羊外周血淋巴細胞的分離方法
2023-05-07 13:09:21 2
專利名稱：羊外周血淋巴細胞的分離方法
技術領域：
本發明涉及細胞的分離方法，具體涉及羊外周血淋巴細胞的分離方法。
背景技術：
T淋巴細胞是介導細胞免疫的細胞，B淋巴細胞是產生抗體的細胞，介導機體的體液免疫，T、B淋巴細胞是機體特異性免疫應答必不可少的免疫活性細胞，對兩者功能及活化機制等方面的研究一直是免疫學研究的熱點，而製備高活性和高純度的T、B淋巴細胞是進行這些研究的先決條件。密度梯度離心分離不同體積大小、不同質量的細胞，使得不同類型的細胞得以分離和純化，通過體外擴增、工程操作後應用於細胞轉基因、疾病診斷、功能基因組學研究和細胞治療等領域。淋巴細胞分離液就是基於密度梯度離心原理設計的淋巴細胞分離試劑，利用淋巴細胞分離液能夠獲得高純度的淋巴細胞。但是不同種屬不同比重分離液的細胞離散係數及細胞帶電不同，這極大地限制了淋巴細胞分離液的通用性。根據文獻報導，針對羊的淋巴細胞分離液和其淋巴細胞分離方法尚未建立起來。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能夠獲得高存活率的羊外周血淋巴細胞分離方法。此外，此方法能夠得到良好的分離效果，利於淋巴細胞的收集。為了實現上述目的，本發明採取如下技術方案一種羊淋巴細胞分離的方法，其特徵在於包括如下步驟a.準備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中採取靜脈血；b.用等體積的Hank』 s液稀釋外周血，後混勻；c.將人淋巴細胞分離液以0. 6-1. OmL/管的量分別置於容器中；d.吸取稀釋血液l_3mL，沿容器壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機；e.使容器在離心力作用下，其內部的溶液形成不同層次的區帶，使得容器中由下至上分別為紅細胞層、分離液層、淋巴細胞層、血漿層；f.吸取淋巴細胞層。在本發明的一個實施方式中，上述c步驟還包括將試管放入離心機中進行離心。在本發明的一個實施方式中，採血方式為靜脈採血。在本發明的一個實施方式中，吸出淋巴細胞層的方式為使用移液器吸取。在本發明的一個實施方式中，上述離心機轉速為2000-3000rpm.在本發明的一個實施方式中，上述離心機的離心時間為25-30min.在本發明的一個實施方式中，還包括用Hank』 s液洗淋巴細胞層2_3次。在本發明的一個實施方式中，所述的羊為綿羊，進一步優選為卡拉庫爾羊。
圖1羊淋巴細胞的分離效果照片；
圖2羊淋巴細胞吉姆薩瑞氏染色照片(10X100)。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1綿羊外周血淋巴細胞的分離準備有抗凝劑的注射器，從卡拉庫爾羊頸靜脈中採取外周血，每次實驗均採1Oml 卡拉庫爾羊血液，添加1ml (3% 5% )枸櫞酸鈉溶液抗凝劑。用等體積的Hank』 s液稀釋混勻，取人淋巴細胞分離液以0. SmL/管的量分別置於容器中，再用移液槍吸取稀釋血液2mL，沿容器壁緩緩地疊加到界面上，注意不要破壞分離液界面，將試管放入離心機；離心機轉速為2000-3000rpm，離心時間為25-30min，使容器在離心力作用下，其內部的溶液形成不同層次的區帶，使得容器中由下至上分別為紅細胞層、 分離液層、淋巴細胞層、血漿層(參見說明書附圖1)；吸取淋巴細胞層後，用Hank』 s液洗 2-3次後得到較純的淋巴細胞。實施例2淋巴細胞的檢測將分離培養後的淋巴細胞取少量按常規方法進行染色，觀察其純度。取一滴細胞懸液滴在計數板上，加0. 2%臺盼藍溶液一滴充分混勻，3-5min內在顯微鏡照相。細胞活力檢測，死的細胞可被染成藍色，活細胞不著色，計數200個淋巴細胞， 計算出活細胞的百分率，按公式活細胞百分率=活細胞數/總細胞數X 100%。計數後得到的淋巴細胞團在無菌的RPMI1640培養液中按照1. OX 107個/mL的密度進行重懸，於37°C、5%的C02培養箱中以4h、6h、》i、iai的不同時間段培養，經臺盼藍染色計算出活細胞百分率分別為93. 1%,92. 4%,91. 5%和90. 6%。由此可見，根據本發明的方法，能夠分離出較純的淋巴細胞，且保證了淋巴細胞的成活率，極大地提高了綿羊淋巴細胞分離實驗的效率。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換， 而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種羊淋巴細胞分離的方法，其特徵在於包括如下步驟a.準備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中採取外周血；b.用等體積的Hank’s液稀釋外周血，後混勻；c.將人淋巴細胞分離液以0.6-1. OmL/管的量分別置於容器中；d.吸取稀釋血液l_3mL，沿管壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機；e.使容器在離心力作用下，其內部的溶液形成不同層次的區帶，使得容器中由下至上分別為紅細胞層、分離液層、淋巴細胞層、血漿層；f.吸取淋巴細胞層。
2.根據權利要求1所述的淋巴細胞分離的方法，其特徵在於所述採血為靜脈採血。
3.根據權利要求1所述的淋巴細胞分離的方法，其特徵在於所述吸取淋巴細胞層的方式為使用移液器吸取。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的淋巴細胞分離的方法，其特徵在於所述的步驟d 中離心機轉速為2000-3000rpm。
5.根據權利要求1-3任意一項所述的淋巴細胞分離的方法，其特徵在於所述的步驟d 中離心時間為25-30min.
6.根據權利要求1-3任意一項所述的淋巴細胞分離的方法，其特徵在於還包括用 Hank』 s液洗淋巴細胞層2-3次。
7.根據權利要求1-6任意一項所述羊淋巴細胞分離方法，其中所述的羊為綿羊，進一步優選為卡拉庫爾羊。
全文摘要
本發明公開了一種羊淋巴細胞分離的方法，其特徵在於包括如下步驟a.準備有抗凝劑的注射器，從羊頸靜脈中採取外周血；b.用等體積的Hank’s液稀釋外周血，後混勻；c.將人淋巴細胞分離液以0.6-1.0mL/管的量分別置於容器中；d.吸取稀釋血液1-3mL，沿管壁緩緩的疊加到界面上，將容器放入離心機；e.使容器在離心力作用下，其內部的溶液形成不同層次的區帶，使得容器中由下至上分別為紅細胞層、分離液層、淋巴細胞層、血漿層；f.吸取淋巴細胞層。本發明的方法能夠得到良好的分離效果，利於淋巴細胞的收集，同時，分離出來的淋巴細胞具有較高的存活率。
文檔編號C12N5/0783GK102154204SQ20111002572
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者劉書東, 左文斌, 李劍, 李蓮瑞, 潘輝, 賀豔豔 申請人:塔裡木大學