一種植物多糖及其製備方法和用途的製作方法

2023-10-09 04:29:04 1

專利名稱：：一種植物多糖及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬中藥領域，涉及植物多糖，具體涉及一種植物多糖及其製備方法和在製備抗補體藥物中的用途。背景琺術在正常的生理條件下，補體的功能主要是攻擊外來病原和清除免疫複合物，並維持機體的平衡。然而補體系統的非正常激活會引起人體免疫系統的過度反應，導致人體自身正常組織的損傷和炎症反應。研究表明，與補體過度激活相關的疾病有類風溼性關節炎、老年性痴呆、系統性紅斑狼瘡(SLE)、器官移植後的排斥反應、多器官功能衰竭綜合症、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)等。據報導，重症非典型性肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，臨床上可發現免疫系統的過度反應症狀，如ARDS，敗血症休克及Reyes症候群等，有研究認為上述反應症狀與細胞免疫、體液免疫過度激活有關。已有的研究證實SARS和補體舉差充的過度激活有關，雖然目前尚未有證據證明高致病性的H5N1型禽流感病毒感染人後會引起補體系統的過度激活，然而已有的研究表明流感病毒感染激活補體旁路途徑，在病毒性呼吸系統疾病的發生中起著重要作用。鑑於補體過度激活在引發人類許多危重疾病中的重要作用，因此急需尋找高效低毒的新型補體抑制劑。天然藥物中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，國內外已完成部分天然藥物如麻黃，巴戟天，人參，杜仲等的篩選，發現自然界中廣泛存在的某些多糖、蛋白質、多肽、黃酮、甾類、萜類和生物鹼等化合物具有顯著的抗補體活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物為多。肝素是由糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的一個^酸化多糖，是研究較早的、較成熟的補體抑制劑。早在1929年就有文獻報導肝素對補體系統有抑制作用，並對其作用機理進行了深入研究，發現肝素能與補體系統中的13種成分發生作用。但由於肝素具有抗凝血作用，在生物體內需較高濃度才能發揮藥效，且副作用大，限制了其臨床應用。從褐色的海藻中分出的低分子量的硫酸化脫氧半乳聚糖(Fucans)，因其抗補體活性是肝素的5倍，抗凝血活性卻僅為肝素的510X而倍受關注。Fucans在體外對補體激活的經典途徑和旁路途徑均有明顯的抑制作用，其ICs。和APs。分別為0.8mg/mL和0.54mg/mL。對其作用機理的研究發現它可作用於C1、C4、C2等補體成分。另有文獻報導從棕色藻類Asc叩AF^鵬"ocfos"/z7中分出的巖藻依聚糖(Fucoidan)也有較強的抗補體作用(IC5。〈0.5mg/mL)，藥理研究表明該多糖是通過與補體激活劑競爭結合Clq，降低C1裂分C2、C4的能力，從而抑制補體激活的。此外，還從錦葵科數種植物、人參、薑黃、芍藥、柴胡、川芎和甘草等植物中分出一系列有抗補體活性的酸性多糖和中性多糖，並闡明了其結構。
發明內容本發明的目的是提供天然藥物中具有抗補體作用的活性成分，具體涉及一種植物多糖PS-1，及其製備方法和在製備補體抑制藥物中的用途。鑑於補體在SARS和禽流感併發症一ARDS發生、發展中的重要作用，本發明對國家中醫藥管理局推薦用於防治重症非典型性肺炎(SARS)的中藥複方的水提物進行分離得到均一多糖，命名為PS-1。經體外實驗證實PS-l具有顯著的補體抑制活性，且與肝素的作用機理相似，但是不具備限制其發揮體內活性的抗凝血作用，預示著PS-1副作用小，具有較好的體內抗補體活性。本發明從用於防治重症非典型性肺炎(SARS)的中藥複方(國家中醫藥管理局推薦)中分離提取得到均一多糖PS-1。所述的中藥複方由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果組成，其重量比例為15:6:15:10:3。本發明所述的植物多糖PS-1的結構特徵描述為PS-1是由五種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)=1.3:1.9:1.0:8.8:4.8;其分子量大於1X106Da，小於2X106Da，比旋度為[a]D25+14.2(c0.318，H20);PS-1的糖含量為90.9%，還有4.16%糖醛酸，2.79%蛋白和4.30%硫酸基；它的連接方式包括末端、1.4-、1,6-和1，3,6-連接的葡萄糖，末端、1,6-和1，3，6-連接的半乳糖，末端、1.5-連接的阿拉伯糖，末端、1，3-連接的鼠李糖，1,6-、1,4-連接的甘露糖和一些1，3-、1，3，4-、1，4，6-連接的己糖。