免疫原性脂質體組合物的製作方法

2023-10-09 19:25:39 2

專利名稱：免疫原性脂質體組合物的製作方法
背景技術：
疫苗的應用歷史上已經提供了一種保護大量人群抵抗多種感染性疾病的安全有效的方法。抗病毒和其它微生物的免疫通常是安全有效的，在發達國家內已經使得人的預期壽命大大增長。但是，可能會出現多種副作用，這取決於疫苗的性質和具體的免疫原。完整病毒的不充分滅活在過去已經導致免疫接種後力圖避免的感染而不是保護(Tigertt，1959，Military Med.124342)。偶爾，用流感病毒等完整有機體免疫接種會促使Guillain Barre症候群等針對正常組織的自身免疫疾病的病情發展(Langmuir et al.，1984，J.Epidemiol.119841)。除了免疫原自身之外，在細胞或複合介質內存在的物質可能會引發對外源蛋白的嚴重過敏反應(Yamane和Uemura，1988，Epidem，Inf.100291)。由於有效的免疫接種方式通常需要多次免疫，這些副作用會降低疫苗的效果，也會降低公眾對這種免疫接種方式的接受程度。近來，人們已經試圖藉助現代分子生物學技術來提供安全性和有效性得到提高的新疫苗組合物。正在研究的可能的策略包括基於重組DNA技術的疫苗(Conry et al.，1994，Cancer Res.541164；Hu et al.，1988，J.Virol.62176)，製備簡單的合成肽作為抗原(Nardelli et al.，1992，Vaccines81405；Watari et al.，1987，J.Exp.Med.165459)，直接注射遺傳物質至組織中引發保護性應答(Ulmer et al.，1993，Science 2591745)。特別是，使用簡單肽抗原引發特異性免疫應答是很多研究的焦點。這一策略的吸引力在於它可能提供免疫特異性，更嚴格地控制生產過程，消除免疫原製備過程中的大多數次要物質或汙染物。
但是，應用純化蛋白或肽片段免疫接種依賴於藉助有效的抗原載體將免疫原運送到免疫部位。最安全的載體之一可能是基於脂類/脂質體的疫苗複合物。脂質體早已是商業上成熟的技術，因為它可以降低藥物毒性，延長在血流中的循環時間，並改變藥物分子的生物分布和藥物動力學(Fujii，1996；Vesicles，ed.M.Rosoff，Marcel Dekker，NewYork NY，p.491)。當體內給藥時，脂質體在血液中循環，通過單核細胞/巨噬細胞吞噬系統清除，特別是肝、脾、淋巴結和肺組織中的吞噬系統(Claasen，1996；Vesicles，ed.M.Rosoff，Marcel Dekker，New YorkNY，p.649)。脂質體導引抗原分布的能力揭示，脂質體免疫原可以最大程度地暴露於免疫系統。迄今，已經試驗了幾種基於脂類的系統，包括輟合於脂類的肽(Nardelli et al.，1992，Vaccines 81405；Watari et al.，1987，J Exp.Med.165459)，脂類存在時全蛋白亞單位的重構(Moreinand Simons，1985，Vaccines 4166；Gregoriadis，1995，Tibtech 13527)，和蛋白與預先形成的脂質體的結合(Therien and Shahum，1989，Immunol.Lett.22253；Alving et al.，1985，Vaccines 4166)。儘管已經證實這些策略是免疫學活性的，大規模生產蛋白及其脂類載體的技術困難，以及費用制約，使得它們作為商用技術的吸引力降低。因此，需要製備蛋白抗原的改進系統或方法，以在疫苗開發中利用脂質體的潛能。
發明概述本發明提供了含有形成小泡的脂類和一種抗原構建體的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體含有一個或多個抗原決定簇和一個疏水區。優選疏水區與脂質體組合物的膜結合。優選疏水區是肽，在一個優選實施方案中，疏水區由約15到約500個胺基酸殘基組成，更優選少於約300個殘基，最優選少於約50個殘基，其中至少一個或更多胺基酸選自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。
根據本發明的一個實施方案，免疫原性脂質體組合物還包括一種或多種佐劑。合適佐劑的實例包括Lipid A等親脂分子和其它脂多糖、QuilA、QS21、MF59、P3CSS、MTP-PE，以及水溶性分子，包括IL-2、IL-4、IL-12、幹擾素等細胞因子。其它細胞因子的實例在後文表1中提供。
根據本發明的另一個實施方案，抗原構建體還包括連接抗原決定簇與疏水區的接頭區。在優選實施方案中，接頭區是肽，由1到約200個胺基酸殘基組成。優選胺基酸殘基是天然存在的胺基酸，如Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和/或Val。
本發明還提供了一種在宿主動物體內引發免疫應答的方法，包括給予免疫有效量的上述脂質體組合物。儘管可以是包括家禽的任何動物，優選宿主動物是哺乳動物，更優選是人。在某些優選實施方案中，免疫原性脂質體組合物還包括一種或多種合適的佐劑。
本發明還提供用於插入一種載體的DNA盒，其包括編碼免疫原性融合蛋白的序列，其中融合蛋白包括疏水蛋白區和一個或多個抗原決定簇。
本發明也提供一種製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達編碼包括一個抗原決定簇和一個疏水區的融合蛋白的基因；在合適的有機溶劑或有機溶劑混合物中溶解脂類和融合蛋白；通過蒸發有機溶劑形成脂膜；使脂膜水化；將水化的脂膜分散形成免疫原性脂質體組合物。
本發明還提供一種製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達編碼包括一個抗原決定簇和一個疏水區的融合蛋白的基因；在含水緩衝液中溶解融合蛋白；用含融合蛋白的緩衝液水化脂顆粒或脂膜；將脂顆粒或脂膜分散形成免疫原性脂質體組合物。
在另一個實施方案中，本發明提供一種製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達編碼包括一個抗原決定簇和一個疏水區的融合蛋白的基因；在含水緩衝液中溶解融合蛋白；將融合蛋白加入預先形成的脂質體中以形成免疫原性脂質體組合物。
在另一個實施方案中，本發明提供一種製備免疫原性脂乳劑組合物的方法，包括表達編碼包括一個抗原決定簇和一個疏水區的融合蛋白的基因；使用脂分散體(如大豆油等油的分散體)代替脂質體，通過上述任一種方法製備免疫原性脂乳劑組合物。
在再一個實施方案中，本發明提供一種製備免疫原性脂質體或脂乳劑組合物的方法，包括化學合成包括一個抗原決定簇和一個疏水區的融合蛋白；通過上述任一種方法製備免疫原性脂質體或脂乳劑組合物。
在本文中，「與膜結合」是指疏水區至少部分包埋在脂質體膜內，優選與小泡形成脂類非共價相連。疏水區也可以與本身包埋在膜內的一種脂的脂肪酸「尾」鍵合。
附圖簡述

圖1顯示本發明的一種脂質體組合物在抵抗HSV2的保護作用中的效果。
圖2顯示本發明的脂質體組合物與其它疫苗組合物的效果比較。
圖3顯示小鼠存活曲線，證實脂質體HSV2g(1-23)-HD引發保護性免疫應答的能力。
發明詳述本發明提供旨在提高抗多種微生物和癌症的免疫接種的效果和安全性的抗原運送系統。免疫原的編碼基因盒由與特異性抗原序列融合的疏水區(HD)組成。含有編碼HD的核酸序列和抗原表位的質粒在合適宿主中製備和表達，合適宿主如大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母、昆蟲細胞、COS-1細胞或CHO細胞(Genetic Engineering News，1817(1998))。蛋白表達和純化之後配製在脂質體中。在膜存在時，蛋白與脂雙層結合，形成穩定結構，疏水區與膜結合，抗原表位朝向含水介質。質粒可以在關鍵位置用限制位點改造，使得不同的抗原表位可以方便地被取代，從而提供利用不同抗原表位的能力，以便在免疫接種後提供最大保護。這種盒的一個獨特特徵是蛋白成分可以在宿主細胞中大量製備，方便地純化，然後結合於脂質體中。這為確定改善抗微生物或癌症的保護作用的最合適表位提供了最大程度的靈活性，同時兼顧了大量生產和商業銷售疫苗的最終目標。
因此，本發明的優勢在於(1)表位可以方便地改變以給疫苗設計提供最大程度的靈活性；(2)多個表位可以插入載體分子中；(3)必要時可以包括大抗原序列(即膜蛋白或受體區)或亞單位；以及(4)表達的載體蛋白是水溶性的，易於使用標準蛋白製備方法純化。抗原構建體作為水溶性融合產物合成最大程度減少了大規模生產時由蛋白疏水區引起的問題。因此，具有供脂質體膜插入的疏水區同時又是水溶性的蛋白的構建是主要的優勢。在某些情況下，可以在純化過程中使用少量增溶劑，如胍、脲、十二烷基硫酸鈉、辛基葡糖苷或脫氧膽酸鹽。本發明也提供含兩個或更多抗原的構建體。這些構建體可以表示如下H2N-抗原位點I-HD-抗原位點II-COOH本發明也設想到使用天然衍生或合成的單個跨膜螺旋或螺旋束(2-12)。抗原位點可以位於N或C末端，或位於螺旋束的單股之間形成的環之間。
「抗原」在本文中是指以下的任何物質(包括蛋白或蛋白-多糖、脂多糖、微生物亞單位、全病原體或癌症標誌)，它對宿主動物是外源的，進入這種動物的組織即刺激巨噬細胞、抗原呈遞細胞和抗原特異性抗體的形成，並在體內或體外與這種抗體特異性反應。而且，抗原刺激具有該抗原和交叉反應抗原受體的T-淋巴細胞(如自然殺傷(NK)細胞、細胞毒T細胞和T輔助細胞)的增殖和/或活化，並能與淋巴細胞反應，引發稱為細胞介導免疫的系列免疫應答。在本發明的免疫原性組合物中，優選存在的抗原量為約0.1到20毫克/毫升抗原-HD。更優選存在的抗原量為約0.5到5毫克/毫升抗原-HD。
