δ-內毒素基因及其使用方法

2023-10-25 19:43:22 2

專利名稱：δ-內毒素基因及其使用方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域。所提供的是編碼殺蟲蛋白質的新基因。這些蛋白質及編碼它們的核酸序列可用於製備殺蟲製劑以及生產轉基因的抗害蟲植物。
背景技術：
蘇雲金芽孢桿菌是形成孢子的革蘭氏陽性土壤細菌，特徵在於它能產生對某些目和種的昆蟲有特異性毒性、但對植物和其它非靶向生物體無害的晶狀內含物。因此，含蘇雲金芽孢桿菌菌株或它們的殺蟲蛋白質的組合物可用作環境可接受的殺蟲劑，以抑制農業有害昆蟲或針對多種人或動物疾病的昆蟲載體。來自蘇雲金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白質(δ -內毒素)具有主要針對鱗翅類、 雙翅類和鞘翅類幼蟲的有效殺蟲活性。這些蛋白質還顯示出抗膜翅目、同翅目、風、食毛目和蟎等有害目以及諸如線蟲、扁形動物(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora等其它無脊椎動物目的活性(Feitelson (1993)蘇雲金芽孢桿菌家族樹，高級基因工程殺蟲劑中(The Bacillus Thuringiensis famiIyt ree. InAdvanced Engineered Pesticides). Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y.)。這些蛋白質主要基於其殺蟲活性而最初被劃分為 CryI至CryV。主要的種類是鱗翅類特異的(I)、鱗翅類和雙翅類特異的(II)、鞘翅類特異的(III)、雙翅類特異的(IV)以及線蟲類特異的(V)和(VI)。所述蛋白質進一步被劃分為亞家族，各個家族內更密切相關的蛋白質被指派上分類字母，諸如CrylA、CrylB、CrylC等。 在各亞類內更緊密相關的蛋白質則命名為諸如CrylCl、CrylC2等。最近出現了一種針對Cry基因的新命名法，其基於的是胺基酸序列同源性而非昆蟲革巴特異性(Crickmore 等(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-81 3)。在該新的分類法中，每種毒素被分配了一個獨特的名稱，其中合併了第一等級(阿拉伯數字)、第二等級(大寫字母)、第三等級(小寫字母)和第四等級(另一阿拉伯數字)。在新的分類中， 羅馬數字被轉換成第一等級的阿拉伯數字。序列同一性小於4 5%的蛋白質具有不同的第一等級，而對於第二和第三等級而言這一標準分別為78%和95%。晶體蛋白質在被昆蟲中腸攝取和溶解前不呈現殺蟲活性。被攝取的毒素原在昆蟲消化道內被蛋白酶水解成活性的有毒分子。(H6fte和Whiteley(1989)Microbiol. Rev. 53 =242-255)。 此毒素與靶目標幼蟲中腸內的頂端刷狀邊緣受體結合併插入頂端膜中，產生離子通道或孔，導致幼蟲死亡。δ -內毒素通常具有5個保守的序列結構域和三個保守的結構性結構域(參閱， 例如，de Maagd等(2001) Trends Genetics 17 :193-199)。第一個保守的結構性結構域由 7個α螺旋組成，並涉及膜插入和孔形成。結構域II由排列成希臘語鑰匙構形的三個β 摺疊片組成，而結構域III由「果凍-卷」形式的兩個反向平行β摺疊組成(de Maagd等 (2001)同上文)。結構域II和III涉及受體識別和結合，並因此被認為是毒素特異性的決定區。因為昆蟲可造成的破壞，所以一直需要發現新形式的蘇雲金芽孢桿菌δ-內毒素。發明簡述本發明提供了賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子以殺蟲劑抗性的組合物和方法。組合物包括編碼S-內毒素和δ-內毒素相關多肽序列的分離核酸分子、包含這些核酸分子的載體和包含這些載體的宿主細胞。組合物還包括內毒素的分離或重組多肽序列、 包含這些多肽的組合物以及針對那些多肽的抗體。所述核酸序列可用於DNA構建體或表達盒中，用於生物體中的轉化和表達，包括微生物和植物。所述核苷酸或胺基酸序列可以是已被設計成最適於在生物體中表達的合成序列，包括但不局限於，微生物或植物。組合物還包括被轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。具體而言，本發明提供了含有編碼SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、 27或29中所示胺基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、 21、23、25、26或28中所給出的核苷酸序列的分離核酸分子以及它們的變體和片段。與本發明的核苷酸序列互補或與本發明的序列雜交的核苷酸序列也包括在內。還提供了可用於產生本發明的多肽的方法，以及利用那些多肽來控制或殺死鱗翅類或鞘翅類害蟲的方法。本發明的組合物和方法可用於產生具有殺蟲劑抗性的生物體，尤其是細菌和植物。這些生物體及其來源的組合物是農業用途所需要的。本發明的組合物還可用於產生具有殺蟲活性的改變或改良的δ-內毒素或δ -內毒素相關蛋白質，或用於檢測產品或生物體中δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質或者核酸的存在。附圖
描述圖 I 顯示了 AXMI-004(SEQ ID NO 3)與 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylCa(SEQ ID NO :32)、cry2Aa(SEQ ID NO :34)、cry3Aal (SEQ ID NO :35)、crylla(SEQ ID NO :33)和 cry7Aa(SEQ ID NO :41)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標示的最高度保守胺基酸殘基和以灰色標示的高度保守胺基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 3的大約第174位至大約第196位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO 3的大約第250位至大約第292位胺基酸殘基。發現保守組3 是從SEQ ID NO 3的大約第476位至大約第521位胺基酸殘基。發現保守組4是從SEQ ID NO 3的大約第542位至大約552位胺基酸殘基。發現保守組5是從SEQ ID NO 3的大約第618位至大約第628位胺基酸殘基。圖 2A、B 和 C 顯示了 AXMI-006(SEQ ID NO 7)與 cryIAa(SEQ ID NO :30)、 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylla (SEQ ID NO :33)、cry3Aal (SEQ ID NO :35)、cry 3Ba (SEQ ID NO 36)、cry 4Aa(SEQ ID NO :38)、cry6Aa(SEQ ID NO :40)、cry7Aa(SEQ ID NO :41)、 cry8Aa(SEQ ID NO :42)、crylOAa(SEQ ID NO :43)、cryl6Aa(SEQ ID NO :44)、cryl9Ba(SEQ ID NO 45)和cry24Aa(SEQ ID NO :47)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標示的最高度保守胺基酸殘基和以灰色標示的高度保守胺基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 7的大約第218位至大約第239位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO 7的大約第300位至大約第350位胺基酸殘基。
5發現保守組3是從SEQ ID NO :7的大約第547位至大約第592位胺基酸殘基。發現保守組 4是從SEQ ID NO 7的大約第611位至大約621位胺基酸殘基。發現保守組5是從SEQ ID NO 7的大約第694位至大約第704位胺基酸殘基。圖 3A、B 和 C 顯示了 AXMI-007(SEQ ID NO 9)與 crylAa(SEQ ID NO :30)、 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylla (SEQ ID NO :33)、cry3Aal (SEQ ID NO :35)、cry 3Ba (SEQ ID NO 36)、cry 4Aa(SEQ ID NO :38)、cry6Aa(SEQ ID NO :40)、cry7Aa(SEQ ID NO :41)、 cry8Aa(SEQ ID NO :42)、crylOAa(SEQ ID NO :43)、cryl6Aa(SEQ ID NO :44)、cryl9Ba(SEQ ID NO 45)和cry24Aa(SEQ ID NO :47)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標示的最高度保守胺基酸殘基和以灰色標示的高度保守胺基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 9的大約第217位至大約第238位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO 9的大約第299位至大約第347位胺基酸殘基。 發現保守組3是從SEQ ID NO :9的大約第445位至大約第590位胺基酸殘基。發現保守組 4是從SEQ ID NO 9的大約第609位至大約619位胺基酸殘基。發現保守組5是從SEQ ID NO 9的大約第692位至大約第702位胺基酸殘基。圖 4A、B 和 C 顯示了 AXMI-008(SEQ ID NO :14)與 crylAa(SEQ ID NO :30)、 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylla (SEQ ID NO :33)、cry2Aa (SEQ ID NO :34)、cry3Aal (SEQ ID NO 35)、cry3Bb (SEQ ID NO :37)、cry4Aa (SEQ ID NO :38)、cry4Ba (SEQ ID NO :39)、 cry6Aa (SEQ ID NO :40)、cry7Aa (SEQ ID NO :41)、cry8Aa (SEQ ID NO :42)、crylOAa (SEQ ID NO :43)、cryl6Aa(SEQ ID NO :44)、cryl9Ba(SEQ ID NO :45)、cry24Aa(SEQ ID NO :47)、 cry25Aa(SEQ ID NO :48)、cry39Aal (SEQ ID NO :49)和cry40Aal (SEQ ID NO :51)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標不的最聞度保守氣基酸殘基和以灰色標不的聞度保守氣基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 14的大約第185位至大約第206位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO 14 的大約第276位至大約第318位胺基酸殘基。發現保守組3是從SEQ ID NO : 14的大約第 497位至大約第547位胺基酸殘基。發現保守組4是從SEQ ID NO :14的大約第576位至大約586位胺基酸殘基。發現保守組5是從SEQ ID NO : 14的大約第657位至大約第667 位胺基酸殘基。圖 5A 和 B 顯示了 AXMI-008orf2(SEQ ID NO :18)與 cryl9Aa_orf2 (SEQ ID NO: 46)、crybun2-orf2(SEQ ID NO :50)、crybun3_orf2(SEQID NO :52)、cry4Aa (SEQ ID NO :38) 和cry4Ba(SEQ ID NO :39)的序列比對。該序列比對顯不了以黑色標不的最聞度保守氣基酸殘基和以灰色標示的高度保守胺基酸殘基。圖 6A、B 和 C 顯示了 AXMI-009(SEQ ID NO :20)與 crylAa(SEQ ID NO :30)、 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylCa (SEQ ID NO :32)、crylla (SEQ ID NO :33)、cry3Aal (SEQ ID NO 35)、cry3Ba(SEQ ID NO :36)、cry3Bb (SEQ ID NO :37)、cry4Aa (SEQ ID NO :38)、 cry6Aa(SEQ ID NO :40)、cry7Aa(SEQ I D NO :41)、cry8Aa(SEQ I D NO :42)、crylOAa(SEQ ID NO :43)、cryl6Aa(SEQ ID NO :44)、cryl9Ba(SEQ ID NO :45)、cry24Aa(SEQ ID NO :47)、 cry25Aa(SEQ ID NO :48)和cry40Aal (SEQID NO :51)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標示的最高度保守胺基酸殘基和以灰色標示的高度保守胺基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 20的大約第196位至大約第217位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO :20的大約第269位至大約第 311位胺基酸殘基。