黃蜀葵花總黃酮提取物、其製備及應用的製作方法

2023-05-06 16:15:31 1

專利名稱：黃蜀葵花總黃酮提取物、其製備及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及黃蜀葵花總黃酮提取物、該提取物的製備方法、中藥製劑，及其在製備治療腎炎藥物中的應用。
背景技術：
黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵Abelmoschus Manihot(L.)Medic的乾燥花，該藥材收載於江蘇省中藥材標(1989年版)增補本，江蘇省蘇中藥廠將黃蜀葵花醇提物開發為三類新藥-黃葵膠囊，用於治療腎炎疾病。治療慢性腎小球腎炎，總有效率溼熱證組78.95％，非溼熱證組62.12％；治療乳糜尿總有效率84.62％；治療非胰島素依賴型糖尿病並發糖尿病腎病，結果表明黃蜀葵花醇提物可顯著減輕臨床期DN的蛋白尿，結合降糖、降壓治療，近期總有效率為83.87％，其中近期緩解率為25.81％，療效顯著。但黃葵膠囊有效成分含量較低，服用量較大，因此需開發有效成分含量達到50％以上二類新藥。
關於黃蜀葵花化學成分，王先榮等人於1981年，在植物學報，23(3)222-226(1981)報導了「黃蜀葵花的化學成分研究」，從黃蜀葵花中分離到槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、槲皮素等5種黃酮成分。王先榮等人又於2004年，在中國天然藥物，2(2)91-93(2004)報導了「黃蜀葵花黃酮成分的研究」.從黃蜀葵花總黃酮中分離到棉皮素-3′-葡萄糖苷、異槲皮苷、金絲桃苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷等4種黃酮成分，其中棉皮素-3′-葡萄糖苷為一新化合物。
目前研究黃蜀葵花有效成分的方法可歸納為兩種1、先用水或醇提取，將回收溶劑後的提取物混懸於水中，分別用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取，劃分成幾個提取部分。再用矽膠柱或葡聚糖凝膠柱層析、分離成單組分物質。
2、申請號200410035741.X的發明專利申請「治療口腔潰瘍、胃潰瘍、燒燙傷、外傷感染的藥物及製備方法」。
上述的第一種方法是試驗室研究單一黃酮成分的方法，不適合總黃酮的製備。第二種方法是「取黃蜀葵花20kg，用20倍量-14倍量60-90％乙醇水回流提取2次，每次1hr，合併提取液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.13-1.16(60℃)的濃縮液；加適量水稀釋，通過大孔吸附樹脂柱或通過聚醯胺柱，用醇水溶液梯度洗脫，水洗脫3個柱體積，10％及30％乙醇各洗脫3個柱體積，70％乙醇洗脫1個柱體積，洗脫液濃縮，乾燥，粉碎後得總黃酮提取物，其總黃酮含量為5-95％(重量比)」。該技術方案的缺點是其一，因六羥基黃酮楊梅素、棉皮素及其苷類成分在30％乙醇中不穩定，用30％乙醇洗脫總黃酮不妥，其二，沒有具體明確所提供的有效部位由哪些黃酮成分組成及其含量。
黃蜀葵花總黃酮及其製劑目前只見到用於治療口腔潰瘍和心腦缺血性疾病的報導，尚未見到用於治療腎炎疾病的報導。

發明內容
本發明是為避免上述現有技術所存在的問題，提供一種高含量黃蜀葵花總黃酮提取物，藥理和化學研究表明該提取物活性成分明確，質量可控。
本發明另一目的是提供該黃蜀葵花總黃酮提取物的製備方法及其製劑。
本發明目的還在於提供該黃蜀葵花總黃酮提取物在製備治療腎炎疾病藥物中的應用。
本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明黃花蜀葵總黃酮提取物，其特徵是所述提取物按重量百分比的總黃酮含量為50-90％；其中所含黃酮成分包括槲皮素-3-洋槐糖苷1.0-5.0％、金絲桃苷8.0-24.0％、異槲皮苷7.0-20.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷5.0-15.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷3.0-10.0％、楊梅素0.5-5.0％、棉皮素0.5-5.0％、槲皮素2.0-8.0％，其它黃酮類成分餘量。