「抗原決定簇」是抗原或抗原構建體的一部分，它決定抗原的免疫特異性。通常，在天然存在的抗原中抗原決定簇或半抗原是肽、蛋白或多糖。在人工抗原中，也可以是低分子量物質，如對氨苯基砷酸衍生物。抗原決定簇在體內或體外與抗原決定簇的抗原形式(如抗原決定簇輟合於免疫原性物質)誘導的抗體或T淋巴細胞特異性反應。
抗原決定簇可以用來實施本發明，它可以來源於例如以下抗原病毒抗原病毒 抗原 Reference藍舌病毒 結構 Murray and Eaton，1996，Austral.Vet.J.73207牛皰疹病毒(IBR) Franz et al.，1996，Veterini Medicina 41213牛病毒性腹瀉病毒 E2 Bruschke et al.，1997，Vaccine 151940Ludeman and Katz，1994，Biologicals 2221巨細胞病毒 gp58 Wagner et al.，1992，J.Virol.665290GB Wang et al.，1996，J.Inf.Dis.174387多表位 AgThomson et al.，1996，J.Immunol.157822PrM Fonseca et al.，1994，Vaccine 12279EFonseca et al.，1994，Vaccine 12279E/NS1Venugopal and Gould，1994，Vaccine 12967NS1/NS2 Green et al.，1997，Virol.234383被膜BSimmons et al.，1998，Am.J.Trop.Med.Hyg.586554型衣殼 Gagnon et al.，1996，J.Virol.70141犬瘟病毒 F/H Pardo et al.，1997，Am.J.Vet.Res.58833伊波拉病毒 GP/NPVanderzanden et al.，1998，Virol.246134EB病毒 EBNA 1，2，3，4，6 Moss et al.，1992，Sem.Immunol.497口蹄疫病毒 VP1 Filgueria et al.，1995，Vaccine 13953A肝病毒 A/B結合AgBruguera et al.，1996，Vaccine 141407B肝病毒 HbsAgThanavala et al.，1995，PNAS 923358Skelly et al.，1981，Nature 29051C肝病毒 E2/NS1 Weiner et al.，1992，PNAS 893468Taniguchi et al.，1993，Virol.195297NS3 Khudyakov et al.，1995，Virol.206666NS4 Khudyakov et al.，1995，Virol.206666NS5 Khudyakov et al.，1995，Virol.206666
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可以使用的其它抗原和病原體的實例參見Milich，1989(Adv.Immunol.45195)，Hishino和Kaplan，1994(Curr.Top.Microbiol.Immunol.185179)或Venugopal和Gould，1994(Vaccine 12966)。根據一個實施方案，使用人類免疫缺損病毒(HIV)的env基因的gp120亞單位和gag基因的p27。在另一個實施方案中，抗原決定簇可以來源於以下抗原HSV gD或gB，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA，流感嗜血桿菌P5或P6，菌毛蛋白和蛋白D。
在本文中，「疏水區」(HD)是指任何具有表面積大於5002的疏水區域或結構的蛋白、肽、脂或分子。可能的HD的實例包括任何跨膜(TM)區段(如血型糖蛋白A；Tomita和Marchesi，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 722964)、細胞色素b5的疏水區(Taylor和Roseman，1995，BBAQ 127835)、白喉毒素T區(choe et al.，1992，Nature357216)、假單胞菌外毒素A的II區(Allured et al.，1997，Mol.Microbiol.23935)、青黴素感覺傳導蛋白的4螺旋束(Hardt et al.，1997，Mol.Microbiol.23935)、細菌視紫紅質的7螺旋束(enderson和Unwin，1975，Nature 25728)、lac通透酶的12螺旋束(Kabaek et al.，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7537)和大腸菌素的孔形成區(Parker et al.，1989，Nature 35793)。
「載體」在本文中是指一種來自質粒、粘粒、噬菌粒或噬菌體或合成的核酸，其中插入或克隆了核酸片段。為此目的，載體可以含有一個或多個單一限制位點，可以在限定的宿主或有機體中自主複製，使得克隆的序列被複製。載體分子可以賦予宿主有機體確定的表型，它們是可以選擇的或容易檢測的。載體的某些成分可以是含有負責轉錄、翻譯、RNA穩定性和複製的調控元件或其它DNA序列。
「DNA盒」在本文中是指載體中的遺傳序列，它可以表達本文所述的融合蛋白。核酸盒在載體內依次排列，使得盒內的核酸可以被轉錄成RNA，必要時翻譯成融合蛋白產物。優選，該盒具有適於方便地插入載體的3′和5′末端，例如它在每一末端具有限制性內切酶。
儘管抗原構建體優選使用重組技術製備，但應當理解，該構建體可以通過本領域已知的任何方式合成，例如化學方式。當使用非肽接頭或疏水區包括非天然存在的胺基酸殘基或模擬物時，這一點特別有用。因此，儘管優選實施方案利用重組方法製備抗原融合蛋白，本發明也提供了一種方法，包括通過化學合成方式或組合重組和化學方式製備抗原構建體，如上製備免疫原性脂製劑。
除了優選的肽接頭，其它本領域已知的接頭也可以用來將抗原連接至疏水區。這種接頭的實例包括但不限於聚乙二醇、多糖、聚唾液酸、琥珀酸、丁二酸、己二酸，和標準交聯化學實體，例如SMPT(4-琥珀醯亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-砒啶二硫代)-甲苯)、DSP(二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸))、EGS(乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸))、SMCC(4-琥珀醯亞胺基氧羰基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸)和SPDP(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-砒啶二硫代)-丙酸)(也可參見，Pierce目錄，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.)根據本發明，脂質體在抗原運送中起著關鍵性的作用，因為抗原-脂質體複合物直接呈遞給免疫系統，然後由免疫系統細胞清除出循環。此外，免疫刺激途徑的選擇也可通過改變脂質體的脂類組分而改變。例如，不同的免疫刺激分子如Lipid A(Asano and Kleinerman，1993，J.Immunother.14286)、P3CSS(Lex et al.，1986，J.Immunol.1372676)、胞壁醯二肽或三肽-PE(Fidler et al.，1992，PNAS 781680；Alving et al.，1984，Vaccines 4166)和陽離子脂(Walker et al.，1992，PNAS 897915)可以被配製到脂質體中，以刺激不同的免疫途徑。MF59、Quil A、QS21或礬等其它佐劑可以與抗原-脂質體複合物聯合使用。此外，可以加入細胞因子等免疫調節分子引發免疫應答。
用來實施本發明的脂質體可以由多種形成小泡的脂類製備，所述脂類包括磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯絲氨酸(PS)、磷脂醯乙醇(PG)和磷脂醯膽鹼等磷脂醯醚和酯；二油醯基甘油琥珀酸等甘油酯；腦苷脂、神經節苷脂、鞘磷脂；膽固醇等類固醇；其它脂類，以及其它賦形劑如維生素E或維生素C棕櫚酸(也可參見美國專利4235871；4762720；4737323；4789633；4861597和4873089)。基於PC的脂類的實例包括但不限於(C-18)二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)；(C-16)二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)；(C-14)二豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)和(C-18，未飽和)二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)。優選脂類在體溫(約38到39℃)時是流體相。因此，Tm高於體溫的脂類如DSPC和DPPC不是優選的(但仍可使用)。Tm低於體溫的脂類如DMPC或DOPC更優選。此外，優選脂類製劑含有不超過約10％的膽固醇，約0-15％PG和約0-100％PC。在某些優選實施方案中，該組合物還可以含有約1-10％佐劑；優選，佐劑的量不超過約5％。
