負面』效應，因為該性質預期會在患者的父母中影響穿孔素的功能。保守的組氨酸的突變，H222Q，導致穿孔素在RBL細胞中的正常表達，但轉染的RBL細胞不具有可檢測的細胞毒性活性(數據未顯示)。對於非保守性取代的殘基C73R、F157V和D313V突變觀察到類似的結果，和WT穿孔素相比，所述突變在RBL細胞中的表達水平只是稍微地減少。
總之，我們已提供了迄今報導的與HLH相關的PRF1的錯義突變和多態性的全面的功能分析。我們的數據表明，突變的穿孔素的不穩定性是比突觸後功能障礙更普遍的造成與穿孔素相關的HLH的原因。我們證實，A91V突變是「多態性」的不尋常情況，因為其顯著地影響了穿孔素的穩定性和細胞裂解活性，最可能是由於穿孔素的不正確摺疊造成的。健康人群中有相當大的比例以純合狀態攜帶A91V，這一事實和我們的實驗發現相符，我們的實驗發現是該取代仍然保持相當高比例的WT功能。
實施例5篩選具有穿孔素抑制劑活性的化合物A.試劑用於本研究的試劑如下HEPES(Sigma Aldrich Cat No.H-4034)NaCl(BDH Cat No.10241.45)CaCl2·2H2O(BDH Cat No.10070.44)BSA(Sigma Aldrich Cat No.A-2153)聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯(Tween 20；Sigma Aldrich Cat No.P-7949)Triton X-100(Sigma Aldrich)Perkin Elmer SpectraMax 384孔平板(Cat No.6007849)。
B.研究方案(i)測定法概述
(ii)測定法動力學和特徵
(iii)測定法試劑和材料
(iv)測定方法
用「穿孔素針釘工具轉移(Perforin-pintool transfer)」方法，使用MiniTrak IX分別向10μl 0.5μg/ml緩衝液A中的穿孔素或對照中加入0.1μl化合物/DMSO，並通常與化合物一起預溫育至少30分鐘。然後用Zymark「Perforin2v4」方法使用MultiDrop將40μl綿羊RBCs加入至RBC緩衝液中。綿羊RBC的裂解導致反應混合物的濁度發生變化，而細胞裂解的抑制導致濁度讀數變化的減少或消除。因為通常將抑制劑化合物溶解在DMSO中，因此可將相同濃度的DMSO用作穿孔素的抑制的負對照。在使用DMSO的小孔中，穿孔素裂解沒有被抑制，並且濁度上的變化和在缺少DMSO或抑制劑化合物的情況下觀察到的等同。
開始時(t＝0分鐘)讀取樣品在650nm的吸光度(在Envision中；使用Envision讀數器，自動化ABS@650nm)，在37℃下溫育15分鐘，然後在650nm讀取吸光度以評估反應混合物的濁度的變化。
C.實驗程序初級穿孔素介導的裂解測定法基於細胞濁度的測量，該濁度通過在650nm的波長處測量吸光度來檢測。因此，所述測定法通過測量化合物對穿孔素介導的綿羊RBC的裂解的抑制來確定該化合物的效力。綿羊RBC的裂解導致反應混合物的濁度發生變化，而細胞裂解的抑制導致濁度讀數變化的減少或消除。因為通常將抑制劑化合物溶解在DMSO中，所以用相同濃度的DMSO作為穿孔素的抑制的負對照。在使用DMSO的小孔中，穿孔素裂解沒有被抑制，並且濁度上的變化和在缺少DMSO或抑制劑化合物的情況下觀察到的等同。
(i)初次篩選在20μM的化合物終濃度下進行初次篩選。測定化合物作為單個點。
(ii)第二次篩選-化合物稀釋平板形式建立5個點的劑量-響應，其使用在V形聚丙烯384孔平板(Matrical，Cat No.MP101-3-PP)中作系列稀釋的(對於每一個稀釋系列更換移液器(pipette)的尖管)化合物母液(在列#23和#24中的對照)，將來自所述384孔平板的0.5μl稀釋的化合物分配至單塊測定板(SpectraMax透明，平底，384孔板，Perkin Elmer Cat No.6007849)的每一個小孔中，即每個單塊測定板具有高達64個受試化合物。
(iii)化合物濃度
(iv)數據分析使用軟體ActivityBaseTM，版本5.0.10(ID Business SolutionsLtd)分析獲自每個重複的實驗的數據。使用基於MS Excel的程序XLfit(版本3.0.5)以使數據符合這樣的4參數邏輯(logistic)函數，從而推算產生穿孔素介導的細胞裂解的50％抑制(IC50)的受試化合物的摩爾濃度，所述函數具有式y＝A+(B-A)/(1+((C/x)^D))其中A是曲線的底部平臺(plateau)，即，最終的最小y值；B是曲線的上部平臺，即，最終的最大y值；C是在50％的y值時，X的值。當A+B＝100時，其提供了log IC50的值；D是Hill傾斜係數(slope factor)。在該模型中，當y隨著X的增加而減小時，返回到了正值。
X是初始已知的x值；和Y是初始已知的y值。