發現保守組3是從SEQ ID NO 20的大約第514位至大約第556位胺基酸殘基。發現保守組4是從SEQ ID NO 20的大約第574位至大約584位胺基酸殘基。發現保守組5是從SEQ ID NO 20的大約第651位至大約第661位胺基酸殘基。圖 7A、B 和 C 顯示了 AXMI-014(SEQ ID NO :27)與 crylAa(SEQ ID NO :30)、 cryIAc (SEQ ID NO :31)、crylla (SEQ ID NO :33)、cry2Aa (SEQ ID NO :34)、cry3Aal (SEQ ID NO 35)、cry3Bb (SEQ ID NO :37)、cry4Aa (SEQ ID NO :38)、cry4Ba (SEQ ID NO :39)、 cry6Aa (SEQ ID NO :40)、cry7Aa (SEQ ID NO :41)、cry8Aa (SEQ ID NO :42)、crylOAa (SEQ ID NO :43)、cryl6Aa(SEQ ID NO :44)、cryl9Ba(SEQ ID NO :45)、cry24Aa(SEQ ID NO :47)、 cry25Aa(SEQ ID NO :48)、cry39Aal (SEQID NO :49)和 cry40Aal (SEQ ID NO :51)的序列比對。具有C-末端非毒性結構域的毒素如圖所示被人為截短。該序列比對顯示了以黑色標不的最聞度保守氣基酸殘基和以灰色標不的聞度保守氣基酸殘基。發現保守組I是從SEQ ID NO 27的大約第177位至大約第188位胺基酸殘基。發現保守組2是從SEQ ID NO 27 的大約第251位至大約第293位胺基酸殘基。發現保守組3是從SEQ ID NO :27的大約第 483位至大約第533位胺基酸殘基。發現保守組4是從SEQ ID NO 27的大約第552位至大約562位胺基酸殘基。圖8顯示了 4-20%梯度SDS丙烯醯胺凝膠的照片。泳道1_4包括表達69kD AXMI-004蛋白質的各種濃度的形成孢子的芽孢桿菌細胞培養物。泳道5-8包括各種濃度的 BSA。泳道9包含分子量標記物。箭頭指示69kD的帶。發明詳述本發明針對的是用於調控生物體、尤其是植物或植物細胞中害蟲抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發明S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的核苷酸序列轉化生物體。具體而言，本發明的核苷酸序列可用於製備具有殺蟲活性的植物和微生物。因而提供了已轉化的細菌、植物、植物細胞、植物組織和種子。組合物是蘇雲金芽孢桿菌的S-內毒素或S-內毒素相關核酸和蛋白質。所述序列可用於構建表達載體用於隨後轉化入目的生物體內，作為探針用於分離其它的δ-內毒素或δ -內毒素相關基因，以及用本領域已知方法產生改變的殺蟲蛋白質，諸如結構域交換或DNA改組。所述蛋白質可用於抑制或殺死鱗翅類或鞘翅類有害種群以及用於產生具有殺蟲活性的組合物。定義「 δ -內毒素」指來自蘇雲金芽孢桿菌且對一種或多種害蟲具有毒性的毒素，所述害蟲包括、但不局限於鱗翅目、雙翅目和鞘翅目等的種類。在某些情況下，S-內毒素蛋白質已從其它生物體分離出來了，包括雙酶梭狀芽孢桿菌(Clostridium bifermentans)和？ 類芽孢桿菌(Paenibacillus popilliae)。δ -內毒素蛋白質包含由本文所公布的全長核苷酸序列推導出來的胺基酸序列，以及由於使用備選的下遊起始位點或者由於產生具有殺蟲活性的較短蛋白質的加工所造成的比全長序列更短的胺基酸序列。加工可發生在所述蛋白質所表達的生物體內，或攝取所述蛋白質後在害蟲體內。δ -內毒素包括被確認為cryl 至cry43、cytl和cyt2的蛋白質以及Cyt-類毒素。目前有超過250種具有廣泛特異性和毒性的已知δ-內毒素。更全面的名單參閱Crickmore等(1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813,而定期的更新資料參閱 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/ Bt/index上的Crickmore等(2003)"蘇雲金芽抱桿菌毒素命名(Bacillus thuringiensistoxin nomenclature)"。細菌基因，諸如本發明的AXMI基因，通常具有多個甲硫氨酸起始密碼子接近開發閱讀框架的起始點。經常地，開始於一個或多個這些起始密碼子的翻譯會導致產生功能性蛋白質。這些起始密碼子可包括ATG密碼子。不過，諸如芽孢桿菌等的細菌還將密碼子 GTG識別為起始密碼子，而翻譯起始於GTG密碼子的蛋白質在第一個胺基酸處含有甲硫氨酸。此外，並非常常可以爭先確定這些密碼子中的哪一個在細菌中天然使用。因此，可以理解，利用這些變通性甲硫氨酸密碼子之一還可導致產生編碼殺蟲活性的S-內毒素蛋白質。例如，本發明ΑΧΜΙ-004 δ-內毒素的一個備選起始位點是SEQ ID NO :1第385位鹼基對處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO :5中所顯示的胺基酸序列。本發明ΑΧΜΙ-007 δ -內毒素蛋白質的一個備選起始位點可以是SEQ ID NO 8第151位鹼基對處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO :11中所顯示的胺基酸序列。本發明的ΑΧΜΙ-008 δ -內毒素蛋白質的一個備選起始位點可以是SEQ ID NO 12的第177位核苷酸處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列。本發明的ΑΧΜΙ-009 δ-內毒素蛋白質的一個備選起始位點可以是SEQ ID NO :19的第34位核苷酸處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO :22中所示的胺基酸序列。本發明的 AXMI-009 δ -內毒素蛋白質的另一個備選起始位點可以是SEQ ID NO :1的第64位核苷酸處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO :24中所示的胺基酸序列。本發明的 AXMI-014 δ -內毒素蛋白質的一個備選起始位點可以是SEQ ID NO 25的第136位核苷酸處。從此備選起始位點開始的翻譯產生了 SEQ ID NO 29中所示的胺基酸序列。這些δ -內毒素蛋白質都包括在本發明的範圍內，可用於本發明的方法中。此外，在所公布的編碼一個或多個δ -內毒素相關蛋白質的核苷酸序列中可以有一個或多個另外的開發閱讀框架。「 δ -內毒素相關蛋白質」指用不同於本發明δ -內毒素所用，使用另一開發閱讀框架由此處所公布的核苷酸序列編碼的蛋白質。諸如此類的蛋白質在本領域中已知可作為輔助蛋白質、穩定序列或δ -內毒素相關蛋白質。這些δ-內毒素相關蛋白質可具有殺蟲活性，或可在促進S-內毒素蛋白質表達中起重要作用。用於檢測殺蟲活性以及用於測定S-內毒素相關蛋白質對δ-內毒素蛋白質表達和晶體形成的影響的方法是本領域已知的(參閱，例如，Park等(1999) FEMS Microbiol. Lett. 181 :319-327 ； Ge 等(1998)FEMS Microbiol. Lett. 165 :35-41 ;Rosso和Delecluse (1997)Appl. Environ. Microbiol. 63 :4449-4455)。這些δ -內毒素相關蛋白質包括在本發明範圍內，並可單獨或與已知的δ -內毒素蛋白質聯合用於本文所公布的方法中。在某一實施方案中，δ-內毒素相關蛋白質具有存在於SEQ ID NO 18中的胺基酸序列，由SEQ ID NO 17的核苷酸序列編碼。「植物細胞」指所有已知形式的植物，包括未分化的組織(如愈傷組織)、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、植物種子、花粉、繁殖體、胚等等。「植物表達盒」指能導致蛋白質在植物細胞中從開放閱讀框架表達的DNA構建體。一般其中包含啟動子和編碼序列。經常地，這樣的構建體還包含3』非翻譯區。所述構建體可包含「信號序列」 或「前導序列」，以促進肽在翻譯的同時或翻譯後轉運至某些細胞內結構，諸如葉綠體(或其它質體)、內質網或聞爾基體。「信號序列」指已知或猜測會導致翻譯時或翻譯後的跨細胞膜肽轉運的序列。在真核細胞中，這通常包括分泌入高爾基體內，具有某些由此產生的糖基化作用。「前導序列」指在翻譯時產生的胺基酸序列足以引起肽鏈共翻譯轉運至亞細胞器的任何序列。因此，這包括通過進入內質網、穿越液泡、包括葉綠體、線粒體等在內的質體而靶向轉運和/或糖基化作用的前導序列。「植物轉化載體」指植物細胞有效轉化所必需的DNA分子。這樣的分子可由一個或多個植物表達盒組成，且可組裝入一個以上的「載體"DNA分子中。例如，二元載體是利用兩個非毗連的DNA載體編碼植物細胞轉化所必需的所有順式和反式作用功能的植物轉化載體(Hellens 和 Mullineaux (2000)Trends in Plant Science 5:446-451)。「載體，，指設計成在不同宿主細胞之間轉移的核酸構建體。「表達載體」指能在外來細胞中摻入、整合併表達異源DNA序列或片段的載體。「轉基因植物」或「已轉化的植物」或「穩定轉化的植物或細胞組織」指在植物細胞中已摻入或整合了外源核酸序列或DNA片段的植物。這些核酸序列包括外源的或不存在於未轉化植物細胞內的那些核酸序列，以及可能是內源的或存在於未轉化的植物細胞內的那些核酸序列。「異源的」通常指對於它們所存在的細胞或部分天然基因組而言不是內源性的，且已通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投影(microprojection)等方式加入細胞內的核酸序列。「啟動子」指起到指導下遊編碼序列轉錄的功能的核酸序列。啟動子與其它轉錄和翻譯調節核酸序列(也稱「調控序列」)一起是目的DNA序列表達所必需的。本文提供了賦予殺蟲活性的新的分離核苷酸序列。還提供了 δ -內毒素和δ -內毒素相關蛋白質的氣基酸序列。由此基因翻譯所廣生的蛋白質可使細胞抑制或殺死攝取它的害蟲。「分離的」或「純化的」核酸分子或蛋白質或者其生物學活性部分指的是，在用重組技術生產時基本上無其它細胞物質或培養基，或者在化學合成時基本上無化學前體或其它化學物質。優選的，「分離的」核酸中沒有天然狀態下在該核酸來源的生物體的基因組內處於該核酸兩側(即，位於所述核酸5』和3』末端的序列)的序列(優選蛋白質編碼序列)。 就本發明的目的而言，「分離的」用於描述核酸分子時，並不包括分離的染色體。例如，在各種實施方案中，分離的編碼S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白的核酸分子可包含天然存在於所述核酸來源的細胞的基因組DNA中該核酸分子兩側的小於大約5kb、4kb、3kb、2kb、 lkb、0. 5kb或O. Ikb的核苷酸序列。基本上無細胞物質的δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質包括具有少於大約30^^20^^10%或5% (乾重)的非δ-內毒素或非δ-內毒素相關蛋白質(在此也稱為「汙染蛋白質」)的蛋白質製品。本發明的各個方面在以下部分有更進一步的詳述。分離的核酸分子及其變體和片段本發明的一方面是關於含有編碼δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質和多肽或其生物學活性部分的核苷酸序列的分離核酸分子，以及足以用作雜交探針來鑑定編碼S -內毒素或S-內毒素相關蛋白質的核酸分子。用於此處時，術語「核酸分子」意在包括DNA分子(如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如，mRNA)和用核苷酸類似物產生的所述DNA或 RNA的類似物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。編碼本發明蛋白質的核苷酸序列包括SEQ ID NOS :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26和28中所提出的序列及其互補序列。「互補序列」意指足以與給定核苷酸序列互補、從而可與該給定核苷酸序列雜交形成穩定的雙聯體的核苷酸序列。