生產l－亮氨酸的方法

2023-05-15 03:47:36 1

專利名稱：生產l－亮氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及生產L-亮氨酸的方法，尤其是用埃希氏菌屬細菌生產L-亮氨酸的方法。L-亮氨酸是一種必需胺基酸，可以用作食品和飼料的營養添加劑、藥物治療、製藥業或化學工業的試劑或材料，或用於生產諸如酪氨酸之類的其它胺基酸的生長因子。
過去，主要採用屬於短桿菌屬、棒狀桿菌屬或沙雷氏菌屬的產生L-亮氨酸的細菌或其突變體已生產了L-亮氨酸(Amino acid fermatation,JAPAN SCIENTIFIC SOCIETY』S PRESS，第397-422頁，1996)。
當採用黃色短桿菌VKPM B-2736時獲得最高水平的L-亮氨酸累積，該菌株在實驗室發酵罐中在含葡萄糖的培養基上發酵72小時，產生的L-亮氨酸濃度高至26g/L(USSR作者證書1394711)。而乳發酵短桿菌34在具有蔗糖的培養基上產生的L-亮氨酸高至34g/L(Appl.Environ.Microbiol.,51，第1024頁(1986))。
如上所述，L-亮氨酸的生產力已經提高到某些程度，然而，需要開發更有效和成本更有效的生產L-亮氨酸的方法，以便滿足未來對L-亮氨酸日益增加的需求。
另一方面，屬於埃希氏菌屬的微生物由於其快速的生長速率、通過遺傳分析獲得的突出的數據和豐富的遺傳材料，可潛在地用作有效的L-亮氨酸生產菌。然而，有幾篇報導公開了採用埃希氏菌屬細菌生產L-亮氨酸。
作為埃希氏菌屬的L-亮氨酸生產細菌菌株，抗β-噻吩基丙氨酸菌株、抗β-噻吩基丙氨酸和β-羥亮氨酸的菌株(關於這兩種，參見日本專利公告62-34397)和抗4-氮雜亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸的菌株(日本專利公開公告8-70879)是已知的。
然而，既不知道埃希氏菌屬的L-亮氨酸抗性菌，也不知道L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生產力之間的關係。
從上述觀點來看，已經進行了本發明，本發明的一個目的是提高埃希氏菌屬細菌L-亮氨酸的生產力，並提供有效和成本有效的L-亮氨酸的生產方法。
為了達到上述目的而努力研究的結果，本發明人已經發現賦予埃希氏菌屬細菌L-亮氨酸抗性使L-亮氨酸的生產力提高，並完成了本發明。
就是說，本發明提供屬於埃希氏菌屬的細菌，它具有產生L-亮氨酸的能力並且抗L-亮氨酸。
另一方面，本發明提供上述細菌，它還抗亮氨酸類似物。該亮氨酸類似物例如為4-氮雜亮氨酸、3-羥亮氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸等等，最好是4-氮雜亮氨酸和3-羥亮氨酸。
在再一方面，本發明提供屬於埃希氏菌屬的細菌，它通過從屬於埃希氏菌屬的細菌中選擇抗L-亮氨酸和亮氨酸類似物的菌株而獲得，其中所述選擇對於L-亮氨酸和亮氨酸類似物的每種至少進行一次。
在又一方面，本發明提供生產L-亮氨酸的方法，它包括以下步驟在培養基中培養下述任何一種細菌(1)具有生產L-亮氨酸的能力並且抗L-亮氨酸和一種或多種亮氨酸類似物的埃希氏菌屬細菌；(2)具有生產L-亮氨酸的能力並且抗L-亮氨酸和抗4-氮雜亮氨酸或3-羥亮氨酸的埃希氏菌屬細菌；或(3)通過從屬於埃希氏菌屬的細菌中選擇抗L-亮氨酸和一種或多種亮氨酸類似物的菌株而獲得的埃希氏菌屬細菌，其中所述選擇對每種L-亮氨酸和亮氨酸類似物至少進行一次；以在該培養基中生產和積累L-亮氨酸，以及從該培養基中回收L-亮氨酸。
