一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法
2023-05-01 18:30:01 1
專利名稱：一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法
一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法本發明提供一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，屬於構建免疫傳感器技術領域。
背景技術：
免疫傳感器的關鍵是敏感界面的構建，因為其直接影響生物分子的固定化、傳感器的穩定性、靈敏度和選擇性等主要性能。生物分子的固定化可以分為生物分子的固定化材料和生物分子的固定化技術，固定化材料和固定化技術既要保持生物活性單元的固有特性和生物活性，又要避免生物自由活性單元應用上的缺陷，因此它們是生物傳感器製備過程中的關鍵性因素。生物分子的固定化材料主要包括有機導電聚合物、溶膠一凝膠、生物材料及表面活性劑、納米材料等，但是單獨使用目中材料往往不能滿足所構建的免疫傳感器的高穩定性、靈敏度和選擇性等主要性能。因此，製備穩定的、與生物分子高結合度的和可保持生物分子活性的三維納米複合膜和其他材料組合構建的免疫傳感器敏感界面，以製備高穩定性、高靈敏度和選擇性好的免疫傳感器成為免疫傳感器技術發展的主要方向。目前關於免疫傳感器敏感界面的製備方法有多種，進而固定化方法多種多樣，常用的免疫蛋白分子的固載方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵合法、定向固定法和層層自組裝法。但是這些方法中都存在一定的缺陷，如基於高分子膜、無機多孔材料、聚電解質等作為固載的吸附法，存在容易脫落，對溶液PH值、溫度、離子強度和換能器表面狀況較為敏感等缺點；直接將免疫分子與高分子溶劑，如聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酷、醋酸纖維、Nafion等合成的高聚物及海藻酸、明膠、殼聚糖等天然的溶膠狀高聚物，混合得到包覆了免疫分子複合膜的包埋法實驗條件溫和，操作較簡單，但是對被測免疫蛋白與包埋蛋白的免疫結合增加了空間位阻，同時也不利於底物與產物的擴散；通過自發的化學吸附作用或鍵合作用的層層自組裝方法在傳感器界面形成二維有序單層膜操作簡便，具有良好的穩定性、有序性，但對自組裝分子結構有限制，且容易受到雜質吸附、分子聚合、溶劑選擇、基片表面物理性質的影響。上述方法的缺陷都會對製備的免疫傳感器的靈敏度、穩定性、選擇性和使用壽命造成影響。發明的目的在於提供一種能克服上述缺陷，可構建出高靈敏度、高選擇性、低成本和長壽命的免疫傳感器的敏感界面的製備方法。其技術方案為一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於免疫傳感器的敏感界面組成為納米金晶體(DpAu)、由功能化多壁碳、普魯士藍、殼聚糖製作的三維納米複合膜、蛋白A和BSA。所述的一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於納米金晶體(DpAu)其濃度為1%，蛋白A濃度為2mg/mL，BSA的濃度為I %。 所述的一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於三維納米複合膜的組成功能化多壁碳(MWNTs) O. 769g/mL、醯基化殼聚糖(CTS) I mg/mL、普魯士藍溶液。其製備原理為本發明製備的免疫傳感器敏感界面可以兼顧保持免疫傳感器表面固定的單克隆抗體蛋白的生物物質活性與固載後的穩定性和耐用性。本發明採用的納米金(DpAu)晶體具有擴大電極比表面積和增大三維複合膜固定量的功能同時能提供和自然相似的微環境並保持固定分子的生物活性使得修飾電極表面能吸附大量抗體並很好地保持其生物活性。功能化多壁碳納米管(MWNTs)具有極高的化學穩定性、良好的傳遞電子性能以及催化活性的表面，被用於免疫傳感器敏感界面的製作。殼聚糖(CTS)屬多糖類，它具有優異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜後具有很好的吸附性、穩定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結構使它被廣泛用於生物分子的固定和修飾電極的製備。普魯士藍(PB)具有良好的氧化還原活性、高度的化學穩定性和易於製備等優點，是製備免疫傳感的理想電極材料，本發明中把PB引入溶膠-凝膠膜(殼聚糖)來提高PB的穩定性。作者將功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍同時複合製成三維納米複合膜，不但增大了傳感器的電流響應以增大檢測精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為蛋白A生物分子提供一個合適的親水性環境，蛋白A分子可以固定地結合抗體的Fe端，從而可以將抗體 定向地固定在電極上使與農藥特異性結合端暴露在表面上，最後BSA對非特異性位點的封閉進一步增大檢測精度，以研發性能優異的電化學生物傳感器。為達到以上目的，採取以下技術方案實現一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於⑴多壁碳納米管的功能化稱取IOmg的多壁碳納米管(MWNTs)，放入IOOmL的燒杯中，量取40mL濃HNO3和H2SO4混合液(V: V=I: 3)加入所述燒杯中混合後，超聲4 h、120°C離心回流3 h，水洗至中性，紅外爐乾燥，室溫下保存待用；⑵普魯士藍溶液的製備普魯士藍溶液指包含I. O mmol/L FeCl3, 1.0 mmol/L K 3[Fe (CN) 6],