本發明黃蜀葵花總黃酮提取物製備方法是按如下步驟操作a、將乾燥的黃蜀葵花粉碎成粗粉，用8-10倍量50-95％乙醇加熱回流提取1-2小時，共提取2-3次；其中，用於回流提取的乙醇優選為60-80％乙醇；b、將提取液在低於60℃的條件下減壓濃縮至60℃時比重為1.13-1.16的浸膏，加入原生藥量3-5倍量沸水，分次溶解，靜置12小時，過濾；c、濾液通過大孔吸附樹脂柱，(可以包括各種非極性、弱極性和中極性大孔吸附樹脂)或聚醯胺柱層析，首先用水衝洗4-8個柱體積，再用不同濃度醇水溶液洗脫、收集、濃縮的操作過程為用10％-20％乙醇或10％-20％甲醇洗脫1-2個柱體積、去除洗脫液；用70-80％乙醇或70-80％甲醇洗脫，收集洗脫液；將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；
d、總黃酮提取物粗品的精製，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得產品，總黃酮含量達到50％-90％的黃蜀葵花總黃酮提取物。
本發明黃蜀葵花總黃酮提取物的中藥製劑，其特徵是所述中藥製劑是以所述黃蜀葵花黃蜀葵花總黃酮提取物為藥物有效成份，加入藥用輔料後製成的滴丸、片劑、膠囊劑、軟膠囊、顆粒劑。
本發明以黃蜀葵花總黃酮提取物用於製備治療腎炎疾病的藥物。
藥理研究表明黃蜀葵花黃酮類成分是治療腎炎的有效成分，化學研究表明黃蜀葵花黃酮類成分以槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、棉皮素和槲皮素8種成分含量較高。不同的提取方法得到的提取物由於包含不同的黃酮類化合物、不同的含量，其藥理、藥性存在很大差異，都是一種新的物質。因此在保證藥效的前提下，儘可能提高提取物總黃酮的純度和明確提取物中主要黃酮類成分及其含量是技術難點。
與已有技術相比，本發明的有益效果體現在1、本發明黃蜀葵花提取物是以總黃酮含量、槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、棉皮素、槲皮素的含量對其進行確切的表徵，以這一表徵方式進行表徵的黃酮類物質以及黃蜀葵花總黃酮提取物具有顯著的治療腎炎疾病作用，均未見相關文獻的報導。
2、本發明採用高效液相色譜法，可以對提取物中對槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、棉皮素、槲皮素的黃酮成分進行明確定性和定量。
3、本發明黃蜀葵花總黃酮提取物治療腎炎疾病有可靠的療效。
4、本發明可以滿足廣大腎炎患者對不同劑型的要求。
本發明黃蜀葵花總黃酮提取物，其提取分離工藝不僅限於上述工藝，亦可採用其它提取分離手段得到。
利用上述工藝得到的黃蜀葵花總黃酮提取物的總黃酮含量及各組成成分含量測定方法為1、黃蜀葵花總黃酮提取物乾燥後，總黃酮含量的測定採用AlCl3絡合比色法進行測定，本品含總黃酮(以蘆丁計)為50-90％。
2、黃蜀葵花總黃酮提取物乾燥後，組成成分槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、棉皮素、槲皮素的含量測定均採用高效液相色譜法，各成分含量見實施例1-4。
黃蜀葵花總黃酮提取物組成成分的化學結構如下 棉皮素-3′-葡萄糖苷棉皮素 楊梅素 槲皮素 異槲皮苷 金絲桃苷 槲皮素-3′-葡萄糖苷槲皮素-3-洋槐糖苷下面用藥理實驗結果闡明其藥效作用一、用大鼠繫膜增生性腎炎(MsPGN)模型，觀察對大鼠腎炎的治療作用，結果如下1、黃蜀葵花總黃酮對第8周末和第10周末24h尿蛋白影響尿蛋白自造模第六周起，模型組與治療組均有不同程度的蛋白尿，且隨時間推漸加重。第8、10周末時，24小時尿蛋白定量黃蜀葵花總黃酮組均顯著低於模型組，二者相比亦有顯著性差異，提示黃蜀葵花總黃酮能明顯減輕MsPGN大鼠的蛋白尿(見表1)。
表1黃蜀葵花總黃酮對第8周末和第10周末24h尿蛋白影響


注與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
2、黃蜀葵花總黃酮對尿素氮、肌酐的影響生化檢查第10周末時，模型組的血CRE、BUN均明顯高於正常組，黃蜀葵花總黃酮各劑量組和腎炎康復片組的血CRE、BUN與模型組相比亦有顯著性差異，表明黃蜀葵花總黃酮能改善MsPGN大鼠的腎功能(見表2)。