下面詳細解釋本發明。1本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌本發明的細菌是屬於埃希氏菌屬的細菌，它具有生產L-亮氨酸的能力並且抗L-亮氨酸。作為屬於埃希氏菌屬的細菌可以例舉大腸桿菌。屬於埃希氏菌屬、具有生產L-亮氨酸能力的細菌的例子例如為對亮氨酸類似物(諸如β-2-噻吩基丙氨酸、3-羥亮氨酸、4-氮雜亮氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸)具有抗性的細菌，它們在日本專利公告62-34397號和日本專利公開公告8-70879號中進行了描述；和如WO96/06926中描述的可以通過遺傳工程技術培育的細菌。通過從屬於埃希氏菌屬具有生產L-亮氨酸能力的細菌中選擇抗L-亮氨酸的細菌，可以獲得本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌。或者，通過從屬於埃希氏菌屬抗L-亮氨酸的細菌中選擇具有生產L-亮氨酸能力的細菌，也可以獲得本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌。屬於埃希氏菌屬細菌的最佳實施方案是還對亮氨酸類似物具有抗性。
在屬於埃希氏菌屬的細菌中，L-亮氨酸通過L-亮氨酸固有的生物合成途徑進行合成，該途徑從L-纈氨酸生物合成系統的最後中間產物(2-酮異戊酸)分叉。在屬於埃希氏菌屬的細菌中，分別用由ilvGMEDA操縱子編碼的一組酶和由leuABCD操縱子編碼的一組酶進行L-纈氨酸生物合成的最後一個步驟和L-亮氨酸固有的生物合成。
leuABCD操縱子包括leuA、leuB、leuC和leuD基因。在它們中，leuA編碼α-異丙基蘋果酸合酶，leuB編碼β-異丙基蘋果酸脫氫酶，leuC和leuD編碼α-異丙基蘋果酸異構酶。在這些酶中，α-異丙基蘋果酸合酶催化從α-酮異戊酸至α-異丙基蘋果酸的合成反應，α-異丙基蘋果酸異構酶催化從α-異丙基蘋果酸至β-異丙基蘋果酸的異構反應，而β-異丙基蘋果酸脫氫酶催化從β-異丙基蘋果酸至L-亮氨酸生物合成最後一個中間產物α-酮異己酸的脫氫反應。從α-酮異己酸至終產物L-亮氨酸的氨基化反應主要由轉氨酶催化。屬於埃希氏菌屬的細菌具有四種轉氨酶，即由aspC基因編碼的轉氨酶A(天冬氨酸-穀氨酸轉氨酶)、由包含在ilvGMEDA操縱子內的ilvE基因編碼的轉氨酶B(BCAA轉氨酶)、由avtA基因編碼的轉氨酶C(丙氨酸-纈氨酸轉氨酶)和由tyrB基因編碼的轉氨酶D(酪氨酸轉氨酶)。這些酶參與各種氨基化反應。在這些酶中，轉氨酶B和轉氨酶D催化從α-酮異己酸至L-亮氨酸的上述氨基化反應。轉氨酶C和轉氨酶D催化L-纈氨酸生物合成的最後一個步驟，它包括L-纈氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成中共同的途徑。
在L-亮氨酸生物合成途徑中的上述反應中，速率決定步驟是由α-異丙基蘋果酸合酶催化的從α-酮異戊酸至α-異丙基蘋果酸的合成反應，該反應由L-亮氨酸反饋抑制。此外，leuABCD操縱子的表達受L-亮氨酸的阻遏。編碼羥乙酸合酶Ⅰ的ilvBN基因的表達受L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同阻遏，編碼羥乙酸合酶Ⅱ的ilvGM基因的表達受L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同阻遏，而編碼羥乙酸合酶Ⅲ的ilvIH基因的表達受L-亮氨酸的阻遏。
受抑制的α-異丙基蘋果酸合酶以及受阻遏的leuABCD操縱子僅涉及L-亮氨酸的生物合成。因此，即使存在過量的L-亮氨酸，以上抑制和阻遏也不導致切斷供應任一營養物質的途徑。此外，儘管ilvIH基因的表達受阻遏，但不影響編碼其它同工酶的ilvBN基因和ilvGM基因的表達。因此，認為過量L-亮氨酸的存在不影響細胞的生長，然而本發明人意外地發現在過量的L-亮氨酸存在下細胞生長受抑制。此外，本發明人通過賦予L-亮氨酸抗性，成功地提高了埃希氏菌屬細菌的L-亮氨酸的生產力。
下面解釋獲得屬於埃希氏菌屬具有L-亮氨酸抗性的細菌和屬於埃希氏菌屬具有亮氨酸類似物抗性的細菌的方法。