脂質體製劑在現有技術中是眾所周知的。一般，脂質體通過多種不同的技術製備，所述技術包括乙醇注射(Batzri et al.，1973，Biochem.Biophys.Acta.2981015)；醚注射(Deamer et al.，1976，Biochem.Biophys.Acta.443629；Schieren et al.，1978，Biochem.Biophys.Acta.542137)；表面活性劑去除(Razin，1972，Biochem.Biophys.Acta.265241)；溶劑蒸發(Matsumato et al.，1977，J.Colloid Interface Sci.62149)；由氯仿的水乳劑中蒸發除去有機溶劑(REV)(Szoka Jr.etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，754194)；通過核心聚碳酸酯膜擠出MLV或EUV(Olsen et al.，1979，Biochem.Biophys.Acta.5579)；磷脂混合物的凍融(Pick，1981，Archives of Biochem and Biophysics，212186)以及超聲處理和勻漿。
習慣上，脂質體按照大小分類，三字母縮寫用來表示討論的脂質體類型。多層小泡通常稱為「MLV」，小的單層小泡被稱為「SUV」，大單層小泡稱為「LUV」。這些名稱有時在脂質體組合物中使用。關於命名和已知脂質體類型的討論，可參見Storm et al.，1998，PSIT，119-31。
本發明考慮到使用具有適當佐劑的脂質體組合物。但是，本發明也考慮到使用不與脂質體聯合而與合適的佐劑組合的抗原構建體。因此，疫苗或免疫原性組合物包括兩種成分連接於疏水區的抗原；和適當的佐劑系統。可以使用的可能的可藥用載體系統實例包括但不限於脂質體、乳劑、福氏(完全或不完全)佐劑、礬、ISCOMS和被膜病毒。
本發明的方法將使用免疫有效量的脂質體組合物，即該用量的組合物與任何加入的賦形劑或載體聯合可以在宿主中產生可檢測的免疫應答。在該組合物用作疫苗組合物時，有效量是指與任何加入的賦形劑或佐劑聯合時會使宿主產生足夠的特異免疫應答，從而在隨後宿主接觸微生物(預防性免疫接種)時保護宿主，或保護患病宿主(治療性免疫接種)。
以上已經一般性介紹了本發明，參照以下實施例將更好地理解本發明，若非特別註明，提供這些實施例僅僅為了說明本發明，而不是要限定本發明。
實施例實施例I-HSV2HSV2gD(1-23)-TM的製備。HSV2被膜蛋白gD的N末端23個胺基酸區段在自動肽合成儀上通過化學合成偶聯於跨膜(TM)區段。合成的肽通過標準HF切割法切割，使用Waters C18柱和含有0.1％TFA的100％乙腈通過製備性HPLC純化。通過質譜和毛細管電泳證實肽的純度至少為95％。
脂質體製備。脂質體按照已知方法(Fujii et al.，1997，Biochemistry364959)通過探頭超聲處理製備。簡而言之，脂類(有或沒有蛋白)溶解在氯仿/甲醇等有機溶劑中。薄的脂膜通過以下方法形成移取等分量的脂溶液進入寬底玻璃試管，65℃在氮氣流下蒸發溶劑。膜置於真空下至少8小時除去殘留有機溶劑。用緩衝液水化脂膜，在65℃溫育懸液5-10分鐘，再用探頭超聲處理，從而完成脂質體製備。脂質體然後通過0.22m的濾器使製備物除菌。脂質體通過動態光散射篩分，然後是至少4周的聚集體形成。
特別優選的脂質體HSV2gD(1-23)-TM製劑的摩爾比是15∶2∶3DMPG∶Chol∶DMPG(二豆蔻醯磷脂醯膽鹼∶膽固醇∶二豆蔻醯磷脂醯甘油)，Lipid A的重量為2.5％。
免疫接種程序和對病毒抗原免疫應答誘導的測定。BALB/c或C57BL/6雌性小鼠(6-8周齡)用試驗疫苗製備物或緩衝液皮下注射，每周一次，共2、3或4周。監測注射部位的副反應，如形成肉芽腫和/或結痂。當動物用疫苗通過鼻內途徑免疫接種時，用氟烷麻醉之，使用微量移液器的無菌吸頭將組合物(10-20l)加到鼻孔內使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168622)。
在免疫接種過程中和病毒攻擊後，定期測定小鼠對病毒抗原的免疫應答。病毒中和抗體試驗使用含1×105BHK細胞的24孔板進行，細胞中加有與病毒混合的不同稀釋度小鼠血清。37℃下在二氧化碳培養箱中溫育48-72小時後，觀察細胞單層的細胞毒性，測定中和抗體的滴度。沉澱病毒的抗體通過用5-10g病毒抗原或25-50l HSV2原種(1×105PFU)溫育不同稀釋度的血清來測定。含有抗原表位的脂質體也可用作已知的抗體/ELISA試驗(Tuso et al.，1993，Transplantation551375)的靶。後一試驗的結果將用來測定結合水平和抗體的同種型構造。
在免疫小鼠中對病毒抗原的遲髮型超敏反應使用爪墊試驗測定。免疫接種動物用氟烷麻醉，在一隻後爪墊注射50l紫外滅活的HSV2，在另一隻後爪墊注射50l裂解的未感染細胞。24、48和72小時後，小鼠爪墊腫脹程度使用Vernier卡尺測定，並與基線水平比較。這些動物的T細胞活性也通過在用病毒抗原溫育脾T細胞時的細胞因子產生來測定。從免疫接種動物取出脾，用無菌活塞溫和地打碎脾並擠壓細胞通過尼龍篩網來製備脾勻漿。洗滌細胞懸液，在96孔微量板上以1×106細胞/孔鋪板。細胞在37℃用不等量的病毒抗原溫育3到4天後，收穫各孔上清，測定細胞因子的存在。商用細胞因子ELISA試劑盒用來確定細胞因子譜(來自PharMingen，Inc.San Diego，CA的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12，IFN-□、□-肌動蛋白和TNF-α)。組織培養物上清中的細胞因子蛋白通過夾心ELISA測定，使用特定細胞因子特異性的單克隆抗體(mAb)。簡而言之，ELISA板用大鼠抗小鼠細胞因子單克隆抗體包被過夜。用PBS中的3％胎牛血清封閉培養板2小時，然後等分量的每一測試樣品加入每一孔中。向每一孔中加入細胞因子特異性的生物素化大鼠抗小鼠單克隆抗體，然後是抗生物素蛋白過氧化物酶。通過加入比色底物得到有色反應。在ELISA分光光度計上讀取培養板，根據對照重組細胞因子獲得的標準曲線計算細胞因子濃度。
測定脂質體疫苗製備物的HSV2小鼠腦炎模型。免疫接種或未接種(對照)BALB/c雌性小鼠(10-12周齡)用致死劑量(1×105PFU)大腦傳代的HSV2腹膜內攻擊。用致死劑量HSV2陰道內攻擊的小鼠攻擊前一周和攻擊前-1天首先用雌激素皮下預處理。然後用腹膜內注射乙醯丙嗪和氯胺酮麻醉。然後用幹Calgiswab搽拭陰道，再使用微量移液器的無菌吸頭陰道內給予HSV2(10-30l)(McDermott et al.，1984，J.Virol.51747)。攻擊後監測動物80天，監測存活(每日)、體重損失(頭兩周每兩天一次，然後每周一次)、皮毛外觀和神經學症狀(活動水平下降、四肢行動遲緩或麻木)。
抗原誘導的T細胞增殖。宿主對gD抗原的致敏通過抗原誘導的T細胞增殖試驗測定。用無菌活塞溫和地打碎脾並擠壓細胞通過尼龍篩網來製備脾勻漿。細胞懸浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mM Hepes緩衝液、L-穀氨醯胺(2mM)、青黴素(25IU/ml)、和鏈黴素(25g/ml)的RPMI 1640培養基中。在96孔U形底培養板中，5％二氧化碳下，細胞在存在或不存在gD(5-20g/ml)時於1×106細胞/ml濃度培養。培養物用20μl刃天青染料脈衝處理3小時，然後在Cytofluor II(Perspective Biosystems，Inc.，Farmington，MA)上測定螢光。
細胞因子特異性mRNA分析。測定免疫和未免疫動物的T細胞的主要細胞因子的細胞因子特異性mRNA水平，該水平可能反映了與免疫相關的致敏，包括IL-2、IFN-□、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。由脾獲得T細胞如前所述。總RNA使用Chomczynsky和Sacchi(Chomczynsky et al.，1987，Analyt.Biochem，162156)所述的方法的改進方法(Cosenza et al.，1994，Liver Transpl.Surg.116)分離。新鮮或冰凍細胞(2×106)在1毫升變性液(4mM異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉(pH7.0)、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1mM 2-巰基乙醇)中裂解。用1倍體積的異丙醇在-20℃溫育沉澱RNA。總RNA的濃度調整為260nM，樣品儲存在-80℃待用。
細胞因子分析使用Cosenza et al.(Cosenza et al，1994，LiverTranspl.Surg.116)等所述方法的改進法進行。單鏈cDNA通過在20l總反應體積中使用禽成髓細胞血症病毒逆轉錄酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)轉錄2g總RNA來製備。鼠細胞因子序列特異性寡核苷酸引物(表1)用來擴增每一目標細胞因子基因預定大小的DNA片段。
表1 小鼠細胞因子半定量分析使用的寡核苷酸引物寡核苷酸核酸序列 預期目標大小
PCR混合物由1l cDNA，2.5l PCR 10×緩衝液，1l 5′和3′引物，2.5l 10×dNTPs(2mmol/L)和0.125l水生棲熱菌熱穩定性DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)組成，總體積為25l。特異性□-肌動蛋白引物用來擴增548bp片段作為內部對照。PCR混合物用礦物油覆蓋，94℃溫育混合物7分鐘後，擴增38個循環，條件為94℃變性30秒，60℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，再72℃溫育7分鐘。在溴化乙錠存在下在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物。UV光下顯示條帶，照相，使用Molecular Analyst軟體包(Bio-Rad，Richmond CA)由相片進行光密度定量。
