編碼大腸桿菌熱敏毒素基因及其表達載體和用途的製作方法

2023-10-09 23:52:29 1

專利名稱：編碼大腸桿菌熱敏毒素基因及其表達載體和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新基因，尤其涉及一種編碼人源性大腸桿菌熱敏毒素基因、該基因植物表達載體的構建、轉化和表達以及所獲得的轉基因植物作為免疫佐劑的應用，屬於基因工程領域。
背景技術：
抗原對免疫系統有效的刺激是產生免疫應答的必要條件，對免疫系統的有效刺激需要兩個條件，一是疫苗抗原能夠有效的傳遞到淋巴組織；二是需要合適的佐劑。絕大多數非複合抗原如純蛋白質抗原經黏膜供給時免疫原性弱，特別是經口服途徑，只有大量和反覆接種後才可能引起免疫應答，但應答持續時間短，有時易引起免疫耐受，必須輔以適當的佐劑才能產生滿意的免疫效果。尋找合適的免疫原性的佐劑成為疫苗開發中的關鍵問題。比較理想的佐劑應該高效、安全，能激活免疫系統，在其存在的情況下抗原可引發抗原特異性體液免疫、細胞免疫及全身黏膜免疫應答，同時能避免誘導免疫耐受。
目前人們已開發出多種佐劑，其中有相當一部分通過動物實驗證明其在引發免疫上非常有效。目前所用的大腸桿菌熱敏毒素LT和霍亂毒素CT具有良好的佐劑性，具有廣闊的應用前景。
大腸桿菌熱敏毒素LT和霍亂毒素CT兩種毒素目前被認為是最有效的佐劑，也是最主要的基因工程疫苗佐劑和黏膜免疫佐劑，可消除共抗原的免疫耐受。兩者一級結構有80％同源，三維空間結構基本相似，均為多亞單位的大分子，由結構和生物學功能不同的A(11.6KD)和B(29KD)兩種亞單位組成AB5型結構的六聚體蛋白。每種毒素的B亞基均由五個相同B亞單位組成，負責與細胞表面神經節苷脂結合，A亞基則具有ADP-核糖基化酶的活性。CT、LT引發黏膜免疫非常有效，CT與非關聯蛋白抗原經口、鼻共用，可促進分泌IL-4、IL-5的抗原特異性CD4+Th細胞的出現，引發極強的黏膜sIgA和血清IgG應答。CT發揮佐劑效應主要通過誘導抗原特異性CD4+Th2型細胞，活化的CD4+Th2型細胞不僅相應產生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，而且支持全身IgG1和IgG2b亞類、IgE和黏膜sIgA應答的出現。LT與抗原口服用，可誘導CD4+Th1細胞產生血清IgM、IgG1、IgG2a和黏膜sIgA〔Fujihashi K，KogaT，VanGinkel FW，etal.[J].Vaccine，2002，20(1920)2431-2438〕。LT作為佐劑可與多種抗原經不同途徑共免疫均能明顯增強機體對共服抗原的黏膜sIgA和IgG應答，與CT主要誘導Th2型免疫應答不同，LT誘導的應答要均衡些，產生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜IgA，顯然是Th1和Th2型應答的混合。McNeal等分別用缺乏αβ型和γδCD4+T細胞的小鼠模型進行研究，顯示αβ型CD4+T細胞可能是LT佐劑激活免疫應答最關鍵的細胞，LT佐劑能誘導長期記憶應答〔McNeal MM，VanCott J1，Choi AH，etal.Virol，2002，76(2)560〕。與CT引起的致死性腹瀉相比，LT引起的腹瀉要溫和的多，而且與CT相比，LT同樣具有很好的佐劑作用，基本上不誘生IgE，卻能有效地啟動機體局部和全身的體液和細胞免疫；而CT對Th1細胞無誘導作用，血清中也不產生IgG2a，因此，LT作為佐劑可能比CT更勝一籌〔Millar，D.G.，Hirst，T.R.，Snider，D.P.，InfectImmun，2001，69，3476〕。
LT作為黏膜免疫佐劑引起的免疫應答主要有以下特點1、使機體產生高效價特異的黏膜sIgA；2、LT誘導腸集合淋巴結(peryer′spatch，PP)抗原特異的Th細胞和B細胞應答，包括Th1(γ-INF)和Th2(IL-4、IL-5)細胞、血清IgG1、IgG2a、IgG2b及腸道黏膜sIgA應答，產生體液免疫；3、LTs還誘導MHC-II限制的細胞介導免疫，使抗原特異的T細胞、IL-2、MHC-I限制的細胞毒T細胞(CTL)顯著增多，產生細胞免疫〔Ermak TH，Giannasca PJ，Nichol SR，etal.[J].JExpMed，1998，188(12)2277-2288〕。
LT免疫佐劑的應用1、防止免疫耐受。小分子抗原或半抗原免疫，特別黏膜免疫的最大缺陷是所需抗原劑量大和易對抗原產生免疫耐受。而LTs與抗原一起初次免疫動物後，將長期不會對該抗原產生免疫耐受。2、簡化免疫途徑。黏膜免疫的最大特點之一是免疫途徑可採用口服、灌胃、鼻飼、直腸灌注、陰道滴注等，可以大大減低經血傳播病原如人類免疫缺陷病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)等在受試者之間的傳播率。口服免疫可以預防消化道傳染性疾病，鼻飼免疫可使陰道黏膜抗原特異性sIgA水平顯著升高，甚至優於陰道內免疫，這使通過鼻飼免疫可預防性傳播疾病。3、增強免疫防禦。抗病毒口服LT+感冒病毒疫苗能顯著增強小鼠血清抗-病毒IgG和黏膜sIgA應答，LT使血清凝集抑制抗體和中和抗體均有增加，使病毒特異的T細胞、IL-2、MHC-I限制的細胞毒T細胞顯著增多。用LTB混合微量野生型LT(0.5％)作為佐劑(LTB)、三價滅活感冒病毒作混合抗原鼻飼免疫自願者，能明顯增加呼吸道抗感冒病毒sIgA水平和增強機體抗感冒病毒感染的能力。LT及LTR192G作為黏膜免疫佐劑能使輪狀病毒2/6病毒樣顆粒(2/6-VLPs)疫苗刺激腸道黏膜產生高效價的病毒抗原特異性sIgA，對輪狀病毒感染的免疫保護率達100％，優於CT佐劑(91％)。抗細菌目前主要為預防螺桿菌感染的實驗研究。研究人員選用重組尿素酶(rUrease)作抗原，LT作佐劑，採用口服、鼻飼等途徑進行免疫，結果均顯示了對螺桿菌感染的黏膜免疫保護活性。Welzin研究證實，儘管採用rUre每天鼻飼小鼠可以使唾液和糞便中產生高水平的sIgA，但僅rUre+LT產生的免疫對實驗性貓螺桿菌(helicobacterfelis)感染具有免疫保護作用。而Ermak則研究認為，尿素酶+LT免疫小鼠預防幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染主要依賴MHC-II限制的細胞介導免疫機制，可不需要對於尿素酶的抗體應答。另外，Douce等研究也表明，破傷風毒素C片段與LTK7共鼻飼免疫後的小鼠對有毒的破傷風毒素具有明顯的黏膜免疫保護作用。抗真菌Cardenas用10mgLTR192G作佐劑、與滅活的白色念珠菌(heat-killedcandidaalbicans，HK-CA)鼻免疫CBA/J小鼠，同時以不加佐劑疫苗作對照。結果表明，加佐劑疫苗能引起更明顯的遲發性變態反應，能根除機體104白色念珠菌活菌，並顯著提高小鼠感染後的存活率；而對照組僅使菌量減少〔Cardenasfreytag L，ChengE，Mayeu P，etal.[J].Infect Immun，1999，67(2)826-833.〕。
