一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法

2023-05-17 19:02:21 1

專利名稱：：一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法
技術領域：
：本發明屬於生物技術中土壤微生物檢測領域，本發明公開了一種針對土壤和環境中沙門氏菌(Sa/wo"e〃a)快速定量檢測的方法。二
背景技術：
：沙門氏菌是引起人類胃腸炎的主要病原菌之一，近年來由於沙門菌人畜共患的生態特徵及其所引發的食源性腹瀉發病率上升而使之成為世界衛生組織(WHO)廣泛關注的公共衛生問題，是世界公認的重要病原菌。2008年美國聖保羅沙門氏菌感染疫情暴發，沙門氏菌感染蔓延至23個州，228人感染，25人住院，l人死亡。美國聯邦食品與藥物管理局(FDA)證實是墨西哥辣椒受沙門氏菌感染所致。土壤中的沙門氏菌存活時間長，有關文獻指出土壤中沙門氏菌存活時間長達三個月之久。因此準確、快速地檢測土壤和環境中的沙門氏菌，對於防止沙門氏菌汙染擴散具有十分重要的意義。土壤中沙門氏菌檢測一直採用醫療衛生和食品檢測所用的方法，也即利用鑑別培養基結合生理生化鑑定。但是這種方法應用於土壤樣品檢測時，一方面由於土壤組成複雜、含有大量的微生物而對檢測的靈敏度產生幹擾，另一方面存在檢測周期長、漏檢率高、程序複雜、所需試劑繁多等缺點，費時費力，不能滿足大量土壤或環境樣品快速檢測的要求。本發明所提供的檢測方法能克服傳統的微生物培養檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間縮短到只需2天，操作步驟和勞動強度也大為減縮，達到省時、省力、快速、高靈敏度的要求。本發明方法主要是將土壤J鼓生物;險測的MPN法(最大或然lt,mostprobablenumber)和現代分子生物學技術聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)有機結合起來，使檢測結果既能定量又能具有較高的檢測靈敏性，為土壤和環境中沙門氏菌檢測提供了一個穩定、實用的檢測方法。三
發明內容發明目的本發明提供一種能快速定量檢測土壤和環境樣品中沙門氏菌的檢測方法。技術方案一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於它依次包括以下步驟(1)土壤樣品的梯度稀釋；(2)選擇性增菌培養；(3)DNA提取；(4)PCR擴增及擴增產物檢測；(5)查MPN表並根據公式計算得出結果；所述的步驟(4)中PCR反應體系為反應條件(25ul):10xPCR緩衝液2.5ul,25mmol/LMg2+1.5ul,2.5mmol/LdNTP2.0ul，10.Oumol/L引物各1.0ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.5ul,待測沙門氏菌模板1.0ul,其中特異性引物為正向引物IttrC-13;5，-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3，反向引物IIttrB-1;5，-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3，土壤樣品的梯度稀釋過程包括稱取5.00g土樣加入盛有45ml無菌水的250ml三角瓶中，振蕩10分鐘，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，從而製備出系列梯度稀釋液。選擇性增菌培養過程包括每個稀釋度取lOO^L懸液加入到滅菌的900pL氯化鎂孔雀綠液體培養基，42土rC水浴培養18-24h,每個稀釋度設三個重複。DNA的提取過程包括以下步驟培養好的菌懸液轉移到經滅菌的1.5ml離心管中，13000r/min離心2min，棄去上清液；再加入lml無菌水，蓋嚴管蓋，反覆顛倒離心管數次，以混合內容物；13000r/min離心2min，棄去上清液，加入10ul超純水，沸水煮7分鐘，然後13000r/min離心2min取上清液，完成DNA提取，短時間內使用4°C保存，長時間使用需要-20°C保存。PCR擴增過程包括以下步驟25ulPCR反應體系10xPCR緩衝液2.5ul,25mmol/LMg2+1.5ul,2.5mmol/LdNTP2.0ul,10.0umol/L引物各1.0ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.5ul。擴增程序為95。C預變性lmin;33循環(95。C變性30sec,60。C退火30sec,72。C延伸30sec);72。C補平4min。土壤樣品梯度稀釋後採用三管或五管平行法，每個稀釋度做三個或五個平行樣。將土壤或環境樣品用無菌水稀釋，振蕩成懸液後進行倍梯度稀釋，然後接種於選擇性增菌培養液氯化鎂孔雀綠培養基中，於42土rC水浴培養18-24h後，釆用熱裂解法提取增菌液中的DNA。