其中以l，4-和l，6-連接的葡萄糖為主。本發明的多糖PS-1通過下述方法製備魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果五味中藥按其組成比例為15:6:15:10:3配伍，以95%乙醇冷浸提取，濾過，用熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析，透析液濃縮至小體積後加乙醇至含醇量80%，離心，沉澱冷凍乾燥即得粗多糖。粗多糖加蒸餾水溶解，離心，上清液分次用DEAE-cellulose柱(C廣型，30X2.5cm)層析進行初步分離。以蒸餾水、0.4、0.6、1.0和2.0mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫體積大於2倍柱體積，流速為0.6mL/min，收集各流份，隔管檢測280nm和490nm(硫酸-苯酚法顯色後)下的吸光度值。根據糖顯色反應和紫外檢測的結果合併相同流分，濃縮，透析及冷凍乾燥得5個次級組分Frl，Fr2，Fr3，Fr4和Fr5。根據活性跟蹤結果將Fr3，Fr4和Fr5合併加蒸餾水溶解，離心，上清液分次用S印hacrylS-400柱(100X2.5cm)層析分離。蒸餾水洗脫，流速為0.6raL/min,收集各流分。隔管檢測280nm和490咖(硫酸-苯酚法顯色後)下的吸光度值，活性跟蹤各管餾分。根據檢測結果合併相同流分，濃縮及冷凍乾燥得多糖PS-1。經高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和高效毛細管電泳法(HPCE)檢測PS-1為均一的成分。2.PS-1的結構特徵1)分子量的測定採用TSK-GELGMPWXL凝膠柱(300X7.6mra)，流動相為O.01mol/LNaCl，流速0.8mL/min，柱溫25。C，與T系列的Dextran進行比較，PS-1分子量大於lX106Da，而小於2Xl6Da。2)元素分析結果表明PS-1含C，34.91%;H，4.95%;N，2.55%。比旋度為[a]D25+14,2(c0.318,H20)。3)硫酸-苯酚法測定PS-1的總糖含量為90.9%，間羥聯苯法測定PS-l的糖醛酸含量為4.16%，考馬斯亮藍法測定PS-1的蛋白含量為2.79%，BaCl2比濁法測定PS-1的硫酸基含量為4.30%。4)糖組成分析PS-1經2mol/LTFA於110。C全水解得到的產物，先後進行NaBH4還原，醋酐乙醯化製備成阿爾迪醇乙酸酯衍生物，進行氣相組成分析(BlakeneyAB,HarrisPJ，HenryRJ,ets丄Asimpleandrapidpreparationofalditolacetatesformonosaccharideanalysis.CarbohydrRes.1983，113:291-299)。結果可知PS-l是由五種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)=1.3:1.9:1.0:8.8:4.8。5)甲基化分析PS-1參照文獻方法(NeedsPW,SelvendranRR.Avoidingoxidativedegradationduringsodiumhydroxyl/dimethyl-iodidemediatedcarbohydratemethylationindimethylsulfoxide.CarbohydrRes.1993,245:1-10)進行甲基化，甲基化後的產物用90%甲酸解聚，2mol/LTFA全水解，NaBH4還原和醋酐乙醯化製成部分甲基化的阿爾迪醇乙酸酯衍生物，然後進行GC-MS分析。結合標準圖譜，確定PS-1連接方式包括末端、1，4-、1，6-和1，3，6-連接的葡萄糖，末端、1,6-和1,3,6-連接的半乳糖，末端、1,5-連接的阿拉伯糖，末端、1，3-連接的鼠李糖，1，6-、1,4-連接的甘露糖和一些1，3-、1，3，4-、1,4,6-連接的己糖。其中以l,4-和l，6-連接的葡萄糖為主。經體外試驗證實PS-1對經典和旁路途徑激活所引發的細胞溶血均有抑制。