LT根據來源不同分為人源(LT-h)和豬源(LT-p)兩大類，它們具有很高的基因和胺基酸順序同源性，理化性質和免疫性均極為相似。LT(87KD)由1個A亞單位(LtA 29KD)和5個B亞單位(LtB 11.6KD)組成。5個完全相同的B亞單位在空間上形成環狀五聚體；LtA位於中央，其C-端以非共價鍵與LtB結合。A亞單位能被蛋白酶裂解為兩個片段A1和A2，二者以二硫鍵相連。A1具有ADP-核糖基轉移酶的作用，它由B亞單位介導能透過細胞膜，激活細胞內的腺苷環化酶，引起細胞內cAMP升高，刺激腸黏膜過度分泌水和電解質，導致腹瀉，是CT的毒力活性部分；A2的主要功能是連接A1和B亞單位；B亞單位由五條多肽鏈以非共價鍵方式連結成一個五聚體環，可與靶細胞膜上神經節苷脂1(GM1)特異性結合，打開通道，介導A亞單位進入靶細胞，以發揮毒素活性。LtA和LtB分別由toxA和toxB編碼，它們有4個核苷酸的的重疊。胞漿中的A、B亞單位均以攜帶信號肽的前體形式存在，當穿越細胞膜後才組裝成完整的LT。A亞單位具有GTP依賴的ADP-核糖基化轉移酶活性，通過G蛋白介導的ADP-核糖基化反應破壞胞內cAMP的降解與平衡，刺激cAMP水平增高，從而引發毒素效應。B亞單位的作用是與真核細胞表面的GM1-神經節苷脂受體特異性結合，以利於A亞單位進入靶細胞。LT具有很強的免疫原性，機體接觸LT後可產生強烈的體液免疫反應和黏膜免疫反應。LT-h和LT-p作用於不同的G蛋白，前者是Gs蛋白，後者是Gi蛋白，而最終都是使蛋白激酶A失活，引起一系列生化反應，導致腹瀉。
80年代後期，Clements等首次報導了LT具有免疫佐劑活性，並可消除共免疫抗原的免疫耐受。當LT與卵白蛋白(ovalbumin，OVA)同時初次口服免疫小鼠時，不但可以消除機體對OVA的免疫耐受性，還使血清抗-OVAIgG和黏膜抗-OVAsIgA含量比僅用OVA抗原初次免疫時高約30倍；但當動物在服用OVA後重複上述實驗時，血清抗-OVAIgG和黏膜抗-OVAsIgA水平均明顯降低，不能消除機體對OVA的免疫耐受，表明LT對共免疫抗原(co-administeredantigen)的佐劑作用需以機體對該抗原是初次接觸或以接種為基礎。1992年，Rollwagen等進一步研究表明，LT可以加強彎曲菌的黏膜免疫應答，並加速腸道對該菌的清除〔Rollwagen，FM，Pacheco，ND，Clements，JD，etal.[J].Vaccine，1993，11(13)1316-1320〕。De Haan等對LT的佐劑作用機制和A、B亞單位在佐劑功能中所起的作用進行了廣泛的研究，他們分別用LTB、LT、LT-E112K(LTAGlu112-lys)、LTB-G33D、LT-G33D、LT-E112K/G33D作黏膜免疫佐劑、流感HA分別作共免疫抗原採用鼻飼、陰道滴注途徑免疫小鼠，結果表明雖然LTA的ADP-核糖基轉移酶活性在LT的免疫原性中不起主要的作用，也不是LT佐劑性所必須的，但它的存在卻增強了LT的免疫原性，它的缺失降低了LTB特異性血清IgG的水平，使特異性血清IgA幾乎為0；但對經鼻、陰道免疫的佐劑性卻影響不大，這與其他人的研究結果一致〔DiTommaso A.，Saletti G.，Pizza M.etal.Infec Immun，1996，64，974；De HaanL，Verweij WR，Feil IK，etal.[J]Infect Immun，1996，645413〕。另外一些實驗室發現了其他缺乏ADP-核糖基化活性的突變體如LT R 7K、LT R 192G、LT S 63K與多種抗原經多種途徑都產生與野生型LT相同的佐劑性。另一方面，LTB的GM1結合性對於LTB、LT的免疫原性，是必不可少的，GM1結合特性的缺失也會極大的降低LT、LTB的免疫原性，抗毒素特異性血清IgG、IgA，sIgA都大幅降低；但是，GM1的結合特性對LTB、LT的佐劑性卻不是必須的〔Dehaan L，Verweij W.R.，Feill K.et al.[J].Immunology，1998，94(3)424 430〕、〔Guidry J.J.，Cardenas L.，Cheng E.J.D.Infect Immun，1997，65，4943〕。
目前，LT作為免疫佐劑的觀點已獲公認，但本身強烈的腸毒性限制了它在臨床上的推廣應用。目前一些研究正嘗試將這兩種分子的致腹瀉活性(毒性)與佐劑活性分開，單獨使用LTB做為免疫佐劑，會出現佐劑活性比較低，並基本不產生sIgA，佐劑效果還受如抗原類型、免疫途徑、動物種屬、免疫劑量以及偶聯方法許多因素影響，所以LTB不適宜成為一種通用佐劑。另外一種受歡迎的做法是採用定點誘變的方法替換A亞基活性部位上某一胺基酸，在保持其黏膜佐劑活性的前提下降低或消除細菌毒素的毒性。目前已構建了多種缺乏ADP-核糖基化活性的LT突變體，用以觀察ADP-核糖基化活性在LT黏膜免疫佐劑活性中的作用。Lycke等用無ADP-核糖基化活性的LTE112K(第112穀氨酸→賴氨酸)與KLH共口服免疫小鼠幾乎不能(遠不及LT)增強刺激機體或腸黏膜產生針對KLH的免疫應答，因而認為，LT的佐劑效應機制與ADP-核糖基化活性和激發cAMP產生的能力直接相關。而Verwei等用LTE112K作佐劑，與HA抗原共鼻免疫小鼠，卻比僅用HA顯著增加了血液中IgG水平和鼻腔黏膜sIgA應答，與用野生型LT作佐劑無明顯差異。同樣，其他研究者們還分別證實了LTK7(A亞單位第7位的精氨酸→賴氨酸)、LTR192G(第192位的精氨酸→甘氨酸)、LTK63(第63位的絲氨酸→賴氨酸)、LTR72(A亞單位丙氨酸-精氨酸)等無或減弱ADP-核糖基化活性的LT突變體及rLTB具有顯著的黏膜免疫佐劑活性；不過，這些結論均基於鼻免疫。Giuliani認為，經突變得到得低毒AB複合物，具有和野生型同樣的廣譜免疫佐劑性，佐劑活性不受免疫途徑、免疫動物、共免疫抗原等因素限制，但毒性卻比野生型低得多，在安全範圍內。LTR72就是A亞單位72位丙氨酸突變為精氨酸，體外Y1細胞上檢測毒性比野生型低1000倍，但免疫活性卻等同於野生型〔Neidleman JA，VajdyMM，Ugozzoli G，etal.[J].Immunology，2000，101154-160〕、〔Gill Douce.[J].InfectImmun，1999，(9)4400-4406〕。本發明基因編碼的蛋白即為LTA72(A-R)和LTB組成，安全無毒，佐劑活性等同於同樣劑量的野生型LT。