通過將屬於埃希氏菌屬的細菌培養於含有引起生長抑制的濃度的L-亮氨酸的基本培養基中，可以獲得屬於埃希氏菌屬具有L-亮氨酸抗性的細菌。此中的生長抑制是指緩慢生長或停止生長。所述突變體的選擇可以進行一次或多次。該培養基中L-亮氨酸的濃度不特別限制，但其例子可以為1g/L或更多，最好為1g/L-20g/L。將屬於埃希氏菌屬的細菌在該選擇前經過突變處理。可以通過紫外輻射或通過用通常用於人工誘變的誘變劑(諸如N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等等)處理，來進行突變。
按上述獲得的屬於埃希氏菌屬具有L-亮氨酸抗性的細菌可以在L-亮氨酸存在下生長，L-亮氨酸的濃度使得它們的親代菌株不能生長。
如上所述，L-亮氨酸涉及L-亮氨酸生物合成的幾個調節步驟。因此，引起L-亮氨酸抗性的單個突變可能對L-亮氨酸生產力有效，然而，最好是通過雙突變或多突變脫敏多個調節。屬於埃希氏菌屬具有單個突變的細菌即使其L-亮氨酸生產力低，也可以用作培育L-亮氨酸生產菌株的起始來源。
通過將屬於埃希氏菌屬的細菌在含有生長抑制濃度的亮氨酸類似物的基本培養基中培養並選擇生長的菌株，可以獲得屬於埃希氏菌屬具有對亮氨酸類似物抗性的細菌。所述亮氨酸類似物的例子為4-氮雜亮氨酸、3-羥亮氨酸、α-噻吩基丙氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸等等，最好是4-氮雜亮氨酸和3-羥亮氨酸。
可以用一種亮氨酸類似物，或者用多種亮氨酸類似物進行亮氨酸類似物抗性突變體的選擇。所述突變體的選擇對於一種亮氨酸類似物可以進行一次或多次。
加入該培養基中的亮氨酸類似物的量取決於亮氨酸類似物的種類，但在4-氮雜亮氨酸或3-羥亮氨酸的情況下最好為0.1g/L或更多。在以上述同樣方式進行選擇之前，可以將屬於埃希氏菌屬的細菌經過突變處理。
在選擇屬於埃希氏菌屬具有亮氨酸類似物抗性以及亮氨酸抗性的細菌的情況下，對於每種抗性的選擇的任何順序都是可接受的，該順序不受限制。
在使用大腸桿菌K-12或其衍變株作為埃希氏菌屬細菌的情況下，除賦予對L-亮氨酸和/或L-亮氨酸類似物的抗性外，最好是賦予L-纈氨酸抗性。K-12菌株不表達羥乙酸合酶的活性同工酶Ⅱ，因為在編碼支鏈胺基酸生物合成途徑的一個羥乙酸合酶的同工酶Ⅱ大亞基ilvG基因中存在移碼突變(Proc Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981)。該同工酶Ⅱ不受L-纈氨酸的反饋抑制，然而其它同工酶同工酶Ⅰ和同工酶Ⅲ受L-纈氨酸的反饋抑制。因此，K-12菌株不能在存在過量L-纈氨酸的基本培養基中生長，因為L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的生物合成受抑制。因此，為了獲得得自K-12菌株的L-亮氨酸生產菌株，最好使用其中讀框恢復的ilvG基因回復突變的菌株，以便恢復該羥乙酸合酶的活性。具有ilvG基因回復突變的這樣一種菌株將表達L-纈氨酸抗性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981)。通過將K-12菌株培養於含有L-纈氨酸的基本培養基中，並以用於L-亮氨酸抗性或亮氨酸類似物抗性的同樣方式進行選擇，可以獲得具有L-纈氨酸抗性的K-12菌株。
然而，與上述K-12菌株的情況不一樣，在使用屬於埃希氏菌屬具有不受L-纈氨酸反饋抑制的羥乙酸合酶的細菌培育屬於埃希氏菌屬具有L-亮氨酸抗性的細菌的情況下，不需要賦予該埃希氏菌屬細菌L-纈氨酸抗性。
通過一般的突變處理或遺傳工程技術，可以提高本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌L-亮氨酸生物合成途徑的一種或多種酶的活性。通過在質粒、噬菌體或轉座子中插入含有完整或部分ilvGMEDA操縱子和/或leuABCD操縱子的DNA片段獲得重組DNA，將該重組DNA導入屬於埃希氏菌屬的細菌，可以使這種該酶的活性提高。