通過ELISA進行的細胞因子測定。商用細胞因子ELISA試劑盒被用於確定由免疫和未免疫動物分離的脾CD4+T細胞分泌的細胞因子譜。脾T細胞組織培養物上清中細胞因子蛋白的夾心ELISA測定使用特定細胞因子特異性單克隆抗體進行。簡而言之，ELISA培養板用大鼠抗小鼠細胞因子單克隆抗體包被過夜。培養板用PBS中的3％FCS封閉2小時，然後向每孔中加入等分量的每一樣品。再向每孔加入細胞因子特異性生物素化大鼠抗小鼠單克隆抗體，隨後加入抗生物素蛋白過氧化物酶。通過加入比色底物得到有色反應。在ELISA分光光度計上讀取培養板，根據對照重組細胞因子獲得的標準曲線計算細胞因子濃度。
抗HSV2 CTL應答。免疫接種後，評估脾T細胞中的抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)的存在。如前所述獲得脾淋巴細胞。來自各處理組的淋巴細胞合併(n＝5)，然後在12孔培養板中以107細胞/孔在抗原不存在時培養3天。EL-4(H2+)靶細胞(ATTC)與相應於H2+限制細胞的殘基495到505之間的HSV2 gB CTL表位的肽溫育(Hanke et al.，1991，J.Virol.651177)，37℃下溫育4小時。洗滌靶標，向各孔中加入含1×104細胞的100μl滴定液。洗滌效應淋巴細胞，以不同濃度加入各孔中，37℃溫育4小時。使用Cyto Tox 96試劑盒(Promega，Madison WI)，用標準ELISA培養板讀數儀(HTS 7000+BioAssay Reader，Perkin Elmer，San Jose，CA)通過記錄490納米吸收測定上清乳酸脫氫酶，由此計算特異性裂解百分比。根據常規標準確定HSV2抗原特異性裂解。數據表示為特異性裂解百分比＝100×[(試驗值-效應細胞自發值-靶標自發值)/(靶標最大值-靶標自發值)]。
結果圖1所示存活曲線證實脂質體-肽保護小鼠抵抗致死劑量HSV2的系統攻擊的效果，並確定獲得100％保護所需的接種數。圖1顯示保護BALB/c小鼠抵抗HSV2的致死攻擊所需的脂質體HSV2gD(1-23)-TM疫苗劑數。7隻小鼠組在致死劑量HSV2攻擊之前給予2、3或4次免疫接種。4次免疫接種時，用脂質體疫苗免疫接種的動物沒有顯示與HSV2感染相關的神經學症狀，在研究中也未觀察到任何其它感染跡象。最重要的是，所有小鼠均在HSV2致死攻擊後存活。2或3次每周接種，不到100％的小鼠得到保護。相形之下，4次接種安慰劑(即緩衝液)的小鼠不能在HSV2攻擊時得到保護。
脂質體HSV2gD(1-23)-TM也在3組C57BL/6小鼠中試驗，發現其引發與BALB/c小鼠中獲得的結果相當的類似保護效應。表2總結了這些結果。第1組小鼠在1和4周皮下接種；第2組在第1周皮下接種，第4周直腸內接種；第3組(對照組)不接種。最後一次接種(第4周)後一周，小鼠用致死劑量的HSV2腹膜內攻擊，監測發病率和死亡率3周。同BALB/c小鼠的結果一樣，接受脂質體HSV2gD(1-23)-TM免疫接種組小鼠在皮下注射免疫接種或皮下初次免疫然後黏膜途徑加強免疫時，也有相當數量存活。
表2 用脂質體HSV2gD(1-23)-TM進行各種免疫接種處理的C57BL/6小鼠存活比較結果總結組別免疫接種處理存活(n＝7)1 第1周-皮下 6/7(86％)第4周-皮下2 第1周-皮下 5/7(71％)第4周-直腸內3 對照(未接種)1/7(14％)表2顯示脂質體HSV2gD(1-23)-TM與其它抗原呈遞方法的比較。每組7隻小鼠在致死劑量HSV2攻擊之前給予4次免疫接種。同樣，用脂質體HSV2gD(1-23)-TM疫苗免疫接種4次100％保護小鼠抵抗致死劑量的HSV2。非脂質體HSV2gD(1-23)-TM或無HSV2gD(1-23)-TM的脂質體免疫接種4次不能提供明顯的對致死HSV2攻擊的保護。這清楚地證實，脂質體和工程改造的蛋白成分必需彼此聯合才能獲得有效的免疫應答。特別有意義的是，發現脂質體HSV2gD(1-23)-TM疫苗提供了較熱滅活病毒免疫接種更好的保護，因為基於病毒的疫苗通常被認為提供了免疫應答的良好刺激(Desrosiers，1992，AIDS Res.Hum.Retrovir.81457)。
研究結束時，小鼠被處死，收集血清以鑑定此時免疫應答的性質。免疫接種小鼠的血清被發現含有高滴度(1∶100)特異性識別用來刺激免疫應答的肽的抗體，並且這些抗體引起活病毒的沉澱，表明該抗體識別病毒表面的表位。該抗體也沉澱HSV2gD(1-23)-TM脂質體，但不沉澱沒有肽的脂質體，表明其特異性識別HSV2的gD表位。
下表3提供的免疫實驗結果總結證實，每周一次皮下給予脂質體HSV2gD(1-23)-TM達4周產生較標準佐劑更強的免疫應答。用與不完全弗氏佐劑或礬混合的抗原免疫接種不能保護小鼠抵抗病毒攻擊。中和抗體實驗和遲髮型超敏反應獲得的數據類似於脂質體HSV2gD(1-23)-TM組中觀察到的最高抗體滴度(B細胞應答)和最大爪墊腫脹(T細胞應答)的存活數據。與給予不完全弗氏佐劑和抗原的小鼠中的結果不同，脂質體HSV2gD(1-23)-TM處理的另一個重要優點是，在任何小鼠的注射部位都沒有刺激或炎症(注射部位紅腫，不完全弗氏佐劑17/17，脂質體HSV2gD(1-23)-TM 0/17)。當使用礬時，17/17小鼠在注射部位形成可觸知的肉芽腫。相形之下，脂質體HSV2gD(1-23)-TM在任何小鼠中未引起肉芽腫形成。總之，這些結果顯示，B和/或T細胞應答(通過中和抗體滴度和爪墊腫脹程度判斷)有助於小鼠中HSV2脂質體HSV2gD(1-23)-TM引發的抵抗致死劑量HSV2的保護性免疫應答。
表3 比較接受脂質體HSV2gD(1-23)-TM、不完全弗氏佐劑與HSV2gD(1-23)-TM混合物、礬與HSV2gD(1-23)-TM混合物和僅注射PBS的對照組的免疫應答結果總結疫苗處理 組內存活小 攻擊日中和抗 相對對照小鼠的爪鼠數體滴度 墊腫脹百分比脂質體HSV2gD(1-23)-TM5/7 1∶16388％HSV2gD(1-23)-TM抗原與0/7 1∶717 3％不完全弗氏佐劑的混合物礬與HSV2gD(1-23)-TM的0/7 1∶10245％混合物磷酸緩衝鹽水 0/7 1∶486 0％實施例II-HSV2HSV2gD(1-23)-HD的製備。編碼HSV2gD(1-23)-HD的基因構建體使用編碼連接於45個胺基酸的疏水區(HD)的gD表位的重疊寡核苷酸來製備。構建體通過基因編碼區的依次延伸和擴增構建。基因然後連接於pTrcHis表達載體，通過序列分析確證。用1mM IPTG誘導起始小規模表達研究，使用以脂質體HSV2gD(1-23)-TM免疫接種的小鼠產生的抗體通過蛋白質印跡確證。蛋白也通過SDS-PAGE分析，通過考馬斯蘭染色發現了相應於預期分子量(約6kD)的條帶。證實預期蛋白的小規模表達之後，進行含有pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD構建體的大腸桿菌的10升分批發酵，獲得了約60克細胞沉澱。誘導後，HSV2gD(1-23)-HD的表達通過發酵時間過程的蛋白質印跡確證。來自約30克細胞沉澱的細菌在含1％脫氧膽酸和5mM咪唑的緩衝液中通過弗氏破碎器裂解。離心沉澱細胞碎片後，發現在水溶性上清中主要是HSV2gD(1-23)-HD。
將含可溶性HSV2gD(1-23)-HD蛋白的上清通過荷鎳螯合Sepharose柱完成純化。用含有5mM咪唑、200mM咪唑和5mM咪唑與1％脫氧膽酸的溶液依次洗柱。最後用200mM咪唑、1％脫氧膽酸溶液洗脫HSV2gD(1-23)-HD蛋白。峰值級分通過考馬斯蘭染色的SDS-PAGE和蛋白質印跡鑑定。含有HSV2gD(1-23)-HD的所有峰值級分合併，使用Millipore Ultraprep濃縮器濃縮。通過在考馬斯染色SDS-PAGE凝膠上存在單一條帶判斷，最終濃縮物中含有純HSV2gD(1-23)-HD。從第一次電泳中，獲得了2-3毫克HSV2gD(1-23)-HD用於脂質體製劑配製和免疫接種研究。
脂質體製備和免疫接種程序、免疫應答誘導試驗、HSV2小鼠腦炎模型、抗原誘導的T細胞增殖、細胞因子特異性mRNA分析、ELISA細胞因子測定和抗KSV2 CTL應答基本上如實施例I所述。
結果。圖3顯示的存活曲線證實了HSV2gD(1-23)-HD引發保護性免疫應答的能力。觀察到的該製劑的存活百分比為40％。相形之下，緩衝液處理的對照動物無存活者，而HSV2gD(1-23)-TM對照組100％存活。
