用於促進局部缺血性和糖尿病性創面癒合的組合物、試劑盒和方法

2023-10-26 05:31:22 1

專利名稱：用於促進局部缺血性和糖尿病性創面癒合的組合物、試劑盒和方法
技術領域：
本發明一般涉及藥物和基因療法的領域。更具體地講，本發明涉及用於促進糖尿病受試者的創面癒合的組合物、試劑盒和方法。
背景技術：
損傷性創面癒合是糖尿病患者中存在的顯著臨床問題，並且是下肢截肢的主導原因。當前療法的成功率有限，並且不足以解決糖尿病患者中存在的微血管病變。糖尿病性創面的不良癒合的特徵為受損的血管生成和血管發生。血管發生涉及新血管自BM衍生祖細胞的生長，並且有助於出生後新血管形成和創面癒合的過程。骨髓(BM)衍生內皮祖細胞 (EPC)是參與血管發生的關鍵細胞，並且響應於局部缺血而歸巢到外周組織。尚不清楚對 EPC動員和募集的基本生理刺激(S卩，局部缺血)為何無法在糖尿病宿主中誘導治療性EPC 介導的新血管形成和創面癒合。因此，目前需要增強糖尿病創面癒合的治療劑和方法。發明_既述本文描述了基於SDF-I α特異性上調E選擇素在成熟EC中的表達，從而引起 EC-EPC黏附和EPC歸巢增加這一發現來促進局部缺血性(例如，糖尿病性)創面癒合的組合物、試劑盒和方法。EPC靶向組織的歸巢機制涉及一連串連續事件，這些事件包括從骨髓利基脫離、活動進入血管中且在循環內移動、感測歸巢信號、滾動且黏附到毛細管的內皮細胞(EC)單層上以及隨後的跨內皮遷移，其中需要EPC-EC直接相互作用。本文所述的實驗研究了在毛細管的內層EC與循環EPC之間是否需要直接的細胞間相互作用以實現EPC到靶組織的歸巢，以及是否至少部分地通過調控EC單層上的特異性黏附分子來介導SDF-I α 對EPC歸巢的效應。鑑定了介導SDF-I α誘導的EPC歸巢的黏附分子，即E選擇素。本文所述實驗的結果證實，SDF-I α特異性地上調E選擇素在鼠和人成熟EC單層中的表達，E選擇素負責通過增強EPC對EC單層的黏附及其跨內皮遷移來介導SDF-I α對EPC歸巢的效應， 並且這些效應引起創面新血管形成和創面癒合(新血管形成)的顯著增強。這些新發現不僅使人們對潛藏在SDF-I α對EPC歸巢的生物效應背後的分子機制(信號)有了了解，而且還揭示了E選擇素作為新靶標在局部缺血性(例如，糖尿病性)創面癒合中的治療應用。除非另有定義，本文所使用的所有技術術語的含義與本發明所屬領域中的普通技術人員所通常理解的含義相同。如本文所用，「核酸」或「核酸分子」是指兩種或兩種以上核苷酸的鏈，諸如RNA (核糖核酸)和DNA(脫氧核糖核酸)，以及經化學修飾的核苷酸。「純化的」核酸分子是實質上與核酸天然存在於其中的細胞或有機體中的其它核酸序列分離的核酸分子(例如30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 無汙染)。該術語包括，例如，合併到載體、質粒、病毒或原核生物或真核生物的基因組中的重組核酸分子。純化核酸的實例包括cDNA、基因組核酸片段、聚合酶鏈式反應(PCR)產生的核酸、由基因組核酸的限制酶處理所形成的核酸、重組核酸及化學合成的核酸分子。「重組」核酸分子是通過對兩種以其它方式分離的序列片段進行人工組合(例如，通過化學合成或通過由基因工程技術操縱分離的核酸片段)所製備的核酸分子。所謂術語「基因」是指編碼特定蛋白質或在某些情況下編碼功能或結構RNA分子的核酸分子。所謂術語「E選擇素基因」、「E選擇素多核苷酸」或「E選擇素核酸」是指天然人E 選擇素或E選擇素編碼核酸序列，例如，天然人E選擇素基因(登錄號NM_000450)、具有可由其轉錄E選擇素cDNA的序列的核酸；和/或上述的等位基因變體和同源物。這些術語涵蓋雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。所謂術語「SDF-1CI基因」、「SDF-I α多核苷酸」或「SDF-1 α核酸」是指天然人SDF-I α或SDF-I α編碼核酸序列，例如，天然人SDF-I α基因(登錄號ΝΜ_199168、 ΝΜ_000609, ΝΜ_001033886)、具有可由其轉錄SDF-I α cDNA的序列的核酸；和/或上述的等位基因變體和同源物。這些術語涵蓋雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA。當提及核酸分子中的突變時，「隱性」變化為取代核苷酸序列中一個或多個鹼基對的那些變化，但不改變由該序列編碼的多肽的胺基酸序列。「保守性」變化為這樣的變化，其中核酸的蛋白質編碼區中的至少一個密碼子已改變，使得由核酸序列編碼的多肽的至少一個胺基酸被具有相似特性的另一個胺基酸所取代。當提及肽、寡肽或蛋白質中的胺基酸殘基時，術語「胺基酸殘基」、「胺基酸」和「殘基」可互換使用，並且如本文所用，是指通過醯胺鍵或醯胺鍵類似物與至少一種其它胺基酸或胺基酸類似物共價連接的胺基酸或胺基酸類似物。如本文所用，「蛋白質」和「多肽」以同義詞使用，是指胺基酸的任何肽連接鏈，而不管長度或翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。所謂術語「E選擇素蛋白」或「E選擇素」是指E選擇素基因的表達產物，諸如天然人E選擇素蛋白(登錄號AAQ67702、NP_000441.2)，或與上述蛋白共有至少65% (但優選地為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)胺基酸序列同一性並且顯示出天然E選擇素蛋白的功能活性的蛋白。蛋白質的「功能活性」是與蛋白質的生理功能相關的任何活性。例如，天然E選擇素蛋白的功能活性可包括介導EC-EPC黏附，並且通過介導細胞與血管內層的黏附來促進血液白細胞在炎症部位的聚集。所謂術語「SDF-la蛋白」或「SDF-1 α 」是指SDF-1 α基因的表達產物，諸如天然人SDF-I α蛋白(登錄號CAG29279. 1)，或與上述蛋白質共有至少65% (但優選地為 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% )胺基酸序列同一性並且顯示出天然 SDF-I α蛋白功能活性的蛋白質。蛋白質的「功能活性」是與蛋白質的生理功能相關的任何活性。例如，天然SDF-I α蛋白的功能活性可包括例如刺激細胞生長或血管生成。SDF-Ia 是充當EPC的有效歸巢信號的趨化因子(參見Lapidot等，Ann NY Acad Sci 938 =83-95, 2001 ；PCT/US2008/003760)。當提及核酸分子、多肽或或傳染性病原體時，術語「天然」是指天然存在的(例如， 野生型(WT))核酸、多肽或傳染性病原體。所謂「血管生成」是指源於現有血管的新血管的生長。通過測量無分支的血管節段的數目(每單位面積的節段數目)、功能血管密度(每單位面積的灌注的血管的總長
5度)、血管直徑或血管體積密度(每單位面積的基於每個節段的長度和直徑計算的總血管體積)，可測定血管生成。術語「特異性結合」和「特異性地結合」是指在配對種類(諸如酶/底物、受體/激動劑、抗體/抗原等)之間發生的結合，並且所述結合可以由共價或非共價相互作用或共價和非共價相互作用的組合來介導。當兩個種類的相互作用產生非共價結合的複合體時，發生的結合通常為靜電、氫鍵或親脂相互作用的結果。因此，「特異性結合」發生在配對種類之間，其中兩者之間存在相互作用，其產生具有抗體/抗原或酶/底物相互作用特徵的結合複合體。具體而言，特異性結合的特徵在於配對的一個成員與特定的種類結合，而不與該結合成員的對應成員所屬化合物家族中的其它種類結合。如本文所用，短語「序列同一性」是指當兩個序列比對以使亞單位配對最大化時 (即，考慮到空位和插入)，在兩個序列(例如，核酸序列、胺基酸序列)中的對應位置上相同亞單位的百分數。可用序列分析軟體(例如，得自Accelrys CGC, San Diego，CA的序列分析軟體包)測定序列同一性。短語「分離的」或「生物純的」是指基本上或實質上不含如在物質的天然狀態中發現的通常伴隨其的組分的物質。術語「抗體」意在包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、人源化抗體、能以可溶或結合形式標記的抗體的抗獨特型(抗-id)抗體及其片段、區域或衍生物，這可通過已知的技術(例如但不限於酶切害I]、肽合成或重組技術)提供。如本文所用，術語「慢性創面」和「問題性創面」以及「糖尿病性創面」是指這樣的創面，其未達到持久的解剖學及功能結果，並且其無法按照以下正常的創面癒合過程癒合 去除壞死碎片和感染、消退炎症、修復結締組織基質、血管生成以及表面重修。例如，當缺氧在病理學增加時，創面癒合受損並且創面感染速率增加。正常癒合的基本部分是臨時創面基質中新血管的形成，其被稱為肉芽組織形成。術語「血管生成」是指在一個實施方案中是這樣的過程，通過該過程，創面鄰近的成熟血管網的居留內皮細胞進行增殖，並且在其它實施方案中，遷移並重塑成新血管，該新血管在成熟基質細胞(如成纖維細胞)的輔助下長成初始無血管的創面組織。在另一個實施方案中，術語「血管發生」是指新生的過程，通過該過程，EPC被募集至創面，分化成內皮細胞並且生成替代性血管網。所謂術語「祖細胞」或「內皮祖細胞」或「EPC」是指具有能夠通過分化和增殖產生完全分化的、功能性子代的能力的任何體細胞。在另一個實施方案中，祖細胞包括來自任何組織或器官系統(包括但不限於血液、神經、肌肉、皮膚、消化道、骨骼、腎臟、肝臟、胰腺、胸腺等)的祖代細胞。祖細胞不同於「分化的細胞」，其在另一個實施方案中被定義為這樣的細胞，其可能具有或可能不具有增殖(即，自複製)的能力，但其在正常生理條件條件下不能經歷向不同細胞類型的進一步分化。在一個實施方案中，祖細胞進一步不同於異常細胞， 諸如癌細胞，尤其是白血病細胞，其儘管看上去未成熟或未分化，但其增殖(自複製)，但通常不會進一步分化。如本文所用，術語「全能細胞(totipotent) 」是指未定型的祖細胞，諸如胚胎幹細胞，即，對於產生所有類型的成熟細胞是必要和充分的。保留產生所有胰細胞系的能力但不能自我更新的祖細胞稱為「多潛能細胞(pluripotent) 」。在另一個實施方案中，產生一些但並非所有內皮細胞系並且不能自我更新的細胞稱為「多能細胞(multipotent) 」。如本文所用，短語「骨髓衍生祖細胞」和「BM衍生祖細胞」是指來自骨髓幹細胞系的祖細胞。骨髓衍生祖細胞的實例包括骨髓衍生間充質幹細胞(MSC)和EPC。術語「歸巢」是指吸引和刺激參與癒合的細胞遷移到損傷部位並輔助修復的信號。所謂短語「治療有效量」和「有效劑量」是指足以產生治療上(例如，臨床上)所需結果的量；結果的確切性質將根據所治療病症的性質而變化。例如，在待治療的病症是未癒合的糖尿病性創面的情況下，則結果可為創面的癒合(通過特異性上調E選擇素在成熟EC 中的表達，導致EC-EPC黏附增加、EPC歸巢以及創面新血管形成增加)。