0.I mol/L KCl和0· 025 mol/L的HCl的混合水溶液；⑶殼聚糖溶液的製備稱取O. 5g殼聚糖(CTS)，溶於I. 0%的醋酸溶液，混合液連續攪拌30min，使殼聚糖完全溶解。為達到以上目的，採取以下技術方案實現一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於⑴快速稱取O. Ig氯金酸固體，溶於9. 9g去離子水中，製得1%的氯金酸溶液備用；⑵稱取2 mg蛋白A溶於ImL去離子水中，配製成2mg/mL的蛋白A溶液；⑶稱取Ig BSA，加入99g去離子水，攪拌至完全溶解製成1%的BSA溶液。將全部溶液放入冰箱裡4°C保存備用。本發明採用納米金晶體較高的比表面積、穩定性和導電性可以增大電極表面電子的轉移和生物相容性，進而增大免疫傳感器的響應電流；由功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍複合製成三維納米複合膜，與傳統方法相比不但增大了傳感器的電流響應以增大檢測精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為生物分子提供一個合適的親水性環境。蛋白A分子可以固定地結合克百威單克隆抗體的Fe端，從而可以將抗體定向地固定在電極上使與農藥特異性結合端暴露在表面上，進一步增大檢測精度。所述三維複合膜的製備工藝如下(1) MWNT-CTS修飾劑的製備稱取Img預處理過的功能性MWNTs於O. 3mL無水乙醇中超聲分散，向其中加入ImLl. 0%殼聚糖溶液，再超聲分散8h，最後得到穩定的黑色分散液(MWNT-CTS修飾劑)，其中MWNTs濃度為O. 769g/mL ；⑵三維納米複合膜的製備將配製的MWCNTs-CTS與普魯士藍按體積比I :1混合，超聲混合Ih,所得溶液為功能化多壁碳-殼聚糖溶液-普魯士藍(MWCNTs-CTS-PB)，將其放入冰箱裡4 °C保存備用。
具體實施方式
實施例快速稱取O. Ig氯金酸固體，溶於9. 9g去離子水中，製得1%的氯金酸溶液，固定在電極上，然後用PH=7. 4的PBS緩衝液衝洗表面，氮氣吹乾；取10μ L上述由功能化多壁碳、殼聚糖溶液、普魯士藍溶液製備好的三維納米複合膜滴塗在固定過納米金晶體的電極表面，常溫下靜置I. 5h，然後用PH=7. 4的PBS緩衝液衝洗表面，氮氣吹乾；上述製作好的電極晾乾後，取10μ L 2mg/mL的蛋白A溶液滴塗在電極上，常溫下2h，然後用PH=7. 4的PBS緩衝液衝洗表面。將製備好的電極浸入農藥抗體中在4°C下浸泡8h，取出用PH=7. 4的PBS緩衝液衝洗掉多餘的液體，氮氣吹乾；將上述製備好的電極最後浸入1%的BSA溶液中37°C下靜置2h，以封閉電極上非特異性結合位點，取出置於室溫下晾乾，免疫傳感器的敏感界面製作完成，保存在4°C條件下備用。使用此敏感界面製作的免疫傳感器靈敏度、選擇性較高，其穩定性性和再生性良好。
此構建方法操作工藝簡單，成本較低，能提高免疫傳感器的靈敏度、選擇性等，符合我國免疫傳感器製備方法發展和國際化的要求。
權利要求
1.一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於免疫傳感器的敏感界面組成為納米金晶體(DpAu)、由功能化多壁碳、普魯士藍、殼聚糖製作的三維納米複合膜、蛋白A和BSA。
2.如權利要求I所述的一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於納米金晶體(DpAu)其濃度為1%，蛋白A濃度為2mg/mL，BSA的濃度為I %。
3.如權利要求I所述的一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於三維納米複合膜的組成功能化多壁碳(MWNTs) O. 769g/mL、醯基化殼聚糖(CTS) Img/mL、普魯士藍溶液。
全文摘要
本發明涉及一種檢測農藥殘留的免疫傳感器敏感界面的構建方法，其特徵在於敏感界面的組成為納米金晶體(DpAu)1%、三維納米複合膜(功能化多壁碳-殼聚糖溶液-普魯士藍MWCNTs-CTS-PB)、蛋白A2mg/mL、農藥抗體5μg/mL、BSA１%。依次將上述材料固定在免疫傳感器表面後，因為納米金晶體、功能化多壁碳、普魯士藍溶液能增大電子的轉移，進而增大免疫傳感器的相應，提高傳感器的靈敏度；功能化多壁碳和殼聚糖有良好的成膜性並具有豐富的基團，可以增大與傳感器表面和生物的結合度進而提高傳感器的靈敏度和穩定性；蛋白A的定向固定農藥抗體分子和BSA的封閉作用可以增大傳感器的特異性和穩定性，從而可以製備高穩定性、高靈敏度、選擇性好、長壽命的免疫傳感器。
文檔編號G01N33/577GK102621321SQ201210088809
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者劉君峰, 孫霞, 李青青, 杜淑媛, 王相友 申請人:山東理工大學