降低血磷水平的人fgf23蛋白質突變體的製作方法

2023-10-19 16:59:02 2

專利名稱：降低血磷水平的人fgf23蛋白質突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白質突變體及這些突變體的用途。
背景技術：
FGF23是一種由Ito等在Kyoto大學克隆的基因，其在腦中表達已被確認(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophy.Res.Commun.277494-498；WO01/66596)。進一步地，Luethy等已克隆FGF23基因以生產可表達此基因的轉基因小鼠並分析該小鼠的表型(WO01/61007)另外，基於對患有佝僂病(一種先天性低磷酸鹽血症)的病人的基因譜分析，報導此病是由於FGF23的突變(R176Q，R179Q，R179W)造成(The ADHRConsortium(2000)Nat.Genet 26345-348)。
然而，此報導既未提及獲得了蛋白質或全長cDNA，也未提及前述觀察到的FGF23基因突變與低磷酸鹽血症之間的因果聯繫。

發明內容
本發明是鑑於前述觀察資料完成的。本發明的目的特別包括了提供降低血磷水平的FGF23蛋白質突變體，編碼這些突變體的DNA和這些突變體及DNA的用途。
本發明者為達到前述目的進行了廣泛的研究，目的在於獲得希望降低血磷水平的FGF23蛋白質的突變體。首先分離人FGF23基因的全長cDNA，然後用PCR技術合成編碼突變體的DNA並克隆入表達載體。經由靜脈內給藥將此表達載體導入小鼠以在其體內表達此突變體，其後檢測小鼠的血磷水平。結果表明由於FGF23突變體的表達，小鼠的血磷水平顯著降低。
特別是，除成功製備出FGF23蛋白質突變體外，本發明者還用這些突變體成功降低了小鼠的血磷水平，最後達到了本發明的目的。因為本發明的FGF23蛋白質突變體能如前述降低血磷水平，所以人們十分希望它們可用做治療高磷酸鹽血症的藥物。
本發明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白質的突變體，編碼這些突變體的DNA和這些突變體及DNA的用途。更為具體地，本發明提供了(1)一種DNA，編碼含有胺基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質，此胺基酸序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
(2)一種編碼包含蛋白質的至少1到190位胺基酸序列的片段的DNA，該蛋白質含有胺基酸序列SEQ ID NO2，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
(3)一種載體，其中插入了根據權利要求1或2的DNA。
(4)一種轉化細胞，其包含根據權利要求1或2的DNA或根據權利要求3的載體。
(5)一種含有胺基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
(6)一種含有蛋白質至少其位置1到190的胺基酸序列的片段，該蛋白質含有胺基酸序列SEQ ID NO2，該序列包含選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
(7)一種製備根據權利要求5或6的蛋白質的方法，其包括培養根據權利要求4的轉化細胞的步驟和從此轉化細胞或其培養上清收集表達蛋白質的步驟。
(8)一種降低血磷水平的藥物組合物，其包含根據權利要求1或2的DNA，根據權利要求3的載體或根據權利要求5或6的蛋白質。
(9)權利要求8的藥物組合物，其不影響血鈣水平。
(10)權利要求8或9的藥物組合物，用於治療高磷酸鹽血症。
(11)一種治療高磷酸鹽血症的方法，包括向患者給藥根據權利要求1或2的DNA的步驟。
本發明提供編碼降低血磷水平的FGF23蛋白質突變體的DNA。本發明DNA所編碼的這些突變體包含SEQ ID NO2的人FGF23蛋白質胺基酸序列上位置176上的精氨酸為穀氨醯胺取代的突變體，位置179上的精氨酸為穀氨醯胺取代的突變體和位置179上的精氨酸為色氨酸取代的突變體(在下文中，這些突變體分別被稱為「R176Q突變體」，「R179Q突變體」和「R179W突變體」，並且它們所有都被稱為「FGF突變體」)。在這些突變體中，R176Q突變體和R179Q突變體是優選的，並且R179Q突變體是最優選的。
本發明也提供了這些FGF突變體的片段。優選片段至少含有從FGF突變體位置1到190的胺基酸序列。
本發明的這些FGF23突變體能夠降低血磷水平。因此，人們希望能用這些FGF23突變體對由於血液中磷水平高而引起的疾病起到治療和預防的效果。根據本發明的優選實施方案，FGF23突變體不會影響血鈣水平。
人們期待能夠對此發揮治療和預防效果的疾病實例是高磷酸鹽血症。高磷酸鹽血症通常由於腎臟分泌的PO4降低而發生。進行性(advanced)腎衰(腎小球濾過率(GFR)低於20mL/min)會造成足以導致血漿PO4升高的分泌降低。即使沒有腎衰的病因，假性甲狀旁腺功能衰退或甲狀旁腺功能衰退也可能會引發腎臟PO4分泌紊亂。由於口服用藥PO4過量或有時含磷酸鹽的灌腸劑的應用過量同樣會造成高磷酸鹽血症。而且，高磷酸鹽血症會作為細胞內PO4遷移到細胞外的結果出現。此種遷移常在糖尿病酮症酸中毒(不考慮全身PO4丟失)，瘀傷，無創傷性橫紋肌溶解，全身感染和腫瘤溶解綜合症中出現。並且，高磷酸鹽血症在繼發性甲狀旁腺功能衰退的發作和長時間接受透析治療的病人其腎性骨營養不良的發作中起到重要作用。
本發明的DNA用於體內和體外製備本發明下面所描述的突變體。另外，它們可用於基因治療由於血磷水平高引起的疾病。本發明的DNA可呈現任何形式，只要它們編碼本發明的突變體。例如，DNA可為由mRNA合成的cDNA，為基因組DNA或經由化學合成。而且，基於遺傳密碼簡併性而具有主觀核苷酸序列的DNA包含在本發明的DNA中，只要它們編碼出此發明的突變體。
本發明的DNA可通過修飾人FGF23 cDNA而製成。此種人FGF23cDNA可以用業內人士已知的方法來製備。例如，其可通過從表達FGF23的細胞製備cDNA文庫再用FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1))的部分作為探針進行雜交。例如，cDNA文庫可用文獻(Sambrook，J.et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))描述的方法製備，或應用商品化的DNA文庫。進一步，文庫可如下製備(1)從表達FGF23的細胞製備RNA；(2)用逆轉錄酶合成cDNA(3)合成一段基於FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1)的寡DNA；並且(4)用此寡DNA作為引物進行PCR以擴增編碼本發明多肽的cDNA。