本文所述的組合物和疫苗可以每天一次或多次至每周一次或多次施用。技術人員將意識到，某些因素可影響有效治療受試者所需的劑量和時程，這些因素包括但不限於疾病或病症的嚴重程度、先前的治療、受試者的綜合健康情況和/或年齡，以及存在的其它疾病。此外，用治療有效量的本發明組合物或疫苗治療受試者包括單次治療或一系列治療。如本文所用，術語「治療」被定義為將本文所述或通過本文所述的方法鑑定的治療劑應用或施用於患者，或將所述治療劑應用或施用於來自患者的分離組織或細胞系，所述患者具有疾病、疾病症狀或疾病的誘因，治療目的在於治癒、癒合、緩解、減輕、改變、補救、 改善、改良或影響疾病、疾病症狀或疾病的誘因。術語「患者」、「受試者」和「個體」在本文中可互換使用，並且是指待治療的哺乳動物受試者，優選人類患者。在一些情況下，本發明的方法可用於實驗動物、獸醫應用和開發針對疾病的動物模型，包括但不限於齧齒動物，包括小鼠、大鼠和倉鼠，以及非人靈長類。因此，本文描述的是一種促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法。所述方法包括以下步驟提供治療有效量的組合物，所述組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種選自由下列組成的組的治療劑E選擇素蛋白、編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調 E選擇素表達的試劑；和將組合物在條件下施用於受試者，使得受試者的骨髓衍生祖細胞 (例如，EPC)向創面的遷移增加。所述組合物可例如通過口服施用、局部施用、靜脈內施用、 直接施用至創面或鄰近創面的部位，或經血管內導管施用。對受試者施用所述組合物導致創面癒合加快。在一個實施方案中，組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸， 以及特異性上調E選擇素表達的試劑，其中特異性上調E選擇素表達的試劑為SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。所述方法還可包括對受試者施用高壓氧治療的步驟。本文還描述了一種上調具有糖尿病性創面的糖尿病受試者的E選擇素表達的方法。所述方法包括將包含至少一種rAAV病毒粒子的組合物施用於糖尿病受試者，所述至少一種rAAV病毒粒子包含編碼E選擇素的多核苷酸，所述多核苷酸插入第一 AAV反向末端重複與第二 AAV反向末端重複之間，所述組合物的量可有效上調E選擇素表達、誘導骨髓衍生祖細胞(例如，EPC)向創面的遷移以及加速受試者的創面癒合。所述至少一種rAAV病毒粒子可包含血清2型衣殼蛋白。可將所述組合物例如直接施用至創面或鄰近創面的部位。 所述方法還可包括對受試者施用SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸和/或對受試者施用高壓氧治療的步驟。本文還描述了一種用於治療哺乳動物受試者的至少一種糖尿病性創面的試劑盒。 所述試劑盒包含治療有效量的組合物(包含藥學上可接受的載體和至少一種選自下列的治療劑Ε選擇素蛋白、編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調E選擇素表達的試劑)和使用說明書。在一個實施方案中，所述組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸， 以及特異性上調E選擇素表達的試劑，其中特異性上調E選擇素表達的試劑為SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。在一個實施方案中，所述使用說明書包括用於對受試者施用高壓氧治療的說明書。本文還描述了一種促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法。所述方法包括以下步驟提供包含藥學上可接受的載體和多種骨髓衍生祖細胞的組合物，其中所述骨髓衍生祖細胞包含編碼E選擇素的多核苷酸；和以有效增加骨髓衍生祖細胞(例如，EPC)向創面的遷移並加速受試者的創面癒合的量將組合物施用於受試者。編碼E選擇素的多核苷酸可在病毒載體內，例如，病毒顆粒內包含的病毒載體(例如，AAV顆粒內的rAAV載體)。 組合物還可包含SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸，並且可直接施用至創面或鄰近創面的部位。在一個實施方案中，所述方法還可包括對受試者施用高壓氧治療的步驟。儘管與本文所述類似或等同的組合物、試劑盒和方法可用於實施或測試本發明， 但下文仍將描述合適的組合物、試劑盒和方法。本文提到的所有出版物、專利申請和專利的全文以引用方式併入。如有衝突，則以本說明書(包括定義)為準。下文描述的具體實施方案僅為說明性的，而並不旨在進行限制。


圖1為細胞的系列顯微圖和顯示SDF-I α工程改造的BMDF促進新血管形成和糖尿病性創面癒合的圖。(A)左圖以恢復百分數表示的創面癒合速率。使兩組NOD小鼠受傷，並且用mSDF-1 α /BMDF與GFP/BMDF對比治療。通過數字攝影術和ImageJ分析來每天測定初始創傷面積的比率，直至創面癒合。與用GFP/BMDF治療的對照組相比，用mSDF-Ι α / BMDF治療的患糖尿病小鼠從第3天開始具有顯著改善的創面閉合率。右圖示出各組在不同天數時的代表性創面。(B)使用Dil染料的創面血管灌注。上圖示出通過雷射掃描共焦顯微鏡在第5天測定的各組的Dil染色的創面血管的代表性圖像。下圖創面中血管密度的量化。閾值面積的百分比覆蓋所有檢測為整個創傷面積百分數的血管。與對照組相比，mSDF-1 α/BMDF治療的創面具有顯著較高的血管密度。數據以各組中四個創面的平均值士SD呈現。(C)用mSDF-1 α /BMDF與GFP/BMDF注射的創面組織的IHC的對比，用於檢測mSDF-Ι α。與GFP/BMDF治療的創面(40X)相比，在mSDF-1 α/BMDF治療的創面中觀察到較強的mSDF-Ι α表達(褐色)。圖2為EC單層的照片和顯示EPC對SDF-1 α刺激EC單層的體外黏附增加的圖。 將Dil-Ac-LDL標記的EPC加到用SDF-I α或BSA刺激的EC單層。30分鐘後，衝洗掉未結合的EPC。通過螢光掃描量化結合的EPC。(A)代表性圖像。(B)定量數據。數據以三次獨立測定的平均值士SD呈現，這三次獨立測定中的樣品完全相同。圖3為電泳膠的圖、照片；NOD小鼠創面的一系列顯微圖；以及創面組織的顯微圖， 該圖顯示SDF-I α刺激上調E選擇素在EC單層中的表達。(A)將HMVEC用SDF-I α或BSA 刺激4小時，並且提取全部RNA。使用RT2 PCR測定分析細胞外基質和黏附分子的表達。E 選擇素的表達通過SDF-I α刺激而上調。與SDF-I α處理的EC相比，將BSA處理的EC中 mRNA的水平設為"1"。(B)通過蛋白質印跡分析驗證E選擇素的表達。用SDF-I α或BSA 刺激HMVEC，並且在不同時間點收穫細胞，將β-肌動蛋白用作內參照。(C)與用LacZ/AAV注射的NOD小鼠創面相比，用mSDF-1 α /AAV注射的NOD小鼠創面中的E選擇素的血管表達增加。通過免疫染色檢測血管中KDR(紅色)和E選擇素(綠色)的共表達(黃色)。(D) 通過IHC檢測用mSDF-1 α /AAV注射的創面組織中SDF-I α的表達增加。圖4為EC的一對圖和一系列顯微圖，顯示SDF-I α誘導的EC單層中的E選擇素增加了 EPC黏附和跨內皮遷移。㈧與BSA處理的EC單層相比，更多的EPC黏附至SDF-I α 刺激的EC單層。加入抗E選擇素的阻斷性Ab在此細胞間黏附測定中抑制了 SDF-I α刺激的EC與EPC之間的相互作用。數據以三次獨立測定的平均值士SD呈現，這三次獨立測定中的樣品完全相同。(B，上圖)與具有BSA處理的EC單層的transwell相比，觀察到跨移至具有SDF-I α刺激的EC單層的transwell的下室的Dil-Ac-LDL標記的EPC增多。抗E 選擇素的阻斷性Ab抑制此EPC跨內皮遷移。(B，下圖)通過螢光掃描儀量化transwell的下室上的Dil-EPC。抗E選擇素的阻斷性Ab抑制了 SDF-I α刺激的EC與EPC之間的相互作用。數據以三次獨立測定的平均值士SD呈現，這三次獨立測定中的樣品完全相同。圖5為蛋白質印跡的照片，其示出SDF-I α誘導E選擇素配體在EPC中的表達。通過SDF-I α刺激EPC，並在不同的時間點收穫細胞。通過蛋白質印跡分析檢驗E選擇素配體、⑶162和⑶44的表達，β-肌動蛋白用作內參照。將實驗重複兩次。圖6為一系列照片和圖，其顯示在後肢局部缺血和表皮創傷的鼠模型中E選擇素參與SDF-I α誘導的EPC歸巢、新血管形成和創面癒合。(A)上圖非侵害LDI測量的代表性圖像，其顯示E-sel+與WT小鼠在股動脈結紮/切除後血流自發復原到局部缺血性後肢的對比。下圖LDI測量的定量數據。兩組小鼠的局部缺血性後肢與正常後肢在不同時間點的比率。數據以從各組(n = 6個/組)得到的平均值士SD呈現。(B)E-sel+與WT的創面閉合率對比。上圖E-Sel+和WT小鼠中創面癒合的代表性圖像。E選擇素的缺失延遲了創面癒合。下圖E-sel+與WT小鼠的定量創面閉合率對比。數據以從各組(η = 6個 /組)得到的創面閉合(恢復)百分比的平均值士SD呈現。(C)使用Dil染料的創面血管灌注。上圖示出通過共焦雷射掃描攝影術在第7天檢測的各組的Dil染色創面血管的代表性圖像。下圖在第7天對剩餘創面的整個區域的血管密度進行的軟體輔助定量，以螢光百分數表示。與E-sel+小鼠的創面相比，WT小鼠的創面具有顯著較高的血管密度。數據以各組中三個創面的平均值士SD呈現。(D)E-sel對於EPC歸巢到創面損傷區而言是必須的。將來自R0SA26 (LacZ+)小鼠的1 X IO7個骨髓細胞分別移植到E-sel+和WT小鼠中。 創建局部缺血性後肢創面，並且將SDF-I α注射到創面中。細胞移植後7天，收穫創面，並對冷凍樣品進行X-gal (藍色)和抗-KDR(褐色)染色。上圖雙重染色的代表性圖像。下圖從創面樣品的5個隨機選擇的區域中對雙陽性細胞進行計數。數據為得自各組的平均值士SD (n = 3個創面/組)的百分數。發明詳述本文所述的組合物、方法和試劑盒基於通過EC和循環EPC調節成熟SDF-I α介導的EPC歸巢的信號的發現。在以下描述的實驗中，顯示經由基於細胞的療法的創面中增加水平的SDF-I α促進糖尿病小鼠的癒合(截止第3天，癒合率增加 20%，P = 0. 006)。 SDF-I α增加了 EC-EPC黏附，並且特異性上調人微血管EC中的E選擇素表達6倍增加，P <0. 