目前，LT、LTB作為毒素免疫原或佐劑融合蛋白已在多種系統中表達。1983年Clements等從大腸桿菌中首先產生LTB〔Clements，J.D.，Flint，D.C.，Engert，R.F.，Klipstein，F.A.Infect Immun.1983，40，653〕；Ichikawa等在短芽孢桿菌中表達重組LTB〔Ichikawa，Y.，Yamagata，H.，Tochikubo，K.and Udaka，S.FEMS Microbial.Left，1993，111，219-224〕；Schonberger等在酵母中表達LTB〔Schonberger，O.，Hirst，T.R.and Pines，0.Mol.Microbial.1991，5，2663-2671〕；Lauterslager、Chikwamba、Lamphear在菸草、馬鈴薯、玉米中表達了LTB〔Lauterslager，T.G.，Florack，D.E.，Van der wal，T.J.，etal.Vaccine，2001，19，2749〕、〔Chikwamba R，Cunnick J，Hathaway D，McMurrayJ，Mason H，Wang K.Transgenic Res，2002，11(5)479-493〕、〔Lamphera BJ etal.Delivery of subunit vaccines in maize seed.J Control Release.2002，85(1-3)169-180〕。Hugn等在馬鈴薯中表達人工合成的LTB，表達量為每克塊莖中含4-10微克LTB，每毫升可溶性蛋白提取液中含0.7-1.5微克LTB，以含20或50ug LTB的5g無葉馬鈴薯塊莖飼餵小鼠，產生的血清IgG和sIgA水平與強飼5ug大腸桿菌源的重組LTB相當，以25ug的LT攻毒後，可產生一定的免疫保護〔Hugh S.Mason 11，Tariq A.Haq John D.Clementss and Charles J.gene.1998.Vccine 16(13)1336-1343〕。Birgit等用TMV做載體在菸草中表達LTB五聚體，每1克新鮮植物材料中含量為75微克，有GM1結合性，以15ug/鼠經鼻免疫，可產生LTB特異性IgG1，與三葉橡膠乳膠過敏原Hevb3鼻腔共免疫小鼠，產生Hevb3特異性IgG1、IgG2，具有佐劑效果〔Birgit Wagner，KarinHufnagl，Christian Radauer，etal.Journal of Immunological Methods 2004 287203-215〕。Kang等在菸草葉綠體中表達了LTK63，表達量為可溶性蛋白的3.7％〔Tae-Jin Kang，So-Chon Han，Mi-Young Kim，etal.Protein Expression andPuriWcation 2004，38123-128〕。Rogano等將LTB與結核抗原融合後在擬南芥中成功得以表達〔Riggno MM.etal.Plant cell Rep，2004，22(7)502-508〕。
綜合以上所述文獻可以看出將大腸桿菌熱敏毒素基因在植物中表達均不同程度的存在著表達量較低、佐劑效果較差、表達產物有毒性等缺陷。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的編碼大腸桿菌熱敏毒素基因，該基因能夠在植物中高表達，所表達的重組大腸桿菌熱敏毒素或轉基因植物可用做免疫佐劑，該免疫佐劑具有效果好、安全、無毒等優點。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因，由NLTA和NLTB兩個亞單位組成，其中NLTA具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NLTB具有序列表SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
本發明根據對植物基因表達使用的密碼子的統計分析，選出同一編碼胺基酸時植物偏愛使用的密碼子，然後在保持大腸桿菌熱敏毒素(Heat-libileEnterotoxin of Escherichia colli)的A亞單位和B亞單位的胺基酸序列不變的情況下，採用植物偏愛的密碼子進行反翻譯，同時屏蔽基因序列中的提前加尾信號及促mRNA降解的序列，提高基因G+C的百分含量，兼顧不形成複雜的二級結構，設計人工合成適合於在植物中高表達的新的大腸桿菌熱敏毒素A亞單位、B亞單位的基因NLTA和NLTB。與天然LTA、LTB基因序列相比，新的NLTA和NLTB基因打破了原核基因結構與植物基因結構不同的物種界限，採用植物密碼子優化的思路設計，使之更適合在植物中表達。
NLTA有如下特點1、777個鹼基對中改換了206個，改換率為26.5％。
2、在259個胺基酸密碼子中，被改變鹼基的密碼子有179個，改變率為69％。
3、在259個胺基酸密碼子中，包含154個植物優化密碼子，佔密碼子總數的59％，比天然LTA提高82個，提高了31％。
4、777個鹼基對中G+C數目由297個改換到381個，G+C含量由38.2％提高到49％。
5、在天然基因中的1個PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改換，改換率為100％。
6、為使基因操作方便，在除去了基因序列中間的一些主要的顯著性內切酶識別位點，增強了合成基因的適用性。
NLTB有如下特點1、375個鹼基對中改換了107個，改換率為28.5％。
2、在125個胺基酸密碼子中，被改變鹼基的密碼子有97個，改變率為78％。
3、在125個胺基酸密碼子中，包含91個植物優化密碼子，佔密碼子總數的73％，比天然LTB提高45個，提高了36％。
4、375個鹼基對中G+C數目由137個改換到186個，G+C含量由36.5％提高到49.6％。
5、在天然基因中的3個PPSS序列(AATAAA和AATAAT)全部被改換，改換率為100％。
6、在天然LTB基因中存在的2個幹擾基因表達和使mRNA不穩定的序列(ATTTA)，全部被改換，改換率為100％。
7、為使基因操作方便，在除去了基因序列中間的一些主要的顯著性內切酶識別位點，增強了合成基因的適用性。
本發明所要解決的另一技術問題是構建一種能夠在植物中高效表達NLTA和NLTB核苷酸序列的表達載體。
一種高效表達NLTA和NLTB核苷酸序列的植物表達載體，其構建方法的步驟為將所述的NLTA和NLTB核苷酸序列插入植物表達載體的轉錄起始密碼子之後，即得。
一種優選的構建方法，步驟如下1)將NLTA和NLTB序列分別插入到植物超表達元件pTΩ4A中，構建中間載體pTΩ4ANLTA和pTΩ4ANLTB；
