真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的製備及其使用方法

2023-05-15 03:46:01 7

專利名稱：真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的製備及其使用方法
真菌(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的製備及其使用
方法所屬領域生物醫藥範疇，更確切說是應用人工合成顯色基質，利用真菌細胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖激活東方鱟血細胞裂解物中G因子，從而水解合成顯色基質 Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)進而發生縮合反應而定量檢測(1-3)-β- 葡聚糖方法及相關應用於臨床診斷深部真菌感染的產品。
背景技術：
經初步檢索，未查到以人工合成顯色基質Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)製備成比色檢測真菌細胞壁成分(1-3)-β-D葡聚糖試劑專利。

發明內容
本發明是以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)利用微量 (1-3)-β-D葡聚糖特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發東方鱟血細胞裂解物凝固化反應。被激活的凝固酶水解合成顯色基質釋放出顯色基團DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1_萘酚_2_磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定範圍內呈線形關係，從而定量檢測出樣品中(l-3)-i3-D 葡聚糖濃度。該試劑盒可以用來早期診斷臨床深部真菌感染。參照說明書附圖
將本發明內敘述如下一、合成顯色基質採用生物技術人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、 Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)類顯色基質。具體合成工藝(見工藝路線圖)。二、東方鱟血細胞裂解物提取、分離2. 1血細胞裂解液配製其中裂解液中成分應含有Na+，Mg2+，Ca2+等金屬離子，調節 PH後並進行121°C 90分鐘滅菌處理後方可使用。2. 2血細胞裂解無菌操作，取約20g血細胞，按照1-5比例加入血細胞裂解液，並用高速均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，將破損後的組織細胞液放入_30°C 冰箱內快速冷凍保存10小時，之後將冷凍細胞液取出，在室溫下緩慢溶解，待全部溶解後， 再用高速組織均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，然後將破損後的組織細胞液再次放入-30°C冰箱內快速冷凍保存10小時，重複上次過程2遍即可。2. 3血細胞分離、提取將上述血細胞裂解液取出後進行3000rpm/min，5-8分鐘離心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，劇烈震蕩10分鐘，然後轉移至無熱原離心沉澱管中在4°C下進行10000rpm/min，5-10分鐘分離，仔細取出上清液備用。三、顯色合成基質及縮合溶液的配製及處理1、顯色合成基質溶液配製將顯色合成基質用滅菌注射用水溶解，配製成6mM濃度，使用0. 22um濾膜過濾， 4°C保存備用。2、顯色液A為6mM的1_萘酚_4_磺酸鈉溶液(使用pH 8. 5濃度為0. 05mol的硼酸緩衝液配製)。3、顯色液B為2%高碘酸鈉溶液(使用注射用水配製)。4、顯色液A及顯色液B處理將上述顯色液A及顯色液B配製後，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然後進行冷凍乾燥。5、顯色合成基質溶液處理將顯色合成基質溶液，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然後進行冷凍乾燥。四、反應主劑的製備與標定1、取提取、分離好的東方鱟血細胞的上清液，加到含有1. OM氯化鎂0. 5M氯化鈣溶液中，分裝至西林瓶或安瓿瓶中進行冷凍乾燥即為反應主劑。2、取上述冷凍乾燥好的反應主劑，按照標示值加入溶解液使其完全溶解，然後用滅菌注射用水1-10倍稀釋，用紫外分光光度計檢測，應在270士3nm處有吸收峰。3、將(1-3)-β -D葡聚糖標準品用溶解液溶解並稀釋成最終濃度為100pg/ml溶液，與反應主劑反應，應出現反S型檢測峰。五、(1-3)-β -D葡聚糖比色檢測試劑盒的性能1、靈敏度將(1-3)-β -D葡聚糖標準品用溶解液依次稀釋成1000pg/ml，500pg/ ml, 100pg/ml,50pg/ml, 10pg/ml, 5pg/ml的標準系列，參照試劑盒使用說明書進行檢測，測定各自的吸光度值；以各標準溶液濃度為X軸，以吸光度值為Y軸作圖分析，其直線相關係數r應大於0. 980。2、特異性在已知(1-3)_β-D葡聚糖濃度的空白血漿中添加一定量的 (1-3)-β -D葡聚糖標準溶液，其檢測回收率應在80-120%之間。3、重複性對同一樣品進行4回檢測，其吸光度值的CV值應在10%以內。4、測定範圍5-500pg/ml 之間。六、(1-3)-β-D葡聚糖比色檢測試劑盒的組成1、組成如下表所示
