一種表面等離子共振晶片的製備方法
2023-05-17 07:38:11
專利名稱：一種表面等離子共振晶片的製備方法
技術領域：
本發明屬於表面等離子共振傳感技術領域，特別涉及表面等離子共振晶片的製備方法。
背景技術：
基於表面等離子體共振技術(surface plasmon resonance, SPR)的生物傳感器因其 能實時監測生物分子間相互作用，且具有無需標記、分析快捷、靈敏度高、前處理簡單、 樣品用量少等優點，已被廣泛應用於蛋白質組學、藥物研發、臨床診斷、食品安全和環境 監測等領域，且顯示出廣闊的應用前景。在眾多的SPR生物傳感器中，瑞典比艾可(BIAC0RE ) 系列儀器佔有最大的市場份額，相應地，其傳感晶片的使用也最為廣泛。目前最常用的芯 片為長鏈的羧化葡聚糖基質(CM5)晶片，適用於偶聯帶有氨基、巰基、醛基、羥基或羧基 的分子，但由於該晶片只能從Biacore公司購買，價格昂貴，實驗成本過高，致使很多單 位的Biacore儀器處於閒置狀態。《英國化學會志化學通訊》(Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1990, 116 .1 : 1526—1528 )才艮道過CM5晶片的制 備方法，不但操作繁瑣、耗時長，所使用的葡聚糖價格昂貴，而且其中的環氧氯丙烷是有 毒試劑。鑑於晶片成本已成為該技術普遍應用的瓶頸，因此開發成本低廉、操作簡單、耗 時短且安全無害的晶片製備方法，製備出具有CM5晶片相同功能的晶片，對促進表面等離 子共振傳感技術的發展有著重要意義。目前通過偶聯生物蛋白分子來製備表面等離子共振 傳感晶片的只有美國德州儀器(TI)公司的傳感晶片，它是將預先交聯過的牛血清白蛋白 直接浸泡連接於晶片表面，然後用琥珀酸酐對表面牛血清白蛋白分子進行羧基化。但是， 由於蛋白分子體積較大，金膜表面難免還存在棵露的地方；而預先交聯則會影響晶片表面 基質的平整度；且直接偶聯的強度不夠高，蛋白分子容易在使用過程中發生脫落；這些都 會影響晶片的使用效果、穩定性以及實驗結果的可重複性。除上述方法外，至今未見有其 它製備表面等離子共振晶片方法的報導。
發明內容
本發明的目的是提出一種表面等離子共振晶片的製備方法，以更簡便的方式製備出具 有CM5晶片相同功能的晶片，增加晶片類型的可選擇性。
本發明表面等離子共振晶片的製備方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)生物蛋白質的預處理
向生物蛋白質溶液中加入二硫鍵還原劑至混合溶液中生物蛋白質與二硫鍵還原劑的 終濃度分別為0. 01 nM-lmM和1 u M-1M,反應不少於1分鐘；
所述生物蛋白質選自分子內含有巰基和/或二硫鍵的蛋白質，包括牛血清白蛋白、卵 清白蛋白、血紅蛋白、核糖核酸酶和/或溶菌酶；
所述二硫鍵還原劑選自三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、2-巰 基乙醇和/或2-巰基乙酸；(2)晶片表面基質的構建
a) 將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入上述經預處理的生物蛋白質溶液 中浸泡不少於5分鐘，得到連有生物蛋白質分子的晶片；
b) 將上述得到的連有生物蛋白質分子的晶片放入含有0. 01-10M N-羥基丁二醯亞胺 與0. 01-10M乙基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中，浸泡不少於1分鐘進行表面交 聯；
c) 將表面交聯後的晶片放入含有0. 01-1OM溴乙酸與0. 01-1OM的氫氧化鈉或氫氧化
鉀水溶液中，浸泡不少於5分鐘，取出後用水洗淨並在4-60 °C乾燥，便得到具有羧基表
面的生物蛋白質晶片。
所述乾燥包括氮氣吹千、空氣吹乾、烘乾或自然晾乾。
本發明藉助於金屬表面分子自組裝技術的發展，採用化學方法改性、固定和修飾的手 段，將改性的生物蛋白質分子通過自組裝固定於晶片金膜表面，然後再進一步修飾，製備 出了適用於SPR生物傳感器的新型傳感晶片。
與現有技術相比較，本發明的優點和有益效果為
(1) 與目前已公開的製備CM5晶片的方法相比較，本發明採用簡單的化學方法與安 全無害的試劑，通過簡易的操作便能在較短時間內製備出具有CM5晶片相同功能的生物蛋 白質晶片，增加了晶片類型的可選擇性；
(2) 與目前直接偶聯牛血清白蛋白的方法相比較，本發明方法適用於多種蛋白分子， 且製備的晶片具有偶聯分子密度更高、基質更均一和更牢固穩定的優點；
(3 )由於本發明製備過程使用的試劑均較易獲得且價格不太昂貴，與目前只能從 Biacore公司購買的CM5晶片相比，本發明的生物蛋白質晶片不但具備CM5晶片的功能， 而且製備成本低廉，從而能大幅降低實驗成本；為解決目前表面等離子共振晶片種類少、 價格高的問題提供了新的可能性。