2)酶切回收Ω4A+NLTA和Ω4A+NLTB片段，將上述片段同時插入到植物表達載體pCAMBIA2301中，從而構建高效植物表達載體pC234ANLTAB。
植物超表達元件pTΩ4A是在Puc19的多克隆位點HindIII和EcoRI之間含有兩個35S增強子、1個CaMV35S啟動子、1個Ω序列、1個Kozak序列、4個(poly)A和Nos終止子，Ω序列、Kozak序列、4個(poly)A的作用是增強翻譯。
本發明所要解決的另外一個技術問題是利用上述含有人工合成編碼大腸桿菌熱敏毒素的高效表達載體轉化植物，製備免疫佐劑。
一種免疫佐劑，主要由下述方法製備而成1)用構建的包含NLTA和NLTB序列的植物表達載體轉化受體植物；2)獲得轉基因植物。
其中所述構建的植物表達載體為pC234ANLTAB；轉化方法選用農桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、胚囊、子房注射法、浸泡轉化法、顯微注射法、電激法、超聲波法、脂質體介導法、PEG介導法等方法。本發明優選農桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、脂質體介導法或浸泡轉化法轉化植物，更優選使用農桿菌浸染法，並從中篩選出能夠穩定、高效表達抗原蛋白的轉基因工程植株；所述受體植物為紅三葉草、白三葉草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、菸草、馬鈴薯、百脈根或番茄，優選為百脈根。
將上述獲得的轉基因植物直接與目的抗原混合後直接飼餵動物，或將所表達的重組大腸桿菌熱敏毒素分離、純化後，將其通過混合、融合、化學偶連、雙價載體等方式與目的抗原相連，經直接飼餵、飲水、點眼、滴鼻、腹腔注射、肌注、十二指腸、皮下注射等途徑免疫動物，結果表明，上述方式均能達到增強目的抗原免疫應答的效果。
本發明整體技術方案概述本發明根據人源性大腸桿菌熱敏毒素A亞單位(LTA)、B亞單位(LTB)的胺基酸序列，人工優化合成適合在植物中高表達的編碼大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的新的DNA序列NLTA和NLTB；構建用於植物的超表達元件；將已插入該序列的超表達元件連到植物表達載體的相應酶切位點構建植物表達載體；用該載體轉化植物，獲得高水平表達大腸桿菌熱敏毒素的轉基因植株；用抗生素篩選、PCR、Southern blot、Northern blot鑑定轉基因陽性植株；測定轉基因植株中大腸桿菌熱敏毒素含量，用ELISA鑑定表達蛋白的性質；繁殖和培養轉基因植株；用不同劑量表達大腸桿菌熱敏毒素的植株、其蛋白提取液或其他純化物，以不同的方式加牛血清白蛋白(BSA)，以不同的途徑免疫動物，證明其有加強免疫的佐劑性。
本發明具有以下優點1)本發明編碼大腸桿菌熱敏毒素基因能夠在植物中高表達重組大腸桿菌熱敏毒素；並且採用植物作為表達系統，克服了微生物系統不能對真核生物蛋白進行準確翻譯後加工和蛋白的糖基化等缺陷，能夠對表達產物進行糖基化、醯氨化、磷酸化、亞單位的正確裝配等轉譯後加工，使表達產物三維空間結構更趨於自然狀態，所表達的大腸桿菌熱敏毒素具有更好的生物活性，能夠有效加強抗原免疫應答反應。
2)所表達的重組大腸桿菌熱敏毒素安全、無毒性。


圖1為pCAMBIA2301的質粒圖譜。
圖2為植物表達載體pC234ANLTAB的構建流程示意圖。
圖3為對照野生型基因植物載體pC234ACKLTAB的構建流程示意圖。
圖4為轉本發明基因百脈根Southern blot雜交結果。
圖4A用LTA做探針檢測結果；其中，1為陽性對照；2～5為轉本發明基因植株；6為陰性對照。
圖4B用LTB做探針檢測結果；其中，1為陰性對照；2為陽性對照；3～5為轉本發明基因植株。
圖5為轉本發明基因百脈根Northern blot雜交結果。
圖5A用LTA做探針檢測結果；圖5B用LTB做探針檢測結果。
圖6為轉本發明基因百脈根Western blot雜交結果。
1、陽性對照；2、陰性對照；3、轉野生型基因植株；4、轉本發明基因植株。
圖7為本發明基因表達產物的GM1-ELISA檢測結果。
圖8為ELISA檢測抗BSA血清IgG結果。
橫坐標為血清稀釋度，縱坐標為450nm的OD值。
以下通過實施例進一步闡明本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的範圍。
具體實施例方式
試驗材料1、菌株與載體大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自華美生物公司。
農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)根癌農桿菌EHA105購自華美生物公司。
PUC18(Ampr)購自promega公司。
pTΩ4A(Ampr)購自Invitrogene公司。
pCAMBIA2301(Kanr)購自CAMBIA公司。
2、酶和試劑及人工寡聚核苷酸引物限制性內切酶、Taq酶、T4DNA連接酶等常用酶類購自NewLand和Takara等公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit和DIG DNA Labeling and Detection Kit購自Roche公司；pfu DNA Polymerase購自天為時代公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天為時代科技有限公司；寡聚核苷酸引物由Sangon公司合成；測序由上海基康公司、申能博彩公司和Bioasia公司完成。
3、生化試劑IPTG、X-Gal、Agar為Sigma公司產品；TEMED、過硫酸銨、丙烯醯胺及甲叉雙丙烯醯胺為Promega公司產品；瓊脂、SDS、NaOH、NH4NO3KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MnO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O、肌酸、煙酸、VB6、VB1、甘氨酸、胰蛋白腖、酵母提取物、蔗糖、NaCl均購自北京市生化試劑公司。
4、培養基
LB細菌培養基每升含胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用NaOH調pH至7.0，滅菌待用。加1.5％瓊脂配成固體培養基。
藍白斑篩選培養基每升LB固體培養基中加20mg/mL的X-Gal 40ul和200mg/mL的IPTG 40ul。
YEB培養基每升含胰蛋白腖5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO40.5g。用NaOH調至pH至7.5，滅菌後待用。加1.5％瓊脂配成固體培養基。