更為具體地，mRNA可以首先從表達FGF23的細胞，組織或器官中分離，已知方法可用於分離mRNA。例如，總RNA可用胍超速離心(ChirgwinJ.M.et al.，Biochemistry 185294-5299(1979))或用AGPC法(Comczynski P.和Sacchi n.，Anal.Biochem.162156-159(1987)製備，mRNA則可用一種mRNA純化試劑盒(Pharmacia)純化自總RNA，等等。或者，mRNA可以直接用一種QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)來製備。
得到的mRNA可用逆轉錄酶來合成cDNA。cDNA可用一種試劑盒如AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)來合成。或者cDNA可按照5』-RACE法(Frohman M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.et al.，Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))來合成並擴增，其所用引物是基於SEQ ID NO1，5』-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)和聚合酶鏈式反應(PCR)中描述的序列來製備的。
所要的DNA片段是由PCR產物製備並連接到載體DNA上。重組載體用於轉化大腸桿菌等。而且想要的重組載體是從選擇的菌落來製備的。此所要的DNA的核苷酸序列可用傳統方法來驗證，如雙脫氧核苷酸鏈終止法。
具體地，可以獲得人FGF23 cDNA，例如，用如下例1介紹的方法。
用於製備本發明FGF23突變體時對人FGF23 cDNA所做的修飾可以用業內人士通常使用的DNA誘變方法來進行。例如，所述修飾可用如下例2中的方法。
本發明也提供由本發明前述DNA編碼的突變體。本發明的這些突變體可能在它們的胺基酸，分子量，等電點，或糖鏈的存在或形式上有所不同，此不同依賴於生產突變體的細胞或宿主，或如下所述製備方法的不同。然而，只要得到的突變體能降低血磷水平，它們都包括在本發明中。例如，當本發明的突變體在一種原核細胞如大腸桿菌中表達時，原來突變體的胺基酸序列N末端就會被添加上一個蛋氨酸殘基。此種突變體也被包括在本發明中。
本發明的突變體可用業內人士已知的方法製備成重組多肽。這種重組多肽可經如下過程來製備將編碼本發明突變體的DNA插入適宜的表達載體，收集將載體轉染入適宜宿主細胞得到的轉化子，並在得到提取物後用層析法來純化多肽，如離子交換層析法，反相層析法，凝膠過濾層析法或親和層析法。在親和層析法中，抗本發明突變體的抗體可固定在一個層析柱上或將多個這樣的層析柱進行組合。
而且，當本發明的突變體在一種宿主細胞(例如，動物細胞，大腸桿菌等)中表達為一種與穀胱甘肽S-轉移酶蛋白質融合的多肽或一種添加了多個組氨酸的重組多肽時，此表達重組多肽可以用穀胱甘肽柱或鎳柱來純化。純化融合多肽後，如果必要可以用凝血酶，凝血因子Xa等將非所需的突變體區域從融合多肽上切除。
本發明也提供其中插入了本發明DNA的載體。本發明的載體用於在宿主細胞內維持本發明的DNA或表達本發明的突變體。
當大腸桿菌用作宿主細胞時，除了載體應有一個「ori」和一個標記基因外沒有其它限制。此「ori」用於擴增並大規模製備大腸桿菌內載體(例如，JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue)。標記基因用於選擇轉化的大腸桿菌(例如，通過藥物如氨苄青黴素，四環素，卡那黴素，或氯黴素選擇的抗性基因)。例如，可用M13-系列載體，pUC系列載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。除上述載體外，pGEM-T，pDIRECT，pT7等也可用做cDNA的亞克隆和切割。在一種載體用於製備本發明突變體時，尤其有用的是表達載體。當表達載體在大腸桿菌內表達時，此表達載體應具有上述特徵以在大腸桿菌中擴增。而且，在大腸桿菌，如JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue用做宿主細胞時，載體應具有啟動子，例如lacZ啟動子(Wizard etal.(1989)Nature 341544-546；(1992)FASEB J.62422-2427)，araB啟動子(Better et al.(1988)Science 2401041-1043)，或能有效促進所需基因在大腸桿菌內表達的T7啟動子。其它載體的例子為pGEX-5X-1(Pharmacia)，「QIAexpress系統」(QIAGEN)，pEGFP和pET(對此種載體，一種表達T7RNA聚合酶的菌株BL21優選作為宿主使用)。
而且，載體可包含一段分泌多肽的信號序列。為將多肽製備到大腸桿菌周質中，pelB信號序列(Lei，S.P.et al.(1987)J.Bacteriol.1694379)可用作多肽分泌的信號序列。例如，氯化鈣法或電穿孔法可以用來將載體導入宿主細胞。
作為用於製備本發明突變體的載體，本文提及來自哺乳動物的表達載體(如pCDNA3(Invitrogen)，pEGF-BOS (Nucleic Acids Res.(1990)18(17)5322)，pEF，pCDM8)，來自昆蟲細胞的表達載體(如「Bac-to-BAC杆狀病毒表達系統」(GIBCO-BRL)，pBacPAK8)，來自植物的表達載體(如pMH1，pMH2)，來自動物病毒的表達載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自逆轉錄病毒的表達載體(如pZIPneo)，來自酵母的表達載體(如「畢赤氏酵母表達試劑盒」(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)和來自枯草芽孢桿菌的表達載體(如pPL608，pKTH50)，而來自大腸桿菌的那些表達載體未提及。
為在動物細胞如CHO，COS，和NIH3T3細胞中表達蛋白質，載體必須具有在所述細胞中用於表達所必需的啟動子(例如SV40啟動子(Mulliganet al.(1979)Nature 277108)，MMLV-LTR啟動子，EF1α啟動子(Mizushima etal.(1990)Nucleic Acids Res.185322)，CMV啟動子等)。如果載體另外還有一個用於選擇轉化子的標記基因就更優選(例如，一種由藥物(如新黴素，G418等)選擇的抗藥基因)。具有此種特徵的載體例子可包括pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV，pOP13等。
