草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方法

2023-05-20 08:49:31 1

草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明公開了一種「久香」草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方法，包括外植體消毒、莖尖組織脫毒培養、增殖培養、生根培養，和煉苗與移栽。本發明通過採用莖尖組培法繁殖「久香」草莓脫毒苗，可確保母體的全部優良性狀穩定遺傳，從而不受外界條件的影響，四季皆可進行；節約育苗用地，降低了生產成本；可在短時間內生產大量的優質試管苗，進行規模化生產，為市場提供量大質優的「久香」草莓種苗，滿足市場需求。應用本發明獲得的「久香」草莓脫毒苗長勢強、抗病、大果率增加，產量可提高30%～50%。
【專利說明】草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬植物組織培養領域，涉及一種"久香"草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方 法。

【背景技術】
[0002] 近年來，隨著草莓連作年限的增加及"豐香"、"紅顏"等易感病品種的推廣，草莓炭 疽病的發生在國內呈大幅上升趨勢。一般感病苗定植到田間後，到下年3月份大約80%的 植株會隨著生長而死亡。在上海等南方地區草莓果實收穫從當年12月至下年的5月份，長 達六個月，大量收穫期在2、3、4月初。這樣以來，草莓種植戶將會遭受巨大損失。因此，推 廣與"豐香"、"紅顏"等草莓果實品質媲美的抗病草莓新品種已成為迫在眉睫的問題。
[0003] "久香"草莓是上海市農業科學院2007年新近育成的第一個適合於設施栽培且綜 合性狀優良的草莓品種。"久香"草莓以久能早生為母本、豐香為父本雜交，歷經10年育成的 優質抗病草莓新品種。於2007年11月通過上海市農作物品種審定委員會審定。該品種長 勢強、株形緊湊，果實圓錐形、較大，第I、II級序果平均單果重21. 6g ;果形指數1. 37,果肉 紅色，髓心淺紅色，無空洞；果肉細，質地脆硬；汁液中等，甜酸適度，香味濃。"久香"草莓與 主栽品種"豐香"、"紅顏"相比，在白粉病和灰黴病的抗性突出，產量要高出主栽品種10%，貨 架期較主栽品種延長7天。因此，"久香"草莓適宜於長江流域和冬暖草莓產區廣泛種植。
[0004] 目前，生產上"久香"草莓主要是通過無性繁殖為種植者提供種苗，而長期使用無 性繁殖種苗在快速繁殖過程中常常會感染多種病毒，引起品種種性退化，抗病力減弱，從而 造成單位面積產量和果實品質下降等問題。一般會減產30?80%，給草莓種植者帶來經濟 損失。且隨著無性繁殖代數的增加，病毒感染的機率也大大提高，草莓感染病毒後的直接表 現為葉片皺縮、畸形果率增加、品質下降、植株生長發育遲緩等不良現象。
[0005] 不同的草莓品種由於遺傳背景的差異，在莖尖生長發育過程中內源激素水平明顯 不同，因而，在採用莖尖脫毒組培快速繁殖法獲得草莓種苗的過程中，對外源激素種類和濃 度的要求也因品種不同而表現出較大差異。在相同的培養條件下，草莓基因型(不同品種） 對莖尖誘導分化、增殖、生根等起著決定性作用。以誘導分化為例，採用相同的分化培養 基，分化誘導的百分率以"久香"最高（100%)，而其他品種分別為"紅顏"50%、"章姬"42%、 "甜查理" 33%、"豐香"最低僅23%。
[0006] 由於草莓在生產應用中主要是通過走莖育苗進行無性繁殖的，嚴重的影響草莓新 品種自身的優良特性，且走莖繁殖育苗周期長，制約了"久香"草莓的示範應用和品種推廣 工作。"久香"草莓的種苗快速繁殖技術體系的建立將會直接助推草莓新品種在生產中的推 廣。加速"久香"的示範推廣，對不斷優化和更新上海市草莓品種結構，穩定和提升農民經 濟效益將具有重要的顯示意義。