MS培養基購自sigma公司。
MS共培養培養基MS基本培養基中加入6-BA(2mg/l)及IAA(0.5mg/l)。
MS選擇培養基MS共培養培養基中加入羧苄青黴素(500mg/l)及卡那黴素(100mg/l)。
MS生根培養基MS基本培養基中加入羧苄青黴素(500mg/l)或頭孢拉定(500mg/l)+卡那黴素(50mg/l)+IBA(0.1mg/ml)。
5、植物豆科牧草百脈根「裡奧」6、儀器常溫離心機、冷凍離心機來自sigma公司；凝膠成像儀、電泳儀購自Bio-Rad公司。
本發明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTA和NLTB的製備根據Internet上公布的coden usage資料庫，統計出植物偏愛使用密碼子，然後再利用生物軟體DNASTAR，在保持大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的胺基酸序列不變的情況下，採用植物偏愛的密碼子進行反翻譯、同時屏蔽基因序列中的植物多聚腺核苷酸信號序列(PPSS)(AATAAA、AATAAT)及促mRNA降解的序列(ATTTA)，提高基因的G+C％，避免15～30個鹼基對中A+T％＞80％，避免在10個鹼基對中出現4個或4個以上連續A或T，避免連續A+T或G+C多於5個，避免一些酶切位點，同時兼顧不形成複雜的二級結構，設計適合於在植物中高表達的新的編碼大腸桿菌熱敏毒素A、B亞單位的NLTA序列(SEQ ID NO.1)、NLTB序列(SEQ ID NO.2)。
NLTA、NLTB序列再由大連寶生物公司合成後連在載體PUC18的PstI和XhoI之間構成PUC18NLTA、PUC18NLTB。
構建高效植物表達載體pC234ANLTAB及對照野生型表達載體pC234ACKLTAB2.1大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備1)取在LB固體培養基上生長的受體菌DH5α單菌落，接種於5ml B液體培養基中，37℃搖床培養過夜(200r/min)；2)1％接種量轉接到100ml LB液體培養基中，於37℃，300r/min搖約3hr，可通過測量OD600值(0.4～0.6)來檢測培養物生長狀況；3)在無菌條件下，將細菌轉移到一個無菌、用冰預冷的50ml離心管中，在冰上放置10min，使培養物冷卻至0℃；4)4℃，4000rpm，離心10min，回收菌體細胞，除盡培養液；5)用10ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份細胞沉澱，放置於冰上30min；6)4℃，4000rpm，離心10min，回收細胞，除盡培養液，5、6步驟可重複一次；7)50ml初始培養物，用1ml冰預冷的0.2M CaCl2和1ml 30％甘油，重懸每份細胞沉澱；8)每管200ul分裝，置於液氮中，-70℃保存備用。
2.2大腸桿菌的轉化在200ul的DH5a感受態菌中分別加入2ul質粒，輕輕混勻，冰上放置30min；42℃熱激90秒，快速將離心管轉移到冰浴中，使細胞冷卻5min；每管加800ul LB培養基，於37℃搖床(200r/min)溫育45min，使細菌復甦；在超淨臺中將約600ul菌液轉移到含有相應抗生素的LB平板上，均勻塗板，待液體吸收後，倒置平皿，37℃培養12-16hr。
2.3鹼裂解法小量提取PUC18NLTA、PUC18NLTB、PUC18CKLTA、PUC18CKLTB質粒DNA[參見《分子克隆》]。
2.4酶切和回收在50ul酶切體系中加入5ul質粒PUC18NLTA、PUC18NLTB、5ul10×buffer、PstI和XhoI(購自大連寶生物公司)各2ul，其餘用雙蒸水補齊，混勻後37℃放置4小時，然後在1％瓊脂糖凝膠中150V電泳，紫外燈下切下回收大小NLTA(800bp)、NLTB(400bp)左右的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天為時代科技有限公司)回收，離心管中的液體即是純化的產物，取1ul電泳，檢測並目測定量。
在50ul酶切體系中加入5ul質粒PUC18CKLTA、PUC18CKLTB(購自中國農科院哈爾濱獸醫研究所)、5ul10×buffer、PstI和XhoI(購自大連寶生物公司)各2ul，其餘用雙蒸水補齊，混勻後37℃放置4小時，然後在1％瓊脂糖凝膠中150V電泳，紫外燈下切下回收大小CKLTA(800bp)、CKLTB(400bp)左右的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天為時代科技有限公司)回收，離心管中的液體即是純化的產物，取1ul電泳，檢測並目測定量。
2.5連接、轉化、鑑定同時，用PstI和XhoI雙酶切pTΩ4A，回收約2.9Kb片段，分別在10ul連接體系中加入1ul回收的NLTA、NLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×連接buffer，1ulT4DNA連接酶(購自大連寶生物公司)，其餘用ddH2O補齊，置於16℃低溫水浴鍋中12小時後，在轉化DH5a感受態細胞，挑取菌落，搖菌，提質粒，酶切鑑定，正確的即為中間載體pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB。同樣的方法，用HindIII和EcoRI(購自大連寶生物公司)雙酶切pTΩ4ANLTA、pTΩ4ANLTB，回收Ω4ANLTA(2.1Kb)、Ω4ANLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA連接酶將Ω4ANLTA片段插入到植物表達載體pCAMBIA2301(購自CAMBIA公司，見圖1)的HindIII和EcoRI之間中間載體pC234ANLTA，在用EcoRI酶切pC234ANLTA，乙醇沉澱，KlnowI(購自TAKARA公司)補平。同樣的方法，補平Ω4ANLTB兩端，10ul體系中T4連接酶補平的兩個片段，構建從而構建高效植物表達載體pC234ANLTAB(見圖2)，做酶切、PCR、測序鑑定。