表2黃蜀葵花總黃酮對尿素氮、肌酐的影響


注與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。
3、黃蜀葵花總黃酮對血清白蛋白的影響第10周末時，黃蜀葵花總黃酮大劑量組血清白蛋白與模型組相比有顯著性差異，提示黃蜀葵花總黃酮能改善MsPGN大鼠的蛋白質代謝，提高ALB(見表3)。
表3黃蜀葵花總黃酮對血清白蛋白的影響


注與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。
4、黃蜀葵花總黃酮對腎病理組織學改變的影響光鏡檢查模型組病變主要表現為部分腎小球增大，個別腎小球出現萎縮而至纖維化，多數呈現瀰漫的輕重不等的繫膜組織增生，大部分區域為輕中度增生，表現為繫膜區增寬，增寬的繫膜區內繫膜細胞和繫膜基質均有增生，毛細血管腔狹小，個別結構破壞，血管消失。黃蜀葵花總黃酮組個別區域腎小球繫膜細胞輕度增生，繫膜基質輕度增寬，管管腔無擠壓現象。腎炎康復片組腎小球病理改變與腎疏寧組大致相同，繫膜區輕度增寬，血管腔有輕度擠壓現象，但毛細血管基底膜無明顯改變。
二、結論黃蜀葵花總黃酮對大鼠腎炎有治療作用附圖
為黃蜀葵花總黃酮提取物HPLC圖譜。
該圖譜能對黃蜀葵花總黃酮提取物組成成分槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-3′-葡萄糖苷、槲皮素-3′-葡萄糖苷、楊梅素、棉皮素、槲皮素的黃酮成分進行明確定性和定量。
具體實施例方式下面通過實施例對黃蜀葵花總黃酮提取物提取方法及其製劑的製備方法作進一步詳述。
實施例1取黃蜀葵花生藥粗粉1kg，加10倍量80％乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合併提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至無醇時，並濃縮至60℃相對密度為1.13的浸膏；加相當於生藥5倍量的沸水，分次攪拌使溶解，過濾，濾液加於非極性D101大孔吸附樹脂柱上，用水衝洗6個柱體積後，用10％乙醇洗脫2個柱體積，用70％乙醇洗脫至無AlCl3反應，收集70％乙醇洗脫液，將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；取粗品總黃酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得產品。總黃酮提取物收得率為3.5％，按重理百分比其總黃酮以蘆丁計含量為68.5％，其成分含量為槲皮素-3-洋槐糖苷3.0％、金絲桃苷17.2％、異槲皮苷12.5％、槲皮素-3′-葡萄糖苷9.5％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.6％、楊梅素1.5％、棉皮素4.0％、槲皮素4.0％，其它黃酮類成分餘量。
實施例2取黃蜀葵花生藥粗粉1kg，加8倍量70％乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合併提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至無醇時，並濃縮至60℃相對密度為1.14的浸膏；加相當於生藥4倍量的沸水，分次攪拌使溶解，過濾，濾液加於弱極性AB-8大孔吸附樹脂柱上，用水衝洗8個柱體積後，用10％乙醇洗脫2個柱體積，用70％乙醇洗脫至無AlCl3反應，收集70％乙醇洗脫液，將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；取粗品總黃酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得產品。總黃酮提取物收得率為3.2％，按重量百分比其總黃酮以蘆丁計含量為69.5％，其成分含量為槲皮素-3-洋槐糖苷2.8％、金絲桃苷18.0％、異槲皮苷13.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷10.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.0％、楊梅素1.5％、棉皮素4.2％、槲皮素4.0％，其它黃酮類成分餘量。