由這些核苷酸序列編碼的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的相應胺基酸序列如SEQ ID NOS :3,5, 7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 和 29 中所示。作為這些δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質編碼核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本發明內。「片段」指編碼S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的生物學活性部分，或可能是可以用下文所述方法作為雜交探針或PCR引物的片段。作為δ-內毒素或內毒素相關核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約15、20、50、75、100、200、300、 350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、3000、3500、4000、4500、 5000、5500個核苷酸,或者多達本文所公布的全長δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質編碼核苷酸序列的核苷酸數目(例如，對於SEQ ID NO :1而言是2190個核苷酸，對於SEQ ID NO 2而言是1890個核苷酸，等等)，這將取決於目的用途。本發明的核苷酸序列的片段將編碼保留δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的生物學活性、從而分別保持了殺蟲活性或S-內毒素相關蛋白質活性的蛋白質片段。「δ-內毒素活性」指殺蟲活性。「 S-內毒素相關蛋白質活性」指所述蛋白質具有殺蟲活性，或所述蛋白質可提聞δ-內毒素蛋白質的表達。這種蛋白質表達的提聞可以以任何機制發生。「保持活性」指所述片段具有S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的活性的至少約 30%、優選至少約50%、更優選至少約70%、還更優選至少約80%。用於測定δ-內毒素相關蛋白質對S-內毒素蛋白質表達和晶體形成的影響的方法是本領域所已知的(參閱， 例如，Park 等(1999)FEMS Microbiol. Lett. 181 :319-327 ；Ge 等(1998)FEMSMicrobiol. Lett. 165 :35-41 ；Rosso 和 Delecluse(1997)Appl. Environ. Microbiol. 63 :4449-4455)。 用於測定殺蟲活性的方法在本領域內是眾所周知的。參閱，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83(6) :2480-2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ;和美國專利 5，743，477，所有這些都全文收編於此作為參考。編碼本發明蛋白質生物學活性部分的δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質編碼核苷酸序列片段將編碼本發明全長S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質中的至少約15、25、 30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600 或 650 個連續的胺基酸，或最多可達其中所存在的總胺基酸數目(例如，對於SEQ ID NO :3而言是629個胺基酸，對於SEQ ID NO 5而言是601個胺基酸，等等)。優選的本發明δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質是由與SEQ ID NO :3、5、7、9、 11、14、16、18、20、22、24、27或29中的核苷酸序列足夠一致的核苷酸序列編碼的。「足夠一致的」指用標準參數，通過本文所述序列比對程序之一與參考序列比較而言具有至少約 60 %或65 %序列同一性、優選至少約70 %或75 %序列同一性、更優選至少約80 %或85 %序列同一性、最優選至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的胺基酸或核苷酸序列。本領域技術人員應認識到，這些數值可適當調整，以確定由於密碼子簡併性、胺基酸相似性、閱讀框架定位等原因而由兩種核苷酸序列編碼的蛋白質的相應同一性。為了確定兩種胺基酸序列或兩種核酸的同一性百分比，將這些序列進行比對以達到最佳的比較效果。兩個序列之間的同一性百分比是所述序列共有的相同位置數目的函數 (即，同一性百分比=相同位置的數目/總位置數目(如重疊位置)χ100)。在某一實施方案中，所述的兩個序列長度相同。兩個序列之間的同一性百分比可以用類似於下文所述方法的技術確定，允許或不允許有缺口。在計算同一性百分比時，通常嚴格匹配的才被計算在內。兩個序列之間同一性百分比的確定可用數學運算法則完成。用於比較兩個序列的數學運算法則的非局限性例子是文獻Karlin和Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 中提出的運算法則，根據文獻 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877進行修正。這樣的運算法則被合併入文獻Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN軟體進行(得分=100，詞長=12)，以獲得與本發明δ-內毒素或δ-內毒素相關核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用BLASTN軟體進行(得分=50，詞長=3)，以獲得與本發明S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得帶缺口的序列比對以進行比較，可如文獻Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述利用 Gapped BLAST。或者，可用PSI-Blast進行檢測兩個分子之間疏遠關聯的反覆搜索。參閱， Altschul 等(1997)，同上文。在應用 BLAST、Gapped BLAST 和 PSI-Blast 程序時，可使用各個程序(如，BLASTX和BLASTN)默認的參數。見www. ncbi. nlm. nih. gov。另一用於比較序列的數學運算法則的非限制性例子是ClustalW運算法則(Higgins等(1994)Nucleic Acids Res. 22 :4673-4680)。ClustalW可比較序列，並將胺基酸或DNA序列全部比對，因此可提供有關整個胺基酸序列的序列保守性的資料。ClustalW運算法則被用於數個商品化的 DNA/胺基酸分析軟體包中，諸如載體NTi Program Suite (Informax, Inc)的ALIGNX模塊。 用ClustalW進行胺基酸序列的比對後，可評估胺基酸同一性百分比。可用於ClustalW序列比對分析的軟體程序的非局限性例子是GeneDoc 。Genedoc (Karl Nicholas)可評估多個蛋白質之間的胺基酸(或DNA)相似性和同一性。用於序列比較的數學運算法則的另一非限制性例子是文獻Myers和Miller (1988) CABIOS 4 :11-17中的運算法則。這樣的運算法則被引入ALIGN程序(版本2. O)中，它是GCG序列比對軟體包的一部分(可獲自Accelrys， Inc. ,9865 Scranton Rd.，San Diego, California, USA)。當應用 ALIGN 程序來比較胺基酸序列時，可使用PAMl20加權殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。本發明還包括變體核酸分子。δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質編碼核苷酸序列的「變體」包括編碼本文所公布的δ-內毒素或δ -內毒素相關蛋白質、但由於遺傳密碼簡併性而有保守性差別的序列，以及如上所述足夠相似的那些序列。天然存在的等位基因變體可用眾所周知的分子生物學技術鑑定，諸如聚合酶鏈式反應(PCR)和下文概述的雜交技術。變體核苷酸序列還包括合成來源的核苷酸序列，例如如下所述通過定位誘變產生、但仍然編碼本發明公布的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的序列。包含在本發明範圍內的變體蛋白質是有生物學活性的，也就是說，它們繼續具有天然蛋白質的目的生物學活性，即保持殺蟲活性。「保持活性」是指變體具有δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的活性的至少約30%、優選至少約50%、更優選至少約70%、還更優選至少約80%。用於測量殺蟲活性的方法在本領域中是眾所周知的。參閱，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83(6) :2480-2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ;以及美國專利 5，743，477，所有這些均全部收編於此作為參考。本發明還包括變體核酸分子。δ -內毒素或δ -內毒素相關編碼核苷酸序列的「變體」包括那些編碼本文所公布的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質、但由於遺傳密碼簡併性而有保守性差異的序列以及如上所述充分相同的那些序列。天然存在的等位基因變體可用眾所周知的分子生物學技術鑑定，諸如聚合酶鏈式反應(PCR)和下述雜交技術。變體核苷酸序列還包括合成來源的核苷酸序列，例如如下所述通過定位誘變產生、但仍然編碼本發明公布的δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的序列。技術熟練人員應認識到，可通過突變在本發明的核苷酸序列中引入變異，從而導致所編碼的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的胺基酸序列中的變化，但不改變所述蛋白質的生物學活性。因此，可通過在本文所公布的相應核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失而製備變異的分離核酸分子，從而在所編碼的蛋白質中引入一個或多個胺基酸取代、添加或缺失。突變可通過標準技術引入，諸如定位誘變和PCR介導誘變。這樣的變異核苷酸序列也包括在本發明的範圍內。例如，優選的，可以在一個或多個預知的、優選非必需胺基酸殘基處進行保守胺基酸取代。「非必需的」胺基酸殘基是可以在S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質序列的野生型序列中發生改變、而不改變生物學活性的殘基，而「必需的」胺基酸殘基是生物學活性所必需的。「保守的胺基酸取代」是用具有相似側鏈的胺基酸殘基替換某一胺基酸殘基。具有相似側鏈的胺基酸殘基家族在本領域中已有定義。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸 (如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(如，天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支側鏈的胺基酸(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在δ -內毒素蛋白質之間通常有5個高度保守的區域，主要集中在結構域的中心或結構域之間的連接處(Rajamohan 等(1998)Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 60 1-23)。多種δ-內毒素的保守胺基酸塊以及共有序列可參閱以下文獻Schn印f等 (1998)Microbio. Mol. Biol. Rev. 62 :775-806 和 Lereclus 等(1989)，編碼蘇雲金芽孢桿菌類芽孢δ -內毒素的基因的作用、結構和分子組成(Role, Structure, and Molecular Organization of the Genes Coding for the Parasporal d-endotoxins of Bacillus thuringiensis)。在「原核發育的調控(Regulation of Procaryotic Development)」一書中，Issar Smit，Slepecky，R. A.，Setlow，P.美國微生物學會，Washington, D. C. 20006。 