抗人cd40突變體分子單克隆抗體及其應用的製作方法
2023-05-13 02:05:16
專利名稱：抗人cd40突變體分子單克隆抗體及其應用的製作方法
發明的領域本發明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發明涉及抗人CD40突變體分子單克隆抗體，其製備方法及其在特異性地識別多發性骨髓瘤細胞膜表面CD40蛋白突變體分子，並影響多發性骨髓瘤細胞株細胞生長周期的生物學作用。本發明進一步涉及所說的單克隆抗體在診斷和治療多發性骨髓瘤的中的潛在應用。
發明的背景特異性免疫應答是由多種免疫細胞和分子(膜分子和可溶性因子)參加並受到嚴格調控及制約的複雜生理過程。已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導、建立和調節抗原特異性免疫反應。為了有效地激活T細胞反應，通常至少需要兩個信號。其中除T細胞抗原受體(TCR)識別抗原提呈細胞(APC)上的MHC-抗原複合物以提供第一信號即抗原特異性信號外，還必須獲得T細胞與APC表達的共刺激分子相互作用後產生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號。第二信號即為共刺激信號或協同刺激信號。如果僅有抗原特異性信號而缺失共刺激信號，T細胞將表現為無反應或免疫耐受狀態，甚至導致凋亡。可見，共刺激信號是T細胞克隆擴增、分化和發揮生物效應所必不可少的。因此可以認為，第一信號決定了T細胞活化的特異性，而第二信號則決定T細胞介導的免疫應答能否有效進行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.896550，1992；Allen RC et al.，Science.259990，1993)。近年來的研究表明，一組細胞膜分子——共刺激分子的調節性表達、相互作用及信號傳遞在複雜的免疫應答過程中發揮著極其重要的作用。其中CD40和CD40配體(CD40L，CD154)是一對重要的共刺激分子，它們分別屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族和腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，參與細胞和體液免疫應答並發揮調控作用。
正常生理條件下，表達於抗原遞呈細胞(APC)上的CD40分子與活化的CD4+T細胞上的CD40L相互作用，介導了一系列細胞免疫反應。CD40/CD40L的信號傳遞在不同細胞上可產生截然不同的效應可以是促進細胞的增殖或分化的正向調節，也可以是導致細胞的生長抑制和/或凋亡的負向調節。大量的實驗研究表明，CD40可介導B細胞的增殖、分化、抗體的分泌和類型轉換、樹突狀細胞(DC)的激發、分化和成熟、T淋巴細胞活化和細胞免疫功能的調節，以及對CD40陽性腫瘤細胞生長的抑制和/或促凋亡等活性。
因此，對CD40和CD40L相互作用的分子機制的研究有助於深入了解參與B細胞激活過程中的信號分子及其信號通路。利用基因定向突變研究的結果顯示，CD40與CD40L相互作用過程中直接接觸的CD40胺基酸殘基為位於CD40分子胞外段第2、3結構域中的S65，E66，T70，R73，E74，H76，C77，H78，479，K81，Y82，D84，N86，T112，E114，A115，E117(Bajorath J，Marken J S，Chalupny N J et al.Biochemistry，1995；49884)。這些位點的突變將直接影響CD40與CD40L的相互作用。另有文獻報導(Tong A W，Seamour B，Chen J et al.Leuk Lymph，2000；36(5-6)543)，多發性骨髓瘤(MM)細胞株8226細胞上CD40分子第3結構域上僅1個胺基酸的突變(密碼子TCA→TTA，即胺基酸Ser→Leu)即可顯著地影響CD40L激發CD40分子後的信號傳導。
研究發現，幾乎所有新鮮分離的多發性骨髓瘤(MM)均表達CD40。而且知道MM的發生和發展除了與細胞增殖失控和細胞分化異常有關外，還與轉化的細胞不能正常凋亡有關。已有研究表明，雖然大多數多發性骨髓瘤(MM)細胞均表達CD40，但發現使用常規的CD40單克隆抗體並不能檢測出某些MM細胞株細胞(例如8226細胞)上的CD40分子。這可能是由於編碼CD40分子的基因發生了突變，表達了CD40突變體分子。因此，發現並深入研究信號轉導分子可能出現的突變，製備針對這些突變分子的抗體或其他結合蛋白，進而研究CD40信號對MM生物學行為的影響及其分子機制，必將為拓展MM的治療思路，最終治癒MM提供依據。