01)。此效應在實驗小鼠的血管中也是顯著的，並且導致創面新血管形成增加。SDF-I α 對EC-EPC黏附和EPC歸巢的調節效應受到E選擇素的特異性介導，因為施用E選擇素拮抗劑顯著抑制了 SDF-I α誘導的EC-EPC黏附、EPC歸巢、創面新血管形成和創面癒合。介導 SDF-I α誘導的創面癒合的E選擇素的募集在E-sel+小鼠模型中得以證實。SDF-Ια工程改造的基於細胞的療法通過特異性上調成熟EC中的E選擇素表達而導致EC-EPC黏附增加、EPC歸巢以及創面新血管形成增加，從而促進小鼠的糖尿病性創面癒合。這些發現使人們對潛藏在SDF-I α對EPC歸巢的生物效應背後的信號有了新的了解，並且指明E選擇素作為對局部缺血性(例如，糖尿病性)創面癒合中的EPC運輸進行治療性操縱的新的可能靶標。下面描述的優選實施方案闡釋了這些組合物、疫苗、試劑盒和方法的適應範圍。然而，根據這些實施方案的描述，本發明的其它方面可基於下文提供的描述完成和/或實施。生物學方法本文描述了涉及常規分子生物學技術的方法。此類技術通常是本領域中已知的， 並且詳細描述於以下方法論文中例如Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第3 片反，第 1—3 卷，Sambrook 等編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編著， Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York，1992 (定期更新)。免疫學技術通常是本領域中已知的，並且詳細描述於以下方法論文中例如Advances in Immunology, % 93 Frederick W. Alt H Μ, Academic Press (Burlington, MA), 2007 ；Making and Using Antibodies :A Practical Handbook, Gary C. Howard 禾口 Matthew R 編著，Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, 2006 ；Medical Immunology,第 6 版，Gabriel Virella 編著， Informa Healthcare Press, London, England,2007 ；禾口 Harlow and Lane ANTIBODIES A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988 常規的基因轉移方法和基因療法也適用於本發明。參見例如Gene Therapy Principles and Applications,Τ. Blackenstein,Springer Verlag編著，1999 ；禾口Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), P. D. Robbins 編著，Humana Press, 1997。促進局部缺血性創面癒合的組合物本文描述了用於促進糖尿病受試者的局部缺血性(例如，糖尿病性)創面癒合的組合物。本文所述的組合物可用於促進任何類型的局部缺血性創面的癒合，諸如糖尿病性創面。此類組合物通常包括治療有效量的組合物，所述治療有效量的組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種治療劑，諸如E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸。組合物還可包含特異性上調E選擇素表達的試劑。在此實施方案中，可使用特異性上調E選擇素表達的任何合適試劑。例如，可使用SDF-I α。另外的實例包括IL-1、TNF-α和脂多糖(LPS)。 在此實施方案中，組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸，以及SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。將組合物施用於受試者導致受試者的骨髓衍生祖細胞向創面的遷移增加和創面癒合加速。創面癒合的特徵在於創面的上皮再形成。可使用任何合適的方案(例如，基於A蛋白和G蛋白微珠的抗E選擇素抗體捕獲技術(Invitrogen))來分離或合成E選擇素蛋白。在施用E選擇素蛋白的典型實施方案中， 通過轉化細菌細胞(例如，大腸桿菌)或轉染哺乳動物細胞，然後從這些細胞中純化E選擇素，來製備/合成E選擇素蛋白。在其中也施用SDF-Ια蛋白的實施方案中，以類似方式製備SDF-I α蛋白。
在另一個實施方案中，可將編碼E選擇素的核酸施用於受試者，以治療糖尿病性創面。編碼E選擇素的編碼序列可與登錄號為NM_000450的核苷酸序列相同，或其也可為不同的編碼序列，該不同的編碼序列由於遺傳密碼的冗餘和簡併性而編碼與登錄號為 NM_000450的多核苷酸相同的多肽。如本文所述的其它核酸分子包括天然E選擇素基因的變體，諸如編碼天然E選擇素蛋白的片段、類似物和衍生物的那些。此類變體可為例如天然 E選擇素基因的天然存在的等位基因變體、天然E選擇素基因的同源物或天然E選擇素基因的非天然存在的變體。這些變體具有關於一個或多個鹼基不同於天然E選擇素基因的核苷酸序列。例如，此類變體的核苷酸序列的特徵可為天然E選擇素基因的一個或多個核苷酸的缺失、添加或取代。 在其它實施方案中，在結構上顯示出實質變化的變異E選擇素蛋白可通過進行核苷酸取代產生，所述核苷酸取代引起被編碼多肽中小於保守變化的變化。此類核苷酸取代的實例為引起關於(a)多肽骨架的結構；(b)多肽的電荷或疏水性；或(c)胺基酸側鏈體積的變化的取代。通常預期產生蛋白性質的最大變化的核苷酸取代為引起密碼子的非保守變化的核苷酸取代。可能引起蛋白結構的較大變化的密碼子變化的實例包括引起以下取代的密碼子變化(a)親水殘基，例如絲氨酸或蘇氨酸被取代為疏水殘基，例如，亮氨酸、異亮氨酸、苯基丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸；(b)半胱氨酸或脯氨酸被取代為其它任意殘基；(C)具有正電性側鏈的殘基，例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸被取代為負電性殘基，例如穀氨醯胺或天冬氨酸；或(d)具有大側鏈的殘基，例如苯基丙氨酸被取代為無側鏈的殘基，例如甘氨酸。如本文所述的天然E選擇素基因或天然E選擇素mRNA的天然存在的等位基因變體為從人組織分離的核酸，所述核酸與天然E選擇素基因或天然E選擇素mRNA具有至少 75% (例如，76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^P 99% )的序列同一性，並且編碼與天然E選擇素蛋白具有結構相似性的多肽。如本文所述的天然E選擇素基因或天然E選擇素 mRNA的同源物為從其它物種分離的核酸，所述核酸與天然人E選擇素基因或天然人E選擇素 mRNA 具有至少 75% (例如，76 %、77 %、78 %、79 %、80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 和 99% )的序列同一性，並且編碼與天然人E選擇素蛋白具有結構相似性的多肽。可搜索公共和/或專有核酸資料庫，以鑑定與天然E選擇素基因或天然E選擇素mRNA具有高百分比(例如，70%、 80%、90%或更高)的序列同一性的其它核酸分子。非天然存在的E選擇素基因或mRNA變體為非天然存在(例如，由人手工製備)的核酸，其與天然人E選擇素基因或天然人E選擇素mRNA具有至少75% (例如，76%、77%、 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%和99%)的序列同一性，並且編碼與天然人E選擇素蛋白具有結構相似性的多肽。非天然存在的E選擇素基因變體的實例為編碼E選擇素蛋白片段的基因變體、在嚴格條件下與天然E選擇素基因或與天然E選擇素基因的補體雜交的基因變體、與天然E選擇素基因或其補體共有至少65%序列同一性的基因變體以及編碼E選擇素融合蛋白的基因變體。如本文所述的編碼天然E選擇素蛋白片段的核酸為編碼天然E選擇素蛋白的例如 2個、5個、10個、25個、50個、100個、150個、200個或更多個胺基酸殘基的核酸。編碼或雜交編碼天然E選擇素蛋白片段的核酸的較短的寡核苷酸(例如，具有6個、7個、8個、9個、 10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、50個鹼基對長
度的寡核苷酸)可用作探針、引物或反義分子。編碼天然E選擇素蛋白片段的核酸可通過酶消化(例如，使用限制酶)或化學降解全長天然E選擇素基因、E選擇素mRNA或cDNA或前述的變體來製備。使用先前報導的天然人E選擇素基因的核苷酸序列和天然E選擇素蛋白的胺基酸序列，本領域的技術人員可通過例如標準核酸誘變技術或通過化學合成製備核苷酸序列中具有最小變異的核酸分子。變異E選擇素核酸分子可表達產生變異E選擇素蛋白。促進糖尿病性創面癒合的方法促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法的一個實施方案包括提供治療有效量的組合物，該組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種治療劑，諸如E選擇素蛋白、 編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調E選擇素表達的試劑；和在條件下將組合物施用於受試者，使得受試者的骨髓衍生祖細胞(例如，EPC)向創面的遷移增加。例如，組合物可包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸以及特異性上調E選擇素表達的試劑，諸如 SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。在此方法中，所述組合物可以任何合適的途徑施用，例如口服施用、局部施用、靜脈內施用或直接施用至創面或鄰近創面的部位。對受試者施用所述組合物導致創面癒合加快。一種使糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法還可包括對受試者施用高壓氧治療。在本文所述的方法中，高壓氧療法(HBO2)通常為在微脈管系統已變薄的情況下用於刺激創面癒合的輔助療法。用HBO2治療糖尿病受試者的方法描述於例如PCT/ US2008/003760中，其以引用的方式併入本文。