而且，為了穩定表達基因並在細胞內增加其拷貝數，可採用如下方法將核酸合成途徑缺陷的CHO細胞用作宿主，向此CHO細胞中導入一種含有DHFR基因以彌補此細胞缺陷的載體(如pCHOI)，並用氨甲蝶呤(MTX)來擴增載體。而且為了瞬間表達一種基因，可用如下方法用含有SV40複製起始點的載體(如pcD)，轉化染色體上有SV40 T抗原基因的COS細胞。所述複製起始點可以是多瘤病毒，腺病毒，牛乳頭瘤病毒(BPV)等的複製起始點。另外，為增加宿主細胞內的基因拷貝數，選擇性標記如氨基糖苷轉移酶(APH)基因，胸腺嘧啶激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因，及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因可導入表達載體。
在動物體內表達本發明的DNA的例子包括將此發明DNA插入適宜載體，並用逆轉錄病毒法、脂質體法、陽離子脂質體法、腺病毒法等將此載體導入活體。因此，可用於基因治療由於血磷水平高而引發的疾病。這些方法中所用載體包括但不局限於腺病毒載體(如pAdexlcw)、逆轉錄病毒載體(如pZIPneo)等。基因操作的一般技術，如將本發明的DNA插入一種載體可根據傳統方法(Molecular Cloning，5.61-5.63)進行操作。對於活體的給藥可根據回體(ex vivo)方法或體內方法進行操作。
本發明也提供了該發明載體所導入的宿主細胞。此發明載體導入的宿主細胞不受特殊限制。例如，大腸桿菌和多種動物就可以被應用。本發明宿主細胞可用作，例如，製備和表達本發明蛋白質的製備系統。蛋白質製備系統包括體外和體內系統。應用真核細胞或原核細胞的這些製備系統用作體外製備系統。
例如，可以應用真核宿主細胞，動物細胞，植物細胞和真菌細胞。哺乳動物細胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108945)，COS，3T3，骨髓瘤，BHK(幼年倉鼠腎)，Hela，Vero，兩棲動物細胞(如滑爪蟾卵母細胞(Valle et al.(1981)Nature 291358-340))及昆蟲細胞(如Sf9，Sf21，Tn5)均已知為動物細胞。CHO細胞中，那些具有DHFR基因缺陷的細胞、dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)774216-4220)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)601275)的特別優選。在動物細胞中，CHO細胞特別優選做大規模表達。一種載體可以被導入宿主細胞通過，例如磷酸鈣法、DEAE-dextran法、用陽離子脂質體DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法、電穿孔法、脂質轉染法等。
已知來自菸草(Nicotiana tabacum)的植物細胞為多肽製備系統，其可用作胼胝體(callus)培養物。作為真菌細胞，酵母細胞如酵母屬包括釀酒酵母(Saccharomeyces cerevisiae)，或絲狀真菌如麴黴屬，包括黑麴黴(Aspergillusniger)是已知的。
用作多肽製備的有用原核細胞包括細菌細胞。細菌細胞如大腸桿菌(例如JM109，DH5α，HB101等)和枯草芽孢桿菌已知可用於多肽製備。
這些細胞用理想的DNA轉化，得到的轉化子在體外培養以得到多肽。轉化子可用已知方法培養。例如，培養基如添加或不添加血清如胚胎小牛血清(FCS)的DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM可用作動物細胞的培養基。培養基的pH優選在大約6到大約8。這些細胞通常在大約30℃到大約40℃孵育大約15到大約200個小時，且如果必要，培養基可以置換、通氣或攪動。
動物和植物宿主可以用作體內多肽製備。例如，編碼本發明突變體的DNA可以導入一種動物或者植物宿主。此突變體可在體內製備再回收。這些動物和植物宿主包括在本發明的宿主中。
前述製備系統中所用的動物包括哺乳動物和昆蟲。哺乳動物如羊、豬、綿羊、小鼠和牛是可用的(Vicki Glaser(1993)SPECTRUM BiotechnologyApplications)。或者哺乳動物可為轉基因動物。
例如，編碼本發明突變體的DNA可以與基因如羊β酪蛋白基因(編碼特異地進入奶中的多肽)形成融合基因以此為製備。含有融合基因的DNA片段注入羊胚胎，其可再返回導入母羊。此發明突變體可以從轉基因羊(即那些接受了修飾胚胎的羊所娩出的羊)產的奶中得到或從它們的後代得到。為提高含有轉基因羊製造的多肽的奶量，可給藥適當的激素(Ebert，K.M.etal.，(1994)Bio/Technology 12699-702)。
或者，昆蟲如蠶(silkworm)可以應用。編碼本發明突變體的DNA所插入的杆狀病毒可用來感染蠶，並且突變體可以從體液中回收(Susumu M.etal.，(1985)Nature 315592-594)。
在植物細胞中，菸草可以應用。當應用菸草時，編碼本發明突變體的DNA可插入植物表達載體中，如pMON530，其可導入細菌，如根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。因而，用細菌感染菸草如菸草(Nicotianatabacum)，可從葉片中回收想要的突變體(Julian K.-C.Ma et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24131-138)。
如前獲得的本發明突變體可從宿主細胞內部或外部(如培養基)分離得到，且純化成為基本純的均一多肽。此種多肽分離純化的方法不限於任何特定方法。事實上，可用任何標準方法。例如柱層析法、過濾法、超濾法、鹽析法、溶劑沉澱法、溶劑萃取法、蒸餾法、免疫沉澱法、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法、等電點電泳法、透析法和重結晶法，可從其中適當選擇並組合方法以分離純化多肽。
對於層析、例如親和層析，離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、反相層析、吸附層析等都可以應用(Strategies for Protein Purification andCharacterizationa Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。這些層析可用液相層析如HPLC和FPLC來操作。因此，本發明依前法製作可提供高純度的突變體。
本發明突變體可在純化前後用合適的蛋白質修飾酶處理，從而被選擇性修飾或部分去除。例如，胰蛋白質酶、胰凝乳蛋白質酶、賴氨醯內肽酶、蛋白質激酶、葡萄糖苷酶等可用作蛋白質修飾酶。
本發明進一步提供了藥用化合物以降低血磷水平，此種化合物包含本發明的突變體、編碼突變體的DNA或DNA導入的載體。
