用作IL-Iβ蛋白酶抑制劑的滷甲基醯胺的製作方法

2023-10-11 11:20:04

專利名稱：用作IL-Iβ蛋白酶抑制劑的滷甲基醯胺的製作方法
技術領域：
本發明的背景發明領域本發明涉及一系列新的非肽物質，這些非肽物質在體外和在體內選擇性表現出對白細胞介素-1β轉化酶的抑制作用，本發明還涉及含有該新非肽物質的組合物及其用於治療應用的方法。特別是，本發明所述的白細胞介素1β轉化酶抑制劑含有新的α-滷甲基醯胺和α-滷甲基磺醯胺，其對於治療肺、中樞神經系統和結締組織的炎症和免疫疾病具有特殊應用。已報導的進展白細胞介素-1β(IL-1β)蛋白酶(也稱作白細胞介素-1β轉化酶或ICE)是負責使無生物活性的31KD前體-IL-1β轉化為有生物活性的17KD形式的酶(Kostura，M.J.；Tocci，M.J.；Limjuco，G.；Chin，J.；Cameron，P.；Hillman，A.G.；Chartrain，N.A.；Schmidt，J.A.Proc.Nat.Acad.Sci..(1989)，86，5227-5231和Black，R.A.；Kronheim，S.R.；Sleath，P.R.，FEBS Let.，(1989)，247，386-391)。除了用作機體對損傷和感染的一種早期反應之外，IL-1β還被認為是多種疾病的介質，這些疾病包括類風溼性關節炎、骨關節炎、膿毒病、急慢性骨髓白血病和骨質疏鬆(Dinarello，C.A.；Wolff，S.M.，New Engl.J.Med.(1993)，328，106)。一種天然產生的IL-1β受體拮抗劑已用來說明了IL-1β在許多人類疾病和動物模型中的介質作用(Hannum，C.H.；Wilcox，C.J.；Arend W.P.；Joslin，G.G.；Dripps，D.J.；Heimdal，P.L.；Armes，L.G.；Sommer，A.；Eisenberg，S.P.；Thompson，R.C.，Nature，(1990)，343，336-340；Eisenberg，S.P.；Evans，R.J.；Arend，W.P.；Verderber，E.；Brewer，M.T.；Hannum，C.H.；Thompson，R.C.，Nature(1990)，343，341-346；Ohlsson，K.；Bjork，P.；Bergenfeldt，M.；Hageman，R.；Thompson，R.C.，Nature，(1990)，348，550-552；Wakabayashi，G.，FASEB，(1991)，338-343；Pacifici，R.；等人Proc.Natl.Acad.Sci(1989)，86，2398-2402和Yamamoto，I，；等人Cancer Rsh(1989)，49，4242-4246)。最近觀察(牛痘使用ICE抑制劑來抑制其宿主的炎症反應)可證明IL-1β在炎症和免疫調節作用中的特殊作用(Ray，C.A.等人，Cell，(1992)，69，597-604)。
總之，本領域的一些工作人員通過體內試驗提出並說明了ICE在改善某些IL-1介導的病症中的應用。以下通過目前本領域對ICE的研究的回顧來進一步說明ICE抑制劑的應用1)1993年5月11日公開的WO 9309135提出肽基天冬氨酸芳醯氧基和芳氧甲基丙酮是體內有效的ICE抑制劑。這些化合物還能特別抑制(體內)完整細胞中的ICE，因為其具有抑制完整細胞中成熟IL-1β形成的能力。這些ICE抑制劑也可用於減少鼠的發熱和炎症/腫脹。2)感染色病的患者有時發展成感染色關節炎、B.burgdorferi-感染色病的引發劑，是IL-1由單核細胞合成的有效誘發劑。Miller等人(Miller，L.C.；Lynch，E.A.Isa，S.；Logan，J.W.；Dinarello，C.A.；和Steere，A.C.，「Balance of synovial fluid IL-1β and IL-1 Receptor Antagonist andRecovery from Lyme Arthritis」，Lancet(1993)341；146-148)指出對於迅速痊癒的感染色病患者，IL-1-β和IL-1ra的滑液平衡有利於IL-ra。當該平衡轉換為有利於IL-1β時，疾病消除的時間明顯加長。結論是過量的IL-1ra可阻斷所研究患者中IL-1β的作用。3)IL-1存在於人體潰瘍性結腸炎的感染組織中。在該疾病的動物模型中，IL-1β水平與疾病的嚴重程度有關。在該模型中，施用IL-1ra減少了結腸的組織壞死和發炎細胞的數目。見Cominelli，F.