一種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法
2023-05-06 23:35:26 4
一種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，特徵是先以質量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1∶1∶1的比例配製成高爾基銀染溶液，將腦組織浸泡於37℃銀染溶液中36-48小時，將浸泡好的腦組織在振動切片機上進行切片，將組織切片置於明膠包被的載玻片上，放置過夜，然後進行常規的氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最後用中性樹膠封片，顯微鏡觀察。採用本發明方法能夠快速準確的對大腦各部分腦區進行染色，且染色結果清晰，細節明顯，便於研究人員觀察腦組織的神經元結構，為臨床病例分析神經系統的病變提供了便捷的手段，對於神經學的基礎研究領域同樣具有重大的意義。
【專利說明】—種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於神經病理學組織染色法【技術領域】，具體涉及基於高爾基銀染法的快速神經組織染色的方法。
【背景技術】
[0002]已有的科學研究表明，大腦神經系統有一類專門負責傳遞和處理神經信號的興奮性細胞一有棘神經元，主要是由於神經元樹突上分布的形態各異的小突起一樹突棘而得名。神經元的樹突樹的精細構築調控了神經元之間複雜的突觸連接，並依此來調節神經信號的傳遞。樹突棘是神經元上突觸輸入的重要靶點，它與突觸可塑性有直接的相關性。因此觀察有棘神經元的樹突結構的改變對解釋大腦複雜的功能基礎和神經疾病的病變機理提供了直接證據。
[0003]在組織學染色領域，高爾基銀染法是目前應用最為廣泛的一種觀察神經元形態的染色方法，可以用來分析神經元的樹突結構和樹突棘形態。因其操作方便，耗費小，染色效果好，對顯微鏡要求低，並且該方法的組織切片在200微米左右可以清晰的顯示整個神經元樹突的形態。它的傳統操作流程是在染色液配置好後，將一定大小的腦組織放置其中，室溫避光保存，兩天後需要換置新鮮的染色液，14天後取出腦組織進行切片、顯影和觀察。但是該方法目前還存在一系列問題，比如整個過程費時、切片容易成碎片、染色時容易掉片等等。特別是由於浸染時間需要14天，大大影響了實驗進程。目前有很多研究組對該染色方法進行了一些改進來避免上述問題，比如替換顯影液，氧化劑等，但是實驗時間最短也要5天，也有相關報導將浸染溫度改為37°C，但是因為浸染時間的問題，染色效果不如原始方法的好。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，以實現快速觀察在體神經元結構，從而能夠為臨床病例分析神經系統的病變以及神經學的基礎研究提供便捷的手段。
[0005]本發明基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，其特徵在於包括以下步驟:
[0006]先以質量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1:1:1的比例配製成高爾基銀染溶液；
[0007]將待神經元染色的腦組織浸沒在上述配製的銀染溶液中，在37±2°C環境溫度下浸泡36到48小時；
[0008]然後利用振動切片機將浸泡好的腦組織進行切片，並置於明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜；
[0009]將上述放置過夜的切片經過氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最後用中性樹膠封片。
[0010]所述將浸泡好的腦組織進行切片的步驟為:取出浸泡好的腦組織，用磷酸緩衝液衝洗，然後將振動切片機的有關參數設定為:振幅0.45毫米，切片前進速度0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，採用振動切片機進行切片。
[0011]由於本發明採用了在將組織浸泡的溫度從傳統高爾基染法採用的室溫提高至37±2°C的同時將浸泡時間控制在36到48小時之間，從而在保證染色效果與傳統效果類似的基礎之上，有效地克服了傳統高爾基染色耗時14天的長時程操作、大大精簡了傳統實驗步驟，不需要不斷更新浸泡液，同時由於浸泡時間短和振動切片機合理使用，有效克服了傳統切片操作難、易碎片的缺點。本發明方法為神經元形態觀察提供了一種快速有效的新途徑，為神經領域的臨床分析和科學研究提供了一種有效的檢測手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1到圖6為採用本發明基於高爾基銀染法在不同浸染時間分別處理24小時、36小時、48小時、3天、6天和9天後的錐體神經元的示意圖。
