應用as-pcr檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法
2023-05-22 22:54:56 1
專利名稱：：應用as-pcr檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法
技術領域：
：本發明屬於動物疾病檢測
技術領域：
，具體屬於一種牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)檢測
技術領域：
，涉及應用AS-PCR檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。
背景技術：
：牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficieneyofuridinemonophophatesynthase,DUMPS)是一種常染色體隱性遺傳疾病，會造成母牛流產、死胎、整個牛群的繁殖力下降、產奶量下降等。由於人工授精技術的廣泛應用，使DUMPS在全世界流傳，直接影響了奶牛業的經濟效益。DUMPS的病因主要是由於編碼尿苷酸合酶的基因，在密碼子405處存在C/T的突變，從而造成原編碼精氨酸的密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA，因而轉錄產物最終只能翻譯成一段C-末端缺失76個胺基酸催化亞基的短蛋白，該殘缺蛋白不能催化乳清酸轉化為鳥苷酸，故不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸，導致胚胎在妊娠4060d死亡，死亡率高達100%[1][2]。美國等國家根據DUMPS的致病機制，建立了DUMPS的分子檢測方法和育種方案，要求對荷斯坦種公牛必須進行隱性遺傳疾病的檢測。據報導美國大概有2%的荷斯坦奶牛攜帶DUMPS的致病基因[3]。我國荷斯坦種公牛主要從美國、加拿大、德國、以及澳大利亞和紐西蘭等國進口，包括進口的活牛和胚胎。以前我國對該疾病沒有足夠的認識和重視，引入了大量潛在的DUMPS攜帶者，同時引入的大量沒有系譜資料的荷斯坦母牛，同樣是潛在的攜帶者。這些引進的種公牛在我國的大量使用，使得我國的DUMPS攜帶者數目增加，由於沒有自主產權的檢測技術，因而無法公布母牛的檢測結果，很難根據系譜推斷DUMPS的傳播途徑。我國針對遺傳性疾病展開的工作剛剛起步，在奶牛實際育種中開展的工作還不多，並且僅局限在實驗室中[4]，我們應該在生產實踐中及時檢測出冷凍精液及母牛中DUMPS的攜帶者並予以淘汰，以減少經濟效益的損失。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術存在的缺陷，尋找一種簡便有效的用於牛尿苷酸合酶缺乏症的檢測方法。實現本發明的技術路線如下所示本發明建立了一種快速、準確檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的AS-PCR方法，其具體步驟如下(1)引物設計根據GenBank提供的牛UMPS序列(登錄號NC_007299)，根據AS-PCR的特性，利用生物學引物設計軟體Premier5，設計了AS-PCR擴增引物。該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。該引物序列詳見具體實施方式中的實施例1。(2)AS-PCR:提取牛血樣基因組DNA，根據PCR擴增可直接判斷結果。若個體擴增出的目的片段為261bp(見SEQIDN0:1)，則為致病純合子；若擴增出的目的片段為261bp和90bp，則為雜合子，即DUMPS疾病攜帶者；若擴增的目的片段為90bp(見SEQIDNO:2)，則為健康個體(見序列表SEQIDNO:1和2)。3與現有技術相比，本發明的積極效果是提供了一種快速準確篩選分型DUMPS的方法和特異性引物，直接應用於牛開展DUMPS的致病基因篩選，以利於DUMPS患病個體的早期淘汰。序列表SEQIDNO:l和SEQIDNO:2是本發明擴增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，SEQIDNO:3-6是擴增牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS的特異引物。圖1:是本發明的技術流程圖。圖2:用血樣DNA對UMPS基因進行AS-PCR擴增，瓊脂糖檢測電泳圖。瓊脂糖凝膠濃度為2%。圖中編號說明如下l，2，3，4泳道為健康牛群基因型，擴增的產物長度為90bp;5為隱性攜帶者牛群基因型，擴增的產物長度為261bp和90bp;M為Markerl(600bp)。圖3:是本發明擴增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，圖中下劃線的序列是擴增的261bp片段和90bp片段的共用區。具體實施例方式下面結合實施實例並對照附圖對本發明作進一步詳細說明。實施例1:牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鑑定1、奶牛血樣的採集及處理取奶牛血樣約10mL，加入0.5mol/L的EDTA500yL(使終濃度為25mmol/L)抗凝，4t:離心(8000rpm)10min，棄上層清，分離白細胞，加入蒸餾水，搖勻，使紅細胞破裂，離心10min，棄上層清液。重複兩次後，在沉澱中加入1XSETlmL和10%十二烷基硫酸鈉(SDS，終濃度為0.5%)，再緩慢加入蛋白酶K(終濃度為50100iig/mL)，置於55。C水浴鍋消化810h，4。C冰箱中保存備用。2、從奶牛血樣中提取NDA(1)取消化後的試樣，加入等體積的平衡酚(pH8.0)，緩慢顛倒離心管10min，4°C離心(8000rpm)10min。(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一離心管中，再次加入平衡酚，重複上述操作。(3)吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25:24:1)，緩慢顛倒離心管10min，4。C離心(8000rpm)10min。(4)吸取上清液後加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24:1)，緩慢顛倒離心管10min，4。C8000rpm離心10min。(5)吸取上清液，加入1/10體積3mol/LNaAC及2倍體積的無水乙醇，迅速轉動離心管，可見白色的絮狀物，即DNA，於-20"放置30min。(6)取出冷凍後的樣品，於10000rpm轉速離心58min，去掉上層乙醇，加入70X的乙醇lmL洗滌沉澱，離心(80000rpm)58min。(7)加入70%的乙醇重複洗滌一次，離心(80000rpm)58min。(8)棄去乙醇，在室溫下揮發殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(9)將DNA樣稀釋成一定的濃度，存放於-2(TC冰箱保存備用。3、引物設計根據牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS序列(登錄號NC_007299)，利用生物學引物設計軟體Premier5，設計AS-PCR擴增引物。