實施例3取黃蜀葵花生藥粗粉1kg，加8倍量60％乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合併提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至無醇時，並濃縮至60℃相對密度為1.16的浸膏；加相當於生藥4倍量的沸水，分次攪拌使溶解，過濾，濾液加於中極性DM301大孔吸附樹脂柱上，用水衝洗5個柱體積，用10％乙醇洗脫1個柱體積，用70％乙醇洗脫至無AlCl3反應，收集70％乙醇洗脫液，將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；取粗品總黃酮提取物用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得產品。按重量百分比的總黃酮提取物收得率為3.6％，其總黃酮以蘆丁計含量為69.0％，其成分含量為槲皮素-3-洋槐糖苷2.5％、金絲桃苷17.5％、異槲皮苷13.5％、槲皮素-3′-葡萄糖苷9.8％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.3％、楊梅素1.3％、棉皮素4.0％、槲皮素4.0％，其它黃酮類成分餘量。
實施例4取黃蜀葵花生藥粗粉1kg，加8倍量70％乙醇加熱回流提取2小時，共提取3次，合併提取液，放冷，過濾，減壓回收乙醇至無醇時，並濃縮至60℃相對密度為1.14的浸膏；加相當於生藥4倍量的沸水，分次攪拌使溶解，過濾，濾液加於聚醯胺柱上，用水衝洗8個柱體積後，用10％乙醇洗脫1個柱體積，用70％乙醇洗脫至無AlCl3反應，收集70％乙醇洗脫液，將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；取粗品總黃酮提取物，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79 V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得產品。按重量百分比的總黃酮提取物收得率為3.5％，其總黃酮以蘆丁計含量為71.5％，其成分含量為槲皮素-3-洋槐糖苷2.8％、金絲桃苷18.5％、異槲皮苷14.0％、槲皮素-3′-葡萄糖苷10.0％、棉皮素-3′-葡萄糖苷5.5％、楊梅素1.5％、棉皮素4.2％、槲皮素4.0％，其它黃酮類成分餘量。
實施例5黃蜀葵花總黃酮片組分量黃蜀葵花總黃酮提取物1-100g糊精90g微晶纖維素 105g低取代羥丙甲纖維素 15g70％的乙醇溶液 15ml硬脂酸鎂1g製備過程黃蜀葵花總黃酮提取物、糊精、硬脂酸鎂、低取代羥丙甲纖維素分別粉碎過80目篩；將黃蜀葵花總黃酮與糊精、2/3量的低取代羥丙甲纖維素及70％的乙醇溶液混合研磨，使均勻，制軟材；再20目篩制顆粒，乾燥，整粒後加入剩餘的低取代羥丙甲纖維素，混勻，再加入硬脂酸鎂混勻，壓1000片；檢驗合格後包裝。
實施例6黃蜀葵花總黃酮滴丸組分 量黃蜀葵花總黃酮提取物1-50gPEG4000 15gPEG6000 22g製備過程將聚乙二醇4000、聚乙二醇6000加熱，再將熔融黃蜀葵花總黃酮提取物加入其中，充分攪拌，使藥物充分分散於基質中；將上述藥液轉移至滴丸機上，70℃～80℃密閉保溫10～20分鐘，用無水甲基矽油作冷卻劑，10℃～20℃梯度冷卻，用30～60滴/分速度進行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用無水石油醚洗滌用30～60滴/分速度進行滴制，即得成型丸粒。再收集滴丸，用無水石油醚洗滌2次，涼幹，包裝即可。
實施例7黃蜀葵花總黃酮軟膠囊組分量黃蜀葵花總黃酮提取物5-100g蜂蠟10g食用植物油 150g明膠10g甘油3g水 13g
