一種新的有機磷農藥降解酶及其編碼基因的製作方法

2023-10-17 18:38:59 2

專利名稱：一種新的有機磷農藥降解酶及其編碼基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株對有機磷農藥具有高效廣譜降解能力的細菌菌株——C2-1的分離，並涉及此菌株分泌的有機磷農藥降解酶及其酶學性質研究，以及編碼這種酶的基因的克隆。
背景技術：
有機磷農藥是農藥中的主要類別，佔世界農藥總量的80％[1]，是農業生產必不可少的。但有機磷農藥具有抑制人體乙醯膽鹼酯酶的功能，對人存在著程度不同的毒性。隨著人們生活質量的提高和環保意識的加強，有機磷農藥的殘留毒性問題越來越受到人們的關注。
自1973年Sethunarhan和Yoshida[2]從接觸過有機磷農藥的土壤中分離出第一株有二嗪農和對硫磷降解活性的黃桿菌以來，人們不斷發現一些土壤微生物(細菌、真菌)能夠降解有機磷農藥，這主要是由於它能夠分泌一種酶降解有機磷，同時降解後的產物可作為微生物生長的碳、氮、磷源，為其生長提供營養[3，4，5]。
有機磷通常含有三個磷酯鍵，所以常被稱為磷酸三酯。一般有機磷被分為兩種類型，一是磷通過雙鍵與氧結合(P＝O)，如甲胺磷、氧化樂果、敵敵畏等；另一種是磷通過雙鍵與硫結合(P＝S)，如對硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(樂斯本)等[6]。有研究表明，如果有機磷中的一個磷酸酯鍵被水解將大大降低其毒性，以對硫磷為例，將使其毒性降低100倍[7，8]。因此，破壞有機磷的磷酯鍵是降低有機磷農藥毒性行之有效的方法。
有機磷農藥降解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有機磷農藥分子，破壞有機磷的磷酯鍵而使其脫毒。由於各種有機磷農藥都有類似的結構，只是取代基不同，所以一種有機磷農藥降解酶往往可降解多種有機磷農藥。有機磷農藥降解酶目前已被公認為是消除農藥殘留的最有潛力的新方法[9]。
近年來對於有機磷農藥降解酶的分子生物學研究隨著人們對農藥殘留的認識而不斷深入。DiSioudi等人[10，11]研究了其編碼基因的結構，並進行了分子改造，使其改變了底物特異性，從而能對多種有機磷農藥具有高效的降解效率。同時，人們還將農藥降解酶基因克隆到大腸桿菌中，並使其在細胞表面表達，增加其降解效率[12，13]。
本發明的目的是為了進一步研究這個具有優良酶學性質的有機磷農藥降解酶，並利用基因工程的手段克隆其有機磷農藥降解酶基因，最終將其高效表達，廉價生產有機磷農藥降解酶。

發明內容
本發明提供了一種能有效降解多種有機磷農藥的菌株，並提供該菌株分泌的一種新的有機磷農藥降解酶，以及一種編碼本發明的農藥降解酶的基因。
1.本發明提供一種可降解多種有機磷農藥的菌株C2-1本發明中菌C2-1是採用農藥富集的方法分離得到。主要步驟如下取農藥廠經農藥長期汙染的土樣，在100mL液體Burk無機鹽培養基中，32℃振蕩培養過夜。菌液用無菌水梯度稀釋後分別塗布於加有敵敵畏和甲基對硫磷的Burk無機鹽培養基上，置於32℃培養箱中培養，挑取單菌落，經平板劃線純化。將分離到的單菌落菌株分別接種於分別含有不同有機磷農藥的Burk無機鹽平板上，32℃培養箱培養，進行降解試驗，培養兩天後開始觀察是否有消解圈以及消解圈的大小。對分離出的在農藥平板上有消解圈的菌株所分泌的有機磷農藥降解酶進行酶活性測定，篩選出具有高活性且有廣譜降解農藥特性的菌株。
其中，編號為C2-1的菌在幾種農藥平板上均有消解圈，並且酶活性高，說明其有機磷農藥降解特性最為優良。將篩選到的菌株C2-1轉接於斜面編號保存，送交中國科學院微生物研究所國家菌種保藏檢測中心進行菌種鑑定。經鑑定該菌株屬於假產鹼假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)。並於2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關村，北一條13號)，保藏號為CGMCC1150。
該菌株是一株革蘭氏染色反應陰性菌，菌體呈短杆狀，大小為0.8×1.5-3.0微米，一般有1-3根鞭毛及極毛，無芽孢，氧化酶和接觸酶測定為陽性，其生長嚴格好氧，菌落一般是光滑的。此菌能夠在加有有機磷農藥的無機鹽培養基上生長，降解農藥為其生長提供碳源。