當本發明突變體作為藥物用於人體和其他動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒(baboons)和黑猩猩時，突變體可直接或作為用已知藥物製備方法配製的藥用化合物用藥給受試者。例如，根據預期的應用，藥物可作為糖衣藥片、膠囊、酏劑和微膠囊口服或以水或其它可藥用液體製成的無菌溶液、懸液的注射劑形式非口服給藥。例如，化合物可以以通常接受的使用藥物所需的單位劑量形式，與藥學上可接受的載體或介質混合，具體是無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、溶劑、表面活性劑、穩定劑、調味劑、賦形劑、載體(vehicles)、防腐劑和粘合劑。這些製劑中活性成分的量為在指定要求範圍內適宜的量。
可與之混合製成藥片或膠囊的添加劑的例子是粘合劑如明膠、玉米澱粉、西黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑如結晶纖維素；膨脹劑如玉米澱粉、明膠和褐藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖或糖精；調味劑如薄荷油、白株樹腺毛油(Gaultheria adenothrix oil)和櫻桃(cherry)。當單位劑量形式為膠囊、液體載體，如油也可包括在上述成分中。無菌注射用組合物按通常的藥物配製方法，應用載體如注射用蒸餾水來配製。
生理鹽水、葡萄糖和其他等滲液體包括佐劑，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用水溶液。這些可與適宜增溶劑如醇、尤其是乙醇，多元醇如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑如Polysor bate 80TM和HCO-50聯合應用。
芝麻油或大豆油可用作油質液體，並可與苯甲基安息香酸酯或苯甲基乙醇聯合用作增溶劑；其可與緩衝液如磷酸鹽緩衝液和乙酸鈉緩衝液來配製；可與止痛劑如鹽酸普魯卡因；穩定劑如苯甲基乙醇、苯酚；以及抗氧化劑配製。製備好的注射劑注入合適的安瓿中。
業內人員已知的方法可用於向病人給藥此藥物化合物。例子包括動脈內注射、靜脈內注射、皮下注射、鼻內給藥、經氣管給藥、肌肉內給藥、經皮給藥和口服用藥。劑量可根據病人體重和年齡及用藥方法而有所變化。
本發明突變體的劑量可根據個體、靶器官、症狀和用藥方法而不同，但通常一個成年人(體重60kg)每天大約100μg到大約20mg。
儘管會隨個體、靶器官、症狀和用藥方法變化，腸胃外給藥的化合物的單次劑量，在靜脈內注射給藥正常成年人(60kg體重)時每天優選在大約0.01mg到大約30mg的範圍，優選在約0.1mg到約20mg的範圍，更優選在約0.1mg到約10mg的範圍。轉換成60kg體重或單位體表面積的劑量可以給藥其它動物。
而且，當本發明DNA用作藥物組合物時，其可插入載體以確保前述本發明DNA的體內表達，並通過例如逆轉錄病毒法、脂質體法、陽離子脂質體法、腺病毒法等導入活的個體。用此方法，可以進行針對由高血磷水平引發的疾病的基因治療。回體方法和體內方法可用於向活的個體內給藥。
附圖簡述

圖1此圖顯示FGF23突變體對於血清無機磷水平的作用。血清無機磷水平在導入DNA載體4天後檢測。數據以均值±SEM表示。柱體數字為動物數量。與模擬對照相比*P＜0.05(不對稱t-檢驗)。
圖2此圖顯示FGF23對於血清無機磷水平的作用。血清無機磷水平在導入DNA載體4天後檢測。數據以均值±SEM表示。柱體數字為動物數量。與模擬對照相比*P＜0.05(不對稱t-檢驗)。
圖3此圖顯示FGF23和FGF23突變體對於血清1α，25(OH)2D3水平的作用。血清1α，25(OH)2D3水平在導入DNA載體4天後檢測。混合3隻動物所得血清用於檢測(n＝2，6隻動物/組)。其數據以均值表示。
圖4此圖顯示FGF23突變體對於自腎分離的刷狀緣膜囊泡磷轉運活性的作用。檢測腎刷狀緣膜囊泡對導入小鼠的裸DNA載體的Pi攝取量(導入4天後)。取2隻動物的腎用於檢測(n＝3，6動物/組)。其數據以均值表示。
圖5此照片顯示FGF-23(突變體)M2-F的SDS-PAGE(考馬斯亮藍(CBB)染色)分析的結果。M表示分子量標記(BIO-RAD Laboratories，寬範圍的分子量標記)。
圖6此圖顯示C末端缺失的M2FGF23突變體對血清磷水平的降低作用。「模擬」表示導入親代載體pCAGGS的小鼠。「Normal」表示的正常小鼠。
圖7此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23降低TPTX大鼠血清磷的作用。
圖8此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23對TPTX大鼠血清鈣的作用。
圖9此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23對TPTX大鼠腎臟磷酸分泌的作用。
具體實施方案在下文中，本發明參考實施例進行具體闡述，但這些實施例不構成對本發明的限制。
實施例1複製人FGF23的全長cDNA(ORF部分)克隆FGF23全長cDNA(ORF部分)採用PCR法。根據GenBank數據，向序列(5』ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg-3』/SEQ ID NO3；和5』ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg-3』/SEQ ID NO4)添加EcoR I位點和Xho I位點以設計引物(登錄號AB037973)。之後，對於5』引物將Kozak序列(CCACC)添加至其ATG起始密碼子上遊，並且兩個TGA終止子被添加到3』端序列。引物承包給Sawady Technology構建。人心臟cDNA(Multiple cDNA試劑盒，Cat.No.CH-1101，OriGene)用作模板，QIAGEN PCR試劑盒(Cat.No.201223，QIAGEN)用於PCR反應。更為具體的是，0.75μl人心臟cDNA(Multiple cDNA試劑盒，OriGene)，2.5μl QIAGEN10×PCR緩衝液，0.5μl dNTP混合物(200mM)，0.25μl QIAGEN Taq DNA聚合酶，5.0μl 5×Q-溶液，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和15μl去離子蒸餾水(DDW)混合至PCR反應總體積為25μl。此PCR反應是用熱循環儀ABI2400按如下條件進行初次變性95℃2分鐘，2步穿梭(shuttle)PCR的35輪循環(94℃40秒，然後60℃1分鐘)，延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之後用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應擴增產物。結果呈現為一條特異性條帶位於750bp附近。再用TOPO TA克隆試劑盒(Cat.No.K45000-01，Invitrogen)，用2μl PCR反應溶液將擴增的DNA亞克隆至TA載體pCR2.1。其後步驟根據試劑盒提供的流程。然後，對用TA克隆的克隆#3進行核苷酸序列分析，該分析是來用M13的M4引物(Cat.No.3832A，TaKaRa)，M13的RV引物(Cat.No.3830A，TaKaRa)，引物SEQ ID NO5(5』CgCACCCCATCAgACCATCT-3』) 和引物SEQ ID NO6(5』gCAgTTCTCCgggTCgAAATA-3』)在ABI377DNA測序儀上進行的。結果是克隆#3的內部序列與人FGF23的完全吻合。最後完成FGF23的克隆。