D.結果(i)初次篩選的數據
(ii)第二次篩選接著使用和初次篩選中所用的方法相同的方法以及384孔的形式，以100μM、20μM、4μM、0.8μM和0.16μM檢測初次篩選中鑑定的所有612種化合物。在這612種化合物中進一步確認了333種以可重複的方式抑制小鼠穿孔素對於綿羊RBC的裂解，其IC50＜100mM。在這333種化合物中，觀察到132種具有最大的效力，被定義為以IC50＜20μM抑制綿羊RBC的裂解。
(iii)第三次篩選就抑制小鼠穿孔素的裂解作用，第三次檢測具有IC50＜20mM的132種化合物中的129種。在該情況下，在100mM、25mM、5mM和1mM下檢測每種抑制劑(參見下表)。如下改變用於綿羊RBC裂解測定法的方法在96孔V形底平板中，向穿孔素或對照中加入化合物/DMSO並預溫育30分鐘。如上所述製備所有試劑。然後加入綿羊RBC(如上所述製備的)，並將板在37℃下溫育15分鐘。然後在環境溫度下將板以1500rpm離心3分鐘。用移液器從每個測試小孔中收集上清液，並通過測量541nm處的吸光度來定量血紅蛋白的釋放。通過在相同體積的蒸餾水中重懸浮相同數量的綿羊RBC來確定最大的從RBC中的血紅蛋白釋放，裂解的負對照由在相同體積的不含穿孔素的緩衝液A中溫育相同數目的綿羊RBC組成。每種化合物的裂解抑制百分數顯示錶中。
結果證明，在100μM和25μM的情況下，大多數化合物能夠抑制穿孔素誘導的紅細胞裂解，當以1μM使用時，其中許多化合物仍然相當有效。當以1μM使用時，大約30％的所述化合物仍然是有效的。
(iii)在存在0.1％、0.5％和1％BSA情況下的綿羊紅細胞測定法，化合物濃度為20μM在所述129種化合物中，我們選擇46種最有效的化合物(在20μM)，連同負對照，在各種濃度的牛血清白蛋白(BSA)存在的情況下進行SRBC裂解測定法。我們發現當BSA以0.1％存在時，所述化合物中的22種仍然能夠抑制小鼠穿孔素達到至少60％的程度。
(iv)在HE緩衝液中，在0.1％BSA存在的情況下有核(Jurkat)細胞上的穿孔素抑制然後在0.1％BAS存在的情況下，在80μM、20μM、5μM和1μM下通過51Cr釋放測定法就其抑制有核細胞(Jurkat T淋巴瘤細胞)的能力對這樣的化合物進行檢測，所述化合物在0.1％BSA存在的情況下仍然能夠抑制綿羊RBC的穿孔素裂解達到超過60％的程度。在HE緩衝液或RPMI介質中檢測所述化合物，下面顯示的數據是對於HE的數據。
結果顯示在80μM下，36種化合物中的30種抑制穿孔素達到60％或更大的程度；在20μM下，36種化合物中的24種抑制穿孔素達到60％或更大的程度；在5μM下，36種化合物中的17種抑制穿孔素達到60％或更大的程度；和在1μM下，36種化合物中的9種抑制穿孔素達到60％或更大的程度。
(v)在RPMI緩衝液中，在0.1％BSA存在的情況下對有核Jurkat細胞的穿孔素裂解的抑制
(vi)作用的特異性—為了檢測抑制劑是否特異性地抑制穿孔素，或者是否還能夠阻斷肺炎球菌毒素肺炎球菌溶血素(PLO)的裂解功能，在20μM下就其抑制由PLO誘導的綿羊RBC裂解的能力對下表中的抑制劑進行檢測。沒有抑制劑具有顯著的對PLO的抑制作用，表明其特異地抑制穿孔素。

(vii)在綿羊紅細胞裂解測定法中的小鼠和人穿孔素的抑制(在1μM下使用的化合物)使用小鼠穿孔素進行所有上述的穿孔素抑制劑的篩選。就其抑制作為對於小鼠和人穿孔素的響應的綿羊RBC裂解的能力同時檢測下表中的化合物。
結果證明，每種化合物都能夠抑制人穿孔素，其抑制能力近似等於或甚至稍大於對小鼠穿孔素的抑制能力。例如，化合物ID no.53700抑制小鼠穿孔素達96.7％的程度，和抑制人穿孔素達103.9％的程度。
然後選擇化合物46553，並就其阻斷穿孔素和粒酶B在誘導Jurkat細胞的凋亡中的協同作用的能力進行測定。結果證實抑制劑化合物46553完全阻斷Jurkat細胞的凋亡(圖32)。對於抑制劑化合物34231、77367和32846也已觀察到類似的效果(此處未顯示數據)。
最後，應當理解可產生各種其他的修飾和/或改變而不背離此處概括的本發明的精神。
權利要求
1.一種逆轉錄病毒載體，該載體能夠在用所述載體轉染的宿主細胞中驅動穿孔素分子或其片段或變體的表達。
2.權利要求1的逆轉錄病毒載體，其進一步包含編碼穿孔素分子或其片段或變體的多核苷酸。
3.權利要求1或2的逆轉錄病毒載體，該載體來源於莫洛尼鼠白血病病毒、鼠幹細胞病毒、脾壞死病毒、勞斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類造白細胞組織增生病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。
4.權利要求3的逆轉錄病毒載體，其來源於鼠幹細胞病毒(MSCV)。
5.權利要求4的逆轉錄病毒載體，其是pLXSN。