已提出具有這些保守區的S -內毒素可共享相似的結構，由三個結構域組成(Li等(1991) Nature 353:815-821)。結構域I在δ -內毒素之間具有最高的相似性(Bravo (1997) J. Bacteriol. 179 :2793-2801)。可在非保守區內進行保持活性的胺基酸取代。一般而言，不對保守胺基酸殘基、或定位在保守基元內的胺基酸殘基進行這樣的取代，其中所述的殘基對於蛋白質活性是必需的。保守的、並且可能為蛋白質活性所必需的殘基例子包括，例如，在所提供的序列比對中含有的所有蛋白質之間均相同的殘基。保守的、但可能允許發生保守性胺基酸取代而仍保持活性的殘基的例子包括例如在所提供的序列比對中所包括的所有蛋白質之間僅有保守性取代的殘基。不過，本領域技術人員應理解，功能性變體可在保守殘基中具有微小的保守或非保守變異。或者，可通過諸如飽和誘變等方法沿著所有或部分編碼序列隨機引入突變而製備變異核苷酸序列，並可對所產生的突變體篩選賦予S-內毒素或δ-內毒素相關活性的能力，以鑑別保持活性的突變體。誘變後，所編碼的蛋白質可重組表達，而蛋白質的活性可用標準檢測技術測定。用諸如PCR、雜交等方法可鑑定相應的δ -內毒素或δ -內毒素相關序列，這樣的序列與本發明的序列基本上相同。參閱，例如，Sambrook J.和Russell, D. W. (2001)分子克隆實驗室手冊Molecular Cloning A Laboratory Manual.(冷泉港實驗室出版社， 冷泉港，紐約)和Innis等(1990) PCR流程方法和應用指南PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY)。在雜交方法中，可用全部或部分δ-內毒素或δ-內毒素相關核苷酸序列篩選 cDNA或基因組文庫。所述cDNA和基因組文庫的構建方法是本領域普遍已知的，並被描述在Sambrook和Russell，2001中。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA 片段或其它寡核苷酸，它們可用諸如32P等可檢測基團或諸如其它放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子等任何其它可檢測標記物進行標記。可通過標記基於本文所公布的已知 δ-內毒素或δ-內毒素相關編碼核苷酸序列的合成寡核苷酸製備用於雜交的探針。此外， 還可使用基於核苷酸序列或所編碼的胺基酸序列中的保守核苷酸或胺基酸殘基設計的簡併引物。所述探針通常包含在嚴謹條件下與本發明S-內毒素或δ-內毒素相關編碼核苷酸序列或其片段或變體的至少約12個、優選約25個、更優選至少約50、75、100、125、150、 175、200、250、300、350或400個連續核苷酸雜交的核苷酸序列區。用於雜交的探針的製備是本領域所普遍已知的，並且公開在此處收編作為參考的文獻Sambrook和Russell, 2001 中。在雜交技術中，已知的核苷酸序列的全部或部分被用作與來自選定生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它相應核苷酸序列選擇性雜交的探針。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可用諸如32P等可檢測基團或任何其它可檢測標記物標記。因此，例如，用於雜交的探針可通過標記基於本發明的S-內毒素或δ-內毒素相關序列的合成寡核苷酸而製備。 雜交探針的製備方法以及cDNA和基因組文庫的構建方法是本領域通常已知的，並公開在 Sambrook 等(1989)分子克隆實驗室手冊 Molecular Cloning A Laboratory Manual (第二版，冷泉港實驗室出版社，Plainview,紐約)中。例如，本文所公布的整個δ -內毒素或δ -內毒素相關序列或其一個或多個部分可用作能特異性地與相應δ -內毒素或δ -內毒素相關樣序列以及信使RNA雜交的探針。 為了實現各種條件下的特異雜交，所述探針包含獨特的序列，並且優選長度為至少約10個核苷酸、最優選至少約20個核苷酸。這樣的探針可用於通過PCR從選定的生物體中擴增相應的S-內毒素或δ-內毒素相關序列。這一技術可用於從目的生物體中分離額外的編碼序列，或作為診斷檢測法用於確定生物體中編碼序列的存在與否。雜交技術包括鋪板的 DNA文庫(或者噬斑或者菌落，參閱，例如，SambiOOk等(1989)分子克隆實驗室手冊(第二版，冷泉港實驗室出版社，Plainview,紐約))的雜交篩選。這些序列的雜交可在嚴謹條件下進行。「嚴謹條件」或「嚴謹的雜交條件」指，在此條件下，探針與其靶序列的雜交程度可檢測性地高於其它序列(例如，至少高於背景2倍)。 嚴謹條件是隨序列而定的，在不同的環境下有所不同。通過控制雜交和/或漂洗條件的嚴謹性，可鑑別與探針100%互補的靶序列(同源探測)。或者，可將嚴謹條件調整成允許序列中有一些錯配，從而檢測較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度小於約1000 個核苷酸，優選長度小於500個核苷酸。通常，嚴謹條件是這樣的條件，其中在pH 7. O至8. 3時鹽濃度小於約I. 5M Na離子、通常約O. 01至I. OM Na離子濃度(或其它鹽)，並且對於短探針(如10_50個核苷酸) 而言溫度至少約30°C，而對於長探針(例如，大於50個核苷酸)而言至少約60°C。還可通過添加諸如甲醯胺等去穩定劑來達到嚴謹條件。示範性的低嚴謹條件包括用30-35%甲醯胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩衝液在37°C進行雜交，在IX至2X SSC(20X SSC =3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)在50-55°C漂洗。示範性的中等嚴謹條件包括在40-45% 甲醯胺、I. OM NaCl、l% SDS中於37°C雜交，並在O. 5X至IX SSC於55_60°C漂洗。示範性的高嚴謹條件包括在50%甲醯胺、IM NaCl U % SDS中於37 °C進行雜交，並在O. IX SSC中於60-65°C漂洗。任選的，漂洗緩衝液中可包含約O. 1%至約1% SDS。雜交的持續時間一般少於大約24小時，通常約為4至12小時。一般而言，特異性是雜交後漂洗條件的函數，關鍵因素是最終漂洗溶液的離子強度和溫度。對於 DNA-DNA 雜交，T111 可用 Meinkoth 等 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 中的公式估計Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -O. 61(% form) -500/L ;其中的 M是單價陽離子的摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是雜交溶液中甲醯胺的百分比，而L是鹼基對中雜交體的長度。Tm是互補靶序列的50%與完全匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和PH下)。對於每I %的錯配，Tm下降約1°C;因此，為了與所期望的同一性的序列雜交，可以調節Tm、雜交和/或漂洗條件。例如，如果搜尋具有>90%同一性的序列，Tm可下降10°C。通常，將嚴謹條件選擇成比該具體序列與其互補序列在確定的離子強度和PH的熱融點(Tm)低約5°C。不過，嚴格的嚴謹條件可利用比熱融點(Tm)低1、2、3或4°C的條件進行雜交和/或漂洗；中等的嚴謹條件可利用比熱融點(Tm) 低6、7、8、9或10°C的條件進行雜交和/或漂洗；低嚴謹條件可利用可利用比熱融點(Tm)低 11、12、13、14、15或20°C的條件進行雜交和/或漂洗。利用所述公式、雜交和漂洗組合物以及預期的Tm，普通技術人員可理解雜交和/或漂洗溶液的嚴謹性的變化已得到了本質的描述。如果所需程度的錯配導致^小於45°C (水溶液)或32°C (甲醯胺溶液)，則優選提高 SSC濃度，以利用較高的溫度。有關核酸雜交的詳盡指南可參閱文獻TijSSen(1993)生化和分子生物學實驗技術-用核酸探針進行雜交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes),第 I 部分，第二章 (Elsevier,紐約)；和Ausubel等編輯(1995)分子生物學通用方法(Current Protocols in Molecular Biology),第二章(Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)。參閱 Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning A LaboratoryManual)(第二版,冷泉港實驗室出版社，Plainview, New York)。分離的蛋白質及其變體和片段δ-內毒素和δ -內毒素相關蛋白質也包含在本發明的範圍內。「 δ -內毒素蛋白質」指具有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、20、22、24、27或29中所示胺基酸序列的蛋白質。 「 δ -內毒素相關蛋白質」指具有SEQ ID NO :18中所不氣基酸序列的蛋白質。同時還提供了它們的片段、生物學活性部分和變體，它們可用於實踐本發明的方法。「片段」或「生物學活性部分」包括含有編碼如SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、
20、22、24、27或29中所示δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的胺基酸序列的一部分且保持δ-內毒素活性或δ-內毒素相關活性的多肽片段。δ-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的生物學活性部分可以是例如10、25、50、100或更多個胺基酸長的多肽。這樣的生物學活性部分可通過重組技術製備，並評估其S-內毒素或δ-內毒素相關活性。檢測殺蟲活性的方法是本領域眾所周知的。參閱，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83(6) 2480-2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252199-206 ；Marrone 等(1985)J. ofEconomic Entomology 78 :290-293 ;以及美國專利5，743，477，所有這些均全部收編於此作為參考。 用於此處時，片段含有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27或29中的至少8個毗連胺基酸。不過，本發明還包含其它的片段，諸如該蛋白質中的任何大於約10、20、30、50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 和 650 個胺基酸的片段。「變體」指具有與 SEQ I D NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列至少約60%、65%、優選至少約70%、75%、更優選至少約80%、85%、最優選至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的蛋白質或多肽。變體還包括在嚴謹條件下與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、 23、25、26或28的核酸分子或其互補分子雜交的核酸分子編碼的多肽。這樣的變體通常保持S-內毒素或δ-內毒素相關活性。變體包括由於誘變而胺基酸序列有所區別的多肽。本發明所包含的變體蛋白質是有生物學活性的，即，它們繼續具有天然蛋白質的所需生物學活性，即保持殺蟲活性。檢測殺蟲活性的方法是本領域眾所周知的。參閱，例如， Czapla 和 Lang(1990)J. Econ. Entomol. 83(6) :2480-2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Ma rrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ;以及美國專利5，743，477，所有這些均全部收編於此作為參考。改變或改良的變體已認識到可用各種方法改變δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的DNA序列，並且這些改變可能產生所編碼的蛋白質胺基酸序列不同於本發明S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質胺基酸序列的DNA序列。這一蛋白質可以多種方式改變，包括胺基酸取代、缺失、 截短和插入。這些操作方法是本領域通常已知的。例如，S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的胺基酸序列變體可通過DNA中的突變來製備。這還可以通過數種誘變形式之一和/ 或定向進化來完成。在某些方面，胺基酸序列中編碼的改變基本上不會影響蛋白質的功能。 這樣的變體將具有所需的殺蟲活性。不過，應理解S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質賦予殺蟲活性的能力可基於本發明組合物通過使用所述技術得以提高。例如，可以在於DNA 複製期間呈現出高比率鹼基錯誤摻入的宿主細胞中表達S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質，諸如XL-IRed(Stratagene)。在所述株系中增殖後，可分離δ -內毒素或δ -內毒素相