發明目的本發明的一個目的是提供抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。
根據本發明的優選實施方案，其中所說的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的重鏈和輕鏈分別具有如SEQ ID NO1(重鏈)和2(輕鏈)所示的推測的胺基酸序列。
根據本發明的優選實施方案，如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1是由保藏編號為CGMCC No.1164的雜交瘤細胞產生的。
本發明的再一個目的是提供如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1在診斷和治療多發性骨髓瘤中的應用。
附圖簡要說明
圖1顯示以免疫印跡法分析單克隆抗體3B1與多發性骨髓瘤細胞株XG2細胞表面膜蛋白的特異性結合。其中1是XG2細胞抽提的膜蛋白，2是Jurkat細胞抽提的膜蛋白(陰性對照)。
圖2顯示用流式細胞術分析單克隆抗體3B1對多株多發性骨髓瘤細胞表面CD40突變體分子的特異性識別。
發明的具體內容本發明是基於我們首先發現了多發性骨髓瘤細胞膜表面上表達的CD40突變體分子這一事實。在這一發現的基礎上，我們成功地製備了抗所說的CD40突變體分子的單克隆抗體，並通過對多發性骨髓瘤細胞膜表面上突變CD40受體/CD40配體相互作用途徑的阻斷實驗研究，證實有可能使用本發明的單克隆抗體作為診斷劑，提供能夠在T細胞激發期間特異地結合多發性骨髓瘤細胞表面上CD40受體的特異性結合分子，用於多發性骨髓瘤的實驗室診斷。或者，也可以使用本發明的單克隆抗體作為治療劑，用於提高T細胞對多發性骨髓瘤抗原的識別能力並切斷其第二信號傳遞，增強CD4+T細胞對瘤細胞的免疫反應，從而達到抑制多發性骨髓瘤細胞的生長和增殖並促使其向正常細胞逆轉的目的。
因此，本發明的一個目的是提供抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。所說的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1具有如SEQ ID NO1所示的推測的胺基酸序列，並且該抗體是由保藏編號為CGMCC No.1164的雜交瘤細胞分泌產生的。
本發明的另一個目的是提供如上限定的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1在診斷多發性骨髓瘤，以及改變多發性骨髓瘤細胞生長周期，進而促進惡性成長的瘤細胞向正常細胞轉化中的應用。
本說明書中所說的「CD40受體」是指B細胞表面上表達的蛋白質；CD40配體是活化的T細胞表達的可與CD40受體特異結合的蛋白質。
術語「CD40」包括完整的CD40、可溶性CD40及包括CD40之功能活性部分的融合蛋白。術語「CD40突變體」是指由於CD40基因第234位鹼基由胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(A)，由此導致其所轉錄後翻譯的CD40蛋白的78位組氨酸突變為穀氨醯胺的CD40蛋白分子。術語「抗CD40突變體分子抗體」可以是CD40突變體分子特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學活性部分。本發明中，優選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人CD40突變體分子抗體。
本發明人在長期從事免疫細胞受體/配體相互作用研究的實踐中，首先發現了多發性骨髓瘤細胞表面上的CD40突變體(其基因在Genebank上的登記號為ss23134804)。我們對該CD40突變體基因及其表達產物的序列分析顯示，其突變在於基因第234位鹼基由胞嘧啶突變為胸腺嘧啶，由此導致其所轉錄後翻譯的CD40蛋白的78位組氨酸突變為穀氨醯胺。由於CD40分子上的78位胺基酸是CD40與CD40L相互作用過程中直接接觸的CD40胺基酸殘基，它的改變將直接影響CD40分子的信號傳導，進而引起一系列CD40分子生物學功能的改變。因此，不僅可能使用高表達該突變體分子的XG2等多發性骨髓瘤細胞株作為免疫原免疫動物，製備特異性單克隆抗體，用於多發性骨髓瘤的體外免疫診斷，而且有可能使用該抗體作為治療劑，用於提高T細胞對多發性骨髓瘤抗原的識別能力並切斷其第二信號傳遞，增強CD4+T細胞對瘤細胞的免疫反應，從而達到抑制多發性骨髓瘤細胞的生長和增殖並促使其向正常細胞逆轉的目的。