以沙門氏菌特異性基因序列為引物，以提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增結果用1.0%瓊脂糖電泳進行檢測，產生特異性擴增條帶的記為陽性，不產生特異性條帶的記為陰性。然後按照MPN計算方法，以出現陽性和陰性反應所對應的稀釋度，計算樣品中沙門氏菌的含量。有益效果本發明採用了MPN的方法，實現了環境樣品中沙門氏菌定量檢測的需要；採用選擇性增菌培養和特異性PCR檢測的方法，避免了其他微生物的幹擾、提高了檢測的靈敏度和特異性，與現有的方法相比，靈敏度可以提高兩個數量級以上。此外，本發明還縮短了檢測的時間、減輕了工作量，而且可以進行大批量樣品的檢測。四圖1土壤和環境樣品中沙門氏菌MPN-PCR檢測流程圖本流程主要包括樣品的梯度稀釋、選擇性增菌培養、DNA提取、PCR擴增以及MPN計算等五個環節。圖2土壤樣品中沙門氏菌MPN-PCR檢測結果實例(PCR擴增結果)從圖可以根據條帶的分布來判斷系列稀釋濃度的條帶近似值，進而計算出土壤中沙門氏菌的數量。五、具體實施實例1、樣品的梯度稀釋稱取5.00g土樣加入盛有45ml無菌水的250ml三角瓶中，振蕩10分鐘，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液。土壤分散後，吸取lml土壤懸液到9ml稀釋液中混合均勻，依次按10倍稀釋到合適的稀釋度。稀釋度按照具體樣品而定。2、選擇性增菌培養選擇性增菌培養基為氯化鎂孔雀綠液體培養基(配方見附表)。每個稀釋度取100uL懸液加入到滅菌的900iaL氯化鎂孔雀綠液體培養基，42土rC水浴培養18-24h，每個稀釋度設三個重複。3、DNA提取培養好的菌懸液轉移到經滅菌的1.5ml離心管中，13000r/min離心2min,棄去上清液；再加入lml無菌水，蓋嚴管蓋，反覆顛倒離心管數次，以混合內容物；13000r/min離心2min，棄去上清液，加入10ul超純水，沸水煮7分鐘，然後13000r/min離心2min取上清液，完成DNA提取，短時間內使用4。C保存，長時間使用需要-20'C保存。4、PCR擴增沙門氏菌特異性引物ttrC-13/ttrB-l引物IttrC-13;5，-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3，引物IIttrB誦l;5，-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3，反應體系(25ul):成分用量(ul)超純水dH2015.510xPCRbuffer2.525mmol/LMg2+1.52.5mmol/LdNTP2.0lO.Oumol/L引物各l.O5U/ulT叫DNA聚合酶0.5待測沙門氏菌模板1.0總體積25.0PCR擴增條件95。C預變性lmin;33循環(95。C變性30sec，60'C退火30sec,72。C延伸30sec);72。C補平4minPCR擴增產物鑑定取擴增產物4ul，點樣於1.0%瓊脂糖膠電泳，以1500bpMaker作為標準分子參照，以5V/cm的電場強度於0.5XTAE電泳緩衝液中電泳，用0.5ug/ml溴化乙錠染色，利用紫外凝膠成像系統進行拍照。結果見附圖2。5、MPN計算PCR擴增結果用1.0%瓊脂糖電泳進行檢測，將產生特異性擴增條帶的為陽性(記為+),不產生特異性條帶的為陰性(記為-)。然後按照MPN計算方法，以出現陽性和陰性反應所對應的稀釋度，計算樣品中沙門氏菌的含量。MPN計數是根據稀釋系列梯度中各稀釋濃度中有無待測微生物條帶出現得出數量指標，再根據每個重複數量(本方法採用三管重複)中呈現陽性的個數而在相應稀釋法測數統計表中查出細菌近似值。應用稀釋法計數時，在濃度稀釋系列中必須最後一個稀釋濃度中所有重複間都呈現陰性。確定數量指標系取濃度稀釋系列中所有重複都呈現陽性的最高稀釋度為數量指標的第一位數，進而確定待測菌液濃度的數量級。具體查表計算方法是將呈現陽性的管數按稀釋梯度由小到大的順序，選擇後3個連續稀釋梯度(10x、10x+1、10x+2),將其排列成一個三位數(如X,X+l,X+2)稱之為條帶近似值(abc)。其中，第一個稀釋度(即10x)是最後一個三次重複都呈陽性的稀釋度，如果第三個稀釋度(10x+2)再往下的梯度仍呈陽性，可將此稀釋度重複中呈陽性的個數加到第三個稀釋度(10x+2)上。然後查閱"稀釋法測數統計表"，得出對應數值，計算出lml檢測土壤樣品中沙門氏菌的總數(參見《土壤微生物研究方法》，科學出版社出1985版出版)，計算公式如下lg檢測樣品中沙門氏菌的總數(個)=條帶近似值x第一個稀釋度的稀釋倍數(lQx)幹土％在本實施案例中，選擇107、108、109三個稀釋度，條帶近似值(320)查閱"稀釋法測數統計表，，，得出對應數值為110。從而得出本實施案例中土壤中沙門氏菌的總數=9'5x1Q7=1.03x1S個/g92.5%在本案例中，我們還利用傳統的HE培養方法進行了MPN計數。