在Nucleic Acid Res.,20,3305-3308(1992)中描述了leuABCD操縱子的核苷酸序列的分析。leuABCD操縱子的完整序列已經記錄於該資料庫(DDBJ登記號D10483,DDBJ的網際網路網址http://www.ddbj.nig.ac.jp)中。通過按照PCR(聚合酶鏈式反應，參閱White,T.J.等，Trends Genet.,5,185(1989))擴增該DNA片段，可以獲得具有leuABCD操縱子的DNA片段，其中使用在上述序列的基礎上製備的寡核苷酸作為引物，將屬於埃希氏菌屬細菌的染色體DNA作為PCR的模板。或者，根據應用在上述序列的基礎上製備的寡核苷酸探針進行的雜交，篩選屬於埃希氏菌屬細菌的染色體DNA文庫，也可以獲得leuABCD操縱子。
在Nucleic Acid Res.,15,2137-2155(1987)和Gene,97,21-27(1991)中分別描述了ilvGMEDA操縱子的完整的核苷酸序列和該操縱子上遊區域的核苷酸序列。通過用在上述序列的基礎上製備的寡核苷酸探針或引物進行PCR或雜交，可以獲得具有ilvGMEDA操縱子的DNA片段。有時，在使用大腸桿菌K-12或其衍變株獲得ilvGMEDA操縱子的情況下，最好使用其中讀框恢復的ilvG基因回復突變的菌株，以便恢復該羥乙酸合酶的活性。在WO96/06926和Fr2627508中分別全面地描述了獲得ilvGMEDA操縱子的方法和在屬於埃希氏菌屬細菌的細胞中擴增該操縱子的方法。2生產L-亮氨酸的方法通過將可以按上述獲得的細菌培養在培養基中，在該培養基中生產並積累L-亮氨酸以及從該培養基中回收L-亮氨酸，可以有效地生產L-亮氨酸。
在本發明的方法中，該屬於埃希氏菌屬細菌的培養、從該培養基中收集和純化L-亮氨酸可以用細菌生產亮氨酸的常規發酵方法的相似方式進行。培養所用的培養基可以或者為合成培養基，或者為天然培養基，只要該培養基包括碳源和氮源以及礦物質和需要時的合適量的所用細菌生長所需的營養物。該碳源可以包括一種或多種不同的碳水化合物(諸如葡萄糖和蔗糖)和各種有機酸。關於所用細菌的同化方式，可以使用包括乙醇和甘油在內的醇。作為氮源，可以使用各種銨鹽，諸如氨和硫酸銨；其它氮化合物，諸如胺類；天然氮源，諸如蛋白腖、大豆水解產物或經消化的發酵微生物。作為礦物質，可以使用磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳或碳酸鈣。
最好在需氧條件下進行該培養，諸如震蕩培養和通氣攪拌培養，溫度為20-40℃，最好為30-38℃。該培養物的pH一般為5-9，最好為6.5-7.2。可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種鹼和緩衝液調節該培養物的pH。通常，培養1-3天使得在該液體培養基中積累靶L-亮氨酸。
培養後，通過離心和膜過濾從該液體培養基中除去諸如細胞的不溶性物質，然後收集靶L-亮氨酸，通過離子交換、濃縮和沉澱進行純化。
本發明的屬於埃希氏菌屬的細菌可以用作培育L-亮氨酸生產菌株或用於L-亮氨酸生產菌株的起始來源。與先前已知的用屬於埃希氏菌屬的細菌生產L-亮氨酸的方法相比，本發明使得可能更有效地生產L-亮氨酸。
下面參考實施例更具體地解釋本發明。
實施例1大腸桿菌L-亮氨酸抗性菌株的構建1L-亮氨酸抗性菌株的選擇通過按下述逐步選擇，從標準實驗室野生型菌株大腸桿菌K-12構建具有L-亮氨酸抗性和亮氨酸類似物抗性的大腸桿菌菌株。通過選擇具有該抗性的自發突變體獲得具有每種抗性的突變體菌株。具體地說，將待選擇的大腸桿菌K-12或其突變體平板接種於包含以下所示各種濃度的L-亮氨酸或亮氨酸類似物的瓊脂平板上。然後，選擇生長的菌株。
首先，在選擇具有L-亮氨酸抗性和亮氨酸類似物抗性的菌株之前，從大腸桿菌K-12選擇抗5g/LL-纈氨酸的突變菌株，獲得菌株B-5(Valr)。從菌株B-5，選擇出抗1g/LL-亮氨酸的突變菌株，命名為第325號(Valr,Leur)。然後，從第325號菌株選擇出抗0.1g/L4-氮雜-D,L-亮氨酸(下文稱為「4-氮雜亮氨酸」)的突變菌株，獲得第244號菌株(Valr,Leur,ALr)。從第244號菌株選擇出抗2g/L4-氮雜亮氨酸的菌株，獲得菌株70號(Valr,Leur,ALrr)。符號Valr、Leur、ALr分別代表賦予對L-纈氨酸、L-亮氨酸或氮雜亮氨酸抗性的菌株。符號ALrr代表賦予氮雜亮氨酸抗性兩次的菌株。2L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生產之間的關係為了研究L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生產之間的關係，按上述從第70號菌株獲得抗15g/LL-亮氨酸的自發突變菌株。