；Nast，C.C.；Clark，B.D.；Schindler，R.，Llerena，R.；Eysselein，V.E.；Thompson，R.C.；和Dinarello，C.A.；「Interleukin-1Gene Expression，Synthesis，and Effect of Specific IL-1 Receptor Blockadein Rabbit Immune Complex Colitis」J.Clin.Investigations(1990)86卷972-980頁。4)在鼠關節炎PG-APS模型中，IL-1ra抑制關節腫脹。見Schwab，J.H.；Anderle，S.K.；Brown，R.R.；Dalldorf，F.G.和Thompson，R.C.，「Pro-and Anti-inflammatory Roles of Interelukin-1 in Recurrence ofBacterial Cell Wall-Induced Arthritis in Rats」。Infect.Immun.(1991)59；4436-4442。5)在小型開放性標記的人體類風溼性關節炎試驗中，IL-1ra顯示其有效。見Lebsack，M，E.；Paul，C.C.；Bloedow，C.C.；Burch，F.X.；Sack；M.A.；Chase，W.，和Catalano.M.A.「Subcutaneous IL-1 ReceptorAntagonist in Patients with Rheumatoid Arthritis」，Arth.Rheum.(1991)34；545。6)IL-1可認為是慢性骨髓白血病細胞增生的自分泌生長因子。IL-1ra和SIL-1R能抑制從白血病患者體內取出的細胞中菌落的生長。見Estrov，Z.；Kurzrock，R.；Wetzler，M.；Kantarjian，H.；Blake，M.；Harris，D.；Gutterman，J.U.；和Talpaz，M.，「Supression of Chronic MyelogenousLeukemia Colony Growth by Interleukin-l(IL-1)Receptor Antagonist andSoluble IL-1 Receptorsa Novel Application for Inhibitors of IL-1Activity」。Blood(1991)78；1476-1484。7)如上述6)所述，但不是用於慢性骨髓白血病而是用於急性骨髓白血病。見Estrov，Z.；Kurzrock，R.；Estey，E.；Wetzler，M.；Ferrajoli，A.；Harris，D；Blake，M.；Guttermann，J.U；和Talpaz，M.「Inhibition of AcuteMyelogenous Leukemia Blast Proliferation by Interleukin-l(IL-1)ReceptorAntagonist and Soluble IL-1 Receptors」。(1992)Blood 79；1938-1945。
用於治療IL-1β介導的炎症的有效療法應在商業上充分發展。因此需要有效治療和預防這些疾病的治療劑。發明概述本發明提供一種式(A)的化合物或其可藥用鹽 其中Y＝CO或SO2；R1＝彼此獨立地選自烷基、滷代烷基和烷氧基烷基；R2＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、羧基烷基、氰基烷基、芳基、雜芳基；和R3＝H、烷基、(CH2)-鏈烷基、芳烷基、雜芳烷基、芳基、雜芳基；「烷基」是指直鏈或支鏈的飽和脂肪烴。優選不多於12個碳原子的基團，可以是甲基、乙基和丙基、丁基直到十二烷基等的異構體。「滷代烷基」是指被一個或多個滷素(F、Cl、Br、I)取代的烷基基團。例如氯甲基、二氯甲基、氟甲基、二氟甲基、氟氯甲基。「烷氧基烷基」是指被烷氧基取代的烷基基團。例如甲氧甲基。「芳基」是指被取代的或未被取代的苯環或萘環，其中環上的一個或多個氫原子可被相同或不同的取代基取代，這些取代基包括滷素、烷基、芳基、硝基、氰基、氨基、烷醯氨基、羥基、烷氧基、滷代烷基。「滷素」指碘、溴、氯、氟。「羧基烷基」是指被羧基取代的烷基。例如羧甲基。「芳烷基」是指被芳環取代的烷基基團。例如苄基、4-氯苄基。「雜芳基」是指吡啶基、噻吩基或呋喃基及其異構體。「雜芳烷基」是指被雜環取代的烷基基團。例如2-噻吩基乙基。「鏈烯基」是指含有一個或多個不飽和部分的烷基。例如乙烯基、乙炔基、1-丁烯基、2-丁炔基、1，3-己二烯基。「氰基烷基」是指被氰基取代的烷基。例如氰乙基。