同樣的方法，用PstI和XhoI雙酶切pTΩ4A回收約2.9Kb片段，分別在10ul連接體系中加入1ul回收的CKLTA、CKLTB片段，2ul回收的pTΩ4A片段，1ul10×連接buffer，1ulT4DNA連接酶(購自大連寶生物公司)，其餘用ddH2O補齊，置於16℃低溫水浴鍋中12小時後，在轉化DH5a感受態細胞，挑取菌落，搖菌，提質粒，酶切鑑定，正確的即為中間載體pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，同樣的方法，用HindIII和EcoRI(購自大連寶生物公司)雙酶切pTΩ4ACKLTA、pTΩ4ACKLTB，回收Ω4ACKLTA(2.1Kb)、Ω4ACKLTB(1.7Kb)的片段，先用T4DNA連接酶將Ω4ACKLTA片段插入到植物表達載體pCAMBIA2301(購自CAMBIA公司，見圖3)的HindIII和EcoRI之間中間載體pC234ACKLTA，在用EcoRI酶切pC234ACKLTA，乙醇沉澱，KlnowI(TAKARA公司)補平，同樣的方法，補平Ω4ACKLTB兩端，10ul體系中T4連接酶補平的兩個片段，構建野生型對照表達載體pC234ACKLTAB(見圖3)，做酶切、PCR、測序鑑定。
2.6農桿菌浸染法轉化百脈根及鑑定2.6.1農桿菌EHA105感受態細胞的製備與轉化1)挑取單菌落EHA105接種於5ml YEB(加利福平100mg/l)液體培養基中，28℃、200r/min振蕩培養過夜；2)取2ml菌液轉入50ml YEB液體培養基中繼續培養至OD600≈0.5；3)轉入無菌離心管，冰浴30min，5000r/min離心5min，去上清液；4)加入2ml 20mM CaCl2重懸菌體；5)每管200ul分裝於無菌Eppendorf管中，於4℃保存；6)取20ug提取純化的重組pC234ANLTAB、pC234ACKLTAB質粒DNA，分別加入200ul感受態細胞中，混勻；7)冰浴5min，轉入液氮冷凍8min，迅速置37℃水浴5min；8)加入800ul YEB液體培養基，28℃，200r/min預表達4-5hr；9)將菌液移至YEB固體選擇培養基(含卡那黴素100mg/l，利福平100mg/l)表面，均勻塗布於整個平板，28℃培養1-2天。
10)挑取轉化後單菌落，接種於5ml含相應抗生素的YEB液體培養基中，28℃培養2天，鹼裂解法小量提取質粒，用酶切或PCR方法鑑定。
2.6.2百脈根的遺傳轉化1)取百脈根種子75％酒精消毒後種在MS0培養基上發芽；2)剪取10日齡的百脈根子葉放在農桿菌菌液(OD600≈0.5)中浸泡5min或用基因槍轟擊；3)用無菌濾紙吸乾植物材料表面的菌液，轉入表面鋪一層濾紙的MS固體基本培養基，28℃暗培養；4)三天後，將材料轉到含有抗生素的分化培養基(MS基本培養基+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中進行培養(25℃，鎢燈3000mol.m-2.s-1，光照周期為16hr光照/8hr黑暗)；5)待抗性芽生長至2～3cm高時，切下小芽轉入生根培養基(MS基本培養基+NAA 0.2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中誘導生根。由於幼苗生根時對卡那黴素非常敏感，此時適當提高Kan的濃度至100-125g/ml，以降低轉化體假陽性出現的頻率，從而減少後續篩選工作量。
2.6.3轉基因百脈根的分子生物學鑑定2.6.3.1轉基因植株的DNA提取1)取2g百脈根葉片，加入液氮充分研磨後，將粉末倒入50ml離心管中；2)待離心管中液氮揮發完全後，加入適量DNA提取Buffer(4ml/g)，充分混勻後(可適當加熱)，室溫下充分抽提10～15min；3)加入0.5倍體積苯酚，抽提5～10min；再加入0.5倍體積氯仿，繼續抽提10～15min；4)3,750rpm，室溫離心20min；5)吸取上清，加入等體積異丙醇，輕柔晃動離心管，使異丙醇與上清液充分混勻，可見白色絮狀DNA；6)將DNA沉澱挑入新的1.5ml離心管中，加入1ml 70％的乙醇，洗滌沉澱；7)沉澱乾燥後加入0.5ml TE(含終濃度50mg/ml的RNaseA)溶解，37℃消化RNA 0.5～1hr；8)等體積苯酚/氯仿、氯仿各抽提一次；9)上清加入1/10倍體積3M NaAc(pH5.2)和2-2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻後，於-20℃放置30min，12,500rpm，4℃離心15min，棄上清；10)70％乙醇洗滌DNA沉澱，乾燥後溶於適量TE或水中；11)取少許DNA，瓊脂糖凝膠上檢查其質量並進行DNA量的標定，其餘DNA樣品保存在-20℃備用。
2.6.3.2Southern雜交鑑定轉基因植株按照《分子克隆》所提供的方法進行Southern雜交，Southern blot結果如圖4。雜交結果說明，本發明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTAB已成功的整合到受體植物百脈根中。
2.6.3.3Nouthern雜交按照《分子克隆》所提供的方法進行Northern雜交，轉基因百脈根Northernblot結果如圖5。Northern雜交說明，本發明大腸桿菌熱敏毒素基因NLTAB已在受體植物百脈根中得到表達。
檢測轉基因植株中蛋白的表達量測定及活性檢測3.1提取轉基因植物中的可溶性蛋白取100mg轉本發明基因和非轉基因植物材料，用液氮研成粉末，加100ul可溶性總蛋白提取液TBSP(10mM Tris-Cl，0.02％NaCl，0.001％PMSF，pH 8.0)，再研磨5min，4℃放置20分鐘後把勻漿倒入離心管中，12000rpm，離心5min，上清即為提取物。
3.2Bradford測定總蛋白含量按照《精編分子生物學實驗指南》所提供的方法進行Bradford法測蛋白含量，結果為轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液，其可溶性總蛋白含量為13ug/ul，轉野生型大腸桿菌熱敏毒素基因pC234ACKLTAB載體的百脈根蛋白提取液，其可溶性總蛋白含量為10ug/ul。
3.3Western blot鑑定轉基因植物中表達的大腸桿菌熱敏毒素3.3.1試劑標準重組LTB蛋白和兔抗CT血清購自sigma，鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG和其他試劑購自promega等公司3.3.2轉基因植株中大腸桿菌熱敏毒素蛋白的檢測按照《分子克隆實驗指南》方法進行，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)積層膠為5％，分離膠為15％，電壓為130V，上樣量為20ul蛋白提取液，設20ul(0.1ug/ul)標準重組LTB設為陽性對照，20ul非轉基因百脈根可溶性總蛋白提取液為陰性對照，20ul轉野生型大腸桿菌熱敏毒素基因pC234ACKLTAB載體的百脈根可溶性總蛋白提取液，20ul轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為樣品電泳，蛋白質低分子質量標準蛋白，電泳結束後立即進行電轉移，條件為30V，90mA，4℃過夜電轉，結束後用麗春紅染色，標出分子質量標準的位置，用5％脫脂奶粉封閉，一抗為sigma提供抗CT的兔血清，800倍稀釋，二抗為鹼性磷酸酶標記的羊抗兔的IgG，2000倍稀釋，BCIP/NBT顯色，照像，結果如圖6。