圖1為使用本發明方法製備的牛血清白蛋白晶片測量含不同濃度磺胺曱噁唑的標準溶 液的典型共振信號曲線；
圖2為使用本發明方法製備的牛血清白蛋白晶片測量磺胺曱噁唑，根據標準溶液的共 振信號所作的磺胺甲噁唑濃度與共振信號的標準曲線；
圖3為使用Biacore公司的CM5晶片測量含不同濃度磺胺曱噁唑的標準溶液的典型共 振信號曲線；
圖4為使用Biacore公司的CM5晶片測量磺胺曱噁唑，根據標準溶液的共振信號所作 的磺胺甲噁唑濃度與共振信號的標準曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明方法作進一 步具體說明。 實施例1:
(1)生物蛋白質的預處理
4向牛血清白蛋白溶液中加入三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽，使混合溶液中牛血清白蛋白與 三(2-曱醯乙基)膦鹽酸鹽的終濃度分別為0. 5pM和lOOpM，反應30分鐘，使牛血清白蛋 白分子中的二硫鍵被還原；
(2 )進行晶片表面基質的構建
a) 將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入經上述預處理的牛血清白蛋白溶 液中浸泡60分鐘，即得到連有牛血清白蛋白分子的晶片；
b) 將上述得到的連有牛血清白蛋白分子的晶片放入含有0. 4M N-羥基丁二醯亞胺與 0. 5M乙基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中浸泡12分鐘進行表面交聯；
c) 將表面交聯後的晶片放入含有0. 05M溴乙酸與0. 1M氫氧化鈉的水溶液中浸泡60
分鐘，使表面分子羧曱基化，取出後用水洗淨並在30 。C的溫度用氮氣吹乾，便得到具
有羧基表面的牛血清白蛋白晶片。
圖2為使用本發明方法製備的牛血清白蛋白晶片測量磺胺曱噁唑，根據標準溶液的共 振信號所作的磺胺曱噁唑濃度與共振信號的標準曲線；圖4為使用Biacore公司的CM5芯 片測量磺胺甲噁唑，根據標準溶液的共振信號所作的磺胺曱噁唑濃度與共振信號的標準曲 線。
通過將牛血清白蛋白晶片和CM5晶片在相同儀器條件下檢測磺胺甲噁唑所分別得到的 抑制標準曲線圖2與圖4相比較，可見兩者的曲線形狀十分相似，各濃度標準溶液均具有 很好的穩定性，表明牛血清白蛋白晶片完全可以替代CM5晶片用於磺胺甲噁唑的定量分析。 不僅如此，牛血清白蛋白晶片還具有再生更容易，分析時間更短的優勢。
圖3為使用Biacore公司的CM5晶片測量含不同濃度磺胺曱噁唑的標準溶液的典型共 振信號曲線；圖1為使用本發明方法製備的牛血清白蛋白晶片測量含不同濃度磺胺曱噁唑 的標準溶液的典型共振信號曲線。
如圖3和圖1中所顯示的，相對於CM5晶片所使用的進樣1分鐘的再生條件和400秒 的單個樣品分析時間，牛血清白蛋白晶片只需進樣半分鐘作為再生條件便能得到很徹底的 再生效果，而其單個樣品的分析時間僅需大約300秒。此外，牛血清白蛋白晶片進樣前後 的基線信號非常平穩，反映了晶片表面基質具有良好的均一性和穩定性。
實施例2:
(1) 生物蛋白質的預處理
向卵清白蛋白溶液中加入2-巰基乙醇，使混合溶液中卵清白蛋白與2-巰基乙醇的終 濃度分別為2 0 ju M和2mM,反應6 0分鐘，使卵清白蛋白分子中的二硫鍵被還原；
(2) 進行晶片表面基質的構建
a) 將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入經上述預處理的卵清白蛋白溶液 中浸泡4 0分鐘，即得到連有卵清白蛋白分子的晶片；
b) 將上述得到的連有卵清白蛋白分子的晶片放入含有0. 01M N-羥基丁二醯亞胺與 0. 01M乙基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中浸泡30分鐘進行表面交聯；
c) 將表面交聯後的晶片放入含有0. OIM溴乙酸與0. OIM氫氧化鉀的水溶液中浸泡300分鐘，使表面分子羧曱基化，取出後用水洗淨並在25 °C的溫度用空氣吹乾，便得到具
有羧基表面的卵清白蛋白晶片。 實施例3:
(1) 生物蛋白質的預處理
向牛血紅蛋白溶液中加入2-巰基乙酸與二硫蘇糖醇，使混合溶液中牛血紅蛋白、2-巰基乙酸與二硫蘇糖醇的終濃度分別為lmM、 0. 8M和0，5M,反應15分鐘，使牛血紅蛋白 分子中的二硫鍵被還原；
(2) 進行晶片表面基質的構建
a) 將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入經上述預處理的牛血紅蛋白溶液 中浸泡5分鐘，即得到連有牛血紅蛋白分子的晶片；
b) 將上述得到的連有牛血紅蛋白分子的晶片放入含有2M N-羥基丁二醯亞胺與1M乙 基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中浸泡8分鐘進行表面交聯；