權利要求
1.真菌(l-3)-i3-D葡聚糖比色檢測試劑盒的製備及其使用方法，以人工合成顯色基質 Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N, N- 二乙氨基苯胺)，利用微量(1_3)_β -D葡聚糖特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發東方鱟血細胞裂解物凝固化反應.被激活的凝固酶水解合成顯色基質釋放出顯色基團DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，DIAN與顯色劑A (1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉或1_萘酚_5_磺酸鈉)在高碘酸鈉顯色劑B的存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定範圍內呈線形關係，從而定量檢測出樣品中(l-3)-i3_D葡聚糖濃度； 試驗過程應嚴格按照使用說明書上具體操作方法進行操作，同時要注意一些操作過程中的注意事項；該試劑盒可以用來早期診斷臨床深部真菌感染，作為臨床診斷的參考之一。
2.如權利要求1所述的人工合成顯色基質包括Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 及 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N- 二乙氨基苯胺)三種。
3.如權利要求1所述的顯色劑A包括1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉以及顯色劑B (高碘酸鈉)等。
4.如權利要求1所述的所生成的藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定範圍內呈線形關係。
5.如權利要求2所述的人工合成顯色基質的濃度為2-6mMol之間，配製後分裝冷凍乾燥或溶液在2-8°C避光保存，BoC-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)核磁圖見說明書附圖3。
6.如權利要求3所述的顯色劑1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉的濃度為0. 6-6mMol之間，並使用0. 05Mol硼酸緩衝液配製(pH 8. 5)，其顯色劑高碘酸鈉的濃度為0. 2-2%之間，使用滅菌注射用水配製，分裝在棕色瓶中冷凍乾燥或溶液在 2-8 °C避光保存。
7.如權利要求1所述的試劑盒具體操作方法為將反應主劑掰開，加入反應主劑用溶解液0. 1ml，輕輕混勻溶解，分別加入標準品稀釋系列、陰性對照及待測樣品各0. lml，37°C 保溫60分鐘；之後分別加入0. Iml合成顯色基質，37°C保溫15分鐘；取出振搖均勻，然後加入顯色劑A 50ul混勻，之後加入0. Iml顯色劑B混勻，室溫放置5分鐘，最後在波長 630-680nm檢測吸光度值，計算含量。
8.如權利要求1所述的試劑盒使用過程中注意外環境的影響以及所使用器具中含有的(1-3)-β-D-Glucan的汙染，會對測定值產生影響；尤其是顯色試劑添加前操作一定要避免微生物以及(1-3)-β-D-Glucan的汙染，另外以(1-3)-β-D-Glucan為成分的一些藥品、纖維素類透析膜進行血液透析時，也都會對測定值產生影響。
全文摘要
本發明是利用微量真菌細胞壁成分(1-3)-β-D-Glucan激活鱟血細胞裂解物中G因子，從而水解顯色基質(Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，進而發生縮合反應而定性、定量檢測(1-3)-β-D葡聚糖方法。

發明內容
以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，利用微量(1-3)-β-D-Glucan特異性地激活鱟血細胞裂解物中的G因子、凝固酶原及凝固蛋白原，被激活的凝固酶水解顯色基質釋放出基團DIAN，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1-萘酚-2-磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與縮合物的吸光度在一定範圍內呈線形關係，從而定量檢測樣品中(1-3)-β-D-Glucan濃度。該試劑盒可以用來早期診斷臨床深部真菌感染。
文檔編號C12Q1/56GK102305787SQ20101027516
公開日2012年1月4日 申請日期2010年9月8日 優先權日2010年9月8日
發明者苑慶華 申請人:天津市一瑞生物工程有限公司