結果表明，MPN-PCR檢測法比MPN-HE培養法檢測極限提高了約100倍，更能反應土壤樣品中實際的沙門氏菌的數量。表1本方法所用PCR引物序列特徵tableseeoriginaldocumentpage7氯化鎂孔雀綠培養基配方胰蛋白腖5.0g/L,氯化鈉8.0g/L,磷酸二氫鉀1.6g/L,孔雀石綠0.036g/L,臨用時，加滅菌40%氯化鎂溶液表2每毫升稀釋液細菌的近似值tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10序歹IJ表中國科學院南京土i泉研究所—種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法<130〉2Patentlnversion3.2120DNA引物1actgccgataaatgcacgtt20220DNA引物2cttttttccgccagtgaaga20權利要求1、一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於它包括以下步驟(1)土壤樣品的梯度稀釋；(2)選擇性增菌培養；(3)DNA提取；(4)PCR擴增及擴增產物檢測；(5)查MPN表並根據公式計算得出結果；所述的步驟(4)中PCR反應體系為反應條件(25ul)10×PCR緩衝液2.5ul，25mmol/LMg2+1.5ul，2.5mmol/LdNTP2.0ul，10.0umol/L引物各1.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.5ul，待測沙門氏菌模板1.0ul，其中特異性引物為正向引物IttrC-13；5』-[ACTGCCGATAAATGCACGTT]-3』反向引物IIttrB-1；5』-[CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA]-3』。2、根據權利要求1所述的一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於(1)土壤樣品的梯度稀釋過程包括稱取5.00g土樣加入盛有45ml無菌水的250ml三角瓶中，振蕩10分鐘，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，從而製備出系列梯度稀釋液。3、根據權利要求1所述的一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於(2)選擇性增菌培養過程包括每個稀釋度取100)iL懸液加入到滅菌的900氯化鎂孔雀綠液體培養基，42士rC水浴培養18-24h，每個稀釋度設三個重複。4、根據權利要求1所述的一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於(3).DNA的提取過程包括以下步驟培養好的菌懸液轉移到經滅菌的1.5ml離心管中，13000r/min離心2min,棄去上清液；再加入lml無菌水，蓋嚴管蓋，反覆顛倒離心管數次，以混合內容物；13000r/min離心2min,棄去上清液，加入10ul超純水，沸水煮7分鐘，然後13000r/min離心2min取上清液，完成DNA提取，短時間內使用4°C保存，長時間使用需要-20°C保存。5、根據權利要求1所述的一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於(4)PCR擴增過程包括以下步驟25ulPCR反應體系10xPCR緩沖液2.5ul，25mmol/LMg2+1.5ul,2.5mmol/LdNTP2.0ul,10.0umol/L引物各1.0ul,5U/ulT叫DNA聚合酶0.5ul。擴增程序為95。C預變性lmin;33循環(95。C變性30sec，60。C退火30sec,72。C延伸30sec);72。C補平4min。6、根據權利要求1所述的一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，其特徵在於土壤樣品梯度稀釋後採用三管或五管平行法，每個稀釋度做三個或五個平行樣。全文摘要一種用於土壤中沙門氏菌快速定量檢測方法，它依次包括以下步驟(1)土壤樣品的梯度稀釋；(2)選擇性增菌培養；(3)DNA提取；(4)PCR擴增及擴增產物檢測；(5)查MPN表並根據公式計算得出結果本發明採用了MPN的方法，實現了環境樣品中沙門氏菌定量檢測的需要；採用選擇性增菌培養和特異性PCR檢測的方法，避免了其他微生物的幹擾、提高了檢測的靈敏度和特異性，與現有的方法相比，靈敏度可以提高兩個數量級以上。此外，本發明還縮短了檢測的時間、減輕了工作量，而且可以進行大批量樣品的檢測。文檔編號C12Q1/68GK101613744SQ20091003284公開日2009年12月30日申請日期2009年6月4日優先權日2009年6月4日發明者宋德顯,睿尹,林先貴申請人:中國科學院南京土壤研究所被以下專利引用(2),