【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題在於提供一種"久香"草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖 方法，以便進行規模化生產和繁殖滿足市場需要，及以"久香"草莓組培為基礎的其他學科 的研究工作的需要。
[0008] 為了達到上述目的，本發明採用以下技術方案來實現。
[0009] 所述的"久香"草莓莖尖組培脫毒快速繁殖方法，包括外植體消毒、莖尖組培脫毒 培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽，具體依照如下步驟進行：
[0010] (1)外植體消毒：選取健壯無病的"久香"草莓母株匍匐莖上的頂芽大小約 1. 5±0. 5釐米，蘸少量洗滌液用手輕輕搓洗2?3次，流水衝洗90?120分鐘後，再在超淨 工作檯上用75%的酒精漂洗，無菌水清洗後，用含0. 5%次氯酸鈉滅菌，無菌水衝洗，無菌濾 紙吸乾表面水。
[0011] (2)莖尖組織脫毒培養：在無菌條件和解剖顯微鏡下逐層剝去頂芽外層葉片，用 解剖刀切下帶一個葉原基(長約〇. 2?0. 3毫米)的生長點，立即接種於分化培養基上，暗培 養後進行光培養，其中培養溫度為24±1°C，光照強度為40001x，光照時間為12小時。所述 的分化培養基由MS基本培養基、白砂糖30克/升、瓊脂8克/升，和植物生長激素0. 01? 〇. 4毫克/升組成，pH = 5. 7?5. 8。所述的植物生長激素為吲哚丁酸（IBA) 0. 01毫克/ 升，和6-卞基腺嘌呤（6-BA)0. 1?0. 4毫克/升；優選6-BA為0. 15毫克/升，和IBA為 〇. 01暈克/升。
[0012] (3)增殖培養：4周後莖尖長出芽叢，待芽苗長至2±0. 5釐米大小時將芽逐個切下 分成單株，每瓶放5?6個芽，再轉入增殖培養基中繼續增殖，培養溫度24土 1°C，每28天 可增殖1代，增殖6?7代後就可以獲得大量無毒種苗。所述的增殖培養基由MS基本培 養基、白砂糖30克/升、瓊脂8克/升，和植物生長激素0. 01?0. 5毫克/升組成，pH = 5. 7?5. 8。所述的植物生長激素為吲哚丁酸（IBA) 0. 01?0. 03毫克/升，和6-卞基腺 嘌呤（6-BA) 0. 1?0. 3毫克/升，優選6-BA為0. 2毫克/升，和ΙΒΑ0. 02毫克/升。
[0013] (4)生根培養：將經過繼代增殖培養的草莓芽苗由芽叢切下，轉到生根培養基中 促使其生根，在溫度24土 1°C條件下進行光照生根培養14?21天。所述的生根培養基由 1/2MS基本培養基、白砂糖10克/升、瓊脂8克/升，和植物生長激素0.01?0.02毫克/ 升組成，pH = 5. 7?5. 8。所述的植物生長激素為吲哚丁酸0. 02毫克/升。
[0014] (5)煉苗移栽：將生根後的草莓脫毒苗置於待生長條件下煉苗7天，移栽時將組培 瓶蓋打一條縫，進行自然條件馴化2天，接著完全揭開蓋並添加10?15毫升的蒸餾水鍛鍊 1天。然後用鑷子將組培苗從瓶中取出，用水衝掉培養基，移栽到已經滅菌的栽培基質(椰 糠：蛭石=5:1，V/V)中，用黑色遮光塑料進行遮陰馴化3?5天後，將草莓苗移到玻璃溫室 保持相對溼度75%進行煉苗。
[0015] 本發明採用莖尖組培脫毒快速繁殖"久香"草莓種苗的方法，不僅可以擺脫外界條 件的影響，四季均可進行"久香"草莓的生產，節約了育苗佔地，降低了生產成本。而且採用 小於0. 5毫米的草莓莖尖培養獲得的無病毒植株保存了母體的全部優良性狀，遺傳性狀穩 定。
[0016] 本發明方法保留了"久香"草莓的植株活性，可在短期內形成大量優良試管苗，進 行規模化、工廠化生產，促進"久香"草莓新品種栽培面積快速增大，經濟效益顯著提升。應 用本發明方法獲得的"久香"草莓脫毒苗長勢強、抗病、大果率增加，產量可提高30%?50%。