2.本發明提供一種新的有機磷農藥降解酶OPHC2的分離純化及其酶學性質的研究用LB完全培養基大量培養菌體，超聲波破碎細胞，離心，上清用硫酸銨沉澱收集蛋白。將沉澱的蛋白重懸於緩衝液中，經透析濃縮得到粗酶液。通過聚丙烯醯胺(PAGE)非變性膠電泳將粗酶液中的蛋白各組分分離開，在電洗脫儀(Phamasia)上將各蛋白分別洗脫下來，經酶活性測定確定所需蛋白。將確定為農藥降解酶的蛋白洗脫液過夜透析，濃縮，走SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，並初步確定OPHC2的分子量約為35KD。
以純化的農藥降解酶OPHC2為材料，測得其最適反應溫度為65℃。60℃和70℃下此酶相對較穩定，說明此酶有很好的耐熱性；其最適反應pH為9，且在pH6-11的範圍內酶的相對活力均在60％以上，說明其有很寬的pH酶解範圍；在研究不同金屬離子及化學試劑對酶反應的影響時，發現只有SDS影響最大，其他金屬離子及化學試劑對酶的活性影響不大。
3.本發明有機磷農藥降解酶OPHC2的胺基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列的獲得委託奧科生物技術公司對OPHC2酶蛋白進行了N端肽段測序，同時委託軍事醫學科學院儀器測試分析中心對OPHC2蛋白進行了酶解後的內肽測序，得到了4個內肽段的N端序列。根據N端及內肽段的序列設計合成了簡併性引物，通過PCR反應得到了部分編碼基因(786bp)的核苷酸序列，根據得到的序列設計合成了兩對特異性的引物。大量培養C2-1菌，提取質粒DNA，用限制性內切酶消化後連接，以此DNA為模板，進行PCR反應，擴增得到特異DNA條帶，回收後克隆，測序，得到編碼基因全長核苷酸序列(SEQ ID NO1)，同時推出有機磷農藥降解酶OPHC2的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。


圖1C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基對硫磷的Burk無機鹽平板上生長5天所產生的消解圈。
圖2OPHC2純化過程SDS-PAGE電泳圖。
圖3對硝基酚含量測定標準曲線。
圖4溫度對OPHC2酶反應的影響。
圖5OPHC2酶的溫度穩定性。
圖6pH對OPHC2酶反應的影響。
圖7OPHC2酶的pH穩定性。
圖8有機磷農藥降解酶OPHC2胺基酸序列。
圖9有機磷農藥降解酶結構基因ophc2核苷酸序列。
本發明的可降解多種有機磷農藥的菌株C2-1於2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關村，北一條13號)，保藏號為CGMCC 1150。
具體實施例方式
下述實施例是為了更詳細地解釋本發明，但不應理解為本發明局限於此。
一.生化試劑、酶及試劑盒限制性內切酶為寶生物及BioLabs公司產品、連接酶為Promega公司產品、Taq酶為上海生工生物工程公司產品；DNA回收試劑盒購於寶生物工程公司、T載體連接試劑盒購於Promega公司；其他生化試劑均購於Sigma、Promega及北京化學試劑公司。
二、培養基1.Burk無機鹽培養基(g/L)K2HPO4，0.2；KH2PO4，0.8；MgSO4.7H2O，0.2；CaSO4.H2O，0.1；NaMoO4.2H2O，0.003；FeSO4.7H2O，0.005；(NH4)2SO4，1.0；酵母粉0.5；pH7.2，121℃滅菌20分鐘，固體培養基加入1.5％瓊脂。2.LB完全培養基(g/L)NaCl，10；蛋白腖；10；酵母粉，5。
三.蛋白及DNA測序、引物合成委託北京奧科生物技術公司對OPHC2進行了蛋白N端測序；委託軍事醫學科學院儀器測試分析中心進行蛋白酶解後的內肽測序；委託上海基康生物技術有限公司進行DNA測序；委託北京奧科生物技術公司合成所有實驗用的引物。
實施例1本實施例說明篩選可降解多種有機磷農藥的天然菌株C2-1的篩選過程，其主要步驟如下1.取土樣0.5g在100mL Burk無機鹽液體培養基中，32℃振蕩培養過夜。
2.菌液用無菌水梯度稀釋，稀釋倍數為10、102、103、104、105、106，分別塗布於加有0.2mg/mL敵敵畏(純品)和0.2mg/mL甲基對硫磷(純品)的Burk無機鹽固體培養基平板上，置於32℃培養箱中培養，挑取單菌落，經平板劃線純化。
3.將分離到的單菌落菌株分別接種於分別含有有機磷農藥甲基對硫磷(0.05％)、對硫磷(0.05％)、甲胺磷(0.05％)、氧化樂果(0.05％)、辛硫磷(0.05％)(均為v/v)(上述農藥均購自中國國家農藥質量監督檢驗中心)的Burk無機鹽五種平板上，32℃溫箱培養，進行消解試驗，培養兩天後開始觀察是否有消解圈以及消解圈的大小。