本發明也涉及藥物組合物和對需要治療的哺乳動物所患IL-1β蛋白酶介導的疾病的治療方法，該方法包括施用作為活性成分的式(A)IL-1β蛋白酶抑制劑。這些病症或疾病包括傳染病如腦膜炎和輸卵管炎；敗血性休克、呼吸疾病；炎症如關節炎、膽管炎、結腸炎、腦炎、endocerolitis、肝炎、胰腺炎、再灌注損傷、免疫疾病如過敏；自身免疫疾病如多發性硬化；骨疾病；以及某些腫瘤和白血病。
本發明在調節IL-1β治療類風溼性關節炎過程中有特殊的應用。已知在患有上述疾病的患者滑液中IL-1β的水平會升高。另外，向動物體進行關節內注射後，IL-1β會激發被認為與炎症有關的酶(如膠原酶和PLA2)的合成，造成與類風溼性關節炎類似的關節損傷。
在實施本發明時，向需要或希望治療的患者施用有效量的本發明的化合物或其藥物組合物。根據特殊的目的用途，這些化合物或組合物可經不同的途徑給藥，包括經口服、非腸道(包括皮下、關節間、肌內和靜脈內給藥)、直腸、頰(包括舌下)、透皮或鼻內的途徑給藥。列舉情況中最適用的途徑應根據用途、特殊的活性成分和有關患者的情況而定。該化合物或組合物也可經控釋、貯存植入物或注射劑等(在下文充分說明)方式施用。
本發明中所採用的活性成分用於人類治療時通常適宜的給藥量為每kg體重約0.1-100mg，最優選每kg體重約0.1-30mg，該活性成分給藥優選為每日約0.1到20-50mg/kg。可經一次給藥，或多次給藥或經緩釋給藥以達到最為有效的結果。當以單獨劑量給藥時，優選的給藥範圍約0.1mg/kg至約10mg/kg。
這些化合物和組合物的確切給藥劑量和給藥方案需根據所治療患者個人的需要、治療類型及疾病的程度而定。通常非腸道給藥的劑量低於其它更多依賴於吸收的給藥方法。
本發明的另一方面涉及藥物組合物，該組合物含有作為活性成分的本發明的化合物，及可藥用的無毒載體。如上所述，該組合物可被製備成用於非腸道(皮下、關節內、肌內或靜脈內)給藥的形式，特別是溶液劑或混懸劑的形式；用於口服或頰部給藥的形式，特別是片劑或膠囊的形式；或用於鼻內給藥的形式，特別是粉劑、滴鼻劑或氣霧劑。
當該化合物經口服(或直腸)給藥時，通常製成單元劑型，如片劑、膠囊、拴劑或扁囊劑。這些組合物一般包含固體、半固體或液體載體或稀釋劑。典型的稀釋劑和載體是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、；澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、礦物油、可可脂、可可油、agmates、黃蓍膠、明膠、糖漿、甲基纖維素、單月桂酸聚氧乙烯脫水山梨醇酯、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石和硬脂酸鎂。
該組合物可採用製藥領域所熟知的方法進行製備，例如Remington’sPharmaceutical Sciences第17版Mack Publishing Company，Easton，PA，1985中所述的方法。用於非腸道給藥的組合物可含有作為常規賦形劑的滅菌水或鹽水、鏈烯基、二醇如丙二醇、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、天然植物油、氫化萘等。用於非腸道給藥的載體的實例包括水、含水載體如鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液以及無水載體如非揮發性油(如玉米油、油棉籽油、花生油和芝麻油)、油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。滅菌鹽水為優選的載體並且該化合物應是充分水溶性的從而可製成能達到預先要求的溶液。該載體可含有少量添加劑如增加溶解度、等滲和化學穩定性的物質，例如抗氧劑、緩衝溶液和防腐劑。用於口服給藥時，配方中還可加入膽汁鹽和乙醯肉鹼(Am.J.Physiol.251332(1986))。鼻內給藥的組合物可為固體並含有例如乳糖或葡萄糖等賦形劑，或者為適用於滴鼻劑或定量噴霧劑形式的水或油溶液。用於頰部給藥的典型賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預膠化澱粉等。