實施例2人FGF突變體(R176Q，R179Q，R179W，R176Q+R179Q和R176Q+R179W)的製備以人FGF23作為模板，FGF突變體R176Q(M1)，R179Q(M2)，R179W(M3)，R176Q+R179Q(M4)和R176Q+R179W(M5)得以製備。根據文獻(「常染色體顯性低磷酸鹽血佝僂病與FGF23的突變之間的關聯」，NatureGenetics.Vol.26，p345-348，November 2000)，三種突變體527G？A(R176Q)，536G-A(R179Q)和535C-T(R179W)，以及它們的組合，M4(R176Q+R179Q)和M5(R176Q+R179W)可自人FGF23製備。引物合成承包給SawadyTechnology。所用引物的核苷酸序列如下5』CACggCAgCACACCCggAgC-3』(SEQ ID NO7)；5』CACggCggCACACCCAgAgC-3』(SEQ ID NO8)；5』CACggCggCACACCTggAgC-3』(SEQ ID NO9)；5』CACggCAgCACACCCAgAgC-3』(SEQ ID NO10)；和5』-CACggCAgCACACCTggAgC-3』(SEQ ID NO11)。
誘變用包含如下3個步驟的方法進行經過第一次PCR製備用於誘變的部分片段，製備含第二次PCR中的突變的全長突變體的模板，最後在第三次PCR中得到完全的突變體。具體為0.2μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，5μl TaKaRa EX 10×PCR緩衝液，4μl dNTP混合物(50μM)，0.5μl TaKaRaExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定突變體引物(50μM，SEQ ID NOs7，8，9，10或11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和39.3μl DDW混合至總體積50μl，以在熱循環儀ABI2400上進行PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的35輪循環(94℃40秒，然後60℃30秒)，最後延伸反應72℃4分鐘以完成反應。之後用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應擴增產物。結果呈現為一條特異性條帶位於200bp附近。用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)按試劑盒提供的流程從膠中純化每條特異性擴增的片段。之後，用該純化片段(突變體部分序列)，進行第二次PCR反應(製備全長突變體模板)。用1μl純化片段作為引物，0.1μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR緩衝液，2μldNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，和18.15μl DDW混合至總體積24μL，以在熱循環儀ABI2400上進行第二次PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，3步循環PCR的5輪循環(94℃1分鐘，60℃1分鐘，然後72℃1分鐘)以完成第二次PCR反應。之後，將0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)和0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQID NO4)加入此反應溶液達到總體積25μl，在熱循環儀ABI2400上以如下反應條件進行第三次PCR反應初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的35輪循環(94℃40秒，然後60℃1分鐘)，最後延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之後用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應的最終擴增產物，其顯示為一條特異性擴增的條帶位於750bp附近。
根據類似實施例1的方法進行其後的分析。具體為在內部序列的TA克隆之後進行內部序列的核苷酸序列分析。其結果為成功獲得各自含有所需突變的突變體克隆。
實施例3表達載體製備每個克隆的表達載體都是通過將FGF23的各自的內部序列和每種突變體(M1到M5)插入到pCAGGS3製備。具體為每個克隆都用EcoRI限制性酶切割，得到的EcoRI片段用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)純化以插入到EcoRI切割的pCAGGS3。載體分別稱為pCGF23和pCGFM1到pCGFM5。
實施例4無內毒素的質粒的製備為直接體內用藥質粒DNA，進行質粒純化時添加了內毒素去除處理。更具體地，pCGF23和pCGFM1到pCGFM5可用Endofree plasmid MaxiKit(Cat.No.12362，QIAGEN)根據其提供的流程純化成無內毒素型質粒。
實施例5添加C末端FLAG-標記至FGF-23和M2(R179Q)在C末端含有FLAG序列的突變體可用模板為pCGF23和pCGFM2，引物為含有SEQ ID NO3序列和FLAG序列的SEQ ID NO12來製備。更具體地，1μl pCGF23或pCGFM2(30ng/μL)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR緩衝液，2μl dNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，5』ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg-3』/SEQ ID NO12)和18.5μl DDW混合至總體積25μl，以在熱循環儀ABI2400上進行PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的30輪循環(94℃30秒，然後60℃1分鐘)，最後延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之後用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應的最終擴增產物，其顯示為一條特異性擴增的條帶位於800bp附近。其後的分析用類似實施例1到4的方法進行，最後製備pCGF23-F和pCGFM2-F表達載體。