15關DNA (例如通過製備質粒，或通過PCR擴增並將產生的PCR片段克隆入載體中)，在非誘變性菌株中培養δ -內毒素或δ -內毒素相關突變，鑑定具有殺蟲活性的突變的δ -內毒素或S-內毒素相關基因，例如進行檢測來測試殺蟲活性。通常，將所述蛋白質混和並用於餵服試驗中。參閱，例如，Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293。這樣的試驗可包括使植物接觸一種或多種害蟲並測定植物存活的能力和/或引起害蟲死亡的能力。導致毒性增強的突變的例子參閱Schnepf等(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 775-806 ο或者，可在氨基或羧基末端對許多蛋白質的序列進行改變而基本上不影響其活性。這可包括利用現代分子方法引入的插入、刪除或改變，諸如PCR，包括由於在PCR擴增所用的寡核苷酸中含有胺基酸編碼序列而改變或延長蛋白質編碼序列的PCR擴增。或者，所加入的蛋白質序列可包括完整的蛋白質編碼序列，諸如那些在本領域中通常用於產生蛋白質融合體的序列。這樣的融合蛋白質常常用於⑴增加目的蛋白質的表達，⑵引入結合結構域、酶促活性或表位以方便蛋白質純化、蛋白質檢測或本領域已知的其它實驗性應用，
(3)使蛋白質的分泌或翻譯定向於亞細胞性細胞器，諸如革蘭氏陰性細菌的周質空間，或真核細胞的內質網，後者常常導致蛋白質的糖基化。本發明的變體核苷酸和胺基酸序列還包括來自諸如DNA改組等誘變和重組方法的序列。通過這樣的步驟，可利用一個或多個不同的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質編碼區構建具有所需特性的新的S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質。以此方式，由含有具有充分的序列同一性且可體外或體內同源重組的序列區的相關序列多核苷酸群產生重組多核苷酸文庫。例如，用此方法，可在本發明的S-內毒素或δ-內毒素相關基因與其它已知S-內毒素或δ-內毒素相關基因之間對編碼目的結構域的序列基元進行改組，以獲得編碼具有改良目的特性的蛋白質的新基因，諸如提高殺蟲活性。所述的DNA改組策略是本領域所已知的。參閱，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ； Stemmer(1994)Nature 370 :389-391 ;Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15:436-438 ; Moore 等(1997) J. Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 ；Crameri 等(1998)Nature 391 :288-291 ；以及美國專利 5，605，793 和 5，837，458。結構域交換或改組是產生改變的δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的另一機制。結構域II和III可在δ-內毒素蛋白質之間進行交換，產生具有改良的殺蟲活性或目標譜的雜合或嵌合毒素。產生重組蛋白質並檢測其殺蟲活性的方法在本領域中是眾所周知的(參閱，例如，Naimov 等(2001) Appl. Environ. Microbiol. 67 :5328-5330 ；de Maagd 等(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 :1537-1543 ;Ge 等(1991)J. Biol. Chem. 266 17954-17958 ；Schnepf 等(1990)J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ；Rang 等 91999)Appl. Environ. Micriobiol. 65 :2918-2925)。植物轉化可通過本領域已知的數種技術之一完成植物細胞的轉化。首先，以允許其在植物細胞中表達的方式改造S-內毒素或δ-內毒素相關基因。通常表達這種蛋白質的構建體應含有驅使基因轉錄的啟動子以及允許轉錄終止和聚腺苷酸化的3』非翻譯區。這樣的構建體的組成在本領域中是眾所周知的。在某些情況下，可有效改造基因，使得產生的肽被分泌出來，或定向於植物細胞中。例如，可改造基因，使其含有信號肽，以方便所述的肽轉移至內質網。還可能優選的是，改造植物表達盒使其含有內含子，從而使內含子的mRNA加工為表達所必需。通常這一「植物表達盒」將被插入「植物轉化載體」中。該植物轉化載體可由完成植物轉化所需的一個或多個DNA載體組成。例如，本領域的通用慣例是利用由一個以上毗連DNA區段組成的植物轉化載體。這些載體在本領域中常常稱為「二元載體」。二元載體以及具有輔助質粒的載體是最常用於農桿菌介導的轉化中的，其中完成有效轉化所需的DNA 區段的大小和複雜性是相當大的，並且將功能分攤到分開的DNA分子上比較有利。二元載體通常包含含有T-DNA轉移所必需的順式作用序列(諸如左邊界和右邊界)、經改造能在植物細胞中表達的可選擇標記物以及「目的基因」(經改造能在期望產生轉基因植物的植物細胞中表達的基因)的質粒載體。還存在於此質粒載體中的是細菌複製所必需的序列。順式作用序列以可有效轉移入植物細胞並在其中表達的形式安排。例如，可選擇標記基因和目的基因定位於左和右邊界之間。常常有另一個質粒載體包含介導T-DNA從農桿菌轉移至植物細胞的的反式作用因子。按照本領域中所理解的，此質粒常常具有使植物細胞可被農桿菌感染並通過在邊界序列處的斷裂以及病毒介導的DNA轉移來轉移DNA的致病作用(Vir 基因)(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5 :446-451)。數種類型的農桿菌菌株(如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用於植物轉化。該第二種質粒載體不是用諸如顯微投影、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等其它方法轉化植物所必需的。一般而言，植物轉化方法包括將異源DNA轉移入靶植物細胞(如，不成熟或成熟的胚、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體，等等)中，隨後進行最大極限水平的適當選擇(取決於可選擇標記基因)，以從未轉化細胞集合組中回收轉化的植物細胞。通常將外植體轉移至新鮮置換的同種培養基中並進行常規培養。隨後，在放置於補充了最大極限水平的選擇劑的再生培養基中後已轉化的細胞被分化成芽。然後將所述的芽轉移到選擇性生根培養基中以回收生根的芽或苗。然後將轉基因苗培養成成熟的植物並產生能繁殖的種子(如 Hiei 等(1994)The Plant Journal 6 :271-282 ;Ishida 等(1996) Nature Biotechnology 14:745-750)。通常將外植體轉移至新鮮補充的同種培養基中並進行常規培養。產生轉基因幼苗的有關技術和方法的全面描述參閱文獻Ayres和Park， 1994(Critical Reviews in Plant Science 13:219-239)以及 Bommineni 和 Jauhar， 1997(Maydica 42:107-120)。由於被轉化的物質包含許多細胞，轉化和未轉化的細胞都存在於任何受試靶愈傷片或組織或細胞組中。殺死未轉化細胞並允許轉化細胞增殖的能力使被轉化的植物培養物得以生長。通常，去除未轉化細胞的能力是對快速回收被轉化植物細胞並成功產生轉基因植物的限制。轉基因植物的產生可用數種方法之一完成，包括但不局限於通過農桿菌將異源 DNA引入植物細胞中(農桿菌介導的轉化)、用粘附於顆粒上的外源性外來DNA轟擊植物細胞以及各種其它非粒子定向介導的方法(如Hiei等(1994)The Plant Journal 6 271-282 ；Ishida 等(1996)Nature Biotechnology 14 :745-750 ；Ayres 和 Park(1994) Critical Reviews in Plant Science 13 :219-239 ;Bommineni 和 Jauhar(1997)Maydica 42 :107-120)轉移 DNA。轉化方法以及將核苷酸序列引入植物的方法可能隨著待轉化的植物或植物細胞的類型(即單子葉或雙子葉植物)而變化。將核苷酸序列引入植物細胞並隨後插入植物基因組中的合適方法包括顯微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4 :320_334)、電穿孔(Riggs 等(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5602-5606)、農桿菌介導的轉化(美國專利 5，563，055 ;美國專利 5，981，840)、直接基因轉移(Paszkowski 等(1984)EMBO J. 3 2717-2722)和彈道顆粒加速(參閱，例如，美國專利4，945，050 ;美國專利5，879，918 ； 美國專利5，886，244;美國專利5，932，782 Jomes等(1995)"通過顯微投射轟擊將DNA 定向轉移入完整的植物細胞中(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment)",在「植物細胞、組織和器官培養基本方法(Plant Cell,Tissue,and Organ Culture !Fundamental Methods)，，一書中，Gamborg 和 Phi I lips 編輯(Springer-Verlag, Berlin) ;McCabe 等(1988)Biotechnology6 :923-926)、氣溶膠束轉化(美國已出版專利申請20010026941 ;美國專利4，945，050 ;國際專利申請WO 91/00915 ； 美國已出版專利申請2002015066)以及Lecl轉化(W0 00/28058)。也可參閱Weissinger 等(1988) Ann. Rev. Genet. 22 :421-477 ；Sanford ^ (1987)微粒科學和技術(Particulate Science and Technology) 5 :27-37 ；Christou 等(1988)Plant Physiol. 87 :671-674 ； McCabe 等(1988)Bio/Technology 6 :923-926 ;Finer 和 McMullen(1991)In Vitro Cell Dev. Biol. 27P :175-182 ；Singh 等(1998)Theor. Appl. Genet. 96 :319-324(大豆)；Datta 等(1990) Biotechnology 8 :736-740 ;Klein 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 ;美國專利 5，240，855 ;美國專利 5，322，783 和 5，324，646 ；Tomes 等(1995)" 通過微粒轟擊將DNA定向轉移入完整的植物細胞中(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment)"，在「植物細胞、組織和器官培養基本方法(Plant Cell, Tissue, and Organ Culture !Fundamental Methods)」一書中，編輯 Gamborg 和 Phillips(Springer-Verlag, Berlin) ;Klein 等(1988)Plant Physiol.91 440-444 ；Hooykaas-Van Slogteren 等(1984)Naturere (London) 311 :763-764 ;美國專利 5, 736, 369 ；Bytebier 等(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345-5349(Liliaceae)； De Wet 等(1985)在「胚珠組織的實驗操作(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues) 」 一書中，編輯 Chapman 等(Longman, New York),第 197-209 頁；Kaeppler 等 (1990)植物細胞報告 Plant Cell Reports 9 :415-418 和 Kaeppler 等(1992) Theor. Appl. Genet. 