當製成用於鼻內給藥的形式時，採用表面活性酸來增強其經鼻黏膜的吸收，例如甘氨膽酸、膽酸、牛磺膽酸、乙氧膽酸(ethocholic acid)、脫氧膽酸、鵝膽酸、脫氫膽酸、脫氧甘氨膽酸(glycodeoxy-cholic acid)等(見B.H.Vickery，「LHRH及其類似物的避孕和治療用途」，Pt.2，B.H.Vickery和J.S.Nester，Eds.，MTP Piess，Lancaster，UK，1987)。本發明的詳述本發明的化合物是採用下述方案經普通的合成方法製備的。
方案1中，所需胺(式I)可經商業購得或者經醛(式2)和胺(式3)的還原性胺化製備而成，然後用適當的酸或磺醯氯進行醯化或磺化，從而得到式4類型的化合物。
或者(如方案II)，將醯化的胺(式5)直接烷基化從而得到不同的式6類型的N，N-二取代醯胺。採用叔丁氧化鉀作鹼並採用四氫呋喃作為溶劑可使烷基化反應進行得更為滿意。
製備醯氯，磺醯氯、還原性胺化和胺的烷基化的方法都是現有技術中熟知的。見「高等有機化學」，J.March，eds.McGraw-Hill Book Co.，第2版，1977。
方案I 方案II 實施例1N-烯丙基-N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺(2)的製備。 A部分在1g置於6ml 1，2-二氯乙烷中的2，4-二氯甲苯中順序加入428μl烯丙基胺，280μl乙酸和1.8g NaBH(OAc)3。30分鐘後，用氯仿和飽和NaHCO3水溶液稀釋該反應混合物。分層、用MgSO4乾燥有機層，並經真空濃縮得到無色油。經閃式色譜法(15％乙酸乙酯-己烷)得到476mg(38％)無色油狀物1。B部分將476mg 1溶於5ml二氯甲烷中，並加入306μl三乙胺。反應混合物冷卻至0℃並加入175μl氯乙醯氯，將該混合物攪拌2小時。然後將反應物用氯仿稀釋並用水洗2次。用MgSO4乾燥合併的有機層，並經真空濃縮得到白色固體。經閃式色譜法(15％乙酸乙酯-己烷)得到500mg白色固狀的2低分辨質譜分析m/z(相對強度)292(M+H；100)，256(76)，174(12)，159(34)，146(5)實施例2N-苄基-N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺(4)的製備。 A部分將100g 2，4-二氯苄胺溶於600mlCH2Cl2中，並將該反應混合物冷卻至0℃。然後加入89ml三乙胺，再滴加50ml氯乙醯氯。將該反應混合物攪拌24小時。然後水洗2次，用MgSO4乾燥，並經真空濃縮得到固體，用10％己烷-乙酸乙酯研製成131g(97％)純白固狀的3。B部分將500mg 3溶於2ml THF中，並加入2mL(10當量濃度)苄基溴。然後向反應混合物中滴加入276mg叔丁氧鉀的7mL THF溶液，然後攪拌30分鐘，最後真空濃縮。將所得剩餘物溶於氯仿中，並用水洗2次，用MgSO4乾燥並經真空濃縮得到黃色油。經閃式色譜法(15％乙酸乙酯-己烷)得到500mg(73％)的白色固狀的4。低分辨質譜分析m/z(相對強度)356(M+H；11)，196(4)，91(100)採用實施例1和2所述的方法還可製備下列物質實施例3N-(2，4-二氯苄基)N-甲基氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)266(M+H；16)232(53)，214(19)，188(100)，173(16)。
實施例4N-苄基-N-(3-氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)308(M+H；36)，216(5)，182(17)，106(15)，91(100)。
實施例5N-苄基-N-(2，5-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)342(M+H；58)，306(15)，182(32)，106(23)，91(100)。
實施例6N-(4-氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)308(M+H；22)，274(13)，230(11)，125(90)，91(100)。
實施例7N-苄基-N-(3，4-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)342(M+H；20)，106(20)，91(100)。
實施例8N-苄基-N-(2-氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)308(M+H；50)，272(14)，182(15)，125(10)，106(22)，91(100)。