陽性對照在11.6KD有特異性條帶，轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液、轉野生型對照表達載體pC234ACKLTAB的百脈根蛋白提取液都在29KD、11.6KD有特異性帶，而陰性對照則無特異條帶，說明本發明血凝素蛋白基因已在植株中表達。
3.4ELISA測定轉基因植物中大腸桿菌熱敏毒素的蛋白量設標準LTB為陽性對照，野生型非轉基因百脈根可溶性蛋白提取液為陰性對照，轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為測定樣本1，轉野生型表達載體pC234ACKLTAB的百脈根可溶性蛋白提取液為測定樣本2。
3.4.1試劑標準重組LTB蛋白和兔抗CT血清購自sigma，鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG和其他試劑購自promega等公司1)包被緩衝液(pH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝液)NaCO31.59克、NaHCO32.93克加蒸餾水至1000ml。
2)洗滌緩衝液(pH7.4 PBST)KH2PO40.6克、Na2HPO4·2H2O2.9克、NaCl8.0克、KCl0.2克、Tween-200.05％0.5ml加蒸餾水至1000ml。
3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩衝液至100ml。
4)終止液(2M H2SO4)蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。
5)底物緩衝液(pH5.0磷酸/檸檬酸)2M Na2HPO4(28.4克/L)25.7ml、0.1M檸檬酸(19.2克/L)24.3ml、加蒸餾水50ml。
6)TMB(四甲基聯苯胺)使用液TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml、底物緩衝液(pH5.5)10ml、0.75％H2O232ul。
3.4.2器材1)聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50ul及100ul加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
3.4.3操作步驟1)包被用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10ug/ml，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘(簡稱洗滌，下同)。
2)加樣加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時，然後洗滌，同時做空白孔，陰性對照孔(非轉基因植物的蛋白)及陽性對照孔。
3)加酶標抗體於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1ml，37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4)加底物液顯色於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5)終止反應於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6)結果判定在ELISA檢測儀上，於450nm處，以空白對照孔調零後測各孔OD值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
7)用標準陽性LTB蛋白不同量(mg)稀釋梯度為橫坐標，以450nm OD值為縱坐標，繪製標準曲線，測轉基因陽性百脈根可溶性蛋白提取液進行同樣條件下OD值，計算出大腸桿菌熱敏毒素的含量。
結果見表1表1 轉基因百脈根細織中大腸桿菌熱敏毒素的表達量

注樣本0為陰性對照結果發現，轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白含量佔植物可溶性總蛋白的0.6％，轉對照表達載體pC234ACKLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白含量佔植物可溶性總蛋白的僅為0.01％，本發明基因可在植物中高表達，與野生型基因相比，其表達量提高了近60倍。
3.5GM1-ELISA檢測GM1結合性GM1-神經節苷脂(購自sigma公司)，用GM1、BSA包被，方法參照上。結果如圖7。
結果表明，轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB的百脈根蛋白提取液中大腸桿菌熱敏毒素蛋白有GM1結合活性。
轉基因植物的繁殖和培育篩選出穩定表達大腸桿菌熱敏毒素的轉基因百脈根後，通過常規組織培養方法擴繁，然後將這些幼苗轉入田間繁殖，獲得轉基因百脈根。
轉本發明基因百脈根的免疫佐劑效果試驗5.1實驗動物24隻7周齡BALB/c雌性小鼠，體重16～22g，分為4組，每組6隻(購自北京維通利華實驗動物有限公司)。
5.2試驗材料1)PBS溶液(pH7.2)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，蒸餾水定容1L，調pH值7.2。
2)50ug/30ul牛血清白蛋白(BSA≥99.9％)(購自sigma公司)BSA溶於pH7.2的磷酸緩衝鹽液(PBS)中，4℃，8000g，離心20min，取上清，濾膜過濾，配成50ug/30ul的濃度，-20℃保存備用。
3)含BSA50ug的各種百脈根可溶性總蛋白提取液30ul蛋白提取液中加入BSA50ug，溶解混勻。
5.3試驗方法小鼠24隻，隨機分為4組，每組6隻，以非免疫鼠血清作為0組，30ulPBS經鼻免疫的小鼠組為第1組、30ul含BSA50ug的PBS經鼻免疫的小鼠組為第2組、30ul含BSA50ug加非轉基因百脈根可溶性蛋白提取液經鼻免疫的小鼠組為第3組、30ul含BSA50ug加轉野生型表達載體pC234ACKLTAB百脈根可溶性蛋白提取液經鼻免疫的小鼠組為第4組，30ul含BSA50ug加轉本發明植物表達載體pC234ANLTAB百脈根可溶性蛋白提取液經鼻免疫的小鼠組為第5組，在0、7、14天各經鼻腔免疫小鼠，21天後頸動脈採血，ELISA檢測抗體水平。