4.選取在5種農藥平板上均有消解圈的菌株，接種於5mL LB完全液體培養基上，32℃振蕩培養過夜，收集菌體，懸於50mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH9.0)中，超聲波破碎菌體，15,000rpm離心5分鐘去細胞殘渣，上清液用來進行酶活性測定。酶活性測定方法取100μL待測酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基對硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)緩衝液的體系中，37℃保溫10分鐘，加入1mL 10％三氯乙酸終止反應，再加入1mL 10％Na2CO3溶液顯色，410nm測定OD值，計算水解產物對硝基酚的含量和酶的活性。一個酶的活性單位(U)定義為在37℃，每分鐘釋放出1μmol對硝基酚所需酶量為一個酶活性單位。其中C2-1菌所產生的農藥降解酶活性最高，將其保存，送交中國科學院微生物研究所進行菌種鑑定，並於2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關村，北一條13號)，保藏號為CGMCC1150。圖1為C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基對硫磷的Burk無機鹽平板上生長5天所產生的消解圈。
實施例2本實驗說明有機磷農藥降解酶OPHC2的純化過程，其主要步驟如下1.農藥降解酶(OPHC2)粗酶液的提取用1000mL LB完全培養基大量培養C2-1菌體細胞，32℃振蕩培養過夜，5000rpm離心10分鐘，棄上清，並將菌體重懸浮於100mL含有0.1mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)緩衝液中，用超聲波破碎儀(美國Branson公司)破碎細胞，12,000rpm離心20分鐘，收集上清，用飽和度為20％-90％的硫酸銨沉澱蛋白。沉澱重新懸浮於20mL 50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl緩衝液中，並透析脫鹽、濃縮，得到OPHC2粗酶液。
2.OPHC2的分離和純化通過聚丙烯醯胺(PAGE)非變性膠電泳(凝膠的濃度15％)，將粗酶液中的蛋白各組分分離開，取邊上的一條電泳道的膠染色，以此作為對照切下對應的未染色蛋白帶，在電洗脫儀(Phamasia)上將各蛋白分別洗脫下來，經酶活性測定確定所需蛋白。PAGE電泳後，有三條較明顯的蛋白帶，將它們分別切下來，在電洗脫儀上洗脫下來，經酶活性測定位於中間的條帶的蛋白是我們所需要的目的蛋白。將含有目的蛋白的洗脫液透析，濃縮，走SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，並初步確定OPHC2的分子量約為35KD。圖2所示OPHC2純化過程SDS-PAGE電泳圖。
實施例3本實施例說明有關農藥降解酶OPHC2酶學性質的研究，其主要步驟如下1.有機磷降解酶酶活性測定方法有機磷降解酶可將甲基對硫磷等摩爾的分解為二乙基硫代磷酸酯和黃色的對硝基酚，通過測定產物對硝基酚的量即可測定酶的活性。
對硝基酚的含量測定及標準曲線製作步驟如下秤取0.08346g對硝基酚，先用少量95％乙醇溶解，然後用水定容至100mL，濃度為6mmol/L。按下表分別加入不同量的對硝基酚溶液和50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)緩衝液，總體積為1mL，然後每管加入1mL10％三氯乙酸，再加入1mL 10％Na2CO3溶液，總體積為3mL，410nm測定光吸收值。同時，繪製對硝基酚含量測定標準曲線(圖3)。
表1標準曲線的繪製

根據有機磷降解酶酶活性標準曲線，得出有機磷降解酶酶活單位計算公式 其中3×10-3反應總體積(L)；N酶液的稀釋倍數；10①將100μL稀釋酶液中的酶活性折算為1mL的酶活性；10②反應時間。
取100μL待測酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基對硫磷和900μL50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)緩衝液的體系中，37℃保溫10分鐘，加入1mL10％三氯乙酸終止反應，再加入1mL 10％Na2CO3溶液顯色，410nm測定OD值，計算水解產物對硝基酚的含量和酶的活性。一個酶的活性單位(U)定義為在37℃，每分鐘釋放出1μmol對硝基酚所需酶量。