84 :560-566 ;D' Halluin 等(1992)Plant Cell 4 :1495-1505 ;Li 等(1993)Plant Cell Reports 12 :250-255 以及 Christou 和 Ford(1995) Annals of Botany 75 :407-413 ； Osjoda 等(1996)Nature Biotechnology 14 :745_750，所有這些均收編於此作為參考。在將外源性外來DNA整合入植物細胞中後，在培養基中進行最大極限水平的適當選擇，以殺死未轉化的細胞，並通過定期轉移至新鮮培養基中而分離和增殖在此選擇處理中存活的據推定已轉化的細胞。通過連續傳代並進行適當的選擇，可識別並增殖被所述質粒載體轉化的細胞。然後用分子和生化方法證實轉基因植物基因組中被整合的異源目的基因的存在。已被轉化的細胞可以傳統方式生長成植物。參閱，例如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5 :81_84。然後可培養這些植物，用同樣的被轉化株系或不同的株系授粉，並鑑定具有所需表型特徵的組成型表達的所得雜合體。可培養兩代或多代，以保證所需表型特徵的表達穩定維持和遺傳，然後收穫種子以保證已實現了所需表型特徵的表達。以此方式，本發明提供了在其基因組中穩定摻入了本發明的核苷酸構建體、例如本發明的表達盒的已轉化種子(也稱為「轉基因種子」)。本發明的δ -內毒素或δ -內毒素相關序列可存在於用於在目的植物中表達的表達盒中。所述的盒將包括可操作性的與本發明序列連接的5'和3'調控序列。「可操作性的連接」指在啟動子和第二序列之間的功能性聯接，其中的啟動子序列起始並介導了與第二序列相應的DNA序列的轉錄。通常，可操作性連接意味著被連接的核酸序列是毗鄰的，並且，在需連接兩個蛋白質編碼區時，則是毗鄰且處於同一閱讀框架中。所述的盒可另外含有至少一個其它基因以共轉化入生物體中。或者，所述的其它基因可存在於多個表達盒中。向所述的表達盒中提供多個限制性位點，以供插入δ -內毒素或δ -內毒素相關序列，處於調控區的轉錄調控下。所述的表達盒沿5' -3'轉錄方向將包含在植物中發揮作用的轉錄和翻譯起始區(即，啟動子)、本發明的DNA序列以及轉錄和翻譯終止區(即終止區)。啟動子對於植物宿主和/或本發明的DNA序列而言可能是天然的或類似的、或者外源的或異源的。此外， 啟動子可以是天然序列或可以是合成序列。啟動子對於植物宿主而言是「天然的」或「同源的」，指的是啟動子在該啟動子將被引入的天然植物中存在。啟動子對於本發明DNA序列而言是「外源的」或「異源的」，指的是啟動子對於可操作性連接的本發明DNA序列而言不是天然或自然存在的啟動子。終止區可以是對於轉錄起始區而言是天然的，可以是就可操作性連接的目的DNA 序列而言是天然的，可以是就植物宿主而言是天然的，或者可以來自其它來源(即，對於啟動子、目的DNA序列、植物宿主或它們的任何組合而言是外源的或異源的)。方便的終止區可從根癌農桿菌的Ti-質粒獲得，諸如章魚鹼合酶和胭脂鹼合酶終止區。還可參閱 Guerineau 等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 :141-144 ;Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ;Mogen 等(1990)Plant Cell 2:1261-1272; Munroe 等(1990)Gene91 :151-158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891-7903 ； 以及 Joshi 等(1987) Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。在適當的情況下，可將基因最優化以提高其在被轉化宿主細胞中的表達。S卩，所述基因可以用宿主細胞偏好的密碼子合成以促進表達，或者可以宿主偏好的密碼子使用頻率用密碼子合成。例如，有關宿主偏好的密碼子使用的討論參閱Campbell和Gowri (1990) Plant Physiol. 92 =I-Il0合成植物偏好基因的方法是本領域所已知的。參閱，例如,美國專利 6，320，100,6, 075，185,5, 380，831 和 5，436，391，美國已出版專利申請 20040005600 和 20010003849，以及 Murray 等(1989) Nucleic Acids Res. 17 :477_498，在此收編作為參考。在一個實施方案中，目的核酸被定向於葉綠體中表達。以此方式，當目的核酸不是直接插入葉綠體的情況下，表達盒將另外含有編碼轉運肽的核酸以指導目的基因產物進入葉綠體。這樣的轉運肽在本領域中是已知的。參閱，例如,Von Heijne等(1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9 :104-126 ；Clark 等(1989)J.Biol. Chem. 264 :17544-17550 ;Della_Cioppa 等 (1987)Plant Physiol. 84 :965-968 ；Romer 等(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 1414-1421 ;以及 Shah 等(1986) Science 233:478-481。用於葉綠體轉化的方法在本領域中是已知的。參閱，例如，Svab等(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :8526-8530 ;Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :913-917 ；Svab 和 Maliga(1993)EMBO J. 12 :601_606。所述方法依賴於含可選擇標記的DNA的粒子槍投遞以及通過同源重組將DNA定向於質體基因組。此外，質體轉化可通過用核編碼及質體指導的RNA聚合酶的組織優選表達而反式激活沉默的質體攜帶的轉基因而完成。這樣的體系已被報導於文獻McBride等(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 中。可優化定向於葉綠體的目的核酸以表達於葉綠體中，從而解決植物細胞核和此細胞器之間的密碼子使用中的差異。以此方式，目的核酸可以用葉綠體偏好的密碼子合成。參閱，例如，美國專利5，380，831，在此收編作為參考。植物轉化的評估將異源性的外來DNA引入植物細胞中後，用各種方法證實植物基因組中異源基因的轉化或整合，諸如與被整合基因相關的核酸、蛋白質和代謝物的分析。PCR分析PCR分析是在移植至土壤中之前的較早階段篩選已轉化的細胞、組織或芽是否存在被摻入基因的快速方法(Sambrook和Russell，2001)。PCR是用特異於目的基因或農桿菌載體背景等的寡核苷酸引物進行的。DNA雜交分析植物轉化通過基因組DNA的DNA印跡分析證實(Sambrook和 Russell, 2001)。通常，從轉化株中提取總DNA，用適當的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中進行分級分離並轉移至硝酸纖維素或尼龍膜上。然後依照標準技術，用例如放射性標記了 32P的靶DNA片段探測所述的膜或「印跡」，以證實被導入基因在植物基因組中的整合(SambiOok 和 Russell, 2001.分子克隆實驗室手冊 MolecularCloning :A Laboratory Manual.冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。RNA雜交分析依照本領域中常規使用的標準方法，從轉化株的特異組織中分離RNA,在甲醒瓊脂糖凝膠中分級分離，印跡至尼龍濾膜上(Sambrook, J.和Russell, D. W. 2001.分子克隆實驗室手冊Molecular Cloning A Laboratory Manual.冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。然後用本領域已知方法(Sambrook和Russell, 2001),通過將所述濾膜與來自S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的放射性探針雜交而測試δ-內毒素或與δ -內毒素相關基因編碼的RNA的表達。蛋白質印跡和生化檢測可通過標準步驟(Sambrook, J.和Russell,D. W. 2001.分子克隆實驗室手冊Molecular Cloning ALaboratoryManual.冷泉港實驗室出版社,冷泉港，紐約)，利用結合S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質上存在的一個或多個表位的抗體對轉基因植物進行蛋白質印跡和生化檢測及類似測定，以證實由S-內毒素或δ-內毒素相關基因編碼的蛋白質的存在。植物中的殺蟲活性在本發明的另一方面，可產生表達具有殺蟲活性的δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的轉基因植物。可利用上述舉例說明的方法產生轉基因植物，但產生轉基因植物細胞的方式對本發明而言不是關鍵的。可利用諸如農桿菌介導的轉化、氣溶膠束(aerosol beam)、biolistic轉化及非粒子介導方法等本領域中已知或描述的方法來進行，具體所用方法依實驗者而定。可用本領域中描述的通用方法分離表達S-內毒素或δ-內毒素相關蛋白質的植物，例如，通過轉化愈傷組織、篩選被轉化的愈傷組織以及從所述的轉基因愈傷組織再生出可育植物。在所述過程中，可利用任何基因作為可選擇標記，只要通過它在植物細胞中的表達能識別或選擇已被轉化的細胞即可。已開發了許多與植物細胞一起使用的標記物，諸如對氯黴素、氨基糖苷類G418、潮黴素等等的抗性。編碼葉綠體代謝中所涉及的產物的其它基因也可用作選擇標記。例如， 能提供對諸如草甘膦、溴苯腈(bromoxynil)或咪唑啉酮(imidazolinone)等植物除草劑的抗性的基因可能有具體用途。這樣的基因已有報導(Stalker等(1985) J. Biol. Chem. 263 6310-6314 (溴苯臆抗性臆水解酶基因);以及 Sathasivan 等(1990) Nucl. Acids Res. 18 2188 (AHAS咪唑啉酮抗性基因)。可對表達δ -內毒素或δ -內毒素相關蛋白質的可育植物測試殺蟲活性，並選擇顯示出最佳活性的植物進行進一步的培育。本領域中有可供利用的方法能夠用於檢測對害蟲的活性。通常，所述蛋白質被混合併用於餵服試驗中。參閱，例如，Mairone等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290_293。殺蟲控制中的應用將本發明的株系用於殺蟲控制或將其它生物體改造成殺蟲劑的一般方法是本領域所已知的。參閱，例如，美國專利5，039，523和EP0480762A2。本發明的芽孢桿菌株系或經遺傳改造而含有殺蟲基因和蛋白質的微生物可用於保護農作品和產品免受害蟲的侵襲。在本發明的一個方面，當將產生毒素的細胞施用於有目標害蟲的環境中時，用延長所述細胞中產生的毒素的活性的試劑處理生產毒素(殺蟲劑)的生物體的完整(即未裂解)細胞。或者，通過將異源基因引入細胞宿主而產生殺蟲劑。異源基因的表達直接或間接的導致了殺蟲劑在細胞內的產生和保持。在本發明的一個方面，當將所述細胞施用於有目標害蟲的環境中時，在延長該細胞所產生的毒素的活性的條件下處理這些細胞。所產生的產物保持了毒素的毒性。然後可依照常規技術配製這些自然封裝的殺蟲劑，以便施用於含有目標害蟲的環境中，如，土壤、水和植物的葉子。參閱，例如EPA 0192319以及其中引用的文獻。或者，可對表達本發明基因的細胞進行配製，以便可將所產生的物質作為殺蟲劑施用。本發明的活性成分通常以組合物的形式施用，並可與其它化合物同時或接連地施用於待處理的農作物地區或植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、防凍劑、表面活性劑、去垢劑、殺蟲皂、休眠油、聚合體和/或在單次施用製劑後可長期對目標區域進行給藥的隨時間釋放型或可生物降解型載體製劑。它們也可以是選擇性除草劑、化學殺蟲劑、殺病毒劑、 殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或數種這些製劑的混合物，如果需要，可進一步與農業可接受載體、表面活性劑或製備領域中常規採用的促進應用的佐劑一起施用。合適的載體和佐劑可以是固體或液體，並與製備工藝中通常應用的物質相對應，如，天然或再生的礦物、溶劑、分散劑、增溼劑、粘附劑、粘合劑或肥料。 同樣的，所述製劑可製備成可食用的「館」或作成害蟲「陷阱」，使得可被殺蟲製劑的目標害蟲所飼用或攝取。應用本發明活性成分或含本發明細菌菌株所產生的殺蟲性蛋白質中至少一種的本發明農用化學品組合物的優選方法是葉片施用、種子包裹和土壤施用。施用次數和施用頻率取決於相應害蟲的侵襲強度。