在促進糖尿病受試者(患者)的創面癒合的方法的一個實例中，患者每天一次或兩次接受20次或更多次下述治療在加壓室中呼吸介於約2. 0至約3. 2絕對大氣壓(ATA)下的100% 02。治療時間範圍通常從約10分鐘至約 240分鐘(例如，約10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150分鐘、180分鐘、210分鐘、240分鐘，等)。在另一個實施方案中，一種上調具有糖尿病性創面的糖尿病受試者的E選擇素表達的方法，包括將包含至少一種rAAV病毒粒子的組合物施用於糖尿病受試者，所述至少一種rAAV病毒粒子包含編碼E選擇素的多核苷酸，所述多核苷酸插入第一 AAV反向末端重複與第二 AAV反向末端重複之間。在此實施方案中，所述組合物的量可有效上調E選擇素表達、誘導骨髓衍生祖細胞(例如，EPC)向創面的遷移以及加速受試者的創面癒合。在此方法中，所述至少一種rAAV病毒粒子可包含血清2型衣殼蛋白。如在本文所述的其它實施方案中那樣，所述組合物可以任何合適的途徑施用，例如，口服施用、局部施用、靜脈內施用或直接施用至創面或鄰近創面的部位。此方法還可包括對受試者施用SDF-I α蛋白或編碼 SDF-I α蛋白的核酸，和/或對受試者施用高壓氧治療的步驟。在另一個實施方案中，一種促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法包括以下步驟提供包含藥學上可接受的載體和多種骨髓衍生祖細胞的組合物，和以有效增加骨髓衍生祖細胞(例如，EPC)向創面的遷移以及加速受試者的創面癒合的量將組合物施用於受試者。在此實施方案中，所述骨髓衍生祖細胞包含編碼E選擇素的多核苷酸。編碼E選擇素的多核苷酸可包含在病毒載體內，諸如rAAV載體。通常，rAAV載體在rAAV病毒(顆粒)內。在此實施方案中，所述組合物還可包含SDF-I α蛋白或編碼SDF-Ια蛋白的核酸。 如果所述組合物包含編碼SDF-I α的核酸，則該核酸可存在於rAAV載體內、第二 rAAV載體內或不同於rAAV的病毒載體內。所述組合物可以任何合適的途徑施用，例如口服施用、局部施用、靜脈內施用或直接施用至創面或鄰近創面的部位。所述方法還可包括對受試者施用高壓氧治療的步驟。本文所述的方法可用於治療多種不同類型的創面。糖尿病性創面的一個實例為青斑樣血管病變，其為一種以與網狀青斑和白色萎縮相關的疼痛性潰瘍為特徵的病症。糖尿病性創面的另一個實例為糖尿病性潰瘍，例如，外周動脈疾病性潰瘍、靜脈鬱血性潰瘍、慢性未癒合潰瘍、壓迫性潰瘍、褥瘡性潰瘍、慢性足部潰瘍等。創面還可為以上列出的一種或多種創面的組合。糖尿病受試者可具有一種或多種待治療的創面。受試者包括任何哺乳動物，諸如人類、大鼠、小鼠、貓、犬、山羊、綿羊、馬、猴子、類人猿、兔子、牛等。受試者(例如， 哺乳動物)可處於任何發育階段，包括成年和幼年。靶組織可為受試者體內的任何組織， 諸如視網膜、肝臟、腎臟、心臟、肺、胃腸道組成部分、胰腺、膽囊、膀胱、中樞神經系統(包括腦)、表皮、骨骼等。在其中將編碼E選擇素的核酸(以及任選的編碼用於調節EPC歸巢的SDF-I α或其它試劑的核酸)施用於糖尿病受試者的方法中，本文所述的核酸還可包含一個或多個表達控制序列，其可操作性地連接至編碼E選擇素的核酸(以及任選的編碼用於調節EPC歸巢的SDF-I α或其它試劑的核酸)。許多此類序列是已知的。要包括的序列可根據其在其它應用中的已知功能進行選擇。表達控制序列的實例包括啟動子、絕緣子、沉默子、應答元件、內含子、增強子、起動位點、終止信號和PA尾。為使E選擇素(以及任選的SDF-I α )達到適當水平，可採用適合用在靶細胞中的許多啟動子的任何一種。例如，可使用不同強度的組成型啟動子。如本文所述的表達載體和質粒可包括一種或多種組成型啟動子，諸如病毒啟動子或哺乳動物基因的啟動子，其通常積極促進轉錄。組成型病毒啟動子的實例包括單純皰疹病毒(HSV)、胸苷激酶(TK)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、Ad ElA和巨細胞病毒(CMV) 啟動子。組成型哺乳動物啟動子的實例包括多種持家基因啟動子，例如β-肌動蛋白啟動子。也可設想將誘導型啟動子和/或調節元件用於本文所述的組合物和方法中。合適的誘導型啟動子的實例包括得自諸如下列的基因的誘導型啟動子細胞色素Ρ450基因、熱休克蛋白基因、金屬硫蛋白基因和激素誘導型基因，例如雌激素基因啟動子。誘導型啟動子的另一個實例為對四環素應答的tetVP16啟動子。組織特異性啟動子和/或調節元件可用於本文所述組合物和方法的某些實施方案中。可與如本文所述的表達載體一起使用的此類啟動子的實例包括Tie-2或KDR_啟動子。如本文所述的組合物(例如，包含編碼E選擇素的病毒載體的組合物)可通過任何合適的技術施用於哺乳動物受試者。根據本文所述的組合物和方法，提供了使用病毒載體以將E選擇素基因引入細胞的多種技術。病毒是自然進化的將其基因高效遞送到宿主細胞中的媒介物，因此其為遞送治療性基因的理想載體系統。優選的病毒載體表現出對宿主細胞的低毒性，並且產生(例如，以組織特異性方式)治療量的E選擇素蛋白。病毒載體方法和方案可查看 Kay 等，NatureMedicine 7 :33-40, 2001 雖然下面描述的實驗涉及rAAV和慢病毒屬，但可使用任何合適的病毒載體。已知許多病毒載體在本領域中用於將基因遞送至哺乳動物受試者以及以下實例的非詳盡列表。將重組腺病毒用作基因療法載體的方法論述在例如W. C. Russell, Journal of General Virology 81 :2573-2604, 2000，和 Bramson 等，Curr. Opin. Biotechnol. 6 :590-595,1995。 使用單純皰疹病毒載體的方法論述在例如Cotter和Robertson，Curr. Opin. MoI. Ther. 1 633-644,1999。也可使用複製缺陷型慢病毒載體(包括HIV)。使用慢病毒載體的方法論述在例如 Vigna 和 Naldini，J. Gene Med. 5 :308-316,2000 ；和 Miyoshi 等，J. Virol. 72 8150-8157,1998。也可使用逆轉錄病毒載體，包括基於鼠白血病病毒的載體。使用基於逆轉錄病毒載體的方法論述在例如Hu和Pathak, Pharmacol. Rev. 52 =493-511,2000 ；和 Fong 等，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17 1-60，2000。可用的其它病毒載體包括甲病毒(Alphaviruses)，包括塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)和辛德比斯病毒(Sindbis Virus) 0雜合病毒載體可用於將E選擇素基因遞送至靶組織(例如，糖尿病性創面)。構建雜合載體的標準技術為本領域技術人員所熟知。此類所述技術可在例如 Sambrook 等，In Molecular Cloning :A laboratory manual。Cold Spring Harbor, NY 或許多討論重組DNA技術的實驗室手冊中找到。在一些實施方案中，本文所述的組合物和方法的核酸可併入rAAV載體和/或病毒粒子中，以有利於其向細胞內的引入。有用的rAAV載體為重組核酸構建體，其包括(1) 要表達的異源序列(例如，編碼E選擇素蛋白的多核苷酸)和(2)有利於異源基因整合和表達的病毒序列。病毒序列可包括在cis中將DNA複製和包裝到病毒粒子(例如，功能性 ITR)所需的AAV的那些序列。在典型應用中，異源基因編碼E選擇素，其可用於增加糖尿病受試者的骨髓衍生祖細胞向創面的遷移和促進創面癒合。此類rAAV載體還可包含標記物或報告基因。有用的rAAV載體的一個或多個AAV WT基因完全或部分缺失，但仍保留功能性側翼ITR序列。AAV ITR可以是適於特定應用的任何血清型(例如，源於血清型2)。使用 rAAV 載體的方法論述在例如 TaI，J.，J. BioMed. Sci. 7 :279-291，2000 和 Monahan and Samulski, Gene delivery 7:24-30,2000。本發明的核酸和載體可併入rAAV病毒粒子中，以有利於核酸或載體向細胞的引入。AAV的衣殼蛋白構成外表面、病毒粒子的非核酸部分並且由AAV cap基因編碼。該 cap基因編碼三種病毒外殼蛋白質VP1、VP2和VP3，這三種病毒外殼蛋白質對於病毒粒子裝配是必須的。rAAV病毒粒子的構建已有描述。參見例如，美國專利No. 5，173，414、 No. 5，139，941、Νο· 5，863，541 和 No. 5，869，305,No. 6，057，152,No. 6，376，237 ；Rabinowitz 等，J. Virol. 76 :791-801,2002 ；和 Bowles 等，J. Virol. 77 :423_432，2003。可用於本發明的rAAV病毒粒子包括源於多種AAV血清型(包括1型、2型、3型、 4型、5型、6型、7型、8型和9型)的那些rAAV病毒粒子。不同血清型的AAV載體和AAV 蛋白的構建和使用在以下文獻中有所論述=Chao等，Mol. Ther. 2 =619-623,2000 ；Davidson 等，PNAS 97 :3428-3432,2000 ；Xiao 等，J. Virol. 72 :2224-2232, 1998 ；Halbert 等， J.Virol. 74 1524-1532，2000 ；Halbert 等，J.Virol. 75 :6615-6624,2001；和 Auricchio 等，Hum. Molec. Genet. 10 :3075_3081，2001。還可用於本文所述組合物、試劑盒和方法的是假型rAAV。假型載體包括給定血清型假型的AAV載體，其中衣殼基因源於不同於給定血清型的血清型。涉及假型rAAV病毒粒子的構建和使用的技術是本領域中已知的，並且在以下文獻中有所描述=Duan等， J. Virol, 75 :7662-7671,2001 ；Halbert 等，J. Virol, 74 :1524-1532,2000 ；Zolotukhin 等， Methods, 28 158-167，2002 ；和 Auricchio 等，Hum. Molec. Genet. 10 :3075_3081，2001。與非突變衣殼病毒粒子相比，病毒粒子衣殼內具有突變的AAV病毒粒子可用於更有效地感染特定細胞類型。例如，合適的AAV突變體可具有配體插入突變，以有利於將AAV 靶向至特定細胞類型。包括插入突變體、丙氨酸篩選突變體和附加表位突變體在內的AAV 衣殼突變體的構建和表徵在mi等，J. Virol. 