1)抗補體激活經典途徑細胞溶血試驗人血清l:10稀釋液作為補體，抗原激活補體經典途徑導致羊紅細胞溶血，參照文獻方法(Kabat，E.A.,Mayer，M.M..Complementandcomplementfixationinexperimentalimmunology.CharlesC.ThomasPublisher,Ilinois，U.S.A.1964.pp.133-240.)測得PS-1能抑制細胞溶血。CH50=0.36mg/mL，n=3。2)抗補體激活旁路途徑細胞溶血試驗人血清hIO稀釋液作為補體，激活補體旁路途徑導致兔紅細胞溶血，參照文獻方法(Klerx，J.P.,Beukelman，C.J.，Van,D.H.，Willers，J.M..Microassayforcolorimetricestimationofcomplementactivityinguineapig,humanandmouseserum.JournalofImmunologicalMethods.1983.63,215-220)測得PS-1能抑制細胞溶血。AP50=0.17mg/mL，n=3。本發明利用補體缺失血清，參照文獻方法(周捷，章蘊毅，張建文，徐晗，陳道峰.中藥杜仲對補體系統的作用.復旦學報(醫學版).2006，33(1):101-106)研究PS-1抑制補體系統的作用靶點。結果表明PS-1作用於補體Clq、Clr、Cls、C2、C3、C4、C5、C9組分，與肝素的作用機制相一致。本發明參照文獻方法(王學峰，王鴻利.血栓與止血的檢測及應用(第一版).上海上海世界圖書出版公司，2002,p:99)，測定復鈣時間(recalcificationtime，RT)和凝血酶時間(thrombintime，TT)，以5.2mg/L肝素為陽性對照，VBS2+緩衝液為陰性對照(Vehicle),PS-1濃度依次為1500，750，375mg/L。結果表明肝素在5,2mg/L時可顯著延長RT和TT(P<0.05)，不同濃度的PS-1和陰性對照的RT和TT無顯著差異。表明PS-1無抗凝血作用。本發明所述均一多糖PS-1經體外實驗證實有較強抗補體活性，作用於補體Clq、Clr、Cls、C2、'C3、C4、C5、C9組分，且不具有影響體內活性發揮的抗凝血作用。可用於製備補體抑制藥物。具體實施例方式實施例l製備多糖PS-l魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果五味中藥按其組成比例為15:6:15:10:3配伍，共計9.6Kg。以95%乙醇冷浸提取，濾過，藥渣於室溫下置通風處晾乾，然後用熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液用水透析3天，透析液濃縮至小體積後加乙醇至含醇量80%，離心，沉澱冷凍乾燥即得粗多糖。粗多糖加入適量蒸餾水溶解，離心，上清液分次用DEAE-cellulose柱(Cr'型，30X2.5cm)層析進行初步分離。以蒸餾水、0.4、0.6、1.0和2.0mol/L的NaCl溶液洗脫，每種洗脫液的洗脫體積略大於2倍柱體積，流速為O.6mL/min,分別收集各流份，隔管檢測280nm和490nm(硫酸-苯酚法顯色後)下的吸光度值。並且根據糖顯色反應和紫外檢測的結果合併相同流分，經濃縮，透析及冷凍乾燥得到5個次級組分Fr1，Fr2，Fr3，Fr4和Fr5。活性跟蹤結果顯示Fr3，Fr4和Fr5三個部位具有抗補體活性。將Fr3，Fr4和Fr5合併後加入適量蒸餾水溶解，離心，上清液分次用S印hacrylS-400柱(100X2.5cm)層析進行分離。以蒸餾水作為洗脫液，流速為0.6mL/min，收集各流分。隔管檢測280nm和490nm(硫酸-苯酚法顯色後)下的吸光度值，同時活性跟蹤各管餾分。根據檢測結果合併相同流分，濃縮及冷凍乾燥得到PS-1。經高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和高效毛細管電泳法(HPCE)檢測PS-1是均一的成分。PS-1的結構特徵描述為PS-1是由五種單糖組成的雜多糖，糖殘基摩爾比為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)=1.3:1.9:1.0:8.8:4.8。其分子量大於lXl(fDa，而小於2Xl(fDa，比旋度[a]d25+14.2(c0.318，H20)。PS-l的糖含量為90.9%，還有4.16%糖醛酸，2.79%蛋白和4.30%硫酸基。它的連接方式包括末端、1,4-、1，6-和1,3,6-連接的葡萄糖，末端、1,6-和l，3，6-連接的半乳糖，末端、1,5-連接的阿拉伯糖，末端、1，3-連接的鼠李糖，1，6-、1，4-連接的甘露糖和一些l，3-、1,3,4-、1，4，6-連接的己糖。