ELISA檢測抗體方法用含50ul BSA(30ug/ml)、碳酸鹽50mM，pH9.6的包被緩衝液包被96孔玻板過夜，再用PBS-Tween20清洗緩衝液洗3次，用1％明膠封閉板，清洗後每孔中加入稀釋樣品50ul，室溫溫育過夜，再用清洗緩衝液清洗，加入50ul800倍稀釋的辣根過氧化酶標羊抗鼠IgG抗體(購自sigma公司)，室溫放置2小時，清洗後，50ulTMB-H2O2(購自Bio-rid公司)顯色30min，1MH2SO410ul終止，405nm檢測，試驗結果見圖8。
試驗結果表明，採用本發明轉基因百脈根的可溶性蛋白提取液作為佐劑免疫小鼠，其血清中抗BSA血清IGg顯著升高，證明本發明轉基因植物有增強免疫應答的作用，具有良好的免疫佐劑效果。
序列表110中國農業科學院生物技術研究所，深圳市農科集團公司120編碼大腸桿菌熱敏毒素基因及其表達載體和用途130fm0031602170PatentIn version 3.32101211777212DNA213Artificial220
223artificial4001atgaagaaca tcactttcat cttcttcatc ctcctcgctt ctccactcta cgctaacggt 60gacaagctct acagggctga ttctaggcca ccagatgaga tcaagaggtc tggtggtctc120atgccaaggg gtcataacga gtacttcgat aggggtactc agatgaacat caacctctac180gatcatgcta ggggtactca aactggtttc gtgaggtacg atgatggtta cgtgtctact240tctctctctc tcaggtctgc tcatctcagg ggtcaatcta tcctctctgg ttactctact300tactacatct acgtgatcgc tactgctcca aacatgttca acgtgaacga tgtgctcggt360gtgtactctc cacatccata cgagcaagag gtgtctgctc tcggtggtat cccatactct420cagatctacg gttggtacag ggtgaacttc ggtgtgatcg atgagaggct ccataggaac480agggagtaca gggataggta ctacaggaac ctcaacatcg ctccagctga ggatggttac540aggctcgctg gtttcccacc agatcatcag gcttggaggg aggagccatg gatccatcat600gctccacaag gttgcggtaa ctcttctagg actatcactg gtgatacttg caacgaggag660actcagaacc tctctactat ctacctcagg aagtaccaat ctaaggtgaa gaggcagatc720ttctctgatt accaatctga ggtggacatc tacaacagga tcaggaacga gctctaa 7772102211375212DNA213Artificial220
223artifical4002atgaacaagg tgaagttcta cgtgctcttc accgctctcc tctcttctct ctgcgctcat60ggtgctccac agtctatcac cgagctctgc tctgagtacc ataacaccca gatctacacc 120atcaacgata agatcctctc ttacaccgag tctatggctg gtaagaggga gatggtgatc 180atcaccttca agtctggtgc taccttccag gtggaggtgc caggttctca gcatatcgat 240tctcagaaga aggctatcga gaggatgaag gataccctca ggatcaccta cctcaccgag 300accaagatcg ataagctctg cgtgtggaac aacaagaccc caaactctat cgctgctatc 360tctatggaga aactaa 37權利要求
1.一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因NLTA，其特徵是具有序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一種編碼大腸桿菌熱敏毒素基因NLTB，其特徵是具有序列表中SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
3.包含權利要求1和2所述基因的植物表達載體。
4.按照權利要求3所述的植物表達載體，其特徵是所述的植物表達載體是pC234ANLTAB。
5.權利要求3所述植物表達載體的應用方法，包括如下步驟將權利要求3所述的植物表達載體轉化到受體植物中，獲表達目的基因的轉基因植物。
6.按照權利要求5所述的應用方法，其特徵是所述的植物表達載體是pC234ANLTAB；所述的轉化方法選自農桿菌浸染法、基因槍法、花粉管通道法、脂質體介導法或浸泡轉化法；所述的受體植物選自紅三葉草、白三葉草、苜蓿、大豆、玉米、水稻、菸草、馬鈴薯、百脈根或番茄。
7.按照權利要求6所述的應用方法，其特徵是所述的轉化方法為農桿菌浸染法；所述的受體植物為百脈根。
8.一種免疫佐劑，其特徵是由權利要求5～7任一所述應用方法製備得到的產品。
9.權利要求1所述的基因在製備免疫佐劑中的用途。
10.權利要求2所述的基因在製備免疫佐劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種新的編碼大腸桿菌熱敏毒素的基因NLTAB以及該基因的植物表達載體的構建、轉化及表達。根據人源性大腸桿菌熱敏毒素的胺基酸序列，採用密碼子優化原則設計，人工合成新的編碼大腸桿菌熱敏毒素(A亞單位、B亞單位)的基因－NLTA、NLTB；構建高表達上述基因的重組植物表達載體pC234ANLTAB；獲得高表達大腸桿菌熱敏毒素的轉基因植株；動物試驗證實，轉本發明基因植株能有效加強共免疫抗原的免疫應答反應，具有良好的免疫佐劑效果。
文檔編號C12N15/87GK1861792SQ200510068058
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月9日 優先權日2005年5月9日
發明者吳燕民, 唐益雄, 劉建利, 盧運明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所, 深圳市農科集團公司