所述組合物可製備成粉劑、塵劑、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體、溶液等等，且可用諸如含所述多肽的細胞培養物的乾燥、凍幹、勻漿、提取、過濾、離心、沉降和濃縮等常規方式製備。在所有含至少一種所述殺蟲多肽的所述組合物中，所述多肽可以重量約 1% -約99%的濃度存在。利用本發明方法可殺死鱗翅類或鞘翅類害蟲，或者減少其在特定區域內的數目， 或者可預防性的施用於周圍區域以防止易感害蟲的蔓延。優選的，所述害蟲攝取或接觸殺蟲有效量的所述多肽。「殺蟲有效量」指能導致至少一種害蟲死亡或能顯著降低害蟲的生長、飼用或正常生理髮育的殺蟲劑用量。這個量將取決於各種因素而變化，諸如待控制的具體目標害蟲；待處理的特異環境、位置、植物、農作物或農業場所、環境條件，以及該殺蟲有效性多肽組合物施用的方法、速率、濃度、穩定性和用量。製劑還可隨氣候條件、環境因素和 /或施用頻率和/或害蟲侵襲的嚴重程度等而發生變化。所述的殺蟲劑組合物可通過製備細菌細胞、晶體和/或孢子懸浮液或者與所需的農業可接受載體有組合的分離蛋白質組分製成。所述組合物可在施用前配製成適當的形式，諸如凍幹、冷凍乾燥、脫水或在水性載體、培養基或諸如鹽水或其它緩衝液等適當的溶劑中。製備好的組合物可以是塵土或顆粒物形式，或者油(植物油或礦物油)中的懸浮液， 或者水或油/水乳劑，或作為可溼粉末，或者與適於農業應用的任何其它載體物質相組合。 適當的農業載體可以是固體或液體，在本領域中是眾所周知的。術語「農業可接受載體」涵蓋了通常應用於殺蟲劑製備工藝中的所有佐劑、惰性成分、分散劑、表面活性劑、粘著劑、粘合劑等，這些是殺蟲劑製備業中的技術人員眾所周知的。所述製劑可與一種或多種固體或液體佐劑混合，並通過各種方式製備，例如，用常規的製備工藝將殺蟲組合物與適當的佐劑均勻混合、混和和/或碾磨。合適的製劑和應用方法參閱美國專利6，468，523，該文件在此收編作為參考。「害蟲」包括但不局限於，昆蟲、真菌、細菌、線蟲、蟎、蜱等等。昆蟲類的害蟲包括選自以下目的昆蟲鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目、毛翅目等，尤其是鞘翅目、鱗翅目和雙翅目。昆蟲類害蟲包括選自以下目的昆蟲鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、 同翅目、半翅目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、蝨目、蚤目、毛翅目等，尤其是鞘翅目和鱗翅目。針對主要農作物的本發明昆蟲類害蟲包括玉米0strinia nubilalis,歐洲玉米螟；Agrotis ipsilon,小地虎；Helicoverpa zea,谷實夜蛾；Spodoptera frugiperda, 草地夜蛾；Diatraea grandiosella,巨座玉米螟(西南玉米杆草螟)；Elasmopalpus lignosellus,南美玉米苗斑螟(小玉米螟)；Diatraea saccharalis,小鹿杆草螟； Diabrotica virgifera,玉米(幼芽)根葉甲；Diabrotica longicornis barberi,長角葉甲；Diabrotica undecimpunctata howardi,黃瓜十一星葉甲；Melanotus spp·,梳爪叩頭蟲；Cyclocephala borealis,北方圓頭庫金龜(圓頭獨角仙)；Cyclocephala immaculata, 南方圓頭犀金龜(圓頭無斑獨角仙)；Popillia japonica,弧麗跋(日本麗金龜)； Chaetocnema pulicaria,玉米(銅色)跳甲；Sphenophorus maidis,玉米隱_象(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis,玉米姆(玉米溢管蟲牙)；Anuraphis maidiradicis,玉米根蟲牙; Blissus leucopterus Ieucopterus,麥長蟲春(美洲谷長蟲春)；Melanoplus femurrubrum,赤胚黑幢(赤腿蚱猛)；Melanoplus sanguinipes,血黑幢(遷徙蚱ii孟)；Hylemya platura, (玉米)種妮；Agromyza parvicornis,玉米斑潛妮；Anaphothrips obscrurus,玉米黃呆薊馬(美洲維尾薊馬)；Solenopsis milesta，竊蟻；Tetranychus urticae，二斑葉蟎 (普通紅葉蟎):高梁Chilo partellus,玉米禾螟；Spodoptera frugiperda,草地夜蛾； Helicoverpa zea，谷實夜蛾；Elasmopalpuslignosellus，南美玉米苗斑螟(小玉米螟)； Feltia subterranea，粒膚地虎；PhyIlophaga crinita，擠贈(金龜幼蟲);Eleodes，寬胸叩甲(Conoderus)和Aeolusspp.，金針蟲(叩甲幼蟲)；OuIema melanopus，黑角負泥蟲(禮足負泥蟲)；Chaetocnema pulicaria，玉米(銅色)跳甲；Sphenophorus maidis，玉米隱喙; 象(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis，玉米姆(玉米糹益管姆)；Sipha f lava，美甘鹿偽毛蟲牙；Blissus leucopterus leucopterus，麥長蟲舂(美洲谷長蟲舂)；Contarinia sorghicola， 高梁瘦蚊；Tetranychus cinnabarinus,紅葉蟎(硃砂葉蟎)；Tetranychus urticae,葉蟎(普通紅葉蟎):小麥 jPseudaletia unipunctata，粘蟲；Spodoptera frugiperda，草地夜蛾；Elasmopalpus lignosellus，南美玉米苗斑螟(小玉米螟)；Agrotis orthogonia， 西方灰地老虎；Elasmopalpus lignosellus,南美玉米苗斑螟；0ulema melanopus,黑角負泥蟲(橙足負泥蟲)；Hypera punctata，三葉草葉象(車軸草葉象)；Diabrotica undecimpunctata howardi，黃瓜十一星葉甲；俄國麥長管蟲牙；Schizaphis graminum，麥二貧姆；Macrosiphum avenae，麥長管姆；Melanoplus femurrubrum,赤腔黑幢(赤腿蚱 M ) ；Melanoplus differentialis，異黑幢(殊種蚱猛)；Melanoplus sanguinipes，血黑蟲皇(遷徙蚱猛)；Mayetiola destructor，小麥瘦蚊；Sitodiplosis mosellana，麥紅吸眾蟲；Meromyza americana，美洲杆妮(美洲麥杆黃潛妮)；Hylemya coarctata，麥瘦種 M (冬作種妮)；Frankliniella fusca，煙褐花薊馬(菸草褐薊馬)；Cephus cinctus， 麥莖蜂；Aceria tulipae，麥癭蟎(鬱金香瘤蟎):向日葵Suleima helianthana,向日葵芽蟲主蟲；Homoeosoma electellum，向日葵(同)斑螟；zygogramma exclamationis, 向日葵葉甲；Bothyrus gibbosus，胡蘿蔔利犀金龜(胡蘿蔔金龜)；Neolasioptera murtfeldtiana,向日葵好癖蚊棉花Heliothis virescens，煙芽夜蛾；Helicoverpa zea，棉鈴蟲；Spodoptera exigua，甜菜夜蛾；Pectinophora gossypiella，紅鈴麥蛾(棉紅鈴蟲)；Anthonomus grandis，墨西哥棉鈴象(甲)；Aphis gossypii，棉姆；Pseuda tomoscelisseriatus，棉序盲鋳(棉跳盲鋳)；Trialeurodes abutilonea，苘麻粉風(結翅粉風)；Lygus lineolaris，(美國)牧草盲蝽；Melanoplus femurrubrum，赤腔黑幢(赤腿蚱猛)；Melanoplus differentials，異黑蟲皇(殊種蚱猛)；Thrips tabaci，煙薊馬(蔥薊馬)；Franklinkiella fusca，煙褐花薊馬(菸草褐薊馬)；Tetranychus cinnabarinus, 紅葉蟎(硃砂葉蟎)；Tetranychus urticae，二斑葉蟎(普通紅葉蟎)稻Diatraea saccharalis，小鹿杆草螟；Spodoptera frugiperda，草地夜蛾；Helicoverpa zea,棉鈴蟲；Colaspis brunnea,葡萄肖葉甲；Lissorhoptrus oryzophilus,稻根象；Sitophilus oryzae，米象；Nephotettix nigropictus，黑尾葉蜂；Blissus leucopterus leucopterus， 麥長蝽(美洲谷長蝽)；Acrosternum hilare，擬緣椿(喜綠蝽):大豆Pseudoplusia includens，大豆(尺)夜蛾；Anticarsia gemmatalis，梨豆夜蛾；Plathypena scabra， 苜猜綠夜蛾；0strinia nubilalis，歐洲玉米螟；Agrotis ipsilon,小地虎；Spodoptera exigua，舌甘菜夜蛾；Heliothis virescens，煙芽夜蛾；Helicoverpa zea，棉鈴蟲；Epilachna varivestis，墨西哥(大)豆瓢蟲；Myzus persicae，桃蟲牙；Empoasca fabae，香豆微葉蜂； Acrosternum hilare，擬緣鋳(喜綠蝽)；Melanoplus femurrubrum，赤腔黑幢(赤腿蚱
23M ) ；Melanoplus differentialis,異黑幢(殊種蚱由孟)；Hylemya platura,(玉米)種蜆； Sericothrips variabilis,大豆牧草蟲；Thrips tabaci,煙薊馬(蔥薊馬)；Tetranychus turkestani, 土耳其葉蟎(草莓葉蟎)；Tetranychus urticae, 二斑葉蟎(普通紅葉蟎):大壽0strinia nubilalis,歐洲玉米螟；Agrotis ipsilon,小地虎；Schizaphis graminum, 麥二盆姆；Blissus leucopterus leucopterus,麥長疇(美洲谷長疇)；Acrosternum hilare,擬緣椿(喜綠蝽)；Euschistusservus,菸草蝽(褐臭蝽)；Delia platura,(灰地)種妮；Mayetiola destructor,小麥瘦蚊；Petrobia latens,麥巖蟎:油好油菜: Brevicoryne brassicae,甘藍姆(菜姆)；Phyllotreta cruciferae,十字花跳菜甲； Mamestra configurata，宿帶夜蛾(披肩夜蛾)；Plutella xylostella,菜蛾；Delia ssp., 地種蠅(花蠅)。線蟲類包括寄生性線蟲,例如根節、胚囊和損害線蟲,包括異皮線蟲(Heterodera spp.)、根結線蟲(Meloidogyne spp.)和球異皮線蟲(Globodera spp.),具體而言是胚囊線蟲類，包括但不局限於，Heterodera glycines (大豆異皮線蟲)、Heterodera schachtii (甜菜胞囊線蟲)、Heterodera avenae (燕麥胞囊線蟲)和 Globodera rostochiensis (馬鈴薯金線蟲)以及蒼白球異皮線蟲(Globodera pailida)。損害線蟲包括短杆線蟲 (Pratylenchuss pp.)。以下實施例僅供例證說明而非起限制作用。