製備過程稱取黃蜀葵花總黃酮提取物與經過加熱滅菌、澄清的食用植物油及蜂蠟熔融物混合，充分攪勻即得囊心物。取明膠加入適量水使其膨脹；另將甘油及餘下的水置煮膠鍋中加熱至70℃～80℃，混合均勻，加入膨脹的明膠攪拌，熔化，保溫1-2小時，靜置，使泡沫上浮，除去上浮的泡沫，以潔淨白布濾過，保溫待用。將已制好的明膠液，置明膠液貯槽中控制溫度在60℃左右，將黃蜀葵花總黃酮提取物放入藥液貯槽內；液狀石蠟溫度以10-25℃為宜，室溫10-20℃，滴頭溫度30-60℃，開始滴丸。滴出的膠丸先均勻地攤於紗網上，在10℃以下低溫吹風4小時以上，再用擦丸機擦去表面的石蠟，然後再低溫(10℃以下)吹風20小時以上，於40-50℃乾燥約24小時。取出乾燥的膠丸，燈檢，除去廢丸後，用95％乙醇洗滌，再在40-50℃以下吹乾，經質量檢查合格後，即可包裝。
實施例8黃蜀葵花總黃酮膠囊劑組分 量黃蜀葵花總黃酮提取物 5-100g澱粉 125g70％乙醇 適量製備過程將澱粉、黃蜀葵花總黃酮提取物混勻，過80目篩，加入適量的70％乙醇，制軟材，再用20目篩制顆粒，乾燥，整粒，裝膠囊，共製成1000粒，每粒含黃蜀葵花總黃酮提取物5-100mg，即可。
實施例9黃蜀葵花總黃酮顆粒劑組分量黃蜀葵花總黃酮提取物1-10g糊精28g糖粉10g酒石酸 1g50％乙醇(體積分數) 適量將黃蜀葵花總黃酮提取物、糊精、糖粉分別過100目篩，按等體積遞增配研法將黃蜀葵花總黃酮提取物與輔料混勻，再將酒石酸溶於50％乙醇(體積分數)中，一次加入上述混合物中，混勻，制軟材，過16目尼龍篩，60℃以下乾燥，整粒後用塑膠袋包裝，每袋2g，含黃蜀葵花總黃酮提取物50-500mg。
權利要求
1.一種黃蜀葵花總黃酮提取物，其特徵是所述提取物按重量百分比的總黃酮含量為50-90％；其中所含黃酮成分包括槲皮素-3-洋槐糖苷1.0-5.0％、金絲桃苷8.0-24.0％、異槲皮苷7.0-20.0％、槲皮素-3-葡萄糖苷5.0-15.0％、棉皮素-3-葡萄糖苷3.0-10.0％、楊梅素0.5-5.0％、棉皮素0.5-5.0％、槲皮素2.0-8.0％，其它黃酮類成分餘量。
2.一種權利要求1所述黃蜀葵花總黃酮提取物的製備方法，其特徵是按如下步驟操作a、將乾燥的黃蜀葵花粉碎成粗粉，用8-10倍量50-95％乙醇加熱回流提取1-2小時，共提取2-3次；b、將提取液在低於60℃的條件下減壓濃縮至60℃時比重為1.13-1.16的浸膏，加入原生藥量3-5倍量沸水，分次溶解，靜置12小時後過濾；c、濾液通過大孔吸附樹脂柱或聚醯胺柱層析，首先用水衝洗4-8個柱體積，再用不同濃度醇水溶液洗脫、收集、濃縮的操作過程為用10-20％乙醇或10-20％甲醇洗脫1-2個柱體積、去除洗脫液；用70-80％7乙醇或70-80％甲醇洗脫至無AlCl3反應，收集洗脫液；將該洗脫液在低於60℃條件下減壓濃縮，真空乾燥得黃蜀葵花總黃酮提取物粗品；d、總黃酮提取物粗品的精製，用10倍量醋酸乙酯-乙醇(76.89∶38.79V/V)回流提取3次，每次2小時，回收溶劑，80℃減壓乾燥得按重量百分比總黃酮含量達到50％-90％的黃蜀葵花總黃酮提取物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是所述步驟a中用於回流提取的乙醇是60-80％的乙醇。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵是所述步驟c中用於柱層析的大孔吸附樹脂包括非極性、弱極性和中極性大孔吸附樹脂。
5.權利要求1所述黃蜀葵花總黃酮提取物的中藥製劑，其特徵是所述中藥製劑是以所述黃蜀葵花總黃酮提取物為藥物有效成份，加入藥用輔料後製成的滴丸、片劑、膠囊劑、軟膠囊、顆粒劑。
6.權利要求1或2所述黃蜀葵花總黃酮提取物用於製備治療腎炎疾病的藥物。
全文摘要
黃蜀葵花總黃酮提取物、其製備及應用，其特徵是所述提取物按重量百分比總黃酮含量為50－90％，其所含黃酮成分為槲皮素－3－洋槐糖苷1.0－5.0％、金絲桃苷8－24.0％、異槲皮苷7.0－20.0％、槲皮素－3′－葡萄糖苷5.0－15.0％、棉皮素－3′－葡萄糖苷3.0－10.0％、楊梅素0.5－5.0％、棉皮素0.5－5.0％、槲皮素2.0－8.0％，以及其它數種黃酮類成分。本發明黃蜀葵花總黃酮提取物用於製備治療腎炎藥物，黃酮成分定性和定量明確，療效可靠。
文檔編號A61K9/48GK1994337SQ20061009761
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月11日 優先權日2006年11月11日
發明者王先榮, 周亞球, 戴敏, 杜安全, 周正華 申請人:周亞球, 王先榮