74 :8635-45,2000中有所描述。可用於本文所述方法和組合物的其它rAAV病毒粒子包括由病毒的分子育種以及外顯子改組所產生的那些衣殼雜合體。參見 Soong 等，Nat. Genet. 25 :436-439, 2000 ；以及 Kolman 和 Memmer Nat. Biotechnol 19 :423-428,2001 可通過注射(例如通過團注射或連續輸注)來進行病毒載體或病毒顆粒的腸胃外施用。用於注射的製劑可以單位劑型存在，例如，在安瓿瓶或在多劑量容器中，並加入防腐劑。所述組合物可採用例如在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式，並且可包含例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑的配製劑。作為另外的選擇，載體或病毒顆粒可呈粉末形式(例如，凍幹的)，以便在使用前與合適的媒介物(例如，不含熱原的滅菌水)組構。除了病毒載體之外，可使用將編碼E選擇素的核酸引入具有至少一種糖尿病性創面的糖尿病受試者的任何合適的媒介物或載體。例如，可使用基於超聲的基因遞送技術。另外的實例包括粒子轟擊和細胞電通透。也可使用與質粒DNA形成多細胞聚集體的合成基因轉移分子。此類分子包括聚合DNA結合陽離子(Guy等，MoI. Biotechnol. 3 =237-248,1995)， 陽離子兩親物(脂多胺和陽離子脂質，Feigner等，Ann. NY Acad. Sci. 772 126-139，1995) 和陽離子脂質體(Fominaya 等，J. Gene Med. 2 :455-464,2000)。在一些實施方案中，將包含rAAV-E選擇素載體或病毒的EPC施用於糖尿病受試者，以治療一種或多種糖尿病性創面。可使用若干種方法將EPC引入受試者，包括導管介導的遞送I. V.(例如，血管內導管)，或直接注射到靶位點(例如，糖尿病性創面)中。用於分離供體幹細胞和移植此類分離細胞的技術是本領域中已知的。本文所述的方法還設想用 rAAV病毒粒子轉導的細胞的體外遞送。體外基因遞送可用於將例如rAAV轉導的宿主細胞 (例如，EPC)移植回宿主中。合適的體外方案可包括若干步驟。可從宿主中收穫一部分靶組織(例如，骨髓衍生EPC)，並且可使用rAAV病毒粒子將E選擇素編碼核酸轉導至受試者 (即，宿主)細胞中。然後這些經遺傳修飾的細胞可移植回受試者中。可使用若干種方法將細胞重新引入受試者中，包括靜脈內注射、腹膜內注射或原位注射到靶組織中。用經體外修飾的rAAV轉導或感染的細胞的微囊化是可使用的另一種技術。根據本發明，可使用自體和異體細胞移植。為了增加BM衍生祖細胞從BM到非BM隔室(例如，靶組織)的募集，如本文所述的用於促進創面癒合的組合物除了 E選擇素和SDF-I α之外，可包含能夠促進BM衍生祖細胞募集的任何其它製劑。許多此類製劑是已知的。參見，例如國際申請WO 00/50048中描述的那些；整聯蛋白(例如，α 4、α 5)、黏附分子的選擇素家族、VCAM-I和集落刺激因子。本文所述的治療方法通常包括將治療有效量的本文所述的組合物施用於需要其的受試者(例如，動物、人)，包括哺乳動物，特別是人。此類治療將適於施用於患有、具有、
15易患疾病、病症或其症狀或處於患疾病、病症或其症狀的風險的受試者，特別是人。「處於風險」的那些受試者的判定可通過任何客觀或主觀判定(通過診斷性試驗或受試者或醫療服務人員的意見)來完成。本文的方法和組合物還可用於治療任何可能涉及下調E選擇素信號轉導、表達或活性的其它病症。在一個實施方案中，促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法包括監測治療進展。監測受試者的治療進展通常包括測定具有糖尿病性創面的受試者的創面尺寸的測量值或其它診斷測量值，然後對受試者施用足以促進受試者的創面癒合的治療量的本文所述的組合物。在將足以促進癒合的治療量的本文所述的組合物施用於受試者後的一個或多個時間點，測定創面尺寸的第二次測量值，並與創面尺寸的第一次測量值進行比較。將第一次測量值與隨後的測量值進行比較，以監測創面癒合的過程(例如，創面尺寸減小)和治療功效。試劑盒本文描述了用於治療哺乳動物受試者的至少一種糖尿病性創面的試劑盒。典型的試劑盒包含治療有效量的組合物，該組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種治療劑 (諸如E選擇素蛋白、編碼E選擇素蛋白的核酸或特異性上調E選擇素表達的試劑)，以及使用說明書。在一個實施方案中，試劑盒包含治療組合物(包含治療有效量的E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調E選擇素表達的試劑)以及使用說明書。例如， 用於治療哺乳動物受試者的至少一種糖尿病性創面的試劑盒包含治療組合物，該組合物包含治療有效量的E選擇素蛋白或編碼E選擇素(例如，rAAV-E選擇素)的核酸和治療有效量的促進創面癒合的SDF-I α以及單位劑型的藥學上可接受的載體。通常，本文所述的試劑盒包括包裝和使用說明書。在一些實施方案中，試劑盒包括容納治療性或預防性組合物的無菌容器；此類容器可為盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩包裝或本領域中已知的其它合適的容器形式。此類容器可由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或其它適於容納藥物的材料製成。在其中除了本文所述的治療組合物外還將高壓氧治療施用於待治療的受試者的實施方案中，使用說明書通常包括用於對受試者施用高壓氧治療的說明書。在要將EPC(例如，包含rAAV-E選擇素的EPC)施用於糖尿病受試者的實施方案中，如本文所述的試劑盒包含治療量的EPC以及用於將細胞施用於具有一種或多種糖尿病性創面的受試者的說明書。可通過適於運送和儲存細胞的任何方式封裝細胞；此類方法是本領域所熟知的。說明書通常包括以下的一種或多種細胞描述；劑量日程表和用於治療糖尿病性創面的施用方法；注意事項；警告；適應症；禁忌症；過劑量信息；不良反應；動物藥理學；臨床研究；和/或參照。可將說明書可直接印在容器(如果有)，或作為施加至容器的標籤，或作為單獨的紙頁、小冊子、卡片或折頁在容器中或與容器一起提供。組合物的施用本發明的組合物可以任何合適的製劑施用於哺乳動物(例如，齧齒動物、人)。 例如，如本文所述的用於促進創面癒合的組合物(例如，E選擇素、編碼E選擇素的核酸、SDF-I α)可配製成藥學上可接受的載體或稀釋劑，諸如生理鹽水或緩衝鹽溶液。可根據施用模式和途徑以及標準藥學實踐選擇來選擇合適的載體和稀釋劑。示例性的藥學上可接受的載體和稀釋劑以及藥物製劑的描述可在本領域的標準文本Remington' s Pharmaceutical Sciences以及USP/NF中找到。可向組合物中添加其它物質以穩定和/或保存組合物。可通過任何常規技術將本發明的組合物施用於哺乳動物。通常，此類施用將為局部施用(例如，氣霧劑、霜膏、泡沫劑、凝膠、液體、軟膏、糊劑、粉末、洗劑、噴劑、貼劑、貼片或敷料)或口服施用。當組合物在一個實施方案中配製成用於口服遞送時，活性化合物可以與賦形劑混合，並以可吸收的片劑、口含片、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、薄片劑等的形式使用。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可以包含下列組分粘合劑，例如黃芪膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸等；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；並且可以加入甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精，或者調味劑，例如薄荷、冬青油或櫻桃調味劑。當單位劑型是膠囊時，除了上述類型的物質以外，其可包含液體載體。多種其它材料可作為包衣存在或以其它方式改變劑量單位的物理形式。例如， 可用紫膠、糖或兩者對片劑、丸劑或膠囊進行包衣。酏劑的糖漿可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的甲基和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調味劑(例如櫻桃或柑橘調味劑)。此外，活性化合物可以摻入到持續釋放、脈衝釋放、控制釋放或延遲釋放的製劑或劑型中。作為另外的選擇，施用可為腸胃外施用(例如，靜脈內、皮下、瘤內、肌肉內、腹膜內或鞘內引入)。本文中也可以通過真皮內貼劑提供組合物，即，將貼劑鄰近待治療的皮膚區域施用。如如本文所使用的「貼劑」包括至少本文提供的組合物和覆蓋層，使得可將貼劑置於待治療的皮膚區域上。貼劑可被設計成使本文提供的組合物透過角質層到達表皮或真皮中的遞送最大化、減少滯後時間、促進均勻吸收和減少機械磨擦。還可通過例如，手術遞送至內部或外部靶部位，或通過導管(例如，血管內導管) 到達血管可觸及的部位，從而將組合物直接施用至靶部位。當治療具有糖尿病性創面的受試者時，可將組合物通過靜脈內施用至受試者，直接到達創口中或到達創面。可以快速灌注、多次注射或通過連續輸注(例如，靜脈內，通過腹膜透析、泵輸注)來使用組合物。對於腸胃外施用，將組合物優選地配製成無菌的不含熱原的形式。如本文所述的藥物組合物可配製成大致在施用時即刻或在施用後的預定時間或時間段釋放治療劑(例如，E選擇素蛋白、編碼E選擇素的核酸、特異性上調E選擇素表達的試劑)。後一類型的組合物通常稱為控釋製劑。可使用在體內形成基本上恆定的藥物濃度並歷經持續時間段的製劑。在另一個實施方案中，可使用在預定滯後時間後在體內形成基本上恆定的藥物濃度並歷經持續時間段的製劑。作為另一個實例，可使用這樣的製劑，其通過在體內保持相對恆定有效的水平，同時將與活性物質的血漿水平波動相關的不利副作用降至最低來在預定時間段維持作用。還可在本文所述的組合物中使用的是允許方便給藥使得以例如一周一次或兩周一次來施用劑量的製劑，以及通過使用例如滲透泵或基於超聲的基因遞送技術將治療劑遞送到特定細胞類型(例如，內皮細胞)來靶向糖尿病性創面的製劑。可使用許多策略來實現使所遞送治療劑的釋放速率大於代謝速率的控釋。在一個實例中，通過適當選擇多種種製劑參數和成分，包括例如多種類型的控釋組合物和包衣來實現控釋。治療劑可與適當的賦形劑配製成藥物組合物，該藥物組合物在施用時以可控方式釋放治療劑。實例包括單或多單位片劑或膠囊組合物、油性溶液、懸浮液、乳劑、微膠囊、 微球、分子絡合物、納米顆粒、貼劑和脂質體。