可以按照本領域已知的常規方法製備本發明的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1(參見Kohler and Milrtein，Nature 256495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要時，也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法製備相應的人源化形式的抗CD40單克隆抗體。
因此，本發明進一步提供了生產如上限定的抗人CD40突變體分子的單克隆抗體的方法，該方法包括(1)用預製備的高表達人CD40突變體分子的XG2細胞作為免疫原免疫動物；(2)分離被免疫動物的脾淋巴細胞並在適於產生雜交瘤細胞的條件下與適當的骨髓瘤細胞融合；(3)篩選並培養如上得到的雜交瘤細胞；(4)從細胞培養液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離並純化所需的單克隆抗體。
根據本發明的優選實施方案，最好使用高表達CD40分子(包括CD40突變體分子)的多發性骨髓瘤細胞株XG2細胞作為製備本發明單克隆抗體的免疫原。
因此，為了製備本發明的抗人CD40單克隆抗體，最好選擇具有強免疫原性的生物學材料如細胞作為免疫原，並且希望該細胞所表達的抗原分子的空間構型能以自然狀態暴露於細胞膜表面，從而可更有效地激發機體的免疫反應。
可以按照本領域已知的常規方法(Kohler and Milstein，Nature 265495-497，1975)製備能夠生產本發明抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的雜交瘤。簡單地說，首先用XG2細胞免疫BALB/C小鼠。當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，分離動物的脾細胞並製備單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞。例如，可以將脾細胞懸液加到CD40抗原蛋白質包被的平板或小孔內，表達CD40多肽特異性免疫球蛋白的B細胞即結合到平板上，而不能被其餘的懸液洗掉。然後可以收集所得到的B細胞或所有解離的脾細胞，並在適當的融合劑例如聚乙二醇的誘導下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤。然後可以在選擇性培養基例如HAT培養基中培養以篩選融合的雜交瘤細胞，並進一步使用流式細胞術、Western印跡法、免疫沉澱法等方法鑑定所需的陽性抗性細胞株。於體外(例如在組織培養瓶或多孔纖維反應器中)或體內(作為小鼠腹水)培養所選擇的分泌抗人CD40抗體的雜交瘤，並從細胞培養液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗人CD40突變體分子單克隆抗體。
流式細胞儀分析結果顯示，本發明提供的抗人CD40突變體分子單克隆抗體能夠特異地識別多個多發性骨髓瘤細胞株(XG2，XG6，8226，U266)表面上表達的CD40突變體分子。該抗體被定名為3B1。
進一步的核苷酸和胺基酸序列分析結果顯示，純化的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的重鏈和輕鏈多肽分別具有如序列表SEQ ID NO1和2所示的推測的胺基酸序列。其中所有胺基酸序列都是以胺基酸的標準單字母縮寫符表示的。
本發明的雜交瘤細胞株被命名為3B1(Hybridoma SI CD40.1(3B1))，並已按照布達佩斯條約和中國專利法實施細則第25條的規定，於2004年6月2日將這些雜交瘤細胞系樣品保藏在中國北京中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1164。
我們的研究表明，本發明的單克隆抗體能夠特異性識別多發性骨髓瘤細胞表面表達的、其他常規CD40單克隆抗體不能識別的CD40突變體分子。例如，使用本發明的單克隆抗體以流式細胞分析術檢測多發性骨髓瘤細胞株XG6、U266和8226等的細胞表面CD40突變體分子的表達水平，結果顯示陽性表達率分別為51.9％、66.7％和72.8％％。相反，使用目前已知的其他多種CD40單克隆抗體(例如mAb89，3B2，5C11等)檢測上述靶細胞表面表達的CD40突變體分子，結果均為陰性(參見實施例1)。因此，有可能使用本發明的單克隆抗體或建立在該抗體基礎上的免疫檢測試劑盒，檢測多發性骨髓瘤細胞膜表面CD40突變體分子的存在及其水平，藉以作為多發性骨髓瘤的實驗室診斷或預後的指標。
