體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法
2023-05-22 09:35:06
專利名稱：體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及神經幹細胞的製備方法，尤其是一種體外誘導間充質幹細胞向神經幹細胞分化的方法。
背景技術：
神經系統疾病常伴有不同程度的神經功能損傷，是威脅人類生命和嚴重影響人們 生活質量的主要疾病之一。神經幹細胞是具有自我更新能力，並能轉化為各種神經組織細 胞(包括神經元、神經膠質細胞、少突膠質細胞等)的一類細胞。研究發現，在遭受神經損 傷或特定細胞因子存在的條件下，神經幹細胞能夠激活並分化為神經元或神經膠質細胞， 參與損傷部位的修復。因此，我們可以通過神經幹細胞移植來促進損傷的神經再生。目 前，神經幹細胞主要從胚胎幹細胞誘導獲得或直接從成年哺乳動物的中樞神經系統(主要 指分布於室管膜下、紋狀體、海馬齒狀回、側腦室下帶等部位)中分離培養獲得。但是倫理 學、安全性問題以及細胞來源和數量的有限，在一定程度上都限制了神經幹細胞的移植應 用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經幹細胞的途徑來克服這些限制。間充質幹細胞 是一群存在於多種組織中的多能幹細胞，具有較強的自我更新能力和多向分化潛能，在體 外不同的誘導條件下可分化為骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、神經細胞、平滑肌細 胞等多種細胞。目前，國內大都採用鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮細胞生長因子(印idermal growth factor, EGF)直接誘導臍帶間充 質幹細胞向神經幹細胞分化。將細胞接種於低粘附培養瓶中，在含有2%B27，20ng/mL EGF 和20ng/mL bFGF的neurobasal medium中培養10 20天後傳代。誘導後的細胞大約有 80%左右表達神經幹細胞表面標誌巢蛋白(Nestin)並具有向神經元和神經膠質細胞分化 的能力，其中約5%細胞表達神經元特異性表面標誌MAP2 ；而約40%的細胞表達神經膠質 細胞特異性表面標誌GFAP。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種臍帶間充質幹細胞取材方便、易於體外 擴增、免疫源性低且合乎倫理學要求的體外誘導間充質幹細胞向神經幹細胞分化的方法。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種體外誘導間充質幹細胞 分化為神經幹細胞的方法，在添加了 bFGF、成纖維細胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制 因子LIF的DMEM/DF-12培養體系中預誘導間充質幹細胞；在添加了 bFGF、FGF8和SHH的無 血清neurobasal medium培養體系中將預誘導的細胞定向分化為神經幹細胞。所述間充質幹細胞來源自人類。所述間充質幹細胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。所述間充質幹細胞來源自人類臍帶。所述DMEM/DF-12 培養體系添加的 bFGF 為 20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。
所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。所述的無血清neurobasal medium培養體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。一種體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，包括以下步驟1)預誘導(1)取4 6代臍帶間充質幹細胞，當細胞貼壁生長至80% -90%融合時，吸除培 養瓶內原有培養液，取5 IOmL 0. OlM磷酸緩衝液PBS輕輕加入T75培養瓶內洗滌，棄去洗 液；(2)加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液l.OmL，浸漫覆蓋瓶 底，倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL 0. OlM PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去 上清液後，加入IOmL DMEM/F-12重懸細胞，在T25培養瓶中接種2 X IO5個臍帶間充質幹細 胞；(4)培養體系為含體積比濃度為10%人AB血清，100u/mL青黴素，100μ g/mL鏈黴 素的 DMEM/DF12 完全培養液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH禾口 IOng/ mL LIF，總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳培養箱中培養6 8天，每3天換液一次；2)定向誘導臍帶間充質幹細胞向神經幹細胞分化(1)將預誘導後的細胞加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液 1. OmL,浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1. OmL胎牛血清中止 胰蛋白酶消化；(2)加入IOmL 0. OlM PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去 上清液後，加入IOmL neurobasal medium重懸細胞，重新接種在T25培養瓶中；(3)培養體系為含體積比濃度為2%的N2或B27、100u/mL青黴素、100μ g/mL鏈黴 素的無血清 neurobasal medium，添力口了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 禾口 500ng/mL SHH, 總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳飽和溼度培養箱中培養，每3天添加生長因子一次， 每7天換液一次，培養20天後獲得由人臍帶間充質幹細胞定向誘導分化的神經幹細胞。本發明的有益效果是誘導分化率高且易於向神經元分化，能夠減少膠質疤痕的 形成，更利於移植應用。與現有技術相比，本誘導方法可獲得大約90%的Nestin陽性細胞， 且誘導後的神經幹細胞同樣具有向神經元和神經膠質細胞分化的能力，分化後的MAP2和 GFAP陽性細胞表達率分別約為70%和15%。誘導使用的間充質幹細胞可以來源於胚胎、 骨髓、脂肪等組織，但最好是取自臍帶來源。與胚胎幹細胞或神經組織來源相比，臍帶間充 質幹細胞取材方便、易於體外擴增、免疫源性低且合乎倫理學要求。由於生理學特點基本一 致，所以無論是何種來源的人類間充質幹細胞，都適用本發明所提供的誘導方法。