實施例實施例I :質粒DNA的抽提以如下方式由菌株ATX 13026或ATX 13002製備質粒DNA。在大量的豐富培養基中培養菌株ATX 13026或ATX 13002的純培養物。將培養液離心以收穫細胞沉澱塊。然後以本領域已知方法用SDS處理細胞沉澱塊，導致細胞壁破損且DNA釋放。然後通過高鹽濃度沉澱蛋白質和大基因組DNA。通過標準乙醇沉澱來沉澱質粒DNA。通過在氯化銫梯度中的高速離心將質粒DNA與任何剩餘的染色體DNA分開。使用UV光顯現梯度中的DNA，並使用注射器吸取較低密度條帶(即較低條帶)。此條帶含有來自菌株(或是ATX 13026或是 ATX 13002)的質粒DNA。利用本領域已知方法通過在瓊脂糖凝膠上的顯影來檢查DNA的質量。實施例2 :基因的克隆正如本領域已知的，將純化的質粒DNA剪切成5-10kb大小的片段，並且在存在所有四種dNTP的條件下使用T4DNA聚合酶和Klenow片段修補5'和3'單鏈突出。然後，如本領域已知的,通過T4多核苷酸激酶處理而在Y末端添加磷酸根。如本領域已知的,將修復的DNA片段過夜連接到適當製備以接受插入片段(例如通過限制酶消化而生成平端)的標準高拷貝載體(即pBluescript SK+)中。通過用已知在克隆位點側翼具有切割位點的限制酶消化克隆亞群來分析文庫的質量。確定了高百分比的克隆含有插入片段，平均長度5-6kb。實施例3 :文庫平板的高通量測序將通過上述方法製備的文庫塗布在含有適當抗生素的豐富培養基上以維持質粒克隆，並將菌落單獨挑到裝有2ml含有適當抗生素的培養基的96孔板中。將這些板於37°C、以350rpm搖速培養過夜。將板離心而將細胞收集到板底。通過標準的鹼裂解法以高通量方式由這些培養物分離質粒DNA。以如下方式對來自每塊板的大量克隆測定來自該文庫的克隆的末端序列。使用螢光染料終止物測序技術(Applied Biosystems)和位於克隆位點每一側側翼的標準引物測定選擇用於分析的每個克隆的DNA序列。一旦反應在熱循環儀中完成，則使用標準乙醇沉澱法來沉澱DNA。將DNA重懸於水，並加載到毛細管測序儀上。由克隆位點的任一側測定每個文庫平板的DNA，每個平板的每個插入片段產生兩個閱讀結果。實施例4 :測序數據的裝配和篩選將得到的DNA序列彙編成裝配方案，並排列在一起以形成毗連序列群。這可以使用電腦程式有效進行，諸如Vector NTi，或者使用DNA比對和分析程序的Pred/Phrap套餐。將這些毗連序列群連同未能添加到毗連序列群中的任何個別閱讀序列與所有類型的已知殺蟲劑基因的彙編資料庫進行比較。進一步分析鑑定為與已知內毒素或殺蟲劑基因具有同一性的毗連序列群或個別閱讀序列。在得到的序列中，克隆PAX004、pAX006、pAX007、 pAX008、pAX009和pAX014含有鑑定為與已知內毒素基因具有同源性的DNA。因此，選擇這些克隆用於進一步測序。實施例5 : δ -內毒素基因的測序和鑑定設計與內毒素基因具有同源性的序列退火的引物，使得由這些引物產生的DNA序列將與克隆中的現有DNA序列交疊。這一稱為「寡聚物行走」的方法在本領域是眾所周知的。該方法被用於測定顯示與已知內毒素基因有同源性的區域的完整DNA序列。在上文所述克隆的情況中，該方法被用於測定整個克隆的DNA序列，從而得到每個基因的單一核苷酸序列。然後將完整DNA序列放回最初的大裝配結果中以進一步確認。這能夠將更多的 DNA序列閱讀結果插入毗連序列群，產生覆蓋整個區域的多個閱讀結果。對與已知內毒素基因同源的每個區域進行的DNA序列分析鑑定得到了與已知 δ -內毒素基因同源的開放讀碼框。將由ΡΑΧ004鑑定得到的開放讀碼框命名為ΑΧΜΙ-004。 將由ρΑΧ006鑑定得到的開放讀碼框命名為ΑΧΜΙ-006。將由ρΑΧ007鑑定得到的開放讀碼框命名為ΑΧΜΙ-007。將由ρΑΧ008鑑定得到的開放讀碼框命名為ΑΧΜΙ-008。將由ρΑΧ009鑑定得到的開放讀碼框命名為AXMI-009。將由ρΑΧ014鑑定得到的開放讀碼框命名為AXMI-014。 SEQ ID NOS :1 和 2 提供了 AXMI-004 的 DNA 序列，而 SEQ ID NO 3 提供了預測的 ΑΜΧΙ-004 蛋白質的胺基酸序列。位於SEQ ID NO :1第385位核苷酸處的ΑΧΜΙ-004備選起始位點產生了 SEQ ID NO 5中提供的胺基酸序列。SEQ ID NOS :6提供了 ΑΧΜΙ-006的DNA序列，而SEQ ID Ν0:7提供了預測的ΑΜΧΙ-006蛋白質的胺基酸序列。SEQ ID NO :8提供了 ΑΧΜΙ-007的 DNA序列，而SEQ ID NO :9提供了預測的ΑΜΧΙ-007蛋白質的胺基酸序列。位於SEQ IDNO 8 第151位核苷酸處的ΑΧΜΙ-007備選起始位點產生了 SEQ ID NO=Il中提供的胺基酸序列。 SEQ ID NOS :12和 13提供了 ΑΧΜΙ-008 的DNA序列，而 SEQ ID NO :14提供了預測的 ΑΜΧΙ-008 蛋白質的胺基酸序列。位於SEQ ID NO :12第177位核苷酸處的ΑΧΜΙ-008備選起始位點產生了 SEQ ID NO: 16提供中的胺基酸序列。進一步的分析鑑定得到了緊臨ΑΧΜΙ-008開放讀碼框Y末端的開放讀碼框。SEQ ID NO :18中提供了在本文中稱為AXMI-008orf2的該開放讀碼框的這一預測的胺基酸序列。SEQ ID NOS 19中提供了 AXMI-009的DNA序列，而 SEQ ID NO 20中提供了預測的AMXI-009蛋白質的胺基酸序列。位於SEQ ID NO 19第34 25位核苷酸處的AXMI-009備選起始位點產生了 SEQ ID NO :22中提供的胺基酸序列。位於 SEQ ID NO: 19第64位核苷酸處的另一個AXMI-009備選起始位點產生了 SEQ ID NO :24中提供的胺基酸序列。SEQ ID NOS 25和26中提供了 AXMI-014的DNA序列，而SEQ ID NO 27提供了預測的AMXI-008蛋白質的胺基酸序列。位於SEQ ID NO 25第136位核苷酸處的AXMI-014備選起始位點產生了 SEQ ID NO 29中提供的胺基酸序列。實施例6 :分離基因與已知內毒素基因的同源性用本發明的DNA序列和胺基酸序列搜索DNA和蛋白質資料庫揭示出了這些序列與已知內毒素同源。AXMI-004圖I顯示了 AXMI-004與幾種內毒素的序列比對。Blast搜索確定了 crylCa具有最強的同源區，在毒性結構域的整體序列同一性為43% (見表I)。表I. AXMI-004與示範性內毒素類型的胺基酸同一性
權利要求
1.選自下組的分離核酸分子a)含有SEQID NO : 1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26、或28所示核苷酸序列的核酸分子；b)含有與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼含有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列的多肽的核酸分子；d)含有編碼具有與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列有至少95%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述多肽具有殺蟲活性；和e)a)-d)中任一項的互補物。
2.權利要求I的分離核酸分子，其中所述核苷酸序列是設計成在植物中表達的合成序列。
3.權利要求2的核酸分子，其中所述合成序列具有升高的GC含量。
4.含有權利要求I的核酸分子的載體。
5.權利要求4的載體，其中還含有編碼異源多肽的核酸分子。
6.含有權利要求4的載體的宿主細胞。
7.權利要求6的宿主細胞，它是細菌宿主細胞。
8.權利要求6的宿主細胞，它是植物細胞。
9.含有權利要求8的宿主細胞的轉基因植物。
10.權利要求9的轉基因植物，其中所述植物選自下組玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、和油籽油菜。
11.權利要求9的植物的轉基因種子。
12.選自下組的分離多肽a)含有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列的多肽；b)由SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列編碼的多肽，其中所述多肽具有殺蟲活性；c)含有與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多肽具有殺蟲活性；和d)由與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列編碼的多肽。
13.權利要求12的多肽，其中還含有異源胺基酸序列。
14.選擇性結合權利要求12的多肽的抗體。
15.含有權利要求12的多肽的組合物。
16.權利要求15的組合物，其中所述組合物選自下組粉劑、塵劑、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、乳液、膠體和溶液。
17.權利要求15的組合物，其中所述組合物是通過對蘇雲金芽孢桿菌細胞進行乾燥、 凍幹、勻漿、抽提、過濾、離心、沉降、或濃縮而製備的。
18.權利要求15的組合物，其中含有約I重量％至約99重量％的所述多肽。
19.用於生產具有殺蟲活性的多肽的方法，其中包括在編碼所述多肽的核酸分子得到表達的條件下培養權利要求6的宿主細胞，所述多肽選自下組a)含有SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列的多肽；b)由SEQ ID N0:l、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列編碼的多肽，其中所述多肽具有殺蟲活性；c)含有與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27 或 29 所示胺基酸序列具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多肽具有殺蟲活性；和d)由與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列編碼的多肽。
20.用於控制鱗翅類或鞘翅類害蟲種群的方法，其中包括使所述種群接觸殺蟲有效量的權利要求12的多肽。
21.用於殺死鱗翅類或鞘翅類害蟲的方法，其中包括使所述害蟲接觸或給其餵食殺蟲有效量的權利要求12的多肽。
22.在其基因組中穩定摻入了DNA構建體的植物，其中所述DNA構建體含有編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組a)SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、19、21、23、25、26、或 28 所示核苷酸序列；b)與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼含有SEQID NO :3、5、7、9、11、14、16、20、22、24、27或29所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQID NO :3、5、7、9、11、14、16、20、22、24、27或29所示胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；其中所述核苷酸序列可操作性連接了驅動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子。
23.權利要求22的植物，其中所述植物還含有SEQID NO : 17所示核苷酸序列。
24.在其基因組中穩定摻入了DNA構建體的植物細胞，其中所述DNA構建體含有編碼具有殺蟲活性的蛋白質的核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組a)SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、19、21、23、25、26、或 28 所示核苷酸序列；b)與SEQ ID NO :1、2、4、6、8、10、12、13、15、19、21、23、25、26 或 28 所示核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼含有SEQID NO :3、5、7、9、11、14、16、20、22、24、27或29所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQID N0:3、5、7、9、ll、14、16、20、22、24、27或29所示胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；其中所述核苷酸序列可操作性地連接了驅動編碼序列在植物細胞中表達的啟動子。
25.權利要求24的植物細胞，其中所述植物細胞還含有SEQID NO : 17所示核苷酸序列。
全文摘要
本發明提供了賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子以殺蟲活性的組合物和方法。本發明提供了含有δ-內毒素和δ-內毒素相關多肽的編碼序列的組合物。所述編碼序列可用於DNA構建體或表達盒中，以便用於植物和細菌中的轉化和表達。組合物還包括被轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。具體而言，本發明提供了分離的δ-內毒素和δ-內毒素相關核酸分子。另外，本發明還涵蓋與多核苷酸對應的胺基酸序列。具體而言，本發明提供了含有編碼SEQ ID NO3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、27和29中所示胺基酸序列的核苷酸序列和SEQ ID NO1、2、4、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、26和28中所示核苷酸序列的分離的核酸分子及其變體和片段。
文檔編號A01H5/00GK102586285SQ20121005130
公開日2012年7月18日 申請日期2004年2月20日 優先權日2003年2月20日
發明者B·卡爾, M·G·科奇埃爾, N·B·達克, N·卡羅奇, T·哈吉斯 申請人:阿則耐克斯公司