該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下突變型(產物長度為261bp):反向引物3'端倒數第三位引入錯配；IF:5'ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3'(見序列表SEQIDNO:3)，IR:5'TCTGGTTTCATGCTTACGCA3'(見序列表SEQIDNO:4);野生型(產物長度為90bp):正向引物3'倒數第三位引入錯配；2F:5'ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3'(見序列表SEQIDNO:5)，2R:5'AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3'(見序列表SEQIDNO:6)。4、AS-PCR擴增PCR反應總體積為20iiL(見表1)。擴增程序是94。C預熱lOmin—94。C變性45s—63.3°C45s—72延伸45s(從第二步94"變性到第四步72延伸進行35個循環)，72。C延伸10min—15°ClOmin。表1PCR反應體系tableseeoriginaldocumentpage51F/1R與2F/2R擴增出的PCR產物，分別取3iiL混合，2X瓊脂糖凝膠電泳(IOOV，電泳20min)，EB(溴化乙錠)染色後，在凝膠成像系統觀察條帶。5、DUMPS基因型結果判定牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鑑定結果如圖2所示，在基因UMPS的AS-PCR產物電泳圖譜中，若個體擴增出的目的片段為261bp，則為致病純合子；若擴增出的目的片段為261bp和90bp，則為雜合子，即DUMPS疾病攜帶者；若擴增的目的片段為90bp，則為健康個體。參考文獻[l]Schober，S.，Simon，D.，Schwenger，B.SequencesofthecDNAencodingbovineuridinemonophosphatesynthase.Gene，1992，124:307—308.[2]Schwenger，B.，Schober，S.，Simon，D.DUMPScattlecarryapointmutationintheuridinemonophosphatesynthasegene.Genomics,1993，16:241—244[3]Shanks,R.D.，Dombrowski，D.B.，Harpestad，G.W.，Robinson,J丄InheritanceofUMPsynthaseindairycattle.J.Hered，1984，75:337-340.[4]李豔華等.中國荷斯坦牛脊椎畸形症候群的研究現狀與展望.中國奶牛2008，6:27-29。序列表〈110〉華中農業大學〈120〉應用AS-PCR檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法〈130〉〈141>2009-12-01〈160>6〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>261〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈400>13tggg卿3gggg￡itegg￡igttettttegggtcttegtgg3gc3ggtetgtagattcate60tcteagattecctgtttegatetgagttcaatgtgacatg3g朋朋tecatccataagac120agcagagtttcttacgtttggtgtggttaactgctgtcttgtcatctgttgattecattc180cattcaggtgca朋tggctg朋g朋cattctg朋tttgtgattggttttetttctggctc240ccgagteagc3tga朋cc3ga261〈210>2〈211>90〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(90)〈223〉〈400>2attggttttetttctggctcccgagteagcatgaaaccagaatttcttcacttgactcca60ggagttcagttegaagcaggaggteagcct90〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221>primer_bind(1).(20)〈223〉〈400>3Eltggg卿Elgggg￡lt￡lgg￡lg〈210〉4〈211>20〈212>DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)〈221>primer—bind〈222〉(1)..(20)〈400>4tctggtttcatgcttacgca5〈211>22DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)〈220〉primer—bind〈222〉(1)(22)〈223〉〈400>5attggttttatttctggctacc〈210>6〈211>20〈212〉DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉C0112]〈221〉primer一bind〈222〉(1)(20)〈223〉〈400〉6aggcttacctcctgcttcta說明書5/5頁20202220權利要求應用AS-PCR檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特異性引物，其特徵在於，所述引物序列如下所示基因UMPS的擴增引物突變型反向引物3』端倒數第三位引入錯配，擴增產物長度為261bp，1F5′ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3′，1R5′TCTGGTTTCATGCTTACGCA3′；野生型正向引物3』倒數第三位引入錯配產物，擴增產物長度為90bp；2F5′ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3′，2R5′AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3′。2.權利要求1所述的引物在AS-PCR檢測牛尿苷酸合酶缺乏症中的應用。全文摘要本發明屬於動物疾病檢測
技術領域：
，具體涉及應用AS-PCR檢測牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。製備了一種用於牛尿苷酸合酶缺乏症檢測方法的特異性PCR引物，它包括UMPS基因擴增引物突變型反向引物3』端倒數第三位引入錯配，擴增產物長度為261bp；1F5』ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3』，1R5』TCTGGTTTCATGCTTACGCA3』；野生型正向引物3』倒數第三位引入錯配產物，長度90bp；2F5』ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3』，2R5』AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3』。本發明製備的牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特異性引物，可直接應用於開展牛尿苷酸合酶缺乏症的致病基因的篩選，以利於對患病個體進行早期淘汰。文檔編號C12Q1/68GK101705306SQ20091027295公開日2010年5月12日申請日期2009年12月1日優先權日2009年12月1日發明者何年華,劉耘,吳世欽,周傲,宴幫富,張淑君,楊利國,梁愛心,滑國華,熊家軍,王成,黃長梅申請人:華中農業大學