6.權利要求1至5中任一項的逆轉錄病毒載體，其中所述穿孔素分子是天然的穿孔素分子。
7.權利要求1至6中任一項的逆轉錄病毒載體，其中所述變體是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
8.權利要求7的逆轉錄病毒載體，其中所述變體是由在患有噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)和/或家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(FHL)的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
9.權利要求8的逆轉錄病毒載體，其中所述變體是由在患有FHL的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
10.權利要求7的逆轉錄病毒載體，其中所述變體是由包含選自下列的突變的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子i)3 G→A取代ii)50 C缺失iii)50 T插入iv)116 C→A取代v)133 G→A取代vi)148 G→A取代vii)160 C→T取代viii)190 C→T取代ix)207 C缺失x)283 T→C取代xi)445 G→A取代xii)836 G→A取代xiii)657 C→A取代xiv)658 G→A取代xv)662 C→T取代xvi)671 T→A取代xvii)673 C→T取代xviii)694 C→T取代xix)695 G→A取代xx)755 A→G取代xxi)781 G→A取代xxii)836G→A取代xxiii)853-855 AAG缺失xxiv)1034 C→T取代xxv)1083 G缺失xxvi)1090-1091 CT缺失xxvii)1122 G→A取代xxviii)1182 T插入xxix)1286 G→A取代xxx)1304 C→T取代。
11.包含權利要求1至10中任一項的逆轉錄病毒載體的包裝細胞。
12.權利要求11的包裝細胞，其選自HEK 293、HEK 293T、TE671、HT1080、PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、美國專利號5,278,056中描述的細胞株系、GP+E-86(ATCC CRL-9642)、GP+envAm-12(ATCC CRL-9641)、293T、PE501、PA317.psi.-2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86和GP+envAm12。
13.權利要求12的包裝細胞，其是HEK 293細胞。
14.權利要求13的包裝細胞，其是HEK 293T細胞。
15.包含權利要求1至10中任一項的逆轉錄病毒載體的逆轉錄病毒顆粒。
16.用權利要求1至10中任一項的逆轉錄病毒載體轉染的細胞。
17.權利要求16的細胞，其是原核細胞或選自胚胎幹細胞、胚胎癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質形成細胞、內皮細胞、支氣管上皮細胞和免疫細胞的真核細胞。
18.權利要求15的細胞，其中所述免疫細胞選自嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和天然殺傷細胞。
19.權利要求18的細胞，其是嗜鹼性粒細胞。
20.權利要求19的細胞，其是大鼠嗜鹼細胞性白血病(RBL)細胞。
21.表達穿孔素分子或其片段或變體的方法，所述方法包括用權利要求1至10中任一項的逆轉錄病毒載體轉染細胞。
22.表達穿孔素分子或其片段或變體的方法，所述方法包括將細胞暴露於權利要求15的逆轉錄病毒顆粒。
23.權利要求21或22的方法，其中所述穿孔素分子是天然的穿孔素分子。
24.權利要求21或22的方法，其中所述變體是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
25.權利要求24的方法，其中所述變體是由在患有噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)和/或家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(FHL)的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
26.權利要求25的方法，其中所述變體是由在患有FHL的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