實施例III-HIV在COS-1細胞中製備HIV(gp120-HD)和HIV(Δgp120-HD)。為進行構象表位研究，由含有gp160基因的pHXB2-env質粒(NIH AIDSResearch and Reagent Program，Rockville，MD)獲得gp120序列，方法如下通過PCR擴增該質粒DNA，亞克隆1536bp產物用於雙脫氧核苷酸法測序。使用相當於HIVgp120基因的前21bp的5′(有義)引物ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT和相當於核苷酸1515到1536的3′(反義)引物TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC，消除HIV gp41蛋白，克隆gp120區段並通過PCR擴增。此外，每種引物的旁側是方便的限制酶位點，以配合pcDNA4-His表達載體的多克隆位點。PCR產物連接到含有HD區作為基因盒質粒的pcDNA4-His(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)。缺失突變體通過PCR擴增製備，使用兩個5′和3′引物對，它們排除了編碼gp120蛋白中殘基的核苷酸；突變體包括Δ136-151gp120、Δ128-194gp120和Δ123-203gp120。引物含有方便的限制酶序列允許兩個基因產物的連接。因此每一突變由特異目標限制位點的兩個胺基酸置換。最終的基因通過DNA測序證實，使用AutoCycle試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和試劑，結果在ALFExpress試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)測序裝置上電泳，用AM軟體v.3.02kit(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)分析。質粒使用DEAE-葡聚糖試劑轉染進COS-1細胞(ATCC，Rockville，MD)。穩定的轉染子使用Zeocin(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)選擇，通過有限稀釋法克隆。Gp120-HD蛋白通過結合至固體載體上的鎳選擇性親和純化。產生高水平蛋白的克隆通過蛋白質印跡分析或FACS分析評估。純化完成後，HIV(gp120)-HD、HIVΔ136-151gp120、HIVΔ128-194gp120和HIVΔ123-203gp120的組氨酸接頭通過腸激酶切割除去。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換或疏水相互作用色譜以進一步純化HIVgp120-HD和HIVΔ120-HD蛋白。
HIV-HD的製備。合併3個表位(CTL、T輔助細胞和B細胞)的核苷酸序列選自不同HIV蛋白中發現的序列(KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFTTK(SEQID NO.19)，根據大腸桿菌密碼子偏嗜由該蛋白序列衍生(Looman etal.，1987，EMBO J.62489)。合成的編碼HIV序列的基因通過合成、雜交、PCR和重疊寡核苷酸的連接來組裝。組裝的編碼HIV片段的全長基因通過PCR擴增，然後連接至表達質粒。最終基因通過DNA測序證實。
含HIV-HD的pTrcHis質粒轉化進大腸桿菌。細菌在含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB培養基中37℃溫育直至中對數期。此時，IPTG被加入以誘導trp/lac雜合啟動子。每小時檢查以確定HIV-HD蛋白誘導後的最佳表達。最佳表達時，細胞通過離心收穫。細胞沉澱裂解並離心。分析裂解物中的蛋白。HIV-HD蛋白通過結合至固體載體上的鎳選擇性親和純化。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換或疏水相互作用色譜以進一步純化HIV-HD。
脂質體製備。脂質體按照已知方法(Fujii et al.，1997，Biochemistry364959)通過探頭超聲處理製備。簡而言之，脂類(有或沒有蛋白)溶解在氯仿/甲醇等有機溶劑中。薄的脂膜通過以下方法形成移取等分量的脂溶液進入寬底玻璃試管，65℃在氮氣流下蒸發溶劑。膜置於真空下至少8小時除去殘留有機溶劑。用緩衝液水化脂膜，在65℃溫育懸液5-10分鐘，再用探頭超聲處理，從而完成脂質體製備。脂質體然後通過0.22m的濾器使製備物除菌。脂質體通過動態光散射篩分，然後是至少4周的聚集體形成。
免疫接種程序和對病毒抗原免疫應答誘導的測定。第1、4和8周，BALB/c雌性小鼠(6-8周齡)用試驗疫苗製備物或緩衝液皮下注射。監測注射部位的副反應，如形成肉芽腫和/或結痂。當動物用疫苗通過鼻內途徑免疫接種時，用氟烷麻醉之，使用微量移液器的無菌吸頭將組合物(10-20l)加到鼻孔內使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168622)。
通過ELISA測定抗體應答。在免疫接種過程中，定期(如每周一次)測定小鼠對病毒抗原的免疫應答。含有抗原表位的脂質體也可用作已知的抗體/ELISA試驗(Tuso et al.，1993，Transplantation 551375)的靶。後一試驗的結果將用來測定結合水平和抗體的同種型構造。
遲髮型超敏反應(DTH)試驗。在免疫小鼠中對病毒抗原的遲髮型超敏反應使用爪墊試驗測定。免疫接種動物用氟烷麻醉，在一隻後爪墊注射50l脂質體抗原或游離抗原，在另一隻後爪墊注射50l緩衝液。24、48和72小時後，小鼠爪墊腫脹程度使用Vernier卡尺測定，並與基線水平比較。
細胞因子特異性mRNA分析。測定免疫和未免疫動物T細胞的主要細胞因子的細胞因子特異性mRNA水平，該水平可能反映了與免疫相關的致敏，包括IL-2、IFN-□、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。免疫後1和4周時如前所述由脾獲得T細胞。總RNA使用Chomczynskyet al.，1987，Analyt.Biochem，162156所述方法的改進方法(Cosenza etal.，1994，Liver Transpl.Surg.116)分離。新鮮或冰凍細胞(2×106)在1毫升變性液(4mM異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉(pH7.0)、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.1mM 2-巰基乙醇)中裂解。用1倍體積的異丙醇在-20℃溫育沉澱RNA。總RNA的濃度調整為260nM，樣品儲存在-80℃待用。
細胞因子分析使用Chomczynsky et al.，1987，Analyt.Biochem，162156所述方法的改進方法(Cosenza et al.，1994，Liver Transpl.Surg.116)進行。單鏈cDNA通過在20l總反應體積中使用禽成髓細胞血症病毒逆轉錄酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)轉錄2g總RNA來製備。鼠細胞因子序列特異性寡核苷酸引物(表1)用來擴增每一目標細胞因子基因預定大小的DNA片段。PCR混合物由1l cDNA，2.5lPCR 10×緩衝液，1l 5′和3′引物，2.5l 10×dNTPs(2mmol/L)和0.125l水生棲熱菌熱穩定性DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)組成，總體積為25l。特異性□-肌動蛋白引物用來擴增548bp片段作為內部對照。PCR混合物用礦物油覆蓋，94℃溫育混合物7分鐘後，擴增38個循環，條件為94℃變性30秒，60℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，再72℃溫育7分鐘。在溴化乙錠存在下在瓊脂糖凝膠上分離PCR產物。UV光下顯示條帶，照相，使用Molecular Analyst軟體包(Bio-Rad，Richmond CA)由相片進行光密度定量。
通過ELISA進行的脾T細胞細胞因子測定。這些動物的T細胞活性也通過在用病毒抗原溫育脾T細胞時的細胞因子產生來測定。從免疫接種動物取出脾，用無菌活塞溫和地打碎脾並擠壓細胞通過尼龍篩網來製備脾勻漿。洗滌細胞懸液，在96孔微量板上以1×105細胞/孔鋪板。細胞在37℃用不等量的病毒抗原溫育3到4天後，收穫各孔上清，測定細胞因子的存在。商用細胞因子ELISA試劑盒用來確定細胞因子譜。組織培養物上清中的細胞因子蛋白通過夾心ELISA測定，使用特定細胞因子特異性的單克隆抗體(mAb)。簡而言之，ELISA板用大鼠抗小鼠細胞因子單克隆抗體包被過夜。用PBS中的3％胎牛血清封閉培養板2小時，然後等分量的每一測試樣品加入每一孔中。向每一孔中加入細胞因子特異性的生物素化大鼠抗小鼠單克隆抗體，然後是抗生物素蛋白過氧化物酶。通過加入比色底物得到有色反應。在ELISA分光光度計上讀取培養板，根據對照重組細胞因子獲得的標準曲線計算細胞因子濃度。所有細胞因子ELISA試劑盒(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12，IFN-□和TNF-α)購自PharMingen，Inc.(SanDiego，CA)。
抗原誘導的T細胞增殖。宿主對HIV抗原的致敏通過抗原誘導的T細胞增殖試驗測定。脾勻漿物的分離如前所述。細胞懸浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mM Hepes緩衝液、L-穀氨醯胺(2mM)、青黴素(25IU/ml)、鏈黴素(25g/ml)和慶大黴素(80g/ml)的RPMI1640培養基中。在96孔U形底培養板中，5％二氧化碳下，細胞在存在或不存在HIV-HD肽(5g/ml)時於1×106細胞/ml濃度培養。培養物用20μl刃天青染料脈衝處理3小時，然後在Cytofluor II(PerspectiveBiosystems，Inc.，Farmington，MA)上測定螢光。
抗HIV CTL應答。免疫接種後，評估脾T細胞中的抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)的存在。如前所述獲得脾淋巴細胞。來自各處理組的淋巴細胞合併(n＝5)，然後在12孔培養板中以107細胞/孔在抗原不存在時培養3天。L5198Y淋巴瘤(H2+)靶細胞(ATTC)與相應於H2+限制細胞的HIV CTL表位的肽溫育(Hanke et al.，1991，J.Virol.651177)，37℃下溫育4小時。洗滌靶標，向各孔中加入含1×104細胞的100μl滴定液。洗滌效應淋巴細胞，以不同濃度加入各孔中，37℃溫育4小時。使用Cyto Tox 96試劑盒(Promega，Madison WI)，用標準ELISA培養板讀數儀(HTS 7000+BioAssay Reader，PerkinElmer，San Jose，CA)通過記錄490納米吸收測定上清乳酸脫氫酶，由此計算特異性裂解百分比。根據常規標準確定HSV2抗原特異性裂解。數據表示為特異性裂解百分比＝100×[(試驗值-效應細胞自發值-靶標自發值)/(靶標最大值-靶標自發值)]。