[0013]圖7、圖8和圖9為本實施例中分別對不同腦組織採用本發明基於高爾基銀染法在浸染時間為48小時的神經元示意圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:
[0015]下面結合附圖通過實施例對本發明作進一步具體詳細的說明。
[0016]本發明基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，具體實施操作步驟包括:
[0017]I)配製銀染溶液:將質量體積比濃度為5%重鉻酸鉀(國藥)、5%氯化汞(國藥)和5%鉻酸鉀(國藥)水溶液按1:1:1的體積比例配製混合好，避光放置。
[0018]2)準備樣本:大鼠(SD)經過二氧化碳麻醉後，利用蠕動泵進行心臟灌流，灌流液為生理鹽水，然後快速斷頭取腦，將半腦浸沒在已配好的銀染染色液中。
[0019]3)組織樣本浸染:按照1:5的體積比將腦組織侵入銀染溶液中，避光放置。在37±2°C環境溫度下浸泡36到48小時。
[0020]4)切片:取出浸泡好的腦組織，用PBS緩衝液衝洗，然後用振動切片機(本實施例中採用的是德國製造的萊卡Viooos振動切片機)進行切片，各有關參數設定為:振幅為
0.45毫米，切片前進速度為0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，最後組織切片置於明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜。
[0021]5)顯影，製片及觀察:切片經過氨水顯影，梯度酒精脫水，利用100%酒精，二甲苯和丙酮新鮮配置的混合液，透明15分鐘，中性樹膠封片，最後在普通光學顯微鏡下觀察(本實施例中採用的是日本製造的尼康EclipseSOi光學顯微鏡)。
[0022]圖1到圖6為採用本發明基於高爾基銀染法在不同浸染時間分別處理24小時、36小時、48小時、3天、6天和9天後的錐體神經元的示意圖。圖中的結果顯示:浸泡36小時和48小時的組織染色效果比較好，神經元的樹突棘比較清晰，細胞結構比較完整。而24小時的染色結果，雖然樹突著色較深，但是樹突棘部分很容易成團，不利於觀察，到了第三天和第六天的結果樹突棘雖然還在，但是很多部位已經開始掉色，也就是背景中出現很多黑色斑點，到了第九天，神經元結構有了明顯的皺縮，神經元只剩下主幹的結構，並且主幹的樹突上的樹突棘也有明顯的皺縮，成團狀分布在樹突的第一級分支上。[0023]圖7、圖8和圖9為本實施例中分別對不同腦組織採用本發明基於高爾基銀染法在浸染時間為48小時的神經元示意圖。其中圖7為大腦視皮層錐體神經元(A)，圖8為海馬區錐體神經元(B)，圖9為海馬區顆粒細胞(C)。從圖7、圖8和圖9中可以看出:大腦視皮層的錐體神經元以及海馬區的錐體神經元和顆粒細胞整體染色清晰，特別是這三類神經元上的樹突棘結構完整，細節清楚，可以充分用於臨床的病理分析，該結果說明實施例中的各個條件的設定都是合理可行的，採用本發明基於高爾基銀染法在環境溫度37°C下浸染48小時的不同腦區的神經元整體結構完整，樹突著色深，樹突棘的結構清晰，同時縮短了常規的實驗流程，操作方便，利於研究人員進行腦組織病理形態的觀察分析。
【權利要求】
1.一種基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，其特徵在於包括以下步驟: 先以質量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1:1:1的比例配製成高爾基銀染溶液； 將待神經元染色的腦組織浸沒在上述配製的銀染溶液中，在37±2°C環境溫度下浸泡36到48小時； 然後利用振動切片機將浸泡好的腦組織進行切片，並置於明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜； 將上述放置過夜的切片經過氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最後用中性樹膠封片。
2.如權利要求1所述基於高爾基銀染法的快速神經元染色方法，特徵在於所述將浸泡好的腦組織進行切片的步驟為:取出浸泡好的腦組織，用磷酸緩衝液衝洗，然後將振動切片機的有關參數設定為:振幅0.45毫米，切片前進速度0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，採用振動切片機進行切片。
【文檔編號】G01N1/30GK103471898SQ201310460112
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】胡繁, 葛夢夢, 汪惠麗, 王豔, 劉志華, 徐麗 申請人:合肥工業大學