檢測從第70號菌株隨機分離的7個菌落和從得自第70號菌株的L-亮氨酸抗性突變體隨機分離的10個突變體的L-亮氨酸生產。結果，得自第70號菌株的任何亮氨酸抗性突變體都比親代菌株產量高。生產平均增加60％。
實施例2從大腸桿菌K-12培育L-亮氨酸生產菌株通過按下述逐步從大腸桿菌K-12選擇對L-纈氨酸、氮雜亮氨酸、羥亮氨酸和L-亮氨酸具有抗性的菌株，構建L-亮氨酸生產菌株。具體地說，將待選擇的大腸桿菌菌株平板接種於包含以下所示各種濃度的L-纈氨酸、亮氨酸類似物或L-亮氨酸的瓊脂平板上。然後，選擇生長的菌株。
從大腸桿菌K-12選擇出抗5g/LL-纈氨酸的突變菌株，獲得第101號菌株(Valr)，它不生產L-亮氨酸。從第101號菌株選擇出抗1.3g/L氮雜亮氨酸的突變菌株。獲得的第51號菌株(Valr,ALr)產生大約0.05-0.1g/L的L-亮氨酸。然後，從第51號菌株選擇出抗2g/L3-羥基-D,L-亮氨酸(下文稱為「羥基亮氨酸」)的突變菌株，獲得第4號菌株(Valr,ALr,Hleur)。符號「Hleur」代表賦予羥亮氨酸抗性的菌株。第4號菌株生產更多的亮氨酸(大約0.4-0.6g/L)。
第4號菌株用NTG處理，選擇出抗l5g/LL-亮氨酸的突變體。結果，獲得第57號和第103號兩個突變菌株(Valr,ALr,Hleur,Leur)。這些突變體的亮氨酸生產量達到15-17g/L。
在以上菌株中，第4號(大腸桿菌K-12,4)、第57號(大腸桿菌K-12,57)和第103號(大腸桿菌K-12,103)已經根據布達佩斯條約保藏於俄羅斯國立工業微生物保藏中心(俄羅斯113545莫斯科1 Dorozhnyproezd,1)中，保藏號分別為VKPM-7387、VKPM-7386和VKPM-7388。
實施例3用第57號和第103號菌株生產L-亮氨酸讓第57號和第103號菌株細胞於37℃在M9瓊脂平板上生長30小時。將每個鉑環量的培養物接種到含有15ml發酵培養基搖瓶(250ml)中，所述發酵培養基含有(％)葡萄糖(6)、硫酸銨(1.5)、磷酸氫鉀(0.15)、硫酸鎂(0.1)、硫胺素(0.00001)、碳酸鈣(2)。該培育於32℃在旋轉搖床上(250rpm)進行48小時。第57號菌株的L-亮氨酸生產量為1.5g/L，第103號菌株的L-亮氨酸生產量為1.7g/L。
權利要求
1．屬於埃希氏菌屬的細菌，它具有生產L-亮氨酸的能力並且抗L-亮氨酸。
2．權利要求1中定義的細菌，它還抗一種或多種亮氨酸類似物。
3．權利要求2中定義的細菌，所述亮氨酸類似物選自4-氮雜亮氨酸和3-羥亮氨酸。
4．屬於埃希氏菌屬的細菌，它通過從屬於埃希氏菌屬的細菌中選擇抗L-亮氨酸和一種或多種亮氨酸類似物的菌株而獲得的，其中所述選擇對每種L-亮氨酸和亮氨酸類似物至少進行一次。
5．生產L-亮氨酸的方法，它包括以下步驟在培養基中培養按照權利要求1-4的任一項的細菌，以生產和在該培養基中積累L-亮氨酸，以及從該培養基中回收L-亮氨酸。
全文摘要
通過在培養基中培養屬於埃希氏菌屬具有生產L－亮氨酸能力並且抗L－亮氨酸的細菌,在該培養基中生產和積累L－亮氨酸,並從該培養基中回收L－亮氨酸,來生產L－亮氨酸。
文檔編號C12N1/20GK1222576SQ98121460
公開日1999年7月14日 申請日期1998年10月29日 優先權日1998年10月29日
發明者G·M·馬科維奇, R·Y·佐格夫納, L·M·格裡戈列夫納, B·T·艾力克聖佐夫納, I·L·威勒列夫納, A·V·扎芬諾維奇, K·E·摩爾西維奇, L·V·阿卡狄維奇, K·Y·艾芬諾維奇, D·V·佐格維奇 申請人:味之素株式會社