其中以l，4-和l，6-連接的葡萄糖為主。實施例2經典途徑補體抑制試驗取健康成年男性志願者血清，以VBS"緩衝液(巴比妥緩衝液，pH=7.4，含0.5mMMg"和0.15mMCa2+)稀釋為l:10，作為經典途徑的補體來源。將兔抗羊紅細胞的抗體以VBS2+緩衝液稀釋為1:IOOO作為溶血素；保存於Alsever液中的羊紅細胞(SRBC)配置成2%SRBC。精密稱量PS-l約lmg，加入VBS"緩衝液溶解，稀釋成8個濃度。不同濃度的PS-I溶液IOOpL與1:IO的補體IOOnL在37'C預孵育10min後，依次加入200uLVBS"緩衝液、100nL溶血素(1:1000)和IOOuL2%SRBC，在37。C水浴30min後放入低溫高速離心機，在5000rpm、4。C條件下離心IOmin。分別取每管上清200uL於96孔板，在405nm測定吸光度。實驗同時設置PS-1對照組(100pL相應濃度的PS-1溶液加500uLVBS2+緩衝液)、補體對照組—(以IOOuLVBS"緩衝液代替PS-l溶液)和全溶血組(100uL2%SRBC溶於500yL三蒸水中)。將各濃度的PS-1組吸光度值扣除相應PS-l對照組吸光度值後計算溶血抑制率。以PS-1濃度的對數作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，得到的擬合直線計算CHs。值。以肝素作為陽性對照藥，結果顯示PS-1可抑制補體經典途徑激活所導致的細胞溶血(表l)。表1是PS-1對補體的抑制作用。實施例3旁路途徑補體抑制試驗取健康成年男性志願者血清，以VBS-Mg-EGTA緩衝液(巴比妥緩衝液，pH=7.4，含5mMMg，卩8mMEGTA)稀釋為l:10，作為旁路途徑的補體來源。保存於3.8%枸櫞酸鈉溶液的兔紅細胞以VBS-Mg-EGTA緩衝液配置成2y。兔紅細胞。精密稱量PS-l約lmg，加入VBS-Mg-EGTA緩衝液，稀釋成8個濃度。不同濃度的PS-1溶液150liL與l:10的補體150nL在37。C預孵育10min後，加入200yL2%兔紅細胞，在37。C水浴30min後放入低溫高速離心機，在5000rpm、4。C條件下離心10rain。分別取每管上清200UL於96孔板，在405nm測定吸光度。實驗同時設置PS-l對照組(150uL相應濃度的PS-l溶液加350uLVBS-Mg-EGTA緩衝液)、補體對照組(以150ULVBS-Mg-EGTA緩衝液代替PS-l溶液)和全溶血組(200yL2%兔紅細胞溶於300uL三蒸水中)。將各濃度的PS-1組吸光度值扣除相應PS-1對照組吸光度值後計算溶血抑制率。以PS-1濃度的對數作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，得到的擬合直線計算APs。值。以肝素作為陽性對照藥，結果顯示PS-1可抑制補體旁路途徑激活所導致的細胞溶血(表l)。表ltableseeoriginaldocumentpage9實施例4PS-1對補體系統的作用耙點人源補體(1:10)0.2mL分別與0.2mL1:1稀釋的C3、C4抗血清，1:32稀釋的Clr、Cls、C5抗血清，1:64稀釋的Clq、C2、C9抗血清混合，37。C水浴15min後，5000rpm，離心IOmin。上清即為補體缺失血清。靶點檢測組補體(1:10)100uL與濃度為1.19mg/mL的PS-l溶液(接近100%抑制補體溶血所需的最低濃度)100uL混勻，於37。C預水浴10min後，加入缺失血清200uL，1:1000溶血素100uL和2。/。SRBC100uL。在37。C水浴30min後放入低溫高速離心機，在5000rpm、4。C條件下離心10min。分別取每管上清200uL於96孔板，在405nm測定吸光度。實驗同時設置PS-l對照組(100UL相應濃度的PS-1溶液加500uLVBS2+緩衝液)、補體對照組(以30QuLVBS2+緩衝液代替PS-l溶液和缺失血清)、缺失血清組(以200yLVBS"緩衝液代替PS-l溶液和補體)和全溶血組(100uL2°/。SRBC溶於500uL三蒸水中)。扣除PS-l對照組吸光度值後計算溶血率。比較缺失血清組和耙點檢測組溶血率的變化，根據靶點檢測組溶血情況，判斷PS-l對補體Clq、Clr、Cls、C2、C3、C4、C5及C9有無拮抗作用。靶點檢測組較相應的缺失血清組溶血能力恢復了，說明PS-l不作用於該缺失組分；若溶血能力不能恢復，則說明PS-1作用於該缺失組分。實施例5PS-1對凝血系統的影響1.