圖1是本發明的人臍帶間充質幹細胞誘導分化成的神經幹細胞。圖2是本發明誘導後神經幹細胞的Nestin表達情況(A) Nestin染色；⑶細胞核 DAPI染色；(C)A和B的合併圖像。
圖3是本發明誘導後神經幹細胞的分化潛能情況(A)神經膠質細胞特異性標誌GFAP染色和細胞核DAPI染色；(B)神經元特異性標誌MAP2染色和細胞核DAPI染色。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的說明，但本發明並不限於下述實施 例。本發明體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，在添加了 breF、成纖維 細胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養體系中預誘導間充質 幹細胞；在添加了 bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養體系中將預誘導的 細胞定向分化為神經幹細胞。所述間充質幹細胞來源自人類。所述間充質幹細胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。所述間充質幹細胞來源自人類臍帶。所述DMEM/DF-12 培養體系添加的 bFGF 為 20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。所述的無血清neurobasal medium培養體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8 為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。所述bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。下面通過具體實施例，以間充質幹細胞來源自人類臍帶為例進行敘述1.預誘導(1)取4 6代臍帶間充質幹細胞，當細胞貼壁生長至80% -90%融合時，吸除培 養瓶內原有培養液，取IOmL 0. OlM磷酸緩衝液(phosphate bufferedsaline，PBS)輕輕加 入T75培養瓶內洗滌，棄去洗液；(2)加入(質量/體積比)0· 25 %胰蛋白酶-0. 01 %乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1. OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察 見細胞呈圓形漂起時，加入l.OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入IOmL 0. OlM PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去 上清液後，加入IOmL DMEM/F-12重懸細胞，在T25培養瓶中接種2 X IO5個臍帶間充質幹細 胞；(4)培養體系為含10 %人AB血清，100u/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素的DMEM/ DF12 完全培養液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH 和 lOng/mL LIF，總 體積為5mL/瓶。置37°C，5%二氧化碳培養箱中培養6 8天。每3天換液一次。2.定向誘導臍帶間充質幹細胞向神經幹細胞分化(1)將預誘導後的細胞加入0. 25 %胰蛋白酶-0. 01 %乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetates, EDTA)消化液1. OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察 見細胞呈圓形漂起時，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(2)加入IOmL 0. OlM PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去 上清液後，加入IOmL neurobasal medium重懸細胞，重新接種在T25培養瓶中；
(3)培養體系為含體積比濃度為2%的N2或B27，100u/mL青黴素，ΙΟΟμ g/mL鏈黴 素的無血清 neurobasal medium，添力口了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 禾口 500ng/mL SHH, 總體積為5mL/瓶。置37°C，5%二氧化碳飽和溼度培養箱中培養20天左右。每3天添加生 長因子一次，每7天換液一次。3.神經幹細胞的鑑定(1)形態學鑑定倒置顯微鏡下觀察臍帶間充質幹細胞在誘導過程中形態的變 化，發現神經幹細胞呈神經球樣生長(見圖1)。定向誘導3 4天後，可觀察到懸浮的小細 胞團。誘導約20天時，大約可形成300 400個大小不等的細胞團。(2)神經幹細胞特異性標誌檢測將載玻片固定於甩片機的轉頭上，滴加誘導後 的神經幹細胞懸液IOOul後，1200g迅速離心5分鐘。常規免疫螢光染色檢測神經幹細胞 特異性標誌巢蛋白(Nestin)。細胞破膜、封閉後，滴加一抗Nestin單克隆抗體，4°C孵育過 夜。然後滴加異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的大鼠抗小鼠 IgG抗，37°C孵育lh。細胞核用4 『6-二脒基-2-苯基吲哚(dihydrochloride，DAPI)染 色。最後封片，螢光顯微鏡下觀察，拍照。免疫螢光染色結果顯示陽性表達率為90%左右 (見圖2)。(3)神經幹細胞分化潛能的檢測將無菌蓋玻片放置在24孔板孔內，加入誘導 後的神經幹細胞懸液IOOul，含10 %人AB血清，100u/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素的 neurobasal media中培養7天。取出蓋玻片進行免疫螢光染色，檢測MAP2和GFAP的表達 情況。細胞破膜、封閉後，分別滴加一抗MAP2和GFAP單克隆抗體，4°C孵育過夜。然後滴加 FITC標記的大鼠抗小鼠IgG 二抗，37°C孵育lh。細胞核用DAPI染色。最後封片，螢光顯微 鏡下觀察，拍照。結果顯示誘導後的神經幹細胞能分化成神經元和神經膠質細胞(見圖3)。 其中，約70%細胞表達神經元特異性標誌MAP2，約15%細胞表達神經膠質細胞特異性標誌 GFAP0綜上所述，本發明的內容並不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可 以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發 明的範圍之內。