另一方面，我們用本發明的單克隆抗體3B1處理多株表達CD40突變體分子的多發性骨髓瘤細胞株細胞(包括的XG6，U266，8226)，結果可見，該單克隆抗體可顯著地影響XG6，U266，8226等多發性骨髓瘤細胞的生長周期，導致XG6細胞的生長周期阻滯在G2期，並使U266和8226細胞的生長周期阻滯在G1和G2期(參見實施例1)。因此，有可能使用本發明的單克隆抗體作為治療劑，用於提高T細胞對多發性骨髓瘤抗原的識別能力並切斷其第二信號傳遞，阻斷多發性骨髓瘤的生長周期並增強CD4+T細胞對瘤細胞的免疫反應，從而達到抑制多發性骨髓瘤細胞的增殖並促使其惡性生長發生逆轉的目的。我們的初步動物實驗也已證實，本發明的CD40突變體分子單克隆抗體3B1可以有效地抑制多發性骨髓瘤動物模型的腫瘤的生長(數據未示出)。
因此，本發明的抗CD40突變體分子單克隆抗體有可能作為一種診斷和/或治療劑，用於體外診斷或者體內治療細胞表面高表達突變CD40分子的多發性骨髓瘤。
以下藉助非限制性實施例舉例詳細描述本發明。本領域技術人員可以在不背離本發明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術內容或技術環節。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發明的待批權利要求範圍之內。
實施例1抗人CD40突變體分子單克隆抗體的製備本實施例描述本發明的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1的製備。
(1)分泌抗人CD40突變體分子單克隆抗體雜交瘤細胞株的製備使用高表達CD40分子(包括CD40突變體分子)的XG2細胞作為免疫原，三次免疫接種Balb/c小鼠(107/500μl/只)(間隔3周)。末次免疫後第四天，取小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株進行細胞融合(共10塊96孔板)。以高表達CD40分子的XG2為陽性對照並以不表達CD40分子的XG7為陰性對照，用間接免疫螢光法對雜交瘤培養物上清進行初步篩選、蛋白鑑定及Ig亞類鑑定(圖1)。陽性克隆經3次有限稀釋後，使克隆的陽性率達到約95％。經復篩和克隆後獲得穩定地分泌特異性鼠抗人CD40的雜交瘤細胞株，並被命名為3B1。這些雜交瘤細胞經體外持續傳代(40代)後，仍能穩定地分泌特異性抗體。
(2)抗人CD40突變體分子單克隆抗體的製備與特性鑑定(a)採用本室建立的腹水體內誘生方法生產單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內注入Pristane(0.5ml/只)。一周後腹腔內接種雜交瘤細胞(1×107/只)，同時再次腹腔內注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-10天後收穫腹水，並離心取上清於-80℃保存。
(b)腹水型單抗的純化和定量。收集宿主動物的腹水液，經去除纖維蛋白和鹽析處理後，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對磷酸鹽緩衝液(PBS)透析後用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8～10mg/ml。間接免疫螢光法分析顯示，純化後單抗的效價為1∶1000以上。
(c)Ig亞類鑑定。採用試紙快速測定(Argen公司)法，鑑定Ig亞類，結果顯示3B1為IgG1型。
(d)CD40突變體分子在多種腫瘤細胞上的表達。收集培養的多發性骨髓瘤細胞株XG2，XG6，8226，U266，加入單抗3B1(每管2μg)，4℃孵育30分鐘。洗滌後用FITC標記的羊抗鼠IgG處理細胞，4℃孵育30分鐘後進行流式細胞分析。結果可見，單克隆抗體3B1能夠特異地識別XG2、XG6、8226、U266等多種腫瘤細胞上表達的CD40突變體分子。其他多種已知的單克隆抗體(mAb89，3B2，5C11)均不能識別只表達CD40突變體分子的XG6、8226、U266細胞系，但能識別共表達正常CD40分子和CD40突變體分子的XG2細胞表面的正常CD40分子。結果(以CD40突變體分子的陽性表達率表示)如下列表1和圖2所示。
表1單克隆抗體3B1對腫瘤細胞表面的膜蛋白分子的識別
由表1所示的結果可以看出，單克隆抗體3B1除了能識別其免疫原-超高表達CD40分子的多發性骨髓瘤細胞株-XG2以外，還可以中等強度識別另外三株多發性骨髓瘤細胞株XG6，8226，U266，陽性率分別是51.9％，66.7％，72.8％；而其他多種CD40單克隆抗體(mAb89，3B2，5C11)均不能識別XG6、8226、U266表面CD40突變體分子的抗原位點。