實施例6添加N末端FLAG-標記至FGF-23和M2(R179Q)含N末端FLAG標記的FGF23表達載體用如下PCR法構建。第一階段PCR反應(25個循環即96℃15秒，55℃15秒，然後72℃2分鐘)用3ngpCG23作模板，100pmol每種特定的正向PCR引物和23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/SEQ IDNO13)或23NR1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/ SEQ IDNO14)與23NFLAGF(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/SEQ ID NO15)作為引物組，並用此處提供的TaKaRa ExTaq及其緩衝液來進行。在通過Microcon-30(Millipore)過濾從PCR反應產物中除去引物後，得每種PCR反應產物的混合物用作模板，FGFF與23R1作為引物組，在與第一階段同樣的條件下進行第二階段的PCR反應。反應完成後，用瓊脂糖電泳純化PCR反應產物。然後用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)來克隆片段，測定其DNA序列以確認導入了所需的突變而非不需要的突變。製備含有確認序列的質粒，用EcoRI切割，收集所得片段用於插入到已經EcoRI切割的pCAGGS3中。最後，確認片段插入的方向後，此表達載體被稱為pCGF23NF。
攜帶N末端FLAG標記的FGF23M2載體可用上述同種方法製備。不同的是在第一階段PCRpCGFM2用作模板，該載體稱為pCGFM23NF。
實施例7製造表達載體用於裸DNA注入的動物實驗使用裸DNA注射法，檢測FGF23及其突變體能否直接或間接影響成年小鼠磷代謝。
所用材料如下FGF23表達載體(pCGF23)R176Q FGF23突變體表達載體((pCGFM1))R179Q FGF23突變體表達載體(pCGFM2)R179W FGF23突變體表達載體(pCGFM3)R176QR179Q FGF23突變體表達載體(pCGFM4)
R176QR179WFGF23突變體表達載體(pCGFM5)對照物(陰性對照物)
模擬載體(pCAGGS)劑型10mMTris/1mMEDTA(pH8.0)溶液保存-20℃，避光保存製備方法
劑型為溶液，製備方法依照TransIT In Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)(TransITIn Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)標準流程)。10μg模擬載體，FGF23表達載體或FGF23突變體表達載體用於給藥每隻動物。10μl TransIT聚合物溶液及適量無菌水在50mL Falcon試管中混合至終體積200μl。室溫放置5分鐘後，2.8mL 1×Delivery溶液加至上述200μl混合溶液以達到給藥溶液總體積3.0mL。如給藥6隻動物，製備用於7隻動物即21mL的溶液量。給藥溶液在製備的當天用完。
本實驗所用動物及其居住條件如下所用動物
動物種類小鼠譜系JclCD-1(ICR)或CrjCD-1(ICR)性別雄性體重35g到40g年齡給藥時為8到9周提供者CLEA日本或Charles River日本安樂死方法麻醉下放血順應時間大約2周分組方法隨機分配繁殖環境
室溫24±2℃相對溼度55±10％通風頻率10到30次/小時照明時間5:00到19:00飼養CE-2(CLEA日本)隨意飲水自來水
實驗方法
靜脈內給藥每劑3mL，8秒鐘內給藥總劑量。
樣本收集
(1)血清在給藥後第4天，醚麻醉狀態下從腹主動脈收集全血。收集血液置於Separapid tube mini(Sekisui chemical)中，離心(1,400×g，10分鐘，4℃)以分離血清。此血清儲存於設置為-20℃的冰箱直到檢測。
(2)尿在給藥後第3天，將小鼠置於玻璃代謝籠(METABOLICA，SUGIYAMA-GEN IRIKI)，匯聚第四天24小時尿收集物。檢測前將此尿一直儲存於設置為-20℃的冰箱。
(3)腎收集血清後，雙腎摘除，去被膜，並對刷狀緣膜囊泡進行純化。
各項指標檢測
血清和尿中無機磷(Pi)，鈣(Ca)，尿素氮(UN)和肌酸酐(CRE)用自動分析儀檢測(Hitachi 7170E型)。25-羥基維生素D和24，25-二羥基維生素D用競爭性蛋白質結合試驗(CPBA)來檢測，而1α，25-二羥基維生素D則用RIA2抗體法來檢測。
統計分析方法
不對稱t-檢驗在模擬載體給藥組和FGF23表達載體給藥組或每個FGF23突變體表達載體給藥組之間進行。顯著性水平為5％(雙尾)。SASVer.6.12在此用作分析軟體。
其結果如圖1所示，對血清生化作用方面，與模擬給藥組比較，不考慮突變體類型，給藥3種FGF23突變體表達載體(它們導入了從常染色體顯性低磷酸鹽血佝僂病(ADHR)病人鑑定出的點突變)中任何一種(即FGF23-M1，FGF23-M2或FF23-M3)的給藥組，血磷水平可見顯著下降。然而，在給藥具有這些點突變的組合的兩種突變體表達載體中任何一種(即FGF23-M4或FGF23-M5)的給藥組，儘管可見類似的血清磷水平降低作用，但不能確定由於點突變的組合帶來了累加或協同作用。野生型FGF23(FGF23-Wild)給藥組，無血清磷水平降低作用(圖2)。
表1所示，比較模擬組和野生型FGF23組或FGF23-M2組，其它血清生化指標(鈣，肌酸酐和尿素氮)無明顯差異。
表1

而且，關於突變體對於尿生化的作用結果，如表2所示，比較FGF23-M2給藥組和模擬組，在FGF23-M2給藥組可見每天磷分泌水平升高的趨勢，然而差異不明顯。
表2

而且，關於突變體對於血清1α，25(OH)2D3的作用結果，如圖3所示，與模擬給藥組相比，FGF23-M2給藥組和野生型FGF23組可見1α，25(OH)2D3水平顯著下降。在野生型FGF23組，1α，25(OH)2D3水平降至大約一半，而在FGF23-M2給藥組，1α，25(OH)2D3水平降低到檢測靈敏度以下。
另一方面，在模擬給藥組，野生型FGF23給藥組和FGF23-M2給藥組中，體內前體25(OH)D3水平無明顯差異。然而，儘管在野生型FGF23給藥組和模擬給藥組之間24，25(OH)2D3水平無差異，但在FGF23-M2給藥組觀察到其水平明顯下降(表3)。
表3

刷狀緣膜囊泡純化