[0017] 本發明具有簡單、快速、高效，易操作等優點，在"久香"草莓新品種種苗快速繁殖 推廣上具有很大的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為取材用的"久香"草莓植株的匍匐莖圖。
[0019] 圖2為經剝離後的"久香"草莓莖尖在最佳莖尖誘導培養基中的培養圖。
[0020] 圖3為在最佳生長培養基中的增殖培養圖。
[0021] 圖4為組培苗在步驟（4)中處理後的生根情況圖。
[0022] 圖5為組培得到完整的植株圖。
[0023] 圖6為經煉苗馴化的移栽組培苗圖。

【具體實施方式】
[0024] 以下結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實例。最後 應當說明的是，以下實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例 對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行 修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利 要求範圍中。
[0025] 實施例1外植體消毒和莖尖生長點剝離
[0026] 1、參看圖1，選取健壯無病的"久香"草莓母株匍匐莖上頂芽大小約1. 5釐米，蘸少 量洗滌液用手輕輕搓洗2?3次，流水衝洗90?120分鐘後，再在超淨工作檯上用75%的 酒精漂洗10秒，無菌水清洗3遍後，用含0. 5%次氯酸鈉滅菌7分鐘，無菌水衝洗6?7遍， 最後用無菌濾紙吸乾表面水分。
[0027] 2、在無菌條件和解剖顯微鏡下逐層剝去頂芽外層的葉片，用解剖刀切下帶一 個葉原基(長約〇. 2?0. 3毫米）的生長點（參看圖2)，立即接種於分化培養基(配方： MS+6-BA0. 15毫克/升+ΙΒΑ0. 01毫克/升+白砂糖30g/L+瓊脂8克/升，pH = 5. 7?5. 8) 上，遮光培養3天後進行光培養。培養溫度24±1°C，光照強度40001x，光照時間12小時條 件下培養4周。
[0028] 實施例2叢生芽的增殖培養和組培苗的生根、馴化與移栽
[0029] 1、四周後莖尖長出叢生芽，待芽苗長至2釐米大小時將芽逐個切下分成單株，每 瓶放5?6個芽，再轉入增殖培養基(配方：MS+6-BA0. 2毫克/升+ΙΒΑ0. 02毫克/升+白 砂糖30克/升+瓊脂8克/升，pH = 5. 7?5. 8)中繼續增殖，培養溫度24± 1°C，12小時 /白天光照培養。增殖係數達到3,統計結果見下表1、表2,每28d增殖1代，增殖6?7代 後獲得大量無毒種苗，增殖結果參看圖3。
[0030] 2、將經繼代增殖培養的草莓芽苗由芽叢切下，轉接到生根培養基(配方：1/2MS基 本培養基+白砂糖10克/升+瓊脂8克/升+吲哚丁酸0.02毫克/升，pH = 5. 7?5. 8) 中溫度24± 1°C條件下進行光照培養，促使其生根，生根培養14?21天。生根率達100. 0%， 每株平均生根數達10個，生根情況參看圖4,組織培養的繁殖係數約為3 (統計結果見下表 1、表2)，圖5為組培得到完整的植株圖。
[0031] 3、將生根後的草莓脫毒苗置於待生長條件下煉苗7天，移栽時將組培瓶蓋打一條 縫，進行自然條件馴化2天，接著完全揭開蓋並添加10?15毫升的蒸餾水鍛鍊1天。然後用 鑷子將組培苗從瓶中取出，用水衝掉培養基，移栽到滅過菌的栽培基質(椰糠：蛭石=5:1， V/V)中，用黑色遮光塑料進行遮陰馴化3天，3天後將草莓苗移到玻璃溫室保持相對溼度 75%進行煉苗，移栽後成活率可達85%以上(統計結果見下表1、表2)。圖6為經煉苗馴化的 移栽組培苗圖。
[0032] 表1莖尖形成芽叢的情況
[0033]

【權利要求】