有效劑量上述組合物優選地以有效量施用於哺乳動物(例如，人)，即，該量能夠在被治療的哺乳動物中產生期望結果(例如，通過特異性上調E選擇素在成熟EC中的表達而引起增加EC-EPC黏附、EPC歸巢和創面新血管形成，以此促進小鼠的糖尿病性創面癒合)。此類治療有效量可按下文所述進行確定。可通過標準藥物程序、使用培養物中的或實驗動物的細胞來測定LD5tl(使50%的群體致死的劑量)，從而確定本發明的方法中所利用的組合物的毒性和治療功效。毒效和療效之間的劑量比為治療指數，並且其可以表示為比率LD5(i/ED5(i。表現出大的治療指數的那些組合物是優選的。當使用表現出毒副作用的那些組合物時，應注意設計將此類副作用的潛在損傷降至最低的遞送體系。優選組合物的劑量優選地在包括具有很小或無毒性的ED5tl 的範圍之內。該劑量可根據所採用的劑型和所利用的施用途徑在此範圍內發生變化。正如醫療和獸醫領域中所熟知，用於任何一個受試者的劑量取決於多種因素包括受試者的體格、身體表面積、年齡、待施用的具體組合物、時間和施用途徑、總體健康情況以及同時施用的其它藥物。對於顆粒的靜脈內施用而言，預期適當的劑量將在例如每個創面約IO9個病毒顆粒的範圍內，而對於重組蛋白(例如，SDF-Id、E選擇素)而言，適當劑量例如為25μ g/kg。
實施例通過以下具體實施例對本發明做進一步闡釋。所提供的這些實施例僅用於舉例說明，而不應理解為以任何方式對本發明的範圍進行限制。實施例I-E選擇素響應於SDF-I α而介導內皮祖細胞歸巢並且介導正常肢體血管再形成和創面癒合速率對未癒合糖尿病相關的微血管病和未癒合創面的潛在臨床效用。SDF-I α用作使EPC從骨髓募集到需要新血管形成的周邊區域的歸巢信號(Gallagher 等，SDF-I α as a critically important factor，deficient in Diabetes-associated non-healing cutaneous wounds J Clin Invest 2007，117 1249-1259)，但是迄今為止尚未發現SDF-I α導致循環EPC歸巢至靶組織的機制。據推測毛細管內層的成熟EC和循環EPC之間需要直接的細胞間相互作用，以實現EPC到靶組織的歸巢，並且此類相互作用影響肢體血管再形成和表皮創面癒合的速率。本文描述了對由成熟EC上介導EPC歸巢過程的SDF-I α所調節的特異性黏附分子的鑑定；得自小鼠和人細胞研究的新數據將此分子鑑定為E選擇素。另外的數據表明肢體血管再形成和創面癒合受到組織水平的E選擇素表達的有利影響。還推測局部遞送至患有微血管病的未癒合創面(諸如糖尿病患者的未癒合創面)的E選擇素將達到作為新的創面癒合技術的效用。正在開發可在局部缺血性和糖尿病性創面中進行測試的編碼E選擇素的AAV載體。使用RT2 Profiler PCR陣列，在培養的人成熟EC中對由SDF-1 α誘導的細胞外基質和黏附分子進行研究。經所述陣列發現顯著提高了基因表達的分子通過蛋白質印跡法和免疫組織化學得以證實。通過細胞黏附和跨內皮遷移測定來研究SDF-I α對人EPC與EC 之間的直接細胞間相互作用的效應。通過在體外和體內使用拮抗劑來研究鑑定的黏附分子在介導SDF-I α誘導的EC-EPC相互作用、EPC歸巢、肢體血管再形成和創面癒合方面的特殊作用。進行骨髓移植實驗(將得自Rasd6小鼠的骨髓細胞移植到E-sel+/+與E-sel+小鼠中)，以研究EPC到創面的募集和創面癒合速率，有或無E選擇素的組織水平的表達。通過ANOVA分析數據。SDF-I α顯著增加了體外EC-EPC黏附和跨內皮遷移，並且增強了體內EPC歸巢。 SDF-I α特異性上調E選擇素而非P選擇素和L選擇素在培養的人成熟微血管EC和實驗小鼠的血管中的表達。SDF-Ia對EC-EPC黏附和EPC歸巢的調節效應受到E選擇素的特異性介導，因為施用E選擇素拮抗劑顯著抑制了 SDF-I α誘導的EC-EPC黏附、跨移和EPC歸巢。 E選擇素的組織水平表達是體內正常創面癒合和新血管形成所需要的，並且有利地影響這兩種對正常癒合和糖尿病相關的未癒合創面中存在缺陷關鍵的生物學事件。總之，SDF-I α特異性上調E選擇素在成熟EC中的表達，從而引起增加EC-EPC黏附、EPC歸巢、肢體血管再形成和創面癒合。這些新的發現使人們對潛藏在SDF-I α對EPC 歸巢和糖尿病性創面癒合的生物效應背後的分子機制有了深刻的理解，並且通過直接推論指明E選擇素為在糖尿病相關微血管病和未癒合表皮創面中對EPC運輸、新血管形成和創面癒合進行治療性操縱的新靶標。實施例2-將E選擇素鑑定為調節出生後新血管形成影響糖尿病性創面癒合的新靶標此前報導，在糖尿病性創面中SDF-I α ( 一種使EPC募集新血管形成區域的歸巢信號)被下調(Gallagher 等，J Clin Invest 2007,117 =1249-1259) 在以下描述的實驗中， 研究了成熟EC和循環EPC通過其實現SDF-I α介導的EPC歸巢的信號。與注射對照細胞相比，通過注射SDF-I α工程改造的骨髓衍生成纖維細胞使糖尿病性創面中的SDF-I α治療性增加(N = 48(20, NOD)，(28, STZ-C57))。通過蛋白質印跡法和免疫組織化學驗證PCR 陣列基因表達差異。通過在體外和體內使用拮抗劑來進一步研究黏附分子在介導SDF-I α 誘導的EPC歸巢和創面癒合方面的作用。經由基於細胞的療法增加創面SDF-I α促進了糖尿病小鼠的癒合(截止第3天癒合率增加 20%，p = 0. 006)。SDF-I α增加了 EC-EPC 黏附，並且特異性上調E選擇素在人微血管EC中的表達(2. 3倍增加，ρ < 0. 01)。此效應在實驗小鼠的血管中也是顯著的，並且導致創面新血管形成增加。SDF-Ια對EC-EPC黏附和EPC歸巢的調節效應受到E選擇素的特異性介導，因為施用E選擇素拮抗劑顯著抑制了 SDF-I α誘導的EC-EPC黏附、EPC歸巢、創面新血管形成和創面癒合。SDF-I α工程改造的基於細胞的療法通過特異性上調E選擇素在成熟EC中的表達而導致EC-EPC黏附增加、EPC 歸巢以及創面新血管形成增加，從而促進小鼠的糖尿病性創面癒合。這些發現使人們對潛藏在SDF-I α對EPC歸巢的生物效應背後的信號有了新的了解，並且指明E選擇素是對糖尿病性創面癒合中的EPC運輸進行治療性操縱的新靶標。材料和方法HMVEC分離自正常人真皮，並且在塗覆明膠的板上進行培養。人EPC 購自NDRI，Philadelphia, PA,並且在包含補充物和5 %胎牛血清(FBS) (Cambrex Bioscience, ffalkersville, MD)的完全EGM2培養基中進行培養。在補充有10% FBS的 DMEM(Invitrogen, Carsbad, CA)中培養和 NIH/3T3 細胞。所有細胞均在 37°C下於包含5% (X)2的98%潮溼空氣中進行孵育。對於細胞黏附和跨內皮遷移測定，將EPC用 Dil-Ac-LDL (BT-902，Biomedical Technologies, Stoughton, ΜΑ)在 37°C下標記 4 小時，並且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBQ衝洗。將亞匯合HMVEC或EPC用重組人SDF-I α (100ng/ml)刺激實驗中所示的各個時間。BSA(100ng/ml)用作對照。8-12 周齡的野生型(WT)雌性C57 BL6 小鼠購自 Charles River (Wilmington,ΜΑ)。 10-12 周大的 NOD (NOD/shilTJ)、8 周大的 E_sel+(B6. 129S4-seletmiDmil/J)小鼠和 10-12 周大的 Rosa^(IacZ+) (B6. 129S7-GT (ROSA) 26sor/J)小鼠購自 Jackson Laboratory (Bar Harbor,ME)。對於所有手術程序，通過i. p.注射80mg/kg氯胺酮和20mg/kg甲苯噻嗪使小鼠麻醉。對於骨髓移植實驗，將IX IO7個得自Rosd6小鼠的骨髓細胞懸浮在100 μ 1 PBS 中，並且通過尾靜脈注射移植到E-sel+或WT小鼠(C57 BL6)中。按照此前所述誘導和監測鏈脲菌素(STZ，Sigma-Aldrich)糖尿病(Gallagher等， J Clin Invest 2007,117 =1249-1259) NOD小鼠通常在14-20周內發展產生糖尿病。研究了總共48隻糖尿病小鼠(N = 28，STZ-C57 ；N = 20，N0D)。使用血糖儀測定小鼠尾靜脈的血糖。一旦血糖達到250mg/dl，就對小鼠每天進行測定並保持3天，然後用於實驗中。糖尿病小鼠的平均血糖水平為446mg/dl(範圍為356-5iang/dl)，而對照非糖尿病小鼠的平均血糖水平為12aiig/dl (範圍為96-137mg/dl)。使用6mm鑽取活檢在小鼠背部的背面造成創面。移除全層皮膚，露出下面的肌肉。根據此前證明最佳病毒轉導效率的研究和預計的可能臨床相關性，選擇慢病毒載體用於體外研究，並且選擇腺相關病毒載體用於體內實驗，以作為操縱SDF-I α水平的工具。通過將人或鼠SDF-I α基因插入ρΗΧ載體來構建人SDF-lcc/lenti(Balint等，J Clin Invest 2005,115:3166-3176)。如此前所述構建對照載體 GFP/lenti (Liu 等，Cancer Res 2006,66 :4182-4190)。通過用所述三種質粒共轉染細胞來實現假型慢病毒的製備 (Liu等，FASEB J 2006,20:1009-1011)。轉染後48小時收集的慢病毒在ΝΙΗ/3Τ3細胞中表現出大約IO7個轉導單位/ml的滴定濃度。為通過慢病毒感染靶細胞，在4yg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)存在下將細胞暴露於MOI (多重性感染)5的病毒接觸六小時。然後將細胞洗滌，用常規完全培養基另外培養兩天，並且通過ELISA分析蛋白質表達或匯集用於隨後的各實驗所示的分析。通過將鼠SDF-I α或LacZ基因插入AAV2載體中來構建鼠 SDF-I α/AAV 和對照載體 LacZ/AAV(Gao 等，Curr Gene Ther 2005,5:285-297)。通過用三種質粒轉染293細胞來製備AAV，並且將AAV通過肝素色譜法純化並進行滴定。對於使用重組AAV的局部創面注射，將100 μ 1 PBS中IO12個病毒單位/ml的AAV注射到創面基底中。 對於基於細胞的療法，通過將鼠骨髓細胞在塑料培養皿上於補充有10% FBS的DMEM培養基中培養兩周，同時每3天更換一次培養基，以此產生骨髓衍生的成纖維細胞(BMDF)。貼壁細胞呈錠形並且為與肌成纖維細胞顯型一致的α -平滑肌肌動蛋白+(a SMC+)。