27.權利要求24的方法，其中所述變體是由包含選自下列的突變的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子i)3 G→A取代ii)50 C缺失iii)50 T插入iv)116 C→A取代v)133 G→A取代vi)148 G→A取代vii)160 C→T取代viii)190 C→T取代ix)207 C缺失x)283 T→C取代xi)445 G→A取代xii)836 G→A取代xiii)657 C→A取代xiv)658 G→A取代xv)662 C→T取代xvi)671 T→A取代xvii)673 C→T取代xviii)694 C→T取代xix)695 G→A取代xx)755 A→G取代xxi)781 G→A取代xxii)836 G→A取代xxiii)853-855 AAG缺失xxiv)1034 C→T取代xxv)1083 G缺失xxvi)1090-1091 CT缺失xxvii)1122 G→A取代xxviii)1182 T插入xxix)1286 G→A取代xxx)1304 C→T取代。
28.權利要求21至27中任一項的方法，其中所述細胞是原核細胞或選自胚胎幹細胞、胚胎癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質形成細胞、內皮細胞、支氣管上皮細胞和免疫細胞的真核細胞。
29.權利要求28的方法，其中所述免疫細胞選自嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和天然殺傷細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述細胞是嗜鹼性粒細胞。
31.權利要求30的方法，其中所述細胞是大鼠嗜鹼細胞性白血病(RBL)細胞。
32.權利要求21至31中任一項的方法，其進一步包括分離所述表達的穿孔素分子或其片段或變體的步驟。
33.由權利要求32的方法產生的分離的穿孔素分子或分離的其片段或變體。
34.權利要求33的分離的穿孔素分子，其是天然的穿孔素分子。
35.權利要求33的分離的穿孔素分子，其中所述變體是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
36.權利要求35的分離的變體穿孔素分子，其是由在患有噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(HLH)和/或家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症(FHL)的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
37.權利要求36的分離的變體穿孔素分子，其是由在患有FLH的個體中鑑定的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子。
38.權利要求35的分離的變體穿孔素分子，其是由包含選自下列的突變的多核苷酸序列編碼的突變的穿孔素分子i)3 G→A取代ii)50 C缺失iii)50 T插入iv)116 C→A取代v)133 G→A取代vi)148 G→A取代vii)160 C→T取代viii)190 C→T取代ix)207 C缺失x)283 T→C取代xi)445 G→A取代xii)836 G→A取代xiii)657 C→A取代xiv)658 G→A取代xv)662 C→T取代xvi)671 T→A取代xvii)673 C→T取代xviii)694 C→T取代xix)695 G→A取代xx)755 A→G取代xxi)781 G→A取代xxii)836 G→A取代xxiii)853-855 AAG缺失xxiv)1034 C→T取代xxv)1083 G缺失xxvi)1090-1091 CT缺失xxvii)1122 G→A取代xxviii)1182 T插入xxix)1286 G→A取代xxx)1304 C→T取代。
39.鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的表達的化合物的方法，所述方法包括步驟提供權利要求16至20中任一項的細胞；將所述細胞暴露於受試化合物；和確定所述受試化合物是否調節穿孔素分子或其片段或變體在所述細胞中的表達。
40.權利要求39的方法，其中確定所述受試化合物是否調節穿孔素分子或其片段或變體的表達，包括這樣的步驟，即將所述穿孔素分子或其片段或變體在所述細胞中的表達與所述穿孔素分子或其片段或變體在未被暴露於所述受試化合物的細胞中的表達進行比較。
41.鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的活性的化合物的方法，所述方法包括步驟提供權利要求33至38中任一項的分離的穿孔素分子或分離的其片段或變體；將所述分離的穿孔素分子或分離的其片段或變體暴露於受試化合物和靶細胞；和確定所述受試化合物是否調節所述穿孔素分子或其片段或變體對所述靶細胞的活性。
