一種小分子抗體親和肽及其應用的製作方法

2023-04-29 15:53:06 3

一種小分子抗體親和肽及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種小分子抗體親和肽及其應用，其胺基酸序列如SEQIDNo.1-112中的任一項所示，其與人免疫球蛋白IgG的Fc片段結合，而不與人血清白蛋白HAS結合。採用本發明的小分子抗體親和肽作為親和配體，可以實現高效、安全、經濟的IgG分離純化。
【專利說明】一種小分子抗體親和肽及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體地，本發明涉及一種小分子抗體親和肽及其應 用。

【背景技術】
[0002] 免疫球蛋白IgG，即抗體是一種特殊的蛋白質分子，被作為體外診斷的試劑、治療 疾病的藥物、免疫親和層析的配基等，在生命科學研究、生物技術及醫學領域中有著廣泛的 應用。
[0003] 目前，IgG的分離純化多採用抗體的天然親和配體Protein A/G，由於Protein A/ G存在與抗體Fe片段專一性識別的能力，使用Protein A/G親和色譜純化抗體，獲得的產品 的純度較高。但是由於Protein A/G也屬於具有活性的生物物質，因此Protein A/G分離 也存在一些問題：
[0004] 1)價格昂貴：因為蛋白A配基需要通過基因工程的方法生產純化，因此生產成本 高，其價格達到$10000/升親和介質；
[0005] 2)缺乏有效的清洗方法，由於蛋白A在鹼性環境下不穩定，因此不能使用一般的 氫氧化鈉原位清洗法；
[0006] 3)由於配基也屬於蛋白質，易被存在原料液中的蛋白酶水解，從而降低分離效 果；
[0007] 4)與一般的化學配基相比，蛋白A色譜的使用生命周期較短；
[0008] 5)配基易脫落，脫落的蛋白A會引起人的免疫反應且在臨床上已經證實對人體有 毒害；
[0009] 6)洗脫pH較低（pH2_3)，易引起一些抗體失活或者出現聚集，常常需要邊收集產 品，邊中和，增加操作的複雜度。
[0010] 對於抗體的分離純化，也有很多研究者嘗試使用小分子化合物作為配體，也取得 的了一定的效果，但是目前的小分子化合物配體也存在一些問題：
[0011] 1)生理毒性：目前的小分子化合物配體多含有雜環，具有一定毒性。例如，4-巰 基-乙基吡啶（MEP)，其對小鼠50%致死量為178mg/kg。
[0012] 2)親和性差：目前的小分子化合物配體親和力通常較Protein A/G低。
[0013] 3)選擇性差：目前的小分子化合物配體在結合IgG的同時也會與主要分離雜質 HAS結合。
[0014] 所以，目前IgG的分離純化缺乏一種高效安全經濟的親和配體。


【發明內容】

[0015] 本發明的目的在於，提供了一種小分子抗體親和肽作為親和配體，實現高效安全 經濟的IgG分離純化。
[0016] 本發明的另一目的在於提供上述小分子抗體親和肽的應用。
[0017] 本發明的小分子抗體親和肽，其胺基酸序列如SEQ ID No. 1-112中的任一項所示。
[0018] 進一步地，根據本發明的小分子抗體親和肽，其結構特徵，自N端至C端如下：
[0019] NH2-R1-R2-R3-R4-R 5-COOH,
[0020] 其中，R1為穀氨醯胺（Gln)或穀氨酸（Glu)或門冬醯胺（Asn)或門冬氨酸（Asp)， R2為蘇氨酸（Thr)或纈氨酸（Val )，R3為纈氨酸（Val)或亮氨酸（Leu)或無，R4纈氨酸（Val) 或亮氨酸（Leu)或無，R 5為組氨酸（His)或賴氨酸（Lys)。也可以理解為R1為酸性胺基酸及 其衍生物，R 2為含羥基胺基酸和亮氨酸（Leu)，R3、R4為纈氨酸（Val)或亮氨酸（Leu)或無， R5為鹼性胺基酸。
[0021] 本發明的小分子抗體親和肽，所述小分子抗體親和肽與人免疫球蛋白IgG的Fc片 段結合。
[0022] 進一步的，本發明通過將所述的小分子抗體親和肽偶聯於載體，用於分離純化免 疫球蛋白IgG。
[0023] 本發明提供一種小分子抗體親和肽的應用，通過將所述的小分子抗體親和肽偶聯 於不同的載體可以實現不同條件下免疫球蛋白IgG的分離或純化，例如將該小分子抗體親 和肽偶聯於瓊脂糖凝膠，可以製備親和層析柱純化免疫球蛋白IgG ;而將該小分子抗體親 和肽偶聯於透析器的中空纖維膜，則可應用於自身免疫性疾病的血液淨化治療，選擇性的 清除致病IgG。
[0024] 本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果：
[0025] 1)高效：該小分子抗體親和肽的結合力與人免疫球蛋白天然配體Protein A/G相 當，同時不與人血清白蛋白結合。
[0026] 2)安全：該小分子抗體親和肽分子量小(小於6肽)，無免疫原性，其殘基序列取自 20種必需胺基酸，安全無毒。
[0027] 3)經濟：該小分子抗體親和肽由固相合成而得，成本較低且便於質量管控。
[0028] 因而採用該小分子抗體親和肽作為親和配體，可以實現高效、安全、經濟的IgG分 離純化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明中小分子抗體親和肽1與免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線；
[0030] 圖2為天然配體（Pro G)與免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線。