2.OPHC2酶反應最適溫度及熱穩定性研究以純化的農藥降解酶OPHC2為材料，在不同溫度下進行酶促反應後，如上所述測定其酶活性，得到其最適反應溫度；在60℃和70℃下分別處理酶液，處理時間為2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘，處理後在37℃下測酶活性，以確定其熱穩定性。結果表明，其最適反應溫度為65℃。溫度在低於65℃時，隨著溫度升高酶活性逐步上升，但在20℃時相對酶活仍有25.87％。高於65℃酶活力迅速下降，到80℃只有最大活力的7.7％(見圖4)。圖5為OPHC2的熱穩定性曲線，60℃此酶很穩定，保溫30分鐘後，其相對酶活有85.6％；70℃下保溫30分鐘，其酶活性有所下降，但相對酶活仍有近40％，說明此酶有很好的耐熱性。
3.OPHC2酶反應的最適pH及pH穩定性以純化的農藥降解酶OPHC2為材料，在不同的pH下如上所述進行酶促反應，測定了其最適pH；將酶液在不同pH的緩衝液中於37℃保溫30分鐘後，測酶活性以確定其pH穩定性；測定結果表明，其最適反應pH為9，但在pH6-11的範圍內，酶的相對活力均在60％以上，說明其有很寬的pH酶解範圍，見圖6。在不同pH下保溫30分鐘後，酶的相對活力影響不大，即使是pH5其相對酶活也達到72.53％，且在鹼性條件下更加穩定，見圖7。
4.不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶反應的影響以純化的農藥降解酶OPHC2為材料，在酶促反應體系中分別加入不同金屬離子及化學試劑，各種化合物的終濃度為1mmol/L，如上所述測酶活性，以研究不同金屬離子及化學試劑對酶反應的影響。表2所示不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶反應的影響。其中SDS影響最大，為OPHC2酶的強烈變性劑；Cu2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+對OPHC2酶活性有輕微的影響，其他的金屬離子及化學試劑對其影響不大或有的有促進作用。
表2不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶解反應的影響

實施例4本實施例說明有機磷農藥降解酶OPHC2的部分胺基酸序列測定。
將純化的蛋白走SDS-PAGE電泳，通過電轉儀(Phamacia公司)將膠上的蛋白轉至PVDF膜(購於美國Millipore公司)上，委託北京奧科生物技術公司對OPHC2進行成熟蛋白N端測序。同時，將純化的OPHC2酶蛋白走SDS-PAGE電泳，電泳後按常規固定、染色，電泳膠交給軍事醫學科學院儀器測試分析中心進行酶解後的內肽測序。奧科生物技術公司測試分析得出的成熟蛋白N端胺基酸序列為AAPAQQKTQVPGYYR(SEQ ID NO3)。軍事醫學科學院儀器測試分析中心對OPHC2蛋白進行了膠內酶解，得到了4個內肽段的N端胺基酸序列，分別為APEGMQGMFK(SEQ ID NO4)；GIDDKDLQSLLAR(SEQ ID NO5)；ILAEAATDK(SEQ ID NO6)；MAQQAVAPYAK(SEQ ID NO7)。
實施例5本實施例說明農藥降解酶OPHC2編碼基因ophc2全序列的獲得，其主要步驟如下1.首先進行質粒消除實驗，以確定有機磷農藥降解酶基因是在C2-1菌的染色體上還是在質粒上。將菌株接種於LB液體培養基中，32℃振蕩培養過夜，按10％接種量轉接於含有1.5μg/mL絲裂黴素C的LB培養基中培養36小時，用LB培養基稀釋菌液，稀釋倍數為10、102、103、104、105，分別塗布於LB平板上，32℃溫箱培養至菌落出現。挑取單菌落培養後進行農藥降解酶酶活性測定。結果表明，質粒消除後檢測不到酶活性，說明有機磷農藥降解酶基因是位於質粒上。
2.根據成熟蛋白N端胺基酸序列設計合成了5』端簡併性引物5』CA(A/G)GT(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)TA(T/C)TA(T/C)(C/A)G3』(SEQ ID NO8)；並根據內肽段的N端胺基酸序列設計合成4個3』端簡併性引物，分別是722-3』5』(T/C)TG(A/G/C/T)A(A/G)(A/G)TC(C/T)TG(A/G)TC(A/G)TC 3』(SEQ IDNO9)548-3』5』AACAT(A/G/C/T)CC(T/C)TGCAT(A/G/C/T)CC(T/C)TC 3』(SEQ ID NO10)589-3』5』GC(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)GC(T/C)TG(T/C)TT(A/G/T/C)GCCAT3』(SEQID NO11)466-3』5』TT(G/A)TC(A/G/C/T)GT(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GC(T/C)TC(A/G/C/T)GC3』(SEQ ID NO12)3.