圖2顯示用流式細胞術分析單克隆抗體3B1識別多種多發性骨髓瘤細胞株細胞表面的CD40突變體分子。其中，第一行顯示3B1識別XG2細胞表面的CD40突變體分子，並且該分子在XG2細胞上高表達(表達率高達99.8％)；第二行顯示3B1識別XG6細胞表面的CD40突變體分子，並且該分子在XG6細胞上中度表達(表達率達51.9％)；第三行顯示3B1識別8226細胞表面的CD40突變體分子，並且該分子在8226細胞上中度表達(表達率為66.7％)；第四行顯示3B1識別U266細胞表面的CD40突變體分子，並且該分子在U266細胞上中度表達(表達率為72.8％)。相反，抗體5C11則不識別三株只表達CD40突變體分子的多發性骨髓瘤細胞株XG6，8226，U266表面的膜分子，只識別共表達CD40正常體和突變體的XG2細胞表面的正常CD40分子。
(f)單抗的Western印跡鑑定。收集XG2和Jurkat細胞(不表達CD40分子的T淋巴細胞株)，經破膜處理後抽提膜蛋白。經12％SDS-PAGE電泳將所得膜蛋白電轉移(0.65mA/cm2)至硝酸纖維膜上，用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜。24小時後加入純化的抗體，室溫孵育1小時。然後用TBST溶液洗去未結合的抗體，並加入鹼性磷酸酶(AP)標記的二抗保溫30分鐘。孵育後加入底物顯色並記錄結果。結果如圖1所示。
由圖1可以看出，本發明的3B1抗體能夠與XG2細胞表面的CD40突變體分子特異地結合而形成一條清晰的陽性條帶。
實施例2抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1對多發性骨髓瘤細胞生長的影響本實施例描述本發明的單克隆抗體3B1對多株多發性骨髓瘤細胞系的生長影響。
(1)抗CD40突變體分子單克隆抗體3B1誘導多種多發性骨髓瘤細胞株細胞生長周期的改變收集生長良好的多發性骨髓瘤細胞株XG6，U266，8226細胞，加入24孔培養板中(每2×105/孔)。向各小孔中加入3B1(10ug/ml)，培養48小時後再加入PI(5ug/ml)。37℃反應30分鐘後用流式細胞儀檢測。其中使用同型IgG作為陰性對照。結果如下列表2所示。
表2單克隆抗體3B1對多發性骨髓瘤細胞的長周期的影響
由表2所示的結果可以看出，本發明的單克隆抗體明顯影響了XG6，8226和U266細胞的生長，並使其生長停滯在G2期。相似地，本發明的單克隆抗體同樣可阻斷8226和U266細胞的生長，並使其生長周期阻滯在G1和G2期。
序列表110蘇州大學生物技術研究所120抗人CD40突變體分子單克隆抗體及其應用140
141
16012101211135212胺基酸213人工序列220
223根據合成的單克隆抗體3B1的重鏈核甘酸編碼序列推測的胺基酸序列。
4001ACMPAGRRLG VKLQESGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YVIQWVKQKPGQGLEWIGSI NPYNDYTKYN EKFKGKATLT SDKSSITAYM EFSSLTSEDSALYYCARWGD GNYWGQGTTL TVSSAKTTPP SVYPL2102211120212胺基酸213人工序列220
223根據合成的單克隆抗體3B1的輕鏈核甘酸編碼序列推測的胺基酸序列。
4002PSLHACRSTI EIQMTQSPAS LAVSLGQRAT ISYRASKSVS TSGYSYMHWN QQKPGQPPRLLLYLVSNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHIRELTR SEGGPSWRSN
權利要求
1.分別具有如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的重鏈和輕鏈胺基酸序列的抗人CD40突變體分子單克隆抗體3B1。
2.權利要求1的單克隆抗體是由保藏登記號為CCGCC No.1164的雜交瘤細胞產生的。
3.權利要求1的單克隆抗體用於改變多發性骨髓瘤細胞的生長周期，促進惡性成長的瘤細胞向正常細胞轉化。
全文摘要
本發明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發明涉及抗人CD40突變體分子單克隆抗體，其製備方法及其在特異性地識別多發性骨髓瘤細胞膜表面CD40蛋白突變體分子，並改變所說的細胞的生長周期中的應用。
文檔編號C12P21/08GK1844151SQ20051003873
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月7日 優先權日2005年4月7日
發明者張學光, 莊羽美, 鄭璐 申請人:蘇州大學