1. 一種"久香"草莓莖尖組培脫毒的快速繁殖方法，其特徵在於，包括外植體消毒、莖尖 組織脫毒培養、增殖培養、生根培養、煉苗與移栽；具體步驟如下： (1) 外植體消毒：選取健壯無病的"久香"草莓母株匍匐莖上的頂芽1. 5±0. 5釐米，蘸 少量洗滌液用手輕輕搓洗2?3次，流水衝洗90?120分鐘後，再在超淨工作檯上用75% 的酒精漂洗，無菌水清洗後，用〇. 5%次氯酸鈉滅菌，無菌水衝洗，最後用無菌濾紙吸乾表面 水分； (2) 莖尖組織脫毒培養：在無菌條件和解剖顯微鏡下逐層剝去頂芽外層葉片，用解剖 刀切下帶一個長約〇. 2?0. 3毫米葉原基的生長點，立即接種於分化培養基上，暗培養後進 行光培養； (3) 增殖培養：4周後莖尖長出芽叢，待芽苗長至2±0. 5釐米大小時將芽逐個切下分成 單株，每瓶放5?6個芽，再轉入增殖培養基中繼續增殖，每28天增殖1代，增殖6?7代 後獲得大量無毒種苗； (4) 生根培養：將經過繼代增殖培養的草莓芽苗由芽叢切下，轉到生根培養基中促使 其生根，在溫度24土 1°C條件下進行光照生根培養14?21天； (5) 煉苗移栽：將生根後的草莓脫毒苗置於待生長條件下煉苗7天，開瓶後瓶底加水煉 苗3?4天，用鑷子把組培苗從培養瓶中取出，清水洗淨根系附帶的培養基，移栽在栽培基 質中遮光處理3?5天後，將草莓苗移到玻璃溫室保持相對溼度75%進行煉苗。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（2)所述的分化培養基由MS基本培 養基、白砂糖30克/升、瓊脂8克/升，和植物生長激素0. 01?0. 4毫克/升組成，pH值 為 5. 7 ?5. 8。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的植物生長激素為吲哚丁酸0. 01毫 克/升，和6-卞基腺嘌呤0. 1?0.4毫克/升。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（2)的培養溫度為24土1°C，光照強 度40001x，光照時間12小時。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（3)所述的增殖培養基由MS基本培 養基、白砂糖30克/升、瓊脂8克/升，和植物生長激素0. 01?0. 5毫克/升組成，pH值 為 5. 7 ?5. 8。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的植物生長激素為吲哚丁酸0. 01? 0.03毫克/升，和6-卞基腺嘌呤0. 1?0.3毫克/升。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（4)所述的生根培養基由1/2MS基 本培養基、白砂糖10克/升、瓊脂8克/升和植物生長激素0. 01?0. 02毫克/升組成，pH 值為5. 7?5.8。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的植物生長激素為吲哚丁酸0. 02毫 克/升。
9. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（5)所述的栽培基質按椰糠：蛭石 =5:1，V/V 組成。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（5)所述的將生根後的草莓脫毒苗 置於待生長條件下煉苗7天，移栽時將組培瓶蓋打一條縫，自然條件馴化2天，接著完全揭 開瓶蓋並添加10?15毫升蒸餾水鍛鍊1天。
【文檔編號】A01H4/00GK104137772SQ201310163707
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月6日 優先權日:2013年5月6日
【發明者】高清華, 葉正文, 段可, 張玲, 鄭宏清 申請人:上海市農業科學院