用編碼鼠SDF-I α或GFP的慢病毒載體轉導BMDF (作為對照)。通過ELISA證實BMDF中的外源 mSDF-1 α的表達(數據未示出)。形成6mm鑽取活檢皮膚創面，並且將懸浮在100 μ 1 PBS 中的1 X l(fmSDF-l α /BMDF與GFP/BMDF注射到創面中。人黏附分子&ECM RT Profiler PCR陣列定量描繪了黏附分子和ECM的84種基因的表達(#PA-011, SABiosciences, Frederick,MD)。使用Trizol (Invitrogen)從細胞中提取全部RNA，並且使用RTaFirstStrand試劑盒(SABiosciences)合成cDNA。根據製造商的協議實施PCR陣列。閾值周期(Ct)值用於繪製標準曲線。將所有樣品均歸一化為肌動蛋白的相對水平，並且將結果表示為相對水平的螢光強度。根據製造商方案，通過Quantikine SDF-I α ELISA 試劑盒(DY460，R&D Systems)測定細胞培養物上清液中SDF-I α的濃度。將HMVEC的EC單層在M孔板中培養至接近匯合度，並用lOOng/ml的重組人 SDF-I α或BSA刺激8小時。隨後，用不含SDF-I α的EGM2培養基替換培養基。將預先標記並且以懸浮液在2%瓊脂糖塗覆的板上培養16小時的1 X IO5個Dil-Ac-LDL標記的EPC 加入孔中，並且在37°C下與HMVEC單層共同培養1小時。將未結合的EPC用PBS洗滌兩次除去，並且將黏附的Dil-Ac-LDL標記的EPC通過螢光掃描儀(GE Typhoon Trio,Piscataway, NJ)測定並照相。將IX IO4個細胞/孔的HMVEC在纖連蛋白(5 μ g/ml)塗覆的Mtranswell小室 (8. 0μ M孔；Falcon 353097, Becton Dickinson Bedford, ΜΑ)的上室中進行培養。在每次實驗之前，通過倒置螢光顯微鏡確認單層。將HMVEC單層用lOOng/ml的重組人SDF-I α或 BSA刺激8小時。將以上詳述的預先標記的1 X IO4個Dil-Ac-LDL標記EPC加入0. 3mL基礎EGM2培養基的上室中。將0. 6mL完全EGM2培養基加入transwell小室的下室中。將細胞在37°C下培養12小時，並且量化從transwell小室的上室到下室穿越的EPC。按照(Liu等，Mol Cell Biol 2003,23 :14-25)所述進行免疫印跡。將膜用E選擇素的抗體(Ab) (ab-18981)或 β-肌動蛋白(AC-15，Abeam, Cambridge, ΜΑ)探測。然後用 HRP 綴合的二抗 Ab(&inta Cruz, Santa Cruz, CA)進行探測，並進行 ECL(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。將膜脫去，並且根據各實驗所需進行再次印跡。對於免疫染色和免疫組織化學(IHC)，將5 μ m石蠟或冰凍切片進行加工，然後在 4°C下與 FITC-抗-E 選擇素(R&D Systems)、PE-抗-KDR(Cell Signaling Technology, Danvers,ΜΑ)或抗-SDF-1 α (sc28876, Santa Cruz)孵育過夜，然後用HRP綴合的二抗進行孵育。使用DAB試劑盒(Dako, Carpinteria, CA)檢測免疫反應性。用DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA)或蘇木精(IHC)對細胞核進行復染。通過用得自同一製造商的非免疫原同型匹配Ab替換一抗來製備所有抗體的陰性對照。為了誘發肢體局部缺血，將全長(約3-4mm)的右股動脈/靜脈血管束結紮並切除(研究兩組小鼠E-sel+小鼠(n = 6)和WT小鼠(n = 6))。然後將皮膚用5-0尼龍 ^thicon)封閉。通過雷射都卜勒灌注成像證實肢體局部缺血。使用4mm鑽取活檢在小鼠股骨的腹側面上造成局部缺血性後肢創面。移除皮膚的全層部分，以露出下面位於股骨彎折的水平位置遠端的肌肉。使重組鼠SDF-I α蛋白(R&D Systems)在PBS中重構，並在手術剛好完成後注射到創面基底(25yg/kg)中。隨後用Olympus數位照相機對創面連續每天拍攝數碼照片。所有照片中均包括標尺，以允許校準測量值。使用 ImageJ 軟體(Imaging Processing and Analysis in Java, National Institutes of Health，MD)分析圖像。每天測定創傷面積，並且將創面恢復百分率表示為[(初始創傷面積-日創傷面積)/(初始創傷面積)]X 100。使用專門配製的包含Dil (D482dnvitrogen/分子探針)的水溶液(7ml/小鼠)、 通過活體灌注直接在體內標記麻醉小鼠的小鼠血管，所述水溶液在接觸時併入內皮細胞膜中，並且在處死動物之前經由直接心內注射施用。在Di 1灌注後注射7ml固定劑G%多聚甲醛)，並且收穫全部創面組織。通過使用雷射掃描共聚焦顯微鏡(Vibratome (VT1000S, Leica Microsystems)掃描厚度或深度為200 μ m的整個創面組織來顯現血管網。使用ImageJ軟體量化血管密度，以評估歸一化為全部掃描創傷面積的紅色Dil標記血管的總數目。
使用雷射都卜勒灌注成像(LDI)(Periscan PIM II，Perimed AB, Sweden)每日對肢體灌注進行評估。將肢體定義為小鼠股骨彎折處遠端的所有成像組織。在具有基於重量的鎮靜作用的溫度控制設備中進行LDI，以將溫度波動和鎮靜作用水平所引起的人為因素減至最少。將相對灌注數據表示為局部缺血性(右)與正常(左))肢體血流量的比率。在形成局部缺血性後肢創面(右)後通過尾靜脈注射將得自10 12周大的Rosa^ (LacZ+)小鼠的1 X IO7個骨髓細胞移植到Ε-sel+小鼠(n = 6)禾Π WT小鼠(η = 6)中。通過半乳糖苷酶測定量化募集到創面組織並且融入組織切片中的血管中的LacZ+EPC的數目。將收穫的創面組織冷凍，並且然後將組織切片在室溫下與 X-gal (Fermentas，Canada)和抗 _KDR(ab_2349，Abeam)孵育 2 小時。用核固紅(Vector Labs)對切片進行復染。通過對術後第7天的切除創面(n = 3)下的創面肉芽組織連續切片中的KDR+血管內的β -半乳糖苷酶+細胞進行計數，來量化EPC的數目，其中採用至少3 個連續切片，每個切片採用5個隨機高倍視野(HPF，40X)。使用ANOVA和雙尾Mudent t檢驗對差異進行統計分析。使用Microsoft Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA)分析數據。數據以平均值士標準誤差表示。當ρ 1.5倍)，而20種下調(< 1.5倍)，並且51種未變化(表1)。值得注意的是，E選擇素基因的表達在SDF-I α刺激後增加了約1. 3倍(圖3Α)。為了證實觀察到的 E選擇素的mRNA的上調，進行免疫印跡分析，並且證實與BSA處理的EC單層相比，SDF-I α 刺激的EC單層中E選擇素的蛋白質表達上調(圖:3Β)。為了進一步證實SDF-I α在體內使E選擇素在成熟內皮細胞中上調，通過免疫染色檢驗用mSDF-1 α /AAV與lacZ/AAV注射的糖尿病性NOD小鼠創面中的血管。用FITC綴合的抗-E選擇素Ab對E選擇素進行染色， 並用PE綴合的抗-KDR Ab對EC進行染色。與用LacZ/AAV注射的糖尿病性鼠創面相比，用 mSDF-1 α /AAV注射的糖尿病性鼠創面中新血管的EC表達出更強的E選擇素(黃色)(圖 3C)。通過IHC證明mSDF-1 α /AAV的組織水平增加(圖3D)。這些實驗將E選擇素鑑定為一種關鍵的黏附分子，其上調作為血管EC中SDF-I α的下遊靶標。表1-SDF-1 α刺激後4小時內HMVEC中基因的上調和下調。上調
C011A1/C0LL6
CD49D/IA4
CD49f/ITGA6B
CD51/DKFZp686A08142
LAMB2
CLG1/HNC
CD62E/ELAM
CD62/CD62P
DYT11/ESG
BNSP/BSPI
THBS/TSP
CLGI/EPA
CD 106/DKFZp779G23 3 3
下調
CSPG2/DKFZp686K06110
CCN2/HCS24
CTNNB/DKFZp686D02253
CAS/CTNND
CIG/DKFZp686F 10164
BB2/CD54
CD49a/VLAl
mRNA變化倍數 2.14 1.87 2.14 2.3 2
3.73 2.3 2.3
1.74 2.14 1.74 1.74 2.14
-2.14 -3.03 -2.00 -3.73 -3.48 -2.82 -4.90BR/CD49B-3.03CD49e/FNRA-5.30CD29/FNRB-2.30CD61/GP3A-2.30FLJ26658-8.57LAMM-2.82CLM-2.82LAMNBl-5.28MMP-X2/MTmmP2-6.06CLG4/CLG4A-4.28ON-2.63CAR/CMAR-4.00TSP3-2.46上調的E選擇素負責介導SDF-I α增強的EC-EPC相互作用和EPC跨內皮遷移。 為了研究上調的E選擇素是否負責介導SDF-I α增強的EC-EPC黏附，測試E選擇素拮抗劑對EPC對SDF-I α刺激的EC單層的體外黏附的效應。將M孔板中培養的亞匯合HMVEC用 100ng/ml的重組人SDF-I α或BSA刺激8小時，並且將培養基用包含E選擇素中和Ab或同型匹配對照Ab (2 μ g/ml)的不含SDF-I α的EGM2培養基更換，並且在37°C下孵育15分鐘，然後添加EPC。隨後，將以上詳述的預先標記的IX IO5個Dil-Ac-LDL標記的EPC加入孔中，並且在37°C下與EC單層共同培養1小時。將未結合的EPC用PBS洗滌兩次除去，並且通過螢光掃描儀測定黏附的Dil-Ac-LDL標記的EPC。E選擇素中和Ab的添加顯著抑制了黏附到SDF-Ia刺激的EC單層的EPC的數目，而對照Ab無顯著效應(圖4A)。為了進一步研究E選擇素在介導EPC與EC單層之間的特定相互作用方面的生物學功能，檢驗EPC 與EC單層之間增加的黏附是否導致更多的EPC跨移穿過EC單層，如果是，則檢驗此跨移效應是否依賴於E選擇素。在體外transwell系統中測試EPC跨內皮遷移。在YhSDF-Ia 或BSA存在下，將HMVEC單層在內皮細胞transwell小室的上室中進行培養。在將EPC加入小室的15分鐘前，分別用含有YhSDF-Ia或BSA的新鮮培養基更換下室中的EGM2培養基。將按上述製備的IX IO5個Dil-Ac-LDL標記的EPC的懸浮液加入小室中並在37°C下培養過夜。