實施例9N-苄基-N-(2，3-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)342(M+H；36)，306(15)，182(13)，106(17)，91(100)。
實施例10N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)甲氧乙醯胺1H NMR(CDCl3)δ7.44-7.06(m，3H，Ar)，4.70(s，2H，(OCH2-O)4.23和4.11(二單譜線)，2H(旋轉異構體)，ArCH2-N)3.63和3.55(二個三譜線，2H(旋轉異構體)每一譜線J＝6.53Hz，N-CH2-CH2)2.68和2.63(二個三譜線，2H，每一譜線J＝6.53Hz(旋轉異構體)CH2-CN)實施例11N-氰甲基-N-(2，4-二氯苄基)氯甲磺醯胺1H NMR(CDCl3)δ7.55-7.28(m.3H.Ar)，4.72(s，2H，SO2CH2-Cl)4.58(s，2H，ArCH2N)3.70(t，2H，J＝7.02Hz，N-CH2CH2)2.61(t，2H，J＝7.21Hz，CH2-CN)。實施例12N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)丙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)285(M+H；72)，249(100)，188(7)，159(9)，109(6)。實施例13N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)氟乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)289(M+H；100)，253(40)，159(20)。實施例14N-(2，4-二氯苄基)-N-〔(3-苯基)丙基〕氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)370(M+H；62)，336(53)，302(23)，185(40)，159(69)，125(31)，93(100)。實施例15〔(N-氯乙醯基)-N-(2，4-二氯苄基)〕甘氨酸低分辨質譜分析m/z(相對強度)311(M+H；100)，274(46)，232(16)，159(11)，115(5)。實施例16N-(2，4-二氯苄基)-N-〔(2-噻吩基)乙基〕氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)364(M+H；100)，326(7)，266(12)，159(29)，110(56)。實施例17N-(2，4-二氯苄基)-N-〔(2-噻吩基)甲基〕氯乙醯胺1H NMR(CDCl3)δ7.49-6.98(m.6H，Ar)，4.78和4.66(二單譜線，2H(旋轉異構體)Ar-CH2-N)，4.75(s，2H，COCH2-Cl)，4.28和4.12(二單譜線，2H，N-CH2-噻吩)實施例18N-(3-氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)218(M+H；80)，182(77)，153(11)，141(16)，125(100)，106(42)。實施例19N-(2，3-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)254(M+H；59)，216(100)，159(74)，106(42)。實施例20N-(2，5-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)254(M+H；95)，216(100)，159(95)，141(13)，106(89)。實施例21N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)252(M+H；38)，217(20)，185(43.6)，159(25)，132(19)，110(20)，93(100)，75(32)。實施例22N-〔(2，4-二氯苯基)乙基〕氯乙醯胺低分辨質譜分析m/z(相對強度)266(M+H；23)，232(11)，185(56)，139(9)，170(13)，93(100)，75(24)。