攜帶有機磷農藥降解酶基因的質粒的提取用LB液體培養基5mL培養C2-1菌，離心收集菌體，將細菌沉澱懸於350μL STET(NaCl0.1mol/L，Tris HCl 10mmol/L(pH8.0)，EDTA 1mmol/L(pH8.0)，Triton X-1005％)溶液中，加入25μL新配製的溶菌酶溶液(10mg/mL，用pH8.010mmol/L Tris HCl配製)，振蕩混均。將離心管放到沸水浴中煮沸45秒，15,000rpm離心10分鐘後，挑出沉澱，上清中加入40μL 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420μL異丙醇，振蕩混均後，室溫放置5分鐘。15000rpm離心5分鐘，棄上清，沉澱抽乾水分後，溶於400μL TE緩衝液中，依次用酚、酚-氯仿、氯仿抽提，去雜蛋白，乙醇沉澱後溶於雙蒸水備用。
4.以5』端簡併性引物和4個3』端簡併性引物分別配對，以質粒DNA為模板，分別PCR，PCR反應條件為94℃5分鐘；94℃45sec，55℃45sec，72℃1分鐘，30個循環；72℃10分鐘。分別得到4條特異性的條帶，一條為100bp左右，兩條為500bp左右，一條為750bp左右。克隆到T載體上後，測序。測序結果顯示，由5』端簡併性引物和466-3』端引物擴增出來的片段為762bp，其他片段均為其中的一部分。在這762bp的片段中，發現位於412bp處有一個單一EcoRI酶切位點，位於455bp處有一個單一SphI酶切位點。根據EcoRI酶切位點前已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物Q15』CCGAGTGCCATACGGTAGTA 3』(SEQ ID NO13)Q25』AACGCGACCGTGGAGGTG 3』(SEQ ID NO14)
同樣，根據SphI酶切位點後已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物H15』TTGCGCCATCTTGAACATGC 3』(SEQ ID NO15)H25』CAGGCAGTCGCACCCTATGC 3』(SEQ ID NO16)用EcoRI、SphI分別酶切質粒DNA，酶切後連接使其環化，以這兩個DNA分別為模板，分別用以上兩對引物進行PCR擴增(PCR反應條件同上)。其中以SphI酶切的為模板，Q1和Q2為引物擴增出600bp左右的片段，得到的是酶的前段編碼基因；其中以EcoRI酶切的為模板，H1和H2為引物擴增出500bp左右的片段，得到的是酶的後段編碼基因。將這兩段克隆到T載體上後，測序後，即可拼接出完整的基因序列。再根據此完整序列設計基因兩端引物ophc2-5』5』ATGCGTCTTTTCTCGCTGAGC 3』(SEQ ID NO17)ophc2-3』5』TCAGCGGTCGCTACGGATCGG 3』(SEQ ID NO18)以質粒DNA為模板，進行PCR擴增反應(反應條件同上)，得到了完整的有機磷農藥降解酶基因ophc2。經測序驗證，與拼接出的完整基因序列完全一樣。
得到的有機磷農藥降解酶結構基因ophc2全長975個核苷酸，編碼324個胺基酸。有機磷農藥降解酶的胺基酸序列見圖8，其編碼基因的核苷酸序列見圖9。根據信號肽序列的結構規則及成熟N端胺基酸序列測定結果，N端24個胺基酸為信號肽。信號肽的切割位點在+24位的Ala之後。此基因與到目前為止報導過的6個有機磷農藥降解酶基因的最高同源性僅有46％，見表3。
表3 ophc2與已報導的有機磷農藥降解酶的同源性比較


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SEQUENCE LISTING110中國農業科學院生物技術研究所中國農業科學院飼料研究所120一種新的有機磷農藥降解酶及其編碼基因130I04031016018170PatentIn version 3.12101211975212DNA213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)4001atgcgtcttt tctcgctgag caccgcattg tcgtccgcca tgatcgccct ggtcagcctg 60ccgctgcagg cggccgcacc ggcacaacag aagacccagg taccgggcta ctaccgtatg120gcactcggtg acttcgaagt caccgctctg tatgacggct acgtcgacct gcctgccagc180ctgctcaagg gcatcgatga caaggacctg caatcgctgc tggctcgcat gttcgtggcg240