與BSA處理的EC單層相比，SDF-I α刺激的EC單層顯示顯著增加了 EPC從上 transwell小室到下transwell小室的跨移(圖4B)。重要的是，此效應至少部分地依賴於 E選擇素，因為通過將中和AM2 μ g/ml)添加到transwell中而對E選擇素的阻斷能夠顯著抑制EPC跨內皮遷移(圖4B)。總的來說，這些結果證明上調的E選擇素負責介導SDF-I α 增強的EC-EPC黏附和EPC跨內皮遷移。0110SDF-1 α刺激上調E選擇素配體在EPC中的表達。最終，創面毛細管的內層 EC與循環EPC之間的直接相互作用將取決於兩種細胞類型的表面上的黏附分子的彼此相關的對應物。據推測，SDF-Ια可誘導EC和EPC上的相關黏附分子的表達。根據以上詳述的結果，即EC上SDF-I α誘導的E選擇素介導直接的EC-EPC相互作用，檢驗兩種E選擇素配體⑶44和⑶162 (PSGP-I)響應SDF-I α刺激而在EPC上的表達。將亞匯合人EPC分別用 Y hSDF-Ι α或BSA刺激多個時間段。收穫細胞，並進行免疫印跡分析。未刺激的EPC表達強的基礎水平的⑶162和低水平的⑶44。SDF-I α刺激上調⑶162和⑶44兩者在EPC中的表達(圖5)。⑶162和⑶44的誘導首先在SDF-I α刺激後4小時觀察到，並且持續增加直到16小時。這些實驗證實，EPC表達基礎水平的E選擇素配體，並且表明SDF-I α能夠上調這些E選擇素配體在EPC中的表達，這與以下總體假說一致，即可溶性因子SDF-I α通過特異性調節黏附分子在這兩種關鍵細胞類型、成熟內皮細胞和EPC上的分布來介導EPC歸巢效應。在鼠局部缺血性後肢和表皮創面模型中，E選擇素對於介導SDF-I α對EPC歸巢、 新血管形成和創面癒合的效應而言是必須的。為了研究SDF-I α誘導的E選擇素在EPC歸巢、新血管形成和表皮創面癒合方面的具體生物學重要性，採用結合骨髓移植的功能缺失方法。在E-sel+與WT小鼠中建立經由股骨結紮/切除和隨後的兩側4mm表皮切除創傷所形成的單側後肢局部缺血的鼠模型。將重組鼠SDF-I α經由直接創面注射施用至創面。通過將得自Rosd6 (LacZ+)小鼠的IX IO7個骨髓細胞經由尾靜脈注射到小鼠中來提供進一步治療，以(部分地)量化EPC歸巢對新血管形成和創面癒合的貢獻。LDI用於證實術後肢體局部缺血，並且經由隨時間推移測定的平均灌注值來監測和量化後肢血流的自發恢復。經由數碼攝影術獲得每日的創傷面積測量值。通過對在第7天自一半的實驗小鼠中收穫的創面組織進行血管Dil灌注和隨後的雷射掃描共聚焦顯微鏡法，來評估創面組織中的新血管形成。在剩餘的小鼠中，收穫創面並進行IHC。通過用β-gal (藍色)和抗-KDR進行雙重染色來檢測募集至創面組織且合併到血管的EPC。與WT小鼠相比，E-sel+小鼠的局部缺血性後肢表現出灌注隨時間的延遲的改善，正如顯著較低的平均通量測量值所示(圖6A)。 一致的是，E-sel+小鼠的局部缺血性創面比WT小鼠的閉合速率顯著較低(圖6B)。此外， 與WT小鼠的局部缺血性創面相比，E-sel+小鼠的局部缺血性創面的血管化更加不良(圖 6C)。E-sel+小鼠的局部缺血性創面中的不良新血管形成至少部分地與較少的EPC歸巢有關，因為與WT小鼠相比，在E-sel+小鼠的局部缺血性創面的血管中檢測到顯著較少的 LacZ+細胞(圖6D)。這些體內實驗證明E選擇素對於介導SDF-I α誘導的EPC歸巢、新血管形成和創面癒合而言是必須的。本文所描述的實驗證明SDF-I α特異性上調E選擇素在成熟EC中的表達和E選擇素配體在EPC上的表達，從而介導EC-EPC黏附和EPC歸巢。這些發現使人們對潛藏在 SDF-I α對EPC歸巢的生物效應背後的分子機制有了深刻的和新的理解，並且指明E選擇素為在糖尿病相關微血管病和延遲的創面癒合(以及其它局部缺血性創面)中對EPC歸巢進行治療性操縱的新靶標。對EC和EPC中E選擇素及其配體的調節提供了不僅調節EPC相關的直接血管生成響應，而且調節對創面癒合的相關的直接和間接效應的機會，所述效應與未解決的延遲的糖尿病相關表皮創面癒合的臨床問題內在地相關。其它實施方案可對組合物、試劑盒和方法步驟的部分或全部進行改進。本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請和專利在此以引用方式併入。除非另有聲明，本文提供的任何或所有實例或示例性語言(例如，「諸如」)的用途旨在解釋本發明，而並非對本發明的範圍進行限制。例如，儘管本文所述的實驗涉及糖尿病性創面，但本文所述的組合物、試劑盒和方法可用於多種其它治療性和預防性應用，包括任何糖尿病性創面。本文中關於本發明或優選實施方案的性質或有益效果的任何陳述並非旨在進行限制，並且所附權利要求不應視為受此類陳述的限制。更通常而言，說明書中的任何語言均不應解釋為指示任何未要求保護的要素對於本發明的實施而言是必須的。本發明在適用法律允許的條件下包括所附權利要求中所提及主題的所有修改和等效形式。此外，除非在本文另有指示或在上下文中清楚地禁忌，本發明還涵蓋上述要素以所有可能方式的任意組合。
權利要求
1.一種促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法，所述方法包括以下步驟提供治療有效量的組合物，所述組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種選自由下列組成的組的治療劑E選擇素蛋白、編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調E選擇素表達的試劑；和將所述組合物在條件下施用於所述受試者，使得受試者的骨髓衍生祖細胞向創面的遷移增加。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述組合物通過口服施用、局部施用或靜脈內施用。
3.根據權利要求1所述的方法，其中將所述組合物直接施用至所述創面或鄰近所述創面的部位。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述骨髓衍生祖細胞包括內皮祖細胞(EPC)。
5.根據權利要求1所述的方法，其中對所述受試者施用所述組合物引起創面癒合加速。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸以及特異性上調E選擇素表達的試劑，其中特異性上調E選擇素表達的所述試劑為SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。
7.根據權利要求1所述的方法，還包括對所述受試者施用高壓氧治療的步驟。
8.一種上調具有糖尿病性創面的糖尿病受試者的E選擇素表達的方法，所述方法包括將包含至少一種rAAV病毒粒子的組合物施用於所述糖尿病受試者，所述至少一種rAAV病毒粒子包含編碼E選擇素的多核苷酸，所述多核苷酸插入第一 AAV反向末端重複與第二 AAV 反向末端重複之間，所述組合物的量可有效上調E選擇素表達、誘導骨髓衍生祖細胞向所述創面遷移以及加速所述受試者的創面癒合。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述至少一種rAAV病毒粒子包含血清2型衣殼蛋白。
10.根據權利要求8所述的方法，其中將所述組合物直接施用至所述創面或鄰近所述創面的部位。
11.根據權利要求8所述的方法，其中所述骨髓衍生祖細胞包括EPC。
12.根據權利要求8所述的方法，還包括對所述受試者施用SDF-Ια蛋白或編碼 SDF-I α蛋白的核酸的步驟。
13.根據權利要求8所述的方法，還包括對所述受試者施用高壓氧治療的步驟。
14.一種促進糖尿病受試者的糖尿病性創面癒合的方法，所述方法包括以下步驟提供包含藥學上可接受的載體和多種骨髓衍生祖細胞的組合物，其中所述骨髓衍生祖細胞包含編碼E選擇素的多核苷酸；和以有效增加所述受試者的骨髓衍生祖細胞向所述創面的遷移並加速所述受試者的創面癒合的量將所述組合物施用於所述受試者。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述編碼E選擇素的多核苷酸包含在病毒載體內。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述病毒載體包含在病毒顆粒內。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述病毒載體為rAAV載體，並且所述病毒顆粒為AAV顆粒。
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述組合物還包含SDF-Ια蛋白或編碼 SDF-I α蛋白的核酸。
19.根據權利要求14所述的方法，其中將所述組合物直接施用至所述創面或鄰近所述創面的部位。
20.根據權利要求14所述的方法，其中所述骨髓衍生祖細胞包括EPC。
21.根據權利要求14所述的方法，還包括對所述受試者施用高壓氧治療的步驟。
22.一種用於治療哺乳動物受試者的至少一種糖尿病性創面的試劑盒，所述試劑盒包括(a)治療有效量的組合物，所述組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種選自由下列組成的組的治療劑E選擇素蛋白、編碼E選擇素蛋白的核酸和特異性上調E選擇素表達的試劑；和(b)使用說明書。
23.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸以及特異性上調E選擇素表達的試劑，其中特異性上調E選擇素表達的所述試劑為SDF-I α蛋白或編碼SDF-I α蛋白的核酸。
24.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述使用說明書包括用於對所述受試者施用高壓氧治療的說明書。
全文摘要
用於促進糖尿病性創面癒合的組合物、試劑盒和方法是基於SDF-lα特異性上調E選擇素在成熟內皮細胞(EC)中的表達，從而引起EC-內皮祖細胞(EPC)黏附和EPC歸巢增加這一發現。用於促進糖尿病受試者的創面癒合的方法包括提供治療有效量的組合物，所述組合物包含E選擇素蛋白或編碼E選擇素蛋白的核酸，以及任選的特異性上調E選擇素表達的試劑(例如，SDF-lα)。所述方法還可包括對所述受試者施用高壓氧治療。將所述組合物施用於所述受試者導致受試者的骨髓衍生祖細胞向創面遷移、創面癒合加速以及E選擇素表達上調。
文檔編號A61K48/00GK102421894SQ201080019437
公開日2012年4月18日 申請日期2010年4月9日 優先權日2009年4月21日
發明者O·C·維拉斯奎茲, Z-J·劉 申請人:邁阿密大學