實施例IV-流感病毒(INFV)INFV-HD的製備。選定表位的核苷酸序列根據大腸桿菌密碼子偏嗜由該蛋白序列衍生(Looman et al.，1987，EMBO J.62489)。插入基因盒的抗原序列相當於NP(147-161，TYQRTRALVRTGMDP；55-69(SEQ ID NO.20)，RLIQNSLTIERMVLS(SEQ ID NO.21))和HA(91-108，SKAFSNCYPYDVPDYASL(SEQ ID NO.22))。組合表位疫苗可以構建成由T-B表位組成，如Brumeanu et al.，1997等報導(HA 110-120/HA 150-159，SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP(SEQID NO.23))(Brumeanu et al.，1997，J.Virol.715473)。一旦獲得了合適的序列，編碼INFV-HD的合成基因通過合成、雜交、PCR和重疊寡核苷酸的連接來組裝。組裝的編碼INFV片段的全長基因通過PCR擴增，然後連接至表達質粒。最終基因通過DNA測序證實。
含INFV-HD的質粒轉化進大腸桿菌。細菌在含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB培養基中37℃溫育直至中對數期。此時，IPTG被加入以誘導trp/lac雜合啟動子。每小時檢查以確定INFV-HD蛋白誘導後的最佳表達。最佳表達時，細胞通過離心收穫。細胞沉澱裂解並離心。分析裂解物中的蛋白。HIV-HD蛋白通過結合至固體載體上的鎳選擇性親和純化。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換或疏水相互作用色譜以進一步純化INFV-HD。
病毒感染模型。用來證實疫苗功效的INFV毒株是稱為PR8的重配A/PR/8/34病毒。病毒通過卵黃囊接種在10到12日齡含胚雞卵上培養，然後在搖床上37℃溫育40-48小時，4℃溫育20-24小時，然後由卵黃囊液回收病毒。在96孔微量板上用0.5％雞紅細胞進行病毒血凝試驗，以確定每毫升病毒原種血凝單位數(HAU)。
在BALB/c小鼠模型中，用微量移液器的無菌吸頭鼻內給予metofane麻醉小鼠(20l)的1200 HAU PR8毒株4天後產生了明顯的感染症狀，包括運動性降低、不梳理皮毛(grooming)、體重減少20％，並且2周內死亡。以50％終點在96孔微量板上進行的MDCK細胞裂解試驗，發現感染後4天製備的肺勻漿物中存在高滴度感染性病毒。
免疫接種程序和對病毒抗原免疫應答誘導的測定。第1、4和8周，BALB/c雌性小鼠(6-8周齡)用試驗疫苗製備物或緩衝液皮下注射。監測注射部位的副反應，如形成肉芽腫和/或結痂。當動物用疫苗通過鼻內途徑免疫接種時，用metofane麻醉之，使用微量移液器的無菌吸頭將試驗材料(10-20l)加到鼻孔內使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168622)。
肺組織中INFV RNA的RT-PCR檢測。病毒攻擊後4天，在試驗動物的肺上進行INFV RNA的RT-PCR檢測，以確定免疫接種防止病毒感染的效果。取自小鼠的肺樣品驟凍、碾碎，冰凍粉末儲存在-70℃待用。使用已知技術的改進法(Chomczynsky et al.，1976，Analyt.Biochem.162156；Shirwan et al.，1993，J.Immunol.1515228；Lakemanand Whitley，1995，J.Inf.Dis.171857)進行總RNA分離和病毒RNA的RT-PCR分析。使用的引物是流感病毒A基體基因(區段7)特異性的(Atmar et al.，1996，J.Clin.Microbiol.342604)。RT-PCR分析使用Titan One Tube RT-PCR系統(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)試劑和方法進行。簡而言之，1pg到1g總RNA模板在0.2mMdNTP、0.4M反義引物FAM1(5′-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3′(SEQ ID NO.24))、0.4M有義引物FAM2(5′-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3′(SEQ ID NO.25))、5mM DTT、5U Rnase抑制物、1.5mM氯化鎂和AMV/Expand高保真酶存在下溫育，條件是1個循環60℃ 30分鐘；94℃ 2分鐘；10個循環94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒；25個循環94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃45秒，每一循環增加延伸5秒；然後是1個循環68℃ 7分鐘。溴化乙錠染色的1.5％NuSieve瓊脂糖凝膠(FMC Bioproducts，Rockland，ME)中的212bp可見條帶表示陽性結果，用UV照射儀(BioRad Gel Doc1000)照相。該方法對測定病毒DNA的存在是敏感的和高特異性的(Lakeman and Whitley，1995，J.Inf.Dis.171857)。
HA1區的測序。通過在PR-PCR反應中由病毒RNA擴增HA1區，然後亞克隆1100bp產物供測序用，使用雙脫氧核苷酸終止法測序，來獲得HA1區(區段4)序列。基本如上所述使用Tian One TubeRT-PCR系統進行RT-PCR分析，不同之處在於擴增引物是cDNA引物(5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC(SEQ ID NO.26))和PCR引物(5′-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3′(SEQ IDNO.27))(Pyhala et al.，1995 J.Gen.Virol.76205)，條件是1個循環60℃ 30分鐘；94℃ 2分鐘；10個循環94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃45秒；25個循環94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒，每一循環增加延伸5秒；然後是1個循環68℃ 7分鐘。1100bp產物亞克隆進TAPCR2.1克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)供測序用。測序使用AutoCycle試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和試劑進行，結果在ALFExpress試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)測序裝置上電泳，用AM軟體v.3.02kit(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分析。
通過ELISA測定抗體應答。在免疫接種過程中，定期測定小鼠對病毒抗原的免疫應答。含有抗原表位的脂質體也可用作已知的抗體/ELISA試驗(Tuso et al.，1993，Transplantation551375)的靶。後一試驗的結果將用來測定結合水平和抗體的同種型構造。
抗原誘導的T細胞增殖。宿主對INFV抗原的致敏通過抗原誘導的T細胞增殖試驗測定。用無菌活塞溫和地打碎脾並擠壓細胞通過尼龍篩網來製備脾勻漿。細胞懸浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mMHepes緩衝液、L-穀氨醯胺(2mM)、青黴素(25IU/ml)、鏈黴素(25g/ml)和慶大黴素(80g/ml)的RPMI 1640培養基中。在96孔U形底培養板中，5％二氧化碳下，細胞在存在或不存在相當於抗原的化學合成肽(5g/ml)時於1×106細胞/ml濃度培養。培養物用20l刃天青染料脈衝處理3小時，然後在Cytofluor II(Perspective Biosystems，Inc.，Farmington，MA)上測定螢光。
抗INFV CTL應答。免疫接種後，評估脾T細胞中的抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)的存在。如前所述獲得脾淋巴細胞。來自各處理組的淋巴細胞合併(n＝5)，然後在12孔培養板中以107細胞/孔在抗原不存在時培養3天。P815肥大細胞瘤(H2+)靶細胞(ATTC)與相應於H2+限制細胞的INFV NP CTL表位(胺基酸147-158)的肽溫育，37℃下溫育4小時。洗滌靶標，向各孔中加入含1×104細胞的100μl滴定液。洗滌效應淋巴細胞，以不同濃度加入各孔中，37℃溫育4小時。使用Cyto Tox 96試劑盒(Promega，Madison WI)，用標準ELISA培養板讀數儀(HTS 7000+BioAssay Reader，Perkin Elmer，SanJose，CA)通過記錄490納米吸收測定上清乳酸脫氫酶，由此計算特異性裂解百分比。根據常規標準確定INFV抗原特異性裂解。數據表示為特異性裂解百分比＝100×[(試驗值-效應細胞自發值-靶標自發值)/(靶標最大值-靶標自發值)]。