【具體實施方式】
[0031] 實施例1多肽合成
[0032] 1)活化樹脂：稱取 IOOOmg FMOC Cys-wang Resin，加入 10 ?15mL DMF 浸泡 30min (浸沒全部樹脂)，使其充分溶脹。
[0033] 2)脫保護：壓濾除去浸泡樹脂的DMF，加入含20%哌啶的DMF溶液10mL，氮氣吹沸 反應15min，然後壓濾除去含20%哌啶的DMF溶液，脫除保護氨基的FMOC基團，用IOmL異丙 醇洗滌樹脂三次，IOmL DMF洗三次，而後用茚三酮法檢測樹脂應成黑色或紫色。
[0034] 3)縮合反應：連接第一個胺基酸R5,稱取FMOC-胺基酸（His或Lys)的用量是 L4mmol/g樹脂，910mg 0-苯並三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸（TBTU)，加入 IOmL DMF和0.45g 1-羥基苯並三唑（HOBt)混和均勻後，加入0.52mL DIEA配成反應液，室 溫下氮氣吹沸反應2h，反應完畢後，用異丙醇洗滌樹脂三次，然後用DMF洗滌樹脂三次，檢 測氨基。
[0035] 4)重複步驟2)?3):按多肽的順序自C端向N端延伸多肽。重複脫保護、洗滌、 縮合的過程依次將R 4、R3、R2、R1連接完畢，完成多肽的連接。
[0036] 其中，R1為谷胺醯胺（Gln)或穀氨酸（Glu)或門冬醯胺（Asn)或門冬氨酸(Asp)， R2為蘇氨酸（Thr)或纈氨酸（Val )，R3為纈氨酸（Val)或亮氨酸（Leu)或無，R4纈氨酸（Val) 或亮氨酸（Leu)或無，R 5為組氨酸（His)或賴氨酸（Lys)。也可以理解為R1為酸性胺基酸及 其衍生物，R 2為含羥基胺基酸和亮氨酸（Leu)，R3、R4為纈氨酸（Val)或亮氨酸（Leu)或無， R5為鹼性胺基酸。
[0037] 5)多肽切割：用氮氣將多肽-樹脂複合物吹乾，按TFA/phenol/H20/thioanisole/ EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割試劑，將多肽-樹脂複合物置於圓底燒瓶 中，加入切割液磁力攪拌2小時，用200目砂芯過濾器除去樹脂，濾液直接抽入冷凍乙醚中， 3000r/min離心使粗肽沉澱，凍幹至恆重即得粗肽，乾燥稱重。
[0038] 6)粗肽用HPLC純化至95%以上，質譜鑑定。
[0039] 實施例2 IgG親和特性測定
[0040] 1)配製 10mmol/L Hepes 緩衝液，ρΗ7· 4, NaCl 含量 150mmol/L。
[0041] 2)以1)中配製液體為流動相，運行Biac〇reT200分析儀。
[0042] 3 )插入檢測晶片CM5，設定流速30 μ L/min。
[0043] 4)依次注入EDC和NHS各100 μ L，活化晶片。
[0044] 5)將IgG溶解於醋酸鈉緩衝液，ρΗ4· 5, IgGlOO μ g/mL。
[0045] 6)注入5)中IgG溶液100 μ L，固定IgG於晶片表面。
[0046] 7)分別將小分子抗體未和肽1 (胺基酸序列如SEQ ID No. 11所不)，小分子抗體 親和肽2 (胺基酸序列如SEQ ID No. 34所示）和天然配體（ProG與ProA),溶解於1)中配 制液體，含量100 U g/mL。
[0047] 8)依次注入不同濃度的多肽和天然配體(濃度由高到低依次為500 μ m，250 μ m， 125 μ m，62. 5 μ m和31. 25 μ m)，記錄其與IgG的吸附曲線。求得其相關參數，具體結果見圖 1、圖2及表1 (小分子抗體親和肽2的免疫球蛋白IgG的SPR動力學測定曲線圖的繪製同 小分子抗體親和肽1，本實施例不再累述給出）。
[0048] 表1為本發明中小分子抗體親和肽、Protein A/G與免疫球蛋白IgG結合常數比
[0049] 較表
[0050]

【權利要求】
1. 一種小分子抗體親和肽，其特徵在於，所述親和肽的胺基酸序列如SEQ ID No. 1-112 中的任一項所示。
2. 根據權利要求1所述的小分子抗體親和肽，其特徵在於，所述親和肽與人免疫球蛋 白IgG的Fc片段結合，不與人血清白蛋白HAS結合。
3. 權利要求1所述小分子抗體親和肽的應用。
4. 根據權利要求3所述的小分子抗體親和肽的應用，其特徵在於，所述的應用為在分 離、純化或清除人免疫球蛋白IgG中的應用。
【文檔編號】A61M1/18GK104211769SQ201310300336
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年5月30日
【發明者】徐霞, 韋宇平 申請人:中國科學院過程工程研究所