刷狀緣膜囊泡純化是用鎂沉澱法進行的。更具體為將冰浴MET緩衝液(60mM甘露醇，1mM EGTA，2.5mM Tris/HCl，pH7.1)加至收集的腎中，用PHYSCOTRON在18,000rpm下均化1分鐘後，加入1/10體積的1M MgCl2，攪拌並置於冰上15分鐘。通過低速離心(2,000×g，15分鐘，4℃)去除未均化成分，高速離心上清(24,000×g，30分鐘，4℃)以取得沉澱。將MET緩衝液加到沉澱中，進一步將其用Teflon均漿器(1,000rpm，10擊(Strokes))均化。再次加入1/10體積的1M MgCl2，攪拌並置於冰上15分鐘，低速離心此混合物(2,000×g，15分鐘，4℃)後，高速離心(24,000×g，30分鐘，4℃)上清。將Transport緩衝液-K(100mM甘露醇，20mMHEPES/Trs，pH7.4)加至得到的沉澱，用塑料針筒(20G和27G針)反覆抽取推放以此得到刷狀緣膜囊泡。
磷轉運活性測定
快速過濾法適用於用刷狀緣膜測定磷轉運活性。更具體地，20μL刷狀緣膜囊泡和80μL反應液(100mM甘露醇，20mM HEPES/Tris，pH7.4，125mMNaCl，125nM32P-KH2PO4)在25℃反應1分鐘，再加入1mL淬滅溶液(100mM甘露醇，100mM氯化膽鹼，20mM MgSO4，5mM KH2PO4，20mM HEPES/Tris，pH7.4)以終止反應。然後將反應溶液通過硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45μm，2.5cm直徑)抽吸過濾，此硝酸纖維素濾膜先用5mL淬滅溶液清洗。再用液體閃爍計數器TRI-CARB2700TR(Beckman)檢測誘捕在濾膜上的放射性作為總體磷轉運活性。鈉不依賴性磷轉運活性通過在反應溶液中用125mM KCl替代125mM NaCl來檢測。鈉依賴性磷轉運活性作為總體磷轉運活性和鈉不依賴性磷轉運活性的差來計算。此兩種活性都用每分鐘每單位蛋白質吸收的磷量來表示(pmoles/mg蛋白質/分鐘)，在刷狀緣膜囊泡的蛋白質量用BCA蛋白質檢測試劑(PIERCE)來檢測。
其結果如圖4所示，與模擬給藥組相比，FGF23-M2給藥組的腎鈉依賴性磷轉運載體(Na/Pi)活性顯著降低。另一方面，鈉不依賴性磷轉運活性無變化。
實施例8構建C末端缺失型M2FGF23突變體表達載體C末端缺失型M2FGF23突變體表達載體如下所述用PCR法來構建。PCR反應(25循環96℃15秒，55℃15秒，然後72℃2分鐘)用TaKaRa ExTaq及其提供的緩衝液來進行。此反應用3ng pCGFM2NF作為模板，100pmol每種特異性正向PCR引物和dC188(GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/SEQ ID NO16)，dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/SEQ ID NO17)，dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/SEQ ID NO18)，dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA/SEQ ID NO19)，dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/SEQ ID NO20)，dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT/SEQ ID NO21)，dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG/SEQ ID NO22)，或dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/SEQ ID NO23)作為引物組。反應終止後，PCR反應產物用瓊脂糖凝膠電泳純化，所得片段用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)來克隆。然後測定他們的DNA序列以確認導入的為需要的突變而非不需要的突變。製備有確認序列的質粒，之後用EcoRI切割，收集片段再插入已用EcoRI切割的pCAG GS3。由此獲得的表達載體被分別稱為pCGdC188(dC188)，pCGdC194(dC194)，pCGdC200(dC200)，pCGdC210(dC210)，pCGdC217(dC217)，pCGdC223(dC233)，pCGdC240(dC240)和pCGdC245(dC245)。
實施例9C末端缺失型M2FGF23突變體蛋白質的表達1×105COS細胞懸浮在1mL DMEM(10％FCS)培養基(GIBCO)中，並鋪板於一個6孔平板上。過夜培養後，1μg此種表達載體(實施例8中所示的pCGdC188到pCGdC245)通過3μLFuGene(Boeringer)轉染至細胞中並繼續過夜培養。第二天，將培養基置換為CHO-S-SFMII，繼續培養2天。兩天之後，收集培養基，用Western Blotting法用抗FLAG抗體(M2)(SIGMA)來分析培養基中表達的突變體蛋白質，以此確認突變體蛋白質的表達。
實施例10重組FGF-23突變體(M2)在COS細胞中的瞬時表達5×106細胞懸浮在400μLDMEM(10％)FCS培養基(GIBCO)中，加入10μgpCGFM2-F表達載體後移至一0.4cm電穿孔管(BIO-RAD Laboratories)中。用Gene-pulser(BIO-RAD Laboratories)在0.26kV，電阻8，且960mF的條件下進行電穿孔。之後，在30mLDMEM(10％FCS)培養基中懸浮細胞溶液，移至一175cm2的細胞培養瓶(FALCON)中，在CO2孵箱於37℃靜置一日夜。第二天，將培養基置換為30mL CHO-S-SFMII培養基(GIBCO)，繼續培養細胞3天。收集的培養基在3,000rpm離心15分鐘，以去除細胞，再用Western Blotting法用抗FLAG抗體(M2)(SIGMA)來分析培養基以確認重組FGF-23突變體(M2)-F的表達。
實施例11用親和柱純化重組FGF-23(M2)-F純化重組FGF-23(M2)-F是用抗FLAG抗體親和柱(SIGMA)來進行的。此層析法是用GradiFrac系統(Pharmacia)來執行的。用PBS-T平衡親和柱後，上樣含實施例10製備的表達重組FGF-23突變體(M2)-F的培養基，並用甘氨酸鹽酸緩衝液(pH3.5)洗脫。然後分級分離主峰並用SDS-PAGE分析對其進行。因為一條位於所需分子量附近的接近單一的條帶用考馬斯亮藍(CBB)染色被確認，重組體的製備結束(圖5)。
實施例12缺失突變的動物實驗給藥製劑的製備是根據TransIT In VIvo Gene Delivery System(PanVera)的流程。將10μL TransIT溶液及適量無菌水加入10μg圖6所示的不同表達載體中(模擬與實施例7同)，總體積達200μL。混合此溶液並室溫下靜置5分鐘，每200μL添加2.8mL1×Delivery溶液，從而獲得每隻動物的給藥溶液量為3.0mL。當給藥6隻動物時，需製備量達7隻動物即21mL的溶液。給藥溶液僅限當天使用。