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Leu Val Ser Leu Pro Leu Gln Ala Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr20 25 30Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met Ala Leu Gly Asp Phe Glu Val Thr35 40 45Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Val Asp Leu Pro Ala Ser Leu Leu Lys Gly50 55 60Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg Met Phe Val Ala65 70 75 80Ser Glu Lys Gly Val Gln Thr Ala Val Asn Ala Tyr Leu Ile Asn Thr85 90 95Gly Asp Asn Leu Val Leu Ile Asp Thr Gly Ala Ala Gln Cys Phe Gly100 105 110Pro Thr Leu Gly Val Val Gln Thr Asn Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Gln115 120 125Pro Glu Gln Val Asp Thr Val Leu Leu Thr His Leu His Pro Asp His130 135 140Ala Cys Gly Leu Val Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Pro Asn Ala145 150 155 160Thr Val Glu Val Pro Gln Ala Glu Ala Glu Phe Trp Leu Asp Glu Ala165 170 175Thr Met Ala Lys Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys Met Ala180 185 190
Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys Met Asn Lys Leu Lys Pro Tyr195 200 205Lys Thr Glu Gly Glu Leu Leu Pro Gly Val Ser Leu Val Ala Ser Pro210 215 220Gly His Thr Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Phe Lys Ser Gly Gly Gln225 230 235 240Ser Leu Leu Val Trp Gly Asp Ile Leu Leu Asn His Ala Val Gln Phe245 250 255Ala Lys Pro Glu Val Val Phe Glu Phe Asp Val Asp Ser Asp Gln Ala260 265 270Arg Gln Ser Arg Gln Arg Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys Leu275 280 285Trp Val Ala Gly Ala His Leu Pro Phe Pro Gly Leu Gly His Val Arg290 295 300Lys Glu Ala Gln Gly Tyr Ala Trp Val Pro Val Glu Phe Ser Pro Ile305 310 315 320Arg Ser Asp Arg210321115212PRT213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)