42.鑑定調節穿孔素分子或其片段或變體的活性的化合物的方法，所述方法包括步驟提供權利要求16至20中任一項的細胞，所述細胞表達穿孔素分子或其片段或變體；將所述細胞暴露於受試化合物和靶細胞；和確定所述受試化合物是否調節所述穿孔素分子或其片段或變體對所述靶細胞的活性。
43.權利要求41或42的方法，其中所述確定所述受試化合物是否調節所述穿孔素分子或其片段或變體對所述靶細胞的活性的步驟包括這樣的步驟，即將所述穿孔素分子或其片段或變體對所述靶細胞的活性與所述穿孔素分子或其片段或變體對未暴露於所述受試化合物的靶細胞的活性進行比較。
44.權利要求43的方法，其中穿孔素分子或其片段或變體對靶細胞的活性鑑定為所述穿孔素分子或其片段或變體裂解所述靶細胞的能力。
45.由權利要求39至44中任一項的方法鑑定的化合物。
46.由權利要求39或40的方法鑑定的化合物，其中所述化合物能夠抑制穿孔素分子或其片段或變體在細胞中的表達。
47.權利要求39或40的方法鑑定的化合物，其中所述化合物能夠增加穿孔素分子或其片段或變體在細胞中的表達。
48.權利要求41至44中任一項的方法鑑定的化合物，其中所述化合物能夠抑制穿孔素分子或其片段或變體對細胞的活性。
49.權利要求41至44中任一項的方法鑑定的化合物，其中所述化合物能夠增強穿孔素分子或其片段或變體對細胞的活性。
50.抑制穿孔素分子或其片段或變體在細胞中的表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於權利要求46的化合物。
51.增加穿孔素分子或其片段或變體在細胞中的表達的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於權利要求47的化合物。
52.抑制穿孔素分子或其片段或變體對細胞的活性的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於權利要求48的化合物。
53.增強穿孔素分子或其片段或變體對細胞的活性的方法，所述方法包括將所述細胞暴露於權利要求49的化合物。
54.包含權利要求33至38中任一項的穿孔素分子或其片段或變體以及藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。
55.包含權利要求46的化合物和藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。
56.包含權利要求47的化合物和藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。
57.包含權利要求48的化合物和藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。
58.包含權利要求49的化合物和藥學上可接受的媒介物、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑的藥物組合物。
59.治療受試者的預防性或治療性方法，所述受試者具有患與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病的風險或對所述疾病易感，或者患有所述疾病，所述方法包括給所述受試者施用治療有效劑量的權利要求46或48的化合物的步驟。
60.治療受試者的預防性或治療性方法，所述受試者具有患與不希望的穿孔素表達和/或活性相關的疾病的風險或對所述疾病易感，或者患有所述疾病，所述方法包括給所述受試者施用治療有效劑量的權利要求47或49的藥物組合物的步驟。
61.權利要求59的預防性或治療性方法，其中所述疾病選自青少年糖尿病(I型或胰島素依賴型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同種異體移植排斥以及與細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫病理學相關的疾病。
62.權利要求60的預防性或治療性方法，其中所述疾病選自病毒感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和C型肝炎)、癌症(例如淋巴瘤)、結核病以及與穿孔素缺乏相關的病狀，例如HLH和FHL。
全文摘要
本發明涉及能夠在細胞中驅動穿孔素表達的逆轉錄病毒載體和在細胞中表達重組穿孔素的方法。本發明也涉及從其衍生而來的重組穿孔素多肽和核酸分子及其用途。還包括使用該重組穿孔素分子的篩選測定法、由該篩選測定法鑑定的化合物及其用途。
文檔編號C07K14/47GK1950512SQ200580014035
公開日2007年4月18日 申請日期2005年3月1日 優先權日2004年3月1日
發明者J·A·特拉帕尼, M·J·史密斯 申請人:彼得麥克凱勒姆腫瘤研究所