根據以下記錄對本發明化合物的IL-1β蛋白酶抑制活性進行試驗體外試驗將部分純化的IL-β蛋白酶在-80℃保存，將其在冰上融化，並在37℃用置於緩衝溶液中的2.5mM的二硫蘇糖醇預培養10分鐘，該緩衝溶液中含有10mM Tris-HCl(pH8.0)和25％(v/w)甘油。將抑制劑製成溶於二甲基亞碸(DMSO)的儲備液。37℃將蛋白酶在1.5ml聚丙烯微型離心試管中與20μL的抑制劑預培養15分鐘。調節加入到試樣中的化合物的體積，從而使預培養中DMSO的濃度＜15％(v/v)。然後加入底物(TRITC-AYVHDAPVRS-NH2)(SEQ I.D.No.1)引發酶試樣使最終濃度為67μM，最終體積為30μL。該反應在37℃於暗處進行60分鐘並加入10mL 10％的三氟乙酸(TFA)終止該反應。加入115μL0.1％的TFA後，經高壓液相色譜法對試樣進行分析，該色譜法中採用的是反相(C18)柱並用乙腈/水/TFA梯度洗脫。監測底物和產物在550nm的吸收，且其分別在4.2和5.2分鐘時被洗脫。
實施例1的化合物是具有IL-1β蛋白酶抑制作用(IC50＝＜1.0μM)。體內試驗通過以下試驗測定在體內的抑制(IC50)通過Biological Specialty Corporation(Lansdale，PA)提供的肝素化的白細胞分離單元中分離出人體單核細胞。經Ficoll-Hupaque(Pharmacia Fine Chemicals，Piscatawav，NJ)梯度離心純化單核細胞，並經離心淘析得到純度高於95％的單核細胞群。在兩組新分離的人體單核細胞上進行試驗，在37℃的混懸液中培養，並在錐底聚乙烯試管(Sardstedt lnc.，Princeton，NJ)中慢慢旋轉。使濃度為5×106個細胞/ml的人體單核細胞再懸浮於含有1％小牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，UT)和50μg/ml慶大黴素(Gibco，Grand Island，NY)的1mL RPMI 1640(M.A.Bioproducts，Walkersville，MD提供的普通的組織緩衝液)。細胞用本發明的化合物(即測試化合物)或用非抑制劑(對照化合物，一般是0.03°。的DMSO)處理15分鐘，然後用0.01％不揮發的金黃色葡萄球菌(The Enzyme Center，Malden，MA)活化1小時。然後將細胞離心並再懸浮於1mL含有1％滲析FCS(Hyclone)、不含半胱氨酸和甲硫氨酸的RPMI介質中。細胞經測試化合物或對照化合物預處理15分鐘，然後加入0.01％不揮發的金黃色葡萄球菌及100μCi Tran 35-S標記(ICN，Irvine，CA)，並將細胞在37℃下培養1小時。培養後，細胞經離心並用磷酸鹽緩衝鹽水清洗一次並且再懸浮於1mL含有1％小牛血清的RPMI中。細胞再經測試化合物或對照化合物預處理15分鐘然後用0.01％金黃色葡萄球菌處理2小時。培養結束時，細胞經離心後保存上清液用於免疫沉澱反應。細胞經磷酸鹽緩衝鹽水清洗1次後溶於RIPA中，該RIPA是含有2mM苯甲基磺醯氟、10mM碘乙酸鹽、1μg/mL胃蛋白酶抑制素A、1μg/mL亮肽素和0.5TIU抑肽酶的連續相細胞介質。
在免疫沉澱反應中，將等體積的置於RIPA緩衝液中的1％的幹乳及50μL懸浮的蛋白質A瓊脂糖CL-4B(Pharmacia，Piscatway，New York)加入上清液中，並將1mL含有蛋白質A瓊脂糖CL-4B的4％的幹乳加入細胞溶解物中，並將樣品在4℃下旋轉30分鐘。離心沉降得到顆粒，將樣品轉入新試管中，用40μg家兔抗人體IL-1β多克隆抗體(Genzyme，Cambidge，MA)培養過夜。然後用70μL蛋白質A瓊脂糖沉澱IL-1β蛋白，將其懸浮於60μL SDS樣品緩衝液中，然後轉置於15％SGD-PAGE凝膠上。在乾燥凝膠上進行放射自顯影，並用Betascope 603分析儀測量放射量(以每分鐘計cpm)。數據分析在單核細胞脈衝跟蹤試驗中，分個試驗參數都成對出現。採用個人電腦由Beta Scope儀收集數據，然後轉換到VAX系統以計算平均cpm和平均標準偏差，當測定出測試化合物後，按下式計算出由成熟IL-1β釋放的抑制百分數100×〔1-(用刺激素處理的細胞+測試化合物-未活化的細胞)/(用刺激素處理的細胞+對照化合物-未活化細胞)〕採用這些抑制作用％值計算每一化合物的IC50值。由於人體單核細胞脈衝跟蹤試驗採用的是不同供體的原細胞，因此每一測試化合物採用來自2-3不同供體的單核細胞分別作2-3次試驗。
實施例1的化合物在體內試驗中的IC50值＜10μM。程序目錄(1)一般信息(i)申請人Dolle，Roland E.