實施例V-未分型流感嗜血桿菌(NTHi)和b型流感嗜血桿菌(Hib)NIHi蛋白的克隆。編碼P6全長基因的序列通過P6 mRNA的RT-PCR擴增獲自NTHi菌株(Deich et al.，1988，J.Bacteriol.170489；Nelson et al.，1988，Inf.Immun.56128；Looman et al.，1987，EMBO J.62489)。擴增使用Titan One Tube RT-PCR系統(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)試劑和方法進行。簡而言之，細菌與0.2mM dNTP、0.4M反義引物H-InvfP6AS(5′-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3′(SEQ ID NO.28))、0.4M有義引物H-InvfP6S(5′-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3′(SEQ IDNO.29))、5mM DTT、5U Rnase抑制物、1.5mM氯化鎂和AMV/Expand高保真酶一起溫育，條件是1個循環60℃ 30分鐘；94℃ 2分鐘；10個循環94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒；25個循環94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒，每一循環增加延伸5秒；然後是1個循環68℃7分鐘。溴化乙錠染色的1.0％NuSieve瓊脂糖凝膠(FMC Bioproducts，Rockland，ME)中的867bp可見條帶表示陽性結果，用數字成象系統(BioRad Gel Doc 1000)照相。PCR產物使用TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)試劑和方法亞克隆至TA 2.1載體。小規模質粒製備使用標準鹼裂解法(Maniatis，1989 Molecular CloningAlaboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook，Fritsch，Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，p.125)進行。插入的PCR產物的測序使用AutoCycle試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和試劑通過常規雙脫氧終止法進行，結果在ALFExpressII試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)測序裝置上電泳，用AlfWin序列分析軟體v.2.0(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分析。
NTHi(P6)-HD的製備。一旦獲得了編碼P6的基因，編碼NTHi(P6)-HD的合成基因通過合成、雜交、PCR和重疊寡核苷酸的連接來組裝。HD區段通過由甘氨酸和絲氨酸組成的接頭加入蛋白的N或C末端。這使得我們可以測試HD相對抗原的位置對免疫系統加工的影響。組裝的編碼NTHi(P6)-HD片段的全長基因通過PCR擴增，然後連接至表達質粒。最終基因通過DNA測序證實。
含NTHi(P6)-HD的質粒轉化進大腸桿菌。細菌在含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB培養基中37℃溫育直至中對數期。此時，IPTG被加入以誘導trp/lac雜合啟動子。每小時檢查以確定NTHI(P6)-HD蛋白誘導後的最佳表達。最佳表達時，細胞通過離心收穫。細胞沉澱裂解並離心。分析裂解物和細胞沉澱中的蛋白。1-2％的脫氧膽酸鈉溶液用來從裂解的細胞沉澱中提取NTHi(P6)-HD蛋白。NTHi(P6)-HD蛋白通過結合至固體載體上的鎳選擇性親和純化。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換或疏水相互作用色譜以進一步純化NTHi(P6)-HD。
脂質體製備。通常有三種方法可以製備穩定的NTHi(P6)-HD脂質體。第一種方法是，將蛋白和脂一起溶解在有機溶劑中(氯仿/甲醇)，然後乾燥成一薄膜，從而製成脂質體。在重懸於含水緩衝液時，脂和蛋白組裝形成大的雙層結構。懸液然後超聲處理製備單層小泡(SUV)。對較小的蛋白，該方法效果較好。但是，在這些試驗中，蛋白暴露於嚴酷的溶劑條件不太好，因為可能使蛋白變性。因此，為了避免不必要的構象改變，可以使用第二種方法，該方法包括在水化脂膜前，在重懸緩衝液中溶解NTHi(P6)-HD。在對脂進行水化時，蛋白自發與新形成的膜結合，在超聲處理時整合進SUV脂雙層。第三種方法包括在無NTHi(P6)-HD蛋白時製備脂質體，然後加入已形成的SUV，使HD結合進脂雙層。脂質體通過探頭超聲處理按照已知方法(Fujii et al.，1997，Biochemistry 364959)製備。簡而言之，脂類(有或沒有蛋白)溶解在氯仿/甲醇等有機溶劑中。薄的脂膜通過以下方法形成移取等分量的脂溶液進入寬底玻璃試管，65℃在氮氣流下蒸發溶劑。膜置於真空下至少8小時除去殘留有機溶劑。或者，所需組合物的脂粉末通過噴霧乾燥等技術製備，然後用來代替脂膜。用緩衝液水化脂膜或粉末，在65℃溫育懸液5-10分鐘，再用探頭超聲處理，從而完成脂質體製備。脂質體然後通過0.22m的濾器使製備物除菌。脂質體通過動態光散射篩分，然後是至少4周的聚集體形成。可能NTHi(P6)-HD蛋白的構象需要保持。因此，在這三種可以用來製備脂質體的方法中，我們預期優選的是加入蛋白作為水化溶液的一種成分或在脂質體形成之後加入至脂質體的方法。
細菌菌株。NTHi菌株9333(脊髓液分離物)、35056(上呼吸道感染分離物)、43095(中耳炎分離物)、48766(肺膿腫分離物，抗微生物易感性試驗參考菌株)(ATCC)和Hib菌株51654(ATCC)用來在細菌感染模型中證明效果。使用之前，有機體的冰凍原種在補加有NAD(2g/ml)和血紅素(10g/ml)的新鮮腦心浸出液中傳代培養，37℃ 10％二氧化碳下溫育24小時。每種有機體的標準曲線由菌落形成單位對480納米濁度組成，其用來調整細菌試驗或腹膜內攻擊劑量所需的細菌接種物。
免疫接種程序和對細菌抗原免疫應答誘導的測定。出生後第5、12、19和26天或第5和26天用疫苗製備物或緩衝液免疫各組幼鼠(每組n＝6)。大鼠的系統免疫接種通過皮下注射脂質體疫苗完成。動物用疫苗通過鼻內途徑免疫接種時，用metofane使之麻醉，使用微量移液器的無菌吸頭將組合物(20l)加到鼻孔內使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168622)。幼鼠與雌性親鼠一起圈養，監測對免疫接種程序的副反應，如接種部位形成肉芽腫、紅腫或瘙癢。最後一次免疫接種後一周，幼鼠用氟烷麻醉，通過心臟穿刺收集血液，用鹽水灌洗黏膜通道收集黏膜分泌物。動物用二氧化碳行安樂死。血清和黏膜液的細菌抗體滴度如下所述測定。
進行腹膜內攻擊研究時，幼鼠(26日齡)用細菌攻擊，監測血液和CSF的細菌負荷並與未接種動物比較。攻擊後2天對血液和CSF樣品的細菌分析顯示，在動物中有明顯的細菌負荷(即血液1×104CFU/ml；1×104CFU/ml CSF)。含有高滴度細菌抗體的接種的26日齡大鼠血清靜脈給予6日齡大鼠。次日，幼鼠如下所述(n＝10)接受NTHi的腹膜內給藥。然後監測幼鼠發病率和死亡率，存活者26日後無痛處死，收集血液和CSF，並進行培養證實NTHi的存在。
NTHi的腹膜內攻擊。24小時體內傳代NTHi培養物調整為5×107到5×109CFU/ml，100μl該培養物腹膜內注射進5日齡大鼠(Smith etal.，1973，Inf.Immun.8278)。接種後攻擊幼鼠仍與雌性親鼠一起圈養。攻擊後18到96小時內，使用該劑量傳代細菌的大鼠至少90％死亡。
通過ELISA測定抗原特異性抗體應答。檢測來自各大鼠的血清和黏膜樣品的P6抗原特異性IgA抗體。克隆的天然P6或NTHi(P6)-HD蛋白加入適當處理的96孔板，室溫溫育過夜。培養板在pH9.6的碳酸氫鈉緩衝液中用1％牛血清白蛋白37℃封閉30分鐘。培養板用0.05％Tween 20/PBS洗滌。每種血清和黏膜樣品的稀釋液加入至抗原包被的培養板，37℃溫育2小時，溫育結束後用Tween/PBS緩衝液洗滌。特異性針對大鼠IgG或IgA並偶聯有鹼性磷酸酶的單克隆抗體被加入至孔中，37℃ 1小時。然後用Tween/PBS緩衝液洗滌各孔，在pH9.5的二乙醇胺緩衝液中的PNPP底物加入孔中以起始有色反應。反應用0.75N氫氧化鈉終止，在Spectramax ELISA讀板儀上讀出405納米吸收。大鼠IgG和IgA濃度根據標準曲線計算，標準曲線是用包被在96孔板上並同上處理的已知濃度的大鼠IgG或IgA對照樣品獲得的。
細菌抗體測定。待測定細菌抗體的血清樣品56℃溫育30分鐘以滅活補體。待測血清在磷酸緩衝鹽水(PBS)中系列稀釋。24小時細菌培養物用無菌PCM緩衝液調整為5×104CFU/ml，緩衝液組成為含牛血清白蛋白(BSA)及0.15mM CaCl2和1mM MgCl2的PBS。來自未接種幼鼠的血清用作補體來源。合併該血清，等分並儲存於-70℃待用。細菌(20l)、系列稀釋的血清(20l)、補體(20l)和40l PCM緩衝液中的1％BSA加入到96孔板的各孔中。為了確定起始細菌濃度，10l樣品混合物的等分試樣在0時塗布於含加富瓊脂和NAD及血紅素的新鮮BHI瓊脂平板上。37℃ 10％二氧化碳下振蕩溫育反應混合物1小時，從各孔中取出10l重複鋪板，37℃在10％二氧化碳下溫育過夜，以確定CFU/孔。對照包括一個無血清的孔，以確保補體本身不會殺死細菌，一個有試驗血清但無補體的孔，以確保試樣中的血清補體已被滅活。所有試驗以三個重複進行，殺死50％細菌的稀釋度用來比較不同血清的活性。