自Charles River日本購買的8到9周齡的雌性小鼠CD-1(ICR)(35g到40g)在1周順應期後接受實驗。含有表達載體的總量3mL的給藥製劑通過尾靜脈在8秒內給藥。給藥4天後，醚麻醉下從腹主動脈收集全血。將收集的血置於Separapid tube mini(Sekisui Chemical)並離心(1,400×g，10分鐘，4℃)以分離血清。
血清中無機磷(Pi)，鈣(Ca)，尿素氮(UN)，和肌酸酐(CRE)用自動分析儀(Hitachi 7170E型)來檢測。
結果如圖6所示。
M2FGF23突變體由251個胺基酸構成。當此突變體C末端部分縮短時，含胺基酸至位置200的突變體dC200也具有同樣的降低血清磷的作用。然而，當C末端進一步縮短到dC194(含胺基酸至位置194)時，或dC188(含胺基酸至位置188)時，此作用被削弱或喪失。在此推測，在ADHR病人，胺基酸在位置176或位置179的突變使FGF23不易受蛋白質水解的調節作用，其結果為血中過量的FGF23存在導致低磷酸血症。所以，根據本發明結果，我們認為胺基酸位置179到200包括對於血清磷降低作用至關重要的位點。
實施例13FGF23對甲狀腺-甲狀旁腺切除大鼠的作用一8周齡的雄性大鼠Sprague-Dawley(SD)接受甲狀腺-甲狀旁腺-切除術(TPTX)。幾天後，測定其離子鈣以確認手術是否成功。然後，向大鼠股靜脈中插入導管，連接尿袋，將其限制在Ballman籠中。
用Harvard灌注泵，將PTH(1-34)(0.3nmol/mL)，具有C-FLAG標記的M2FGF23蛋白質(6μg/mL)，或載體(0.05％Tween80/鹽水)以1mL/小時的速度灌注給藥6小時。在開始灌注4小時到6小時內收集尿直至給藥結束。終止給藥後從腹主動脈收集全血。此收集的血液於3,000rpm離心10分鐘。將血清和尿的不可溶級分分離並用Hitachi7170型自動分析儀檢測無機磷、鈣和肌酸酐。結果如圖7到圖9所示。
根據圖7，因TPTX而升高的大鼠血清磷濃度已因給藥PTH(1-34)而正常。而且，通過給藥M2FGF23也同樣獲得正常。另一方面，雖然給藥PTH(1-34)可糾正因TPTX造成的血清鈣濃度下降，但給藥M2FGF23對其幾乎無作用(圖8)。這表明M2FGF23對血清磷水平的作用並非由PTH引起，因此不影響血清鈣水平。既然尿中無機磷/肌酸酐比值會隨PTH(1-34)給藥而升高，因此人們認為血清磷被分泌到尿中。另一方面，無機磷/肌酸酐比值不因給藥M2FGF23而變化。因此，血清磷可能已返回骨形成了羥基磷灰石(圖9)。
工業實用性本發明提供FGF23蛋白質突變體。既然本發明的FGF23突變體具有降低血磷水平的作用，人們期望它們能用作高磷酸鹽血症的治療和預防製劑。而且，編碼本發明FGF23突變體的DNA通過導入體內並在體內表達可降低血磷水平。因此，人們希望這些DNA可應用於抗高磷酸鹽血症的基因治療。
序列表110中外製藥株式會社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISYA)120降低血磷水平的人FGF23蛋白突變體130C1-A0019Y1P140
141
150JP2000-3963161512000-12-26150JP2001-1613701512001-05-2916023170PatentIn Ver.2.02101211756212DNA213人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)..(753)4001atg ttg ggg gcc cgc ctc agg ctc tgg gtc tgt gcc ttg tgc agc gtc 48Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15tgc agc atg agc gtc ctc aga gcc tat ccc aat gcc tcc cca ctg ctc 96Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc cac ctg tac aca gcc aca gcc agg 144Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45aac agc tac cac ctg cag atc cac aag aat ggc cat gtg gat ggc gca 192
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220
223對人工序列的描述人工合成的引物序列40023ggctcgagtc agcggcagcc ttccgggcc 29
權利要求
1.一種DNA，編碼含有胺基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質，此胺基酸序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
2.一種編碼包含蛋白質的至少1到190位胺基酸序列的片段的DNA，該蛋白質含有胺基酸序列SEQ ID NO2，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
3.一種載體，其中插入了根據權利要求1或2的DNA。
4.一種轉化細胞，其包含根據權利要求1或2的DNA或根據權利要求3的載體。
5.一種含有胺基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
6.一種含有蛋白質至少其位置1到190的胺基酸序列的片段，該蛋白質含有胺基酸序列SEQ ID NO2，該序列包含選自如下的突變位置176的精氨酸突變為穀氨醯胺，位置179的精氨酸突變為穀氨醯胺或位置179的精氨酸突變為色氨酸。
7.一種製備根據權利要求5或6的蛋白質的方法，其包括培養根據權利要求4的轉化細胞的步驟和從此轉化細胞或其培養上清收集表達蛋白質的步驟。
8.一種降低血磷水平的藥物組合物，其包含根據權利要求1或2的DNA，根據權利要求3的載體或根據權利要求5或6的蛋白質。
9.權利要求8的藥物組合物，其不影響血鈣水平。
10.權利要求8或9的藥物組合物，用於治療高磷酸鹽血症。
11.一種治療高磷酸鹽血症的方法，包括向患者給藥根據權利要求1或2的DNA的步驟。
全文摘要
分離編碼人FGF23蛋白質的全長cDNA，在此cDNA上有單個胺基酸替代的突變體，其為誘變法所構建。這些突變體於體內表達時，具有降低血磷水平的作用。人們希望這些突變體及其編碼DNA可作為高磷酸鹽血症的藥物治療劑，或其基因治療的藥物治療劑。
文檔編號C12N15/12GK1492927SQ0182283
公開日2004年4月28日 申請日期2001年12月26日 優先權日2000年12月26日
發明者伊藤浩孝, 福島直, 齋藤一史, 草野健一郎, 一郎, 史 申請人:中外製藥株式會社