4003Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg1 5 10 15210421110212PRT213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)4004Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys1 5 10210521113212PRT213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)4005Gly Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg1 5 1021062119
212PRT213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)4006Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys1 5210721111212PRT213假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)4007Met Ala Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys1 5 10210821120212DNA213人工合成220
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2101521120212DNA213人工合成40015ttgcgccatc ttgaacatgc 202101621120212DNA213人工合成40016caggcagtcg caccctatgc 202101721121212DNA213人工合成40017atgcgtcttt tctcgctgag c21
2101821121212DNA213人工合成40018tcagcggtcg ctacggatcg g21151權利要求
1.一種有機磷農藥降解酶，其特徵在於，具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述有機磷農藥降解酶的基因，其特徵在於，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的有機磷農藥降解酶在製備用於消除有機磷農藥殘留的產品中的應用。
4.一種篩選具有有機磷農藥降解酶特性的菌株的方法，其包括1)取經農藥長期汙染的土樣，並於液體培養基中過夜預培養；2)稀釋預培養的菌液，並在含敵敵畏和甲基對硫磷的固體培養基上分離單菌落；3)將分離的單菌落在分別含甲基對硫磷，對硫磷，甲胺磷，氧化樂果，辛硫磷的5種固體培養基上進行消解試驗；4)測定在上述5種固體培養基上均有消解圈的菌株的酶活性；5)對具有最高農藥降解酶活性的菌株進行菌種鑑定。
5.權利要求4的方法，其特徵在於，所述培養基是Burk無機鹽培養基，其基本組分為0.2g/L K2HPO4；0.8g/L KH2PO4；0.2g/LMgSO4.7H2O；0.1g/L CaSO4.H2O；0.003g/L NaMoO4.2H2O；0.005g/LFeSO4.7H2O；1.0g/L(NH4)2SO4和0.5g/L酵母粉；pH7.2。
6.權利要求4的方法，其特徵在於，所述菌株的培養溫度是32℃。
7.權利要求4的方法，其特徵在於所述酶活性的測定是在含甲基對硫磷的Tris-HCl緩衝體系中在37℃的溫度下進行。
8.權利要求4的方法，其特徵在於，所述敵敵畏和甲基對硫磷的含量為0.2mg/mL。
9.權利要求4的方法，其特徵在於，所述甲基對硫磷，對硫磷，甲胺磷，氧化樂果，辛硫磷的含量為0.05％(v/v)。
全文摘要
本發明提供了一株對有機磷農藥具有高效廣譜降解能力的細菌菌株，此菌株屬於假產鹼假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，我們將其命名為C2－1，還提供了該菌株的分離過程、培養條件和降解特性，它可利用農藥在無機鹽培養基上生長。同時提供了該菌株分泌的有機磷農藥降解酶的分離和純化及其酶學性質的研究，以及編碼它的基因的分離和克隆。它將為我們利用基因工程手段克隆有機磷農藥降解酶基因提供很好的基因源，最終達到廉價生產有機磷農藥降解酶的目的。
文檔編號C12N9/00GK1644687SQ20041008015
公開日2005年7月27日 申請日期2004年9月24日 優先權日2003年11月3日
發明者伍寧豐, 姚斌, 史秀雲, 範雲六, 鄧敏捷 申請人:中國農業科學院生物技術研究所, 中國農業科學院飼料研究所