c) 將表 面交聯後的晶片放入含有2M溴乙酸與4M氫氧化鈉的水溶液中浸泡15分鐘，
使表面分子羧曱基化，取出後用水洗淨並在4 °C的溫度用氮氣吹乾，便得到具有羧基表
面的牛血紅蛋白晶片。 實施例4:
(1)生物蛋白質的預處理
向核糖核酸酶溶液中加入二^e克蘇糖醇，使混合溶液中核糖核酸酶與二^e克蘇糖醇的終濃 度分別為0. 01 m m和1 (j m，反應40分鐘，使核糖核酸酶分子中的二硫鍵被還原； (2 )進行晶片表面基質的構建
a) 將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入經上述預處理的核糖核酸酶溶液 中浸泡90分鐘，即得到連有核糖核酸酶分子的晶片；
b) 將上述得到的連有核糖核酸酶分子的晶片放入含有5M N-羥基丁二醯亞胺與4M乙 基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中浸泡5分鐘進行表面交聯；
c) 將表面交聯後的晶片放入含有10M溴乙酸、1M氫氧化鈉和7M氫氧化鉀的水溶液中
浸泡5分鐘，使表面分子羧甲基化，取出後用水洗淨並在60 °C的溫度烘乾，便得到具
有羧基表面的核糖核酸酶晶片。 實施例5:
(1)生物蛋白質的預處理
向溶菌酶和牛血清白蛋白混合溶液中加入二硫赤蘚糖醇，使混合溶液中溶菌酶、牛血 清白蛋白與二硫赤蘚糖醇的終濃度分別為40pM、 60pM和100mM,反應1分鐘，使溶菌酶 和牛血清白蛋白分子中的二硫鍵被還原； (2 )進行晶片表面基質的構建
a)將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入經上述預處理的溶菌酶和牛血清 白蛋白混合溶液中浸泡25分鐘，即得到連有溶菌酶和牛血清白蛋白分子的晶片；b) 將上述得到的連有溶菌酶和牛血清白蛋白分子的晶片放入含有10M N-羥基丁二醯亞胺與10M乙基-二曱氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中浸泡1分鐘進行表面交聯；
c) 將表面交聯後的晶片放入含有0. 6M溴乙酸與0. 5M氫氧化鈉的水溶液中浸泡40分鐘，使表面分子羧甲基化，取出後用水洗淨並在室溫下自然晾乾，便得到具有羧基表面的溶菌酶-牛血清白蛋白晶片。
權利要求
1、一種表面等離子共振晶片的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)生物蛋白質的預處理向生物蛋白質溶液中加入二硫鍵還原劑至混合溶液中生物蛋白質與二硫鍵還原劑的終濃度分別為0.01μM-1mM和1μM-1M；所述生物蛋白質為分子內含有巰基和/或二硫鍵的蛋白質；(2)晶片表面基質的構建a)將表面為純金膜的表面等離子共振傳感晶片放入上述經預處理的生物蛋白質溶液中浸泡不少於5分鐘，得到連有生物蛋白質分子的晶片；b)將上述得到的連有生物蛋白質分子的晶片放入含有0.01-10M N-羥基丁二醯亞胺與0.01-10M乙基-二甲氨基丙基-碳二亞胺的混合水溶液中，浸泡不少於1分鐘進行表面交聯；c)將表面交聯後的晶片放入含有0.01-10M溴乙酸與0.01-10M的氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液中，浸泡不少於5分鐘，取出後用水洗淨並在4-60℃乾燥，便得到具有羧基表面的生物蛋白質晶片。
2、 如權利要求1所述表面等離子共振晶片的製備方法，特徵在於所述二硫鍵還原劑選 自三(2-曱醯乙基)膦鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、2-巰基乙醇和/或2-巰基乙酸。
3、 如權利要求1所述表面等離子共振晶片的製備方法，特徵在於所述乾燥採用氮氣吹 幹、空氣吹乾、烘乾或自然晾乾。
全文摘要
本發明公開了一種表面等離子共振晶片的製備方法，特徵是採用二硫鍵還原劑對分子內含有巰基和/或二硫鍵的生物蛋白質分子進行改性，然後藉助金屬表面分子自組裝技術在晶片表面構建蛋白基質，並進一步修飾，從而實現適用於SPR生物傳感器的新型傳感晶片的製備；本發明具有製備成本低、操作簡易、耗時短且安全無害的優點，所製備的晶片具備商業化CM5晶片的功能，為解決目前表面等離子共振晶片種類少、價格高的問題提供了新的可能性。
文檔編號G01N33/48GK101477114SQ20091011611
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月22日 優先權日2009年1月22日
發明者周宏敏, 浩 姜, 宋存先, 歐惠超, 江海峰, 羅昭鋒 申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所