實施例VI-C肝病毒HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD在CHO細胞中的製備。HCV E2/NS1蛋白的核苷酸序列由如下所述獲得的HCV菌株的PCR擴增。使用相當於E2/NS1基因的頭21bp的5′引物CAAACCATGATCGCCCACGGA和相當於殘基622到628的3′引物GAAGTTGACAGTACAGGGTA，除去跨膜區(Cocquerel，L.et al.，1998，J.Virol.72(3)2183-91)。此外，每種引物的旁側是方便的限制位點。PCR產物被連接至含HD區作為基因盒質粒的pcDNA3.1His(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)。通過缺失相當於從384到410的頭27個胺基酸的E2/NS1基因的HVR1構建HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD。使用5′引物CAACTCATCAACACCAATGGC和野生型對照所用的相同3′引物通過PCR擴增製備缺失突變體。最終基因通過DNA測序證實。質粒使用脂感染試劑(脂感染胺，Gibco/BRL Gaithersbrug，MD)按照廠商推薦的方法轉染進CHO細胞(Deen，K.C.et al.，1988，Nature 33182)(ATCC，Rockville，MD)。使用G418選擇穩定的轉染子(Gibco/BRL，Gaithersbrug，MD)，通過有限稀釋法克隆。產生高水平蛋白的克隆通過蛋白質印跡分析評估。HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD蛋白通過結合於固體載體上的鎳選擇性親和純化。純化完成後組氨酸接頭通過腸激酶切割除去。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換和/或疏水相互作用色譜以進一步純化HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD蛋白。
在大腸桿菌中製備HCV(HVR1)-HD和HCV(C)-HD蛋白。選定表位的核苷酸序列根據大腸桿菌密碼子偏嗜衍生自蛋白序列(Looman etal.，1987，EMBO J.62489)。待插入基因盒的抗原序列相應於NP(147-161，TYQRTRALVRTGMDP；55-69，RLIQNSLTIERMVLS)和(91-108，SKAFSNCYPYDVPDYASL)表位。一旦獲得了合適的序列，編碼HCV-HD的合成基因(其旁側是方便的限制酶位點)通過合成、雜交、PCR和重疊寡核苷酸的連接來組裝。簡而言之，通過加熱到65℃並在其回復至室溫時使寡核苷酸退火來完成片段的組裝。在冰上溫育2分鐘，片段用DNA連接酶連接。組裝的編碼HCV片段的全長基因通過PCR擴增，限制酶切割，然後通過凝膠電泳分離。HCV基因然後連接至類似切割過的含HD基因的表達質粒(如pTrcHis或pQE30)。最終基因通過DNA測序證實。
含HIV-HD的質粒轉化進大腸桿菌。細菌在含有氨苄青黴素(50g/ml)的LB培養基中37℃溫育直至中對數期。此時，IPTG被加入以誘導trp/lac雜合啟動子。每小時檢查以確定HCV-HD蛋白誘導後的最佳表達。最佳表達時，細胞通過離心收穫。細胞沉澱裂解並離心。分析裂解物中的蛋白。HCV-HD蛋白通過結合至固體載體上的鎳選擇性親和純化。純化完成後，組氨酸接頭通過腸激酶切割除去。如果必要的話，進行大小排阻、離子交換或疏水相互作用色譜以進一步純化HCV-HD。
脂質體製備和免疫接種程序、免疫應答誘導試驗、ELISA抗體應答測定、DTH試驗、細胞因子特異性mRNA分析、ELISA細胞因子測定、抗原誘導的T細胞增殖和抗HIV CTL應答基本上如實施例III所述。
權利要求
1.一種免疫原性脂質體組合物，包括形成小泡的脂類；和含有一個或多個抗原決定簇和一個疏水區的抗原構建體，其中疏水區與所述脂質體組合物的膜結合。
2.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，還包括一種或多種佐劑。
3.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體是化學合成的。
4.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，其中疏水區是肽。
5.權利要求4的免疫原性脂質體組合物，其中疏水區由約15到約500個胺基酸殘基組成。
6.權利要求5的免疫原性脂質體組合物，其中疏水區包括一個或多個選自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的胺基酸。
7.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，其中抗原決定簇來源於選自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血桿菌P6的抗原。
8.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體還包括連接抗原決定簇和疏水區的接頭區。
9.權利要求8的免疫原性脂質體組合物，其中接頭區是肽。
10.權利要求9的免疫原性脂質體組合物，其中接頭區由1到約200個胺基酸殘基組成。
11.權利要求10的免疫原性脂質體組合物，其中胺基酸殘基選自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。
12.權利要求1的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體是融合蛋白。
13.權利要求9的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體是融合蛋白。
14.在宿主動物中誘導免疫應答的方法，包括給予免疫有效量的權利要求1的組合物。
15.在宿主動物中誘導免疫應答的方法，包括給予免疫有效量的權利要求2的組合物。
16.權利要求14的方法，其中宿主動物是哺乳動物。
17.權利要求16的方法，其中哺乳動物是人。
18.權利要求14的方法，其中動物是禽。
19.權利要求17的方法，其中抗原決定簇選自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血桿菌P6。
20.含有有效量的權利要求1組合物和可藥用載體的疫苗組合物。
21.權利要求20的疫苗組合物，還包括一種或多種佐劑。
22.待插入表達載體的DNA盒，包括編碼免疫原性融合蛋白的序列，所述蛋白包括疏水蛋白區，和一個或多個抗原決定簇。
23.權利要求22的DNA盒，其中抗原決定簇來源於選自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血桿菌P6的抗原。
24.權利要求22的DNA盒，其中疏水區是由約15到約500個胺基酸殘基組成的肽。
25.權利要求24的DNA盒，其中肽包括一個或多個選自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的胺基酸。
26.權利要求22的DNA盒，其中融合蛋白還包括連接抗原決定簇和疏水區的接頭區。
27.權利要求26的DNA盒，其中接頭區由1到約200個胺基酸殘基組成。
28.權利要求27的DNA盒，其中胺基酸殘基選自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。
29.含有權利要求22的DNA盒的載體。
30.製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達一種編碼融合蛋白的基因，所述融合蛋白含有抗原決定簇和疏水區；在一種合適的有機溶劑中溶解形成小泡的脂類和融合蛋白；通過蒸發有機溶劑形成脂膜或噴霧乾燥粉末；水化脂膜或粉末；並分散水化的脂膜或粉末形成免疫原性脂質體組合物。
31.製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達一種編碼融合蛋白的基因，所述融合蛋白含有抗原決定簇和疏水區；在含水緩衝液中溶解融合蛋白；用含有融合蛋白的緩衝液水化脂粉末或脂膜；並分散脂粉末或膜形成免疫原性脂質體組合物。
32.製備免疫原性脂質體組合物的方法，包括表達一種編碼融合蛋白的基因，所述融合蛋白含有抗原決定簇和疏水區；在含水緩衝液中溶解融合蛋白；並將融合蛋白加入至預先形成的脂質體中形成免疫原性脂質體組合物。
33.一種含有抗原構建體和可藥用載體的免疫原性組合物，所述抗原構建體包括一個或多個抗原決定簇和一個疏水區。
34.權利要求33的免疫原性組合物，其中抗原構建體還包括連接抗原決定簇和疏水區的的接頭區。
35.權利要求33的免疫原性組合物，還包括一種或多種佐劑。
36.一種免疫原性乳劑組合物，包括形成小泡的脂類；和包括一個或多個抗原決定簇和一個疏水區的抗原構建體。
37.權利要求36的組合物，其中抗原構建體是融合蛋白。
全文摘要
本發明提供了一種含有形成小泡的脂類和一種抗原構建體的免疫原性脂質體組合物，其中抗原構建體含有一個或多個抗原決定簇和一個疏水區。
文檔編號C07K14/16GK1555254SQ99811216
公開日2004年12月15日 申請日期1999年9月22日 優先權日1998年9月22日
發明者G·福吉, G 福吉, D·V·克拉默, 克拉默, W·A·埃恩斯特, 埃恩斯特, J·阿德勒－莫雷, 呂 莫雷, L·J·佩裡, 佩裡 申請人:分子表達公司