權利要求
一種體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在於，在添加了bFGF、成纖維細胞生長因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養體系中預誘導間充質幹細胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養體系中將預誘導的細胞定向分化為神經幹細胞。
2.根據權利要求1所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，所述間充質幹細胞來源自人類。
3.根據權利要求2所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，所述間充質幹細胞來源包括人類的胚胎、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶組織。
4.根據權利要求3所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，所述間充質幹細胞來源自人類臍帶。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法， 其特徵在於,所述DMEM/DF-12培養體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為50 150ng/ mL、SHH 為 250 750ng/mL 和 LIF 為 5 20ng/mL。
6.根據權利要求5所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL、SHH 為 500ng/mL 和 LIF 為 10ng/mL。
7.根據權利要求5所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵 在於，所述的無血清neurobasal medium培養體系添加的bFGF為20 100ng/mL、FGF8為 50 150ng/mL 和 SHH 為 250 750ng/mL。
8.根據權利要求7所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，所述 bFGF 為 50ng/mL、FGF8 為 100ng/mL 和 SHH 為 500ng/mL。
9.根據權利要求4所述的體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，其特徵在 於，包括以下步驟1)預誘導(1)取4 6代臍帶間充質幹細胞，當細胞貼壁生長至80%-90%融合時，吸除培養瓶 內原有培養液，取5 10mL 0. 01M磷酸緩衝液PBS輕輕加入T75培養瓶內洗滌，棄去洗液；(2)加入0.25%胰蛋白酶-0. 01%乙二胺四乙酸EDTA消化液1. OmL,浸漫覆蓋瓶底，倒 置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1. OmL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；(3)加入20mL0. 01M PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去上清 液後，加入10mL DMEM/F-12重懸細胞，在T25培養瓶中接種2X 105個臍帶間充質幹細胞；(4)培養體系為含體積比濃度為10%人AB血清，100u/mL青黴素，100y g/mL鏈黴素的 DMEM/DF12 完全培養液，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH 和 lOng/mL LIF,總體積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳培養箱中培養6 8天，每3天換液一次；2)定向誘導臍帶間充質幹細胞向神經幹細胞分化(1)將預誘導後的細胞加入0.25%胰蛋白酶-0.01%乙二胺四乙酸EDTA消化液 l.OmL，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察見細胞呈圓形漂起時，加入1. OmL胎牛血清中止 胰蛋白酶消化；(2)加入10mL0. 01M PBS反覆吹打衝洗，在室溫下900轉/分離心10分鐘；棄去上清 液後，加入10mL neurobasal medium重懸細胞，重新接種在T25培養瓶中；(3)培養體系為含體積比濃度為2%的N2或B27、100u/mL青黴素、100iig/mL鏈黴素的無血清 neurobasal medium，添加了 50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8 和 500ng/mL SHH，總體 積為5mL/瓶，置37°C，5%二氧化碳飽和溼度培養箱中培養，每3天添加生長因子一次，每7 天換液一次，培養20天後獲得由人臍帶間充質幹細胞定向誘導分化的神經幹細胞。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導間充質幹細胞分化為神經幹細胞的方法，在添加了bFGF、成纖維細胞生長因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培養體系中預誘導間充質幹細胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的無血清neurobasal medium培養體系中將預誘導的細胞定向分化為神經幹細胞。本發明誘導分化率高且易於向神經元分化，能夠減少膠質疤痕的形成，更利於移植應用。與胚胎幹細胞或神經組織來源相比，臍帶間充質幹細胞取材方便、易於體外擴增、免疫源性低且合乎倫理學要求。
文檔編號C12N5/0735GK101831401SQ201010153969
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者謝姜, 韓忠朝 申請人:天津昂賽細胞基因工程有限公司