Rinker，James M.(ii)發明題目用作IL-1β蛋白酶抑制劑的滷甲基醯胺(iii)程序數目1(iv)聯繫地址(A)地址Sterling Winthrop Inc.(B)街9 Great Vallev Parkway(C)街P.O.Box 3026(D)市Malvern(E)州PA(F)國別USA(G)郵政編碼19355(V)計算機可讀形式(A)數據輸出裝置類型軟盤，3.5英寸，2.0MB內存(B)計算機Apple Macintosh(C)作業系統Macintosh 7.1(D)軟體Microsoft Word 5.1a(vi)目前申請數據(A)申請號已確定(B)登記日4/29/94(C)分類1811(viii)律師/代理人信息(A)名稱Doreen M.Wells(B)註冊號34，278(ix)通訊信息(A)電話(610)889-8684(B)傳真(610)889-6364(2)SEQ ID NO.1信息(i)程序特點(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)局部分析線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞改性位置
(B)定位 -1(D)其它信息/標記＝TRITEC/附註＝「TRITEC是異硫氰酸四甲基若丹明化物」。(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞改性位置(B)定位11(D)其它信息/標記＝Xaa/附註＝「Xaa是NH2」。(xi)程序描述SEQ ID No.1Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser1 510
權利要求
1.式(A)的化合物或其可藥用的鹽 其中Y＝CO或SO2；R1＝彼此獨立地選自烷基、滷代烷基和烷氧基烷基；R2＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、羧基烷基、氰基烷基、芳基、雜芳基；和R3＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、芳基、雜芳基。
2.權利要求1的化合物，其中Y＝CO；R1＝滷代烷基；R2＝(CH2)-鏈烯基；芳烷基；和R3＝芳烷基。
3.權利要求1的化合物選自含有下列物質的集合N-烯丙基-N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(3-氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(2，5-二氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(3，4-二氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(2-氯苄基)氯乙醯胺，N-苄基-N-(2，3-二氯苄基)氯乙醯胺。
4.權利要求1的化合物選自含有下列物質的集合N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)甲氧乙醯胺，N-氰甲基-N-(2，4-二氯苄基)氯甲基磺醯胺，N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)丙醯胺，N-氰乙基-N-(2，4-二氯苄基)氟乙醯胺。
5.權利要求1的化合物選自含有下列物質的集合N-(2，4-二氯苄基)-N-甲基氯乙醯胺，N-(4-氯苄基)氯乙醯胺，N-(3-氯苄基)氯乙醯胺，N-(2，3-二氯苄基)氯乙醯胺，N-(2，5-二氯苄基)氯乙醯胺，N-(2，4-二氯苄基)氯乙醯胺。
6.權利要求1的化合物選自含有下列物質的集合N-(2，4-二氯苄基)-N-〔(3-苯基)-丙基〕氯乙醯胺，〔(N-氯乙醯基)-N-(2，4-二氯苄基)〕甘氨酸，N-(2，4-二氯苄基)-N-〔(2-噻吩基)乙基〕氯乙醯胺，N-(2，4-二氯苄基)-N〔(2-噻吩基)甲基〕氯乙醯胺，N-〔(2，4-二氯苄基)-乙基〕氯乙醯胺。
7.用於抑制白於細胞介素-1β蛋白酶的藥物組合物，該組合物含有式(A)化合物或其可藥用鹽 其中Y＝CO或SO2；R1＝彼此獨立地選自烷基、滷代烷基和烷氧基烷基；R2＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、羧基烷基、氰基烷基、芳基、雜芳基；和R3＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、芳基、雜芳基。
8.權利要求7的藥物組合物，該組合物含有式(A)的化合物或其可藥用的鹽，其中Y＝CO；R1＝滷代烷基；R2＝(CH2)-鏈烯基；芳烷基；和R3＝芳烷基。
9.權利要求7的藥物組合物，其中所述的化合物選自權利要求3-6所述的任一集合。
10.一種抑制所需治療的哺乳動物中白細胞介素-1β蛋白酶活性的方法，該方法包括向所述的哺乳動物施用有效抑制劑量的藥物組合物，該組合物含有式(A)的化合物或其可藥用鹽 其中Y＝CO或SO2；R1＝彼此獨立地選自烷基、滷代烷基和烷氧基烷基；R2＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、羧基烷基、氰基烷基、芳基、雜芳基；和R3＝H、烷基、(CH2)-鏈烯基、芳烷基、雜芳烷基、芳基、雜芳基。
11.權利要求10的方法，其中所述的化合物選自式(A)或其可藥用鹽，其中Y＝CO；R1＝滷代烷基；R2＝(CH2)-鏈烯基；芳烷基；和R3＝芳烷基。
12.權利要求10的方法，其中所述的化合物選自權利要求3-6所述的任一集合。
全文摘要
公開了用於抑制白細胞介素1-β蛋白酶活性的化合物、組合物和方法，該化合物具有式(A)結構。
文檔編號C07C233/13GK1147201SQ95192847
公開日1997年4月9日 申請日期1995年4月28日 優先權日1994年4月29日
發明者R·E·多夫, J·M·林克 申請人:聖諾菲溫特洛普公司