復鈣時間(recalcificationtirae，RT)的測定豚鼠ip1g/kg烏拉坦麻醉，仰位固定。分離頸總動脈，插管放血，3.8%枸櫞酸鈉l:9(V/V)抗凝。3000rpm，離心10min，得貧血小板血漿(plateletpoorplasma,PPP)。15uLPS-1溶液加入150uLPPP，37。C水浴5min，加入0.025mol/LCaCl2150uL，開始計時，每隔5s用特製金屬小鉤檢測，記錄出現纖維蛋白絲的時間(s)，測定三次，取平均值。記錄時間以600s為終點，超出終點仍不凝固以600s計算。以5.2mg/L肝素為陽性對照，VBS2+緩衝液為陰性對照7PS-1的濃度依次為1500，750，375mg/L。2.凝血酶時間(thrombintime,TT)的測定凍幹的凝血酶經2mL蒸餾水復溶後(相當於5U/mL)後，37。C水浴5min後即可使用。15uLPS-1溶液加入150uLPPP，37。C水浴5min，加入凝血酶150uL，記錄出現纖維蛋白絲的時間(s)，測定三次，取平均值。以5.2mg/L肝素為陽性對照，VBS2+緩衝液為陰性對照，PS-1的濃度依次為1500，750，375mg/L。權利要求1.一種植物多糖，其特徵是所述多糖是由五種單糖組成的雜多糖，其化學結構為糖殘基摩爾比為鼠李糖阿拉伯糖甘露糖葡萄糖半乳糖＝1.31.91.08.84.8；其分子量大於1×106Da，小於2×106Da，比旋度[α]D25+14.2(c0.318，H2O)，糖含量為90.9％，糖醛酸4.16％，蛋白2.79％，硫酸基4.30％；其連接方式包括末端、1，4-、1，6-和1，3，6-連接的葡萄糖，末端、1，6-和1，3，6-連接的半乳糖，末端、1，5-連接的阿拉伯糖，末端、1，3-連接的鼠李糖，1，6-、1，4-連接的甘露糖和1，3-、1，3，4-、1，4，6-連接的己糖；命名為多糖PS-1。2、按權利要求1所述的植物多糖，其特徵是所述多糖的連接方式是以末端、1,4-和1，6-連接的葡萄糖為主。3、按權利要求1所述的植物多糖，其特徵是所述多糖採用水提醇沉、離子交換柱層析和凝膠柱層析從中藥複方中分離提取得到；所述複方由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果組成，其重量比例為15:6:15:10:3。4、權利要求3的植物多糖的製備方法，其特徵是包括下述步驟按組成比例15:6:15:10:3配伍中藥魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果，以95%乙醇冷浸提取，濾過，熱水提取3次，濾過，合併提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液透析，透析液濃縮後加乙醇至含醇量80%，離心，沉澱冷凍乾燥得粗多糖；粗多糖加水溶解，離心，上清液分次用DEAE-cellulose柱Cr型，30X2.5cm層析分離，以蒸餾水、0.4、0.6、1.0和2.0mol/L的NaCl溶液洗脫，流速為0.6mL/min，分別收集各流份，陽菅檢測280rnn和490nm下的吸光度值；根據檢測結果合併相同流分，濃縮，透析及冷凍乾燥得5個次級組分，將其中的抗補體活性組分合併後加水溶解，離心，上清液用S印hacrylS-400柱100X2.5cm層析分離；蒸餾水洗脫，流速0.6mL/min，收集各流分；隔管檢測280nm和490nm下的吸光度值，根據檢測結果合併相同流分，濃縮及冷凍乾燥得植物多糖PS-1。5、權利要求1或2的植物多糖在製備補體抑制藥物中的用途。6、按權利要求5的用途，其中所述的補體是Clq、Clr、Cls、C2、C3、C4、C5或C9組分。全文摘要本發明屬中藥領域，涉及一種植物多糖PS-1及其製備方法和在製備抗補體藥物中的用途。本發明從用於防治重症非典型性肺炎(SARS)的中藥複方，由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭、草果組成，其比例為15∶6∶15∶10∶3的水提物中分離提取得到PS-1，並經實驗證實PS-1對補體激活的經典途徑和旁路途徑均有抑制作用，作用於補體C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C9組分，且不具有抗凝血作用。本發明所述的植物多糖PS-1，可進一步作為活性成分，製備新型抗補體藥物。文檔編號A61P11/00GK101390868SQ20071004622公開日2009年3月25日申請日期2007年9月19日優先權日2